Tcnicas de anlise de protenas

Cromatografia

A coluna de Crom
atografia um dos mtodos mais
comuns de purificao de protenas.
Esta

tcnica

consiste

na

passagem da protena atravs de uma

coluna (fase estacionria) que
desenhada para reter ou diminuir a
velocidade da passagem da fase
mvel onde esto as macromolculas
(protenas) e a tcnica baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou
afinidade qumica. A soluo a analisar deve conter a protena concentrada e o mtodo
deve ser rpido para evitar a degradao da mesma, devendo no entanto, utilizar-se
inibidores de proteases.
Dependendo da escolha da coluna, as protenas podem ser separadas de acordo com
a sua carga (IEX cromatografia de troca inica), sua hidrofobicidade (HIC
cromatografia de interaco hidrofbica), seu tamanho (GF filtrao em gel) ou pela
sua capacidade de se ligar a grupos qumicos particulares.
IEX Cromatografia de troca Inica
Baseia-se na carga da protena que estamos a tentar
isolar. Se esta possuir carga positiva, a soluo deve
passar por uma coluna com carga negativa (impedindo a
passagem das protenas com carga positiva).
Depois de fazer passar a soluo pela coluna
recorre-se ao procedimento salting out para separar a
protena, com carga positiva, da coluna com carga

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negativa (este tipo de coluna denominado coluna de troca de caties e possui ies de
sulfato, imobilizados na fase estacionrio).
Para impedir a passagem de uma protena com carga negativa utiliza-se uma coluna
de carga positiva designada por coluna de troca de anies que, geralmente, possui ies
de amnio.
Salting out
Esta tcnica usa uma soluo de elevada concentrao de sal que compete com a
protena na ligao coluna. Como esta tem maior afinidade para a carga dos sais do
que para a das protenas, estas acabam por ser libertadas, mantendo-se os sais ligados
coluna. As protenas com fracas interaces inicas sero libertadas com uma
concentrao baixa de sal. A adio de sal dever ser feita de uma forma gradual e, no
final, para ter a certeza que todas as protenas foram libertadas da coluna, deve ser
colocado nesta uma soluo de concentrao de sal de 2-3mol/L.
Para remover os sais da soluo de protenas deve ser feita uma dilise contra
tampo.
As mudanas no pH alteram a carga das protenas, por isso necessrio conhecer o
seu ponto isoeltrico (pH a que a carga da protena 0) e certificar-se de que o pH do
sistema est convenientemente ajustado e tamponado.
HIC Cromatografia de Interaco hidrofbica
O HIC baseia-se nas propriedades hidrofbicas de algumas protenas.
As protenas devem ser colocadas na presena de elevada concentrao de sulfato
de amnio, o qual aumenta a entropia da gua, aumentando, assim, as interaces
hidrofbicas. Este tambm estabiliza as protenas.
As pores hidrofbicas da coluna so colocadas com uma matriz de agarose de
fenil. Na presena de elevadas concentraes de sal, os grupos de fenil da matriz
impedem a passagem de pores das protenas hidrofbicas. Pode-se controlar a
separao de diferentes ligaes coluna das protenas,
reduzindo a concentrao do sal ou adicionando
solventes.
GF Cromatografia de filtrao em gel

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A cromatografia de filtrao em gel separa as protenas com base no seu tamanho.

A coluna constituda por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas.
Ao fazer passar a soluo de protenas pela matriz da coluna, as molculas
pequenas entram nos poros das esferas demorando a atravess-los, enquanto que as
grandes passam entre as esferas sendo separadas primeiro.
Outro tipo de coluna o AC (Cromatografia de Afinidade), que um procedimento
mais eficiente que os outros, acima citados.
AC Cromatografia de Afinidade
A cromatografia de afinidade baseia-se nas funes
biolgicas da protena que se liga coluna.
O tipo mais comum envolve um ligando (pequena
biomolcula especfica por exemplo anticorpo), que
imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a
celulose ou poliacrilamida.
A protena a analisar passa depois atravs da coluna e
liga-se a ela pelo seu ligando, enquanto que outras protenas sero libertadas. A
separao da protena alvo normalmente feita, passando atravs da coluna uma
soluo que contenha uma elevada concentrao de ligando livre.
Isto um mtodo muito eficiente de purificao, uma vez que se baseia numa
especificidade biolgica da protena que se pretende analisar, tal como a afinidade de
uma enzima a um substrato ou a ligao entre antignio e anticorpo.
Contudo, apesar das inmeras vantagens que a cromatografia convencional oferece,
esta est limitada pela no homogeneidade nas matrizes (como celulose), que causa uma
desigual fluidez do solvente atravs da coluna. Com o objectivo de colmatar esta falha
foi desenvolvida uma nova cromatografia, o HPLC (High Performance Liquid
Cromatography). Para alm disso tambm permite que as protenas sejam separadas
mais rapidamente do que pelos mtodos convencionais e separar molculas com
estruturas e tamanhos muito semelhantes.

Dentro desta variedade centraremos a nossa ateno no SDS-PAGE.

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SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli,

1970)
O objectivo do SDS desnaturar a protena, isto , converter a protena numa
estrutura linear (a sua forma nativa , geralmente, globular) e conferir-lhe densidade de
carga uniforme, de forma a poderem ser separadas por electroforese, somente, em
funo do tamanho (massa molecular). O SDS tem uma alta carga negativa e pH 7 e tem
uma cauda hidrofbica que interactua com as cadeias das protenas (polipeptdeos). O
nmero de molculas de SDS que se ligam s protenas proporcional ao nmero de
aminocidos que constituem as mesmas, pois liga-se na razo de uma molcula por
ligao peptdica.
Se as protenas desnaturadas so postas num campo elctrico, todas elas se movero
para o plo positivo, na mesma proporo, sem possibilidade de avaliar a distncia
migrada. Ento, necessrio coloc-las num ambiente que permita que protenas de
variados tamanhos se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel
de poliacrilamida (polmero de monmeros de acrilamida).
De seguida, aplica-se uma corrente elctrica e, como tal, as molculas movem-se
ao longo do gel de poliacrilamida (a todo este processo chama-se Electroforese em Gel
de Poliacrilamida), migrando mais rapidamente as de menores dimenses.
Aps as protenas terem corrido o gel, preciso fix-las, para evitar que
difundam quando se procede colorao do mesmo. O cido actico a 25% em H 2O
um bom fixador, alm de que mantm as protenas desnaturadas.
O gel , tipicamente, corado com azul de Coomasie (a fixao e colorao podem
ser preparadas na mesma soluo, usando como solvente o metanol ou sais de prata) e
depois descorado.

Focagem isoelctrica
Esta tcnica baseia-se nas diferenas dos pontos isoelctricos das protenas para as
separar.
As protenas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula
dependendo do pH do meio e para cada protena existe um valor de pH do meio para o
qual a carga da mesma 0 (pI, ponto isoelctrico), que geralmente se situa entre 3 12.

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Quando uma protena colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual
o gradiente de pH estabelecido pela mistura de solues tampo especiais e sujeita a
um campo elctrico ir inicialmente mover-se em direco ao elctrodo com carga
oposta. Durante a migrao atravs do gradiente de pH, a protena ir captar ou perder
protes. Enquanto a protena migra a sua velocidade vai diminuindo at chegar ao ponto
em que o valor de pH ser igual ao seu pI. Neste ponto a protena ter carga total neutra
e como consequncia deixa de migrar. Se a protena se difundir para uma regio fora do
seu pI, ir adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posio onde
globalmente neutra. Pode ter grupos ionizados, mas globalmente neutra.

Electroforese Bidimensional
Como as bandas proteicas tendem a sobrepor-se, os mtodos unidimensionais de
separao, como a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS), podem apenas separar
um nmero relativamente pequeno de protenas (geralmente menos de 50), a
electroforese de um gel bidimensional, ao combinar dois processos de separao
distintos, pode ser usado para separar mais de 1000 protenas.
Numa primeira etapa as protenas so separadas em funo da sua carga nativa. As
cadeias polipeptdicas so, ento, separadas por um processo de focagem isoelctrica.
Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contm as
protenas separadas por focagem isoelctrica sujeito, novamente, a electroforese mas
numa direco em ngulo recto quela usada na primeira etapa. O gel original
mergulhado em SDS e depois colocado numa extremidade de um slab de gel de
poliacrilamida SDS, atravs do qual cada cadeia polipeptdica migra em funo do seu
tamanho observando-se no resultado final como um ponto sptot.
As nicas protenas que no so separadas sero aquelas que tero idntico tamanho
e ponto isoelctrico, uma situao relativamente rara. At quantidades vestigiais de cada
cadeia polipeptdica pode ser detectada no gel por vrios processos de colorao ou
por autorradiografia se a amostra da protena tiver sido previamente marcada por um
radioistopo.
O poder de separao to grande que duas protenas que diferem em apenas um
aminocido carregado podem ser prontamente distinguidas.

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Western blotting
O western blotting permite detectar uma protena numa mistura de protenas dando
tambm informao acerca do seu tamanho.
Inicialmente as protenas so separadas por SDS-PAGE e, posteriormente, so
transferidas para uma membrana de nitrocelulose (do mesmo modo que foram separadas
no SDS-PAGE). O polo negativo ctodo, fica do lado do gel e o positivo - nodo no
lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as protenas carregadas negativamente
em direco membrana (carregada positivamente). A razo para a transferncia das
bandas de protenas para uma membrana de nitrocelulose permitir a chegada dos
anticorpos s bandas com maior facilidade e eficcia, j que o gel de poliacrilamida no
permite a difuso de grandes molculas.
A membrana de nitrocelulose incubada com o anticorpo primrio que se liga
protena que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-protena.
Seguidamente -lhe adicionado o anticorpo secundrio conjugado, anticorpo-enzima,
que se vai ligar ao anticorpo primrio. A enzima (ex. fosfatse alcalina ou peroxidase)
funciona como um sinalizador molecular que permite a visualizao do local da protena
detectada. No entanto, para que a enzima seja visualizada necessrio coloc-la na
presena de uma mistura reactiva especfica. adicionado um substrato cromognico,
que ao ser degradado pela enzima conjugada com o anticorpo dar origem a um
precipitado insolvel colocalizado com o anticorpo primrio que por sua vez se ligou
protena.
Podem tambm ser utilizados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou
os radioistopos (que podem ser detectados por tcnicas de autorradiografia).

Apesar do proteoma no ser objectivo directo do trabalho, achamos importante e

pertinente falar sobre este assunto que, de certa forma, est directa ou indirectamente
relacionado com as tcnicas de anlise de protenas 1. integrativo dos estudos de anlise
de protenas

Os mtodos experimentais utilizados no estudo do proteoma dividem-se, fundamentalmente, em duas

etapas: isolamento e separao das protenas a partir do material biolgico (fraccionamento
cromatogrfico - filtrao em gel, afinidade, imunoafinidade, etc - mtodos electroforticos - SDSPAGE, focagem isoelctrica, etc); e sequenciao dos aminocidos de cada protena.
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Proteoma
O proteoma reflecte o estado actual de funcionamento do sistema em condies
fisiolgicas especficas, ou seja, a expresso do genoma funcional. Esta caracterstica
faz com que o estudo do proteoma se torne um grande desafio.
O proteoma da clula bastante dinmico dependendo do seu estado de
desenvolvimento, da presena de activadores ou inibidores e tambm das condies
especficas do meio ambiente.
Embora a identificao de todas as protenas codificadas no genoma de um
organismo parea uma tarefa bastante difcil de concretizar, mesmo em organismos
muito simples, so cada vez mais as informaes completas, atravs de estudos
protemicos, sobre vias de sinalizao celular, conjuntos de protenas reguladoras,
modificaes ps-traduo, bem como outras informaes cruciais sobre os estados
fisiolgicos e fisiopatolgicos de clulas e organismos.
O estudo em questo pode levar a trs vertentes bsicas com implicaes directas
em vrios campos da biologia e da biotecnologia.
Primeiro, o estudo do proteoma permite a descoberta de vias metablicas nas
diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia
celular e na bioqumica. Tal conhecimento torna possvel a identificao de novos alvos
farmacolgicos especficos.
Segundo, esse mesmo estudo permite viabilizar a identificao de novas molculas
bioactivas em extractos biolgicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos
medicamentos.
Terceiro, permite tambm a identificao e caracterizao de marcadores
biolgicos, ou seja, molculas endgenas ou exgenas especficas de um determinado
estado patolgico. A capacidade de identificar essas molculas extremamente til no
diagnstico precoce de doenas e no acompanhamento da evoluo do tratamento.
O estudo do proteoma tambm tem largas aplicaes na medicina, principalmente
na caracterizao de cancros e em doenas neurolgicas (como a doena de Alzheimer),
infecciosas ou cardacas.

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