PRACTICA 3.

CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

MATERIA: BIOQUMICA MICROBIANA
PROFESORA: DRA. VIRGINIA VILLA CRUZ
INTRODUCCIN
Los mtodos directos de cuantificacin de microorganismos permiten
establecer la poblacin total de microorganismos existentes, tienen la ventaja
de ser rpidos aunque no es posible diferenciar a las clulas vivas de las
muertas. Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra y el conteo de clulas.
Turbidimetra
En una suspensin microbiana, la cantidad de microorganismos est
directamente relacionada con la turbiedad o densidad ptica. La metodologa
es til con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde
los microorganismos son unicelulares y con un tamao de unos cuantos
micrmetros, caractersticas que les permiten mantenerse suspendidos y
homogneamente distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor
tamao y con aquellos productores de polisacridos esta metodologa no es
adecuada.
Recuento microscpico
Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial
para cuenta (hemacitmetros, cmaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de
Helber; estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que
facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen.
Con la cuantificacin de microorganismos a travs del tiempo es posible el
representar grficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas
fases:
Fase de latencia lag: perodo de adaptacin de un microorganismo a
un nuevo medio de cultivo.
Fase exponencial o logartmica: aumento regular de la poblacin que se
duplica a intervalos regulares de tiempo (td).
Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes,
por acumulacin de productos txicos, etc.
Fase de declinacin o muerte: el nmero de clulas que mueren es
mayor que el nmero de clulas que se dividen.
Las propiedades de un microorganismo dependern de la fase de la curva en
que se encuentren (por ejemplo la produccin de antibiticos se lleva a cabo en
la fase estacionaria).

OBJETIVOS
Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de clulas y
turbidimetra para obtener la curva de crecimiento.

MATERIAL REACTIVOS
Por equipo:
Sesin extraclase :Caldo nutritivo, 15 Tubos de rosca agua, 1 Gradilla, 5
Pipetas de 1 ml, 5 Pipetas de 10 ml, 1Cilindro para esterilizar pipetas, 1 Parrilla,
Agitadores magnticos, 1 probeta de 100 ml, 1 Vaso de precipitados 1000 ml, 1
Matraz erlenmeyer de 125 ml, 1 probeta de 100 ml, Balanza analtica, Gasa,
Algodn, Papel de estraza.
Sesin prctica: Celdas para espectrofotmetro, Espectrofotmetro,
Microscopio ptico, Portaobjetos, Cmara de Neubauer, Cubreobjetos, 2
Mecheros Fisher y 1 tubo t de vidrio.
Reactivos: Caldo nutritivo y agua destilada.

METODOLOGA

1.- Se preparar 250 ml de caldo nutritivo por equipo, se disolver por

calentamiento y se distribuir de la siguiente manera:
10 ml de medio en tubo con tapn de rosca (15 tubos por equipo)
50 ml en un matraz erlenmeyer de 125 ml con tapn de algodn
2.- Esterilizar las pipetas en un cilindro, los tubos y el matraz erlenmeyer con
medio de cultivo en el autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.
3.- Inocular con Escherichia coli el matraz erlenmeyer el da anterior a la sesin
prctica e incubar a 37C (tabla 1).
4.-Al da siguiente medir densidad ptica del cultivo del matraz erlenmeyer
utilizando como blanco medio estril para calibrar el espectrofotmetro.
5.- Inocular con el cultivo del matraz 4 tubos con caldo nutritivo (serie 1) e
incubar a 37C tres horas antes de que de inicio la sesin prctica.

6.- Inocular con el cultivo del matraz 8 tubos con caldo nutritivo (serie 2) e
incubar a 37C
7.- Realizar el muestreo de acuerdo a la tabla 1, determinando la densidad
ptica de acuerdo al paso 4 y contando clulas siguiendo el procedimiento que
se explica a continuacin.

Tabla 1. Horario de inoculacin de E. coli a tubos con medio de cultivo y

muestreo para cuantificar microorganismos.
Hora
16 a 18 horas antes del da de la
sesin de prctica
Da de sesin prctica
12:30
15:30
16:30
17:00
17:30
18:00
18:30

Serie 1

Serie 2

Inocular medio de cultivo en matraz

0
210
240
300

0
30
60
90
120
150

Conteo de clulas
1. Hacer frotis y tincin de Gram a la muestra a cultivar.
2. Bajo condiciones de asepsia colocar en el rea hundida de la cmara de
Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2) y extenderla
rpidamente. Evitar escurrimientos.
3. Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X
4. Contar las clulas en cuadros individuales. Para evitar el conteo de las
mismas clulas dos veces, omitir aquellas ubicados en las lneas de la parte
superior e izquierda de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son
considerados en los cuadros superior y derecho adyacentes: ejemplo:

5. Contar cuando menos 10 campos

6. Aplicar la siguiente frmula y calcular el nmero de microorganismos por
mililitro o gramo de la muestra original:
(N*

RESULTADOS
Graficar la curva de crecimiento (nmero de clulas y densidad ptica)
Determinar la tasa especfica de crecimiento () en la grfica y con la ecuacin
de la curva de crecimiento
Determinar el tiempo de duplicacin.

CUESTIONARIO
1. Explica en que consisten los mtodos directos e indirectos de cuantificacin
de microorganismos
2. Cules son las ventajas y desventajas de los mtodos de cuantificacin de
microorganismos empleados en la prctica?
3. Explica en qu consiste la curva de crecimiento y que pasa en cada etapa