PCR

Oscar Nolasco

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tcnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis (1984)
Basada en el descubrimiento de la actividad biolgica a altas
temperaturas de las DNA polimerasas encontradas en
bacterias termfilas.

Kary Mullis 1984

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html

Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain

reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

Fig. 1. Comparison of Klenow and Taq DNA polymerase

amplification products of thehuman 3-globin gene.
(A) Electrophoretic analysis of the PCR products obtained with Klenow
polymerase (lanes 1 to 6) and Taq polymerase (lanes 7 to 12) after 0 cycles (lanes 1
and 7), 20 cycles (lanes 2 and 8), 25 cycles (lanes 3 and 9), 30 cycles (lanes 4 and lo),
and 35 cycles (lanes 5,6, 11, and 12) of amplification. The DNA samples human cell
lines MOLT4 (lanes 1 to 5 and 7 to 11) and GM2064 (lanes 6 and 12). MOLT4 is
homozygous for the normal 3-globin gene (2), GM2064 possesses a homozygous
deletion of the entire 3-globin gene .
(B) Southern analysis of the gel with a 32P-labeled oligonucleotide probe

A) Electrophoretic analysis of specificity as affected by increasing extension

times: 0, 0.5, 2, and 8
minutes (lanes 1 to 4, respectively); and by increasing
amounts of enzyme:0.25, 0.5, 1, 2, 4, and 8 units (lanes 5 to 10, respectively).
(B) Electrophoretic examination of the effect of annealing temperature on
specificity at 400 (lanes 1 to 8) and 550C (lanes 9 to 16) with serial dilutions

PCR - Aplicaciones
La tcnica de PCR es una herramienta esencial dentro de la
biologa molecular:
n
n
n
n
n
n

n
n
n

clonacin
secuenciacin
diagnstico
Mutagnesis sitio-dirigida
Anlisis de mutaciones
Cuantificacin de diferencias en expresin gnica (RTPCR)
Pruebas de paternidad
Anlisis forense
Control de calidad a nivel industrial

Hay 7 componentes esenciales en

el proceso estndar de PCR
ADN molde (hebra molde o ADN blanco)
ADN polimerasa termoestable
Oligonucleotidos iniciadores (cebadores), que
limitan la regin a ser amplificada
Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs: dATP,
dCTP, dTTP, dGTP)
Cationes divalentes
Solucin tampn o Buffer (para mantener el pH)
Termociclador, mquina que calienta y enfria los
tubos de reaccin con una gran precision en las
temperaturas requeridas en cada paso.

ADN polimerasas termoestables

Llevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del ADN
blanco.
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3, ej. Taq agrega una A al exremo 3,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)
La mas utilizada = Taq ADN polimerasa
Taq: Thermus aquaticus, Pwo: Pyrococcus woesei, Pfu:
Pyrococcus furiosus, Tli: Thermococcus littoralis

Oligonucletidos iniciadores
(cebadores)
Son de secuencia conocida
Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del
proceso
Deben estar presentes en exceso (calcular concentracin ptima
segn protocolos). En general se usa de 50-100 pmol de cada
cebador por reaccin
Requieren de un cuidadoso diseo (programas en computadora)
Reglas de diseo bsicas:

(a) longitud = 18-25

(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Valores de Tm de no mas de 5C uno del otro
(d) Evitar las secuencias repetidas (dmeros, horquillas, etc.)

(d) Evitar las secuencias repetidas

5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3

5-NNNNNNNNTATA-3
3-ATATNNNNNNNN-5

3 repetido
5

3
3

5
3

PCR

3
5

Formacin de Dmeros

(d) Evitar las secuencias repetidas

5-TATANNNNNNNNNNNNN-3
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3

5-TATANNNNNNNN-3
3-NNNNNNNNATAT-5

5 repetido
5
3

3
5

PCR
5

3
5

no hay extensin

(d) Evitar las secuencias repetidas

5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3
5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3

5-NNNNNNNNNNNGCA
3-CGT

Formacin de horquillas

PCR

5
3
3

5
3

Productos de PCR no deseados

El ciclo de PCR

Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos si G+C < 55%

Temperatura de hibridizacin (Annealing) debe ser calculada o determinada
empiricamente para cada par de primers. En general se usa unos 5C por
debajo del Tm calculado
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = formacin de productos inespecficos
Extensin a la temperatura ptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72C para la Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada,
los cuales a partir de all se tornan en el producto principal
Nmero de ciclos:
- algunos componentes se tornan limitantes despus de 30 ciclos
- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia nica a partir de ADN
genmico de mamfero

Consideraciones para el diseo de un

laboratorio de PCR

Establecer areas Pre-PCR, PCR y Post-PCR

PRE PCR
PREPARACION DE REACTIVOS

PCR
AMPLIFICACION

POST PCR
ANALISIS DE RESULTADOS

Ambientes con Luz Ultravioleta (UV)

Variantes de PCR :
Long PCR
RT-PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
RAPDs
PCR-RFLP
Colony PCR
Differential Display
PCR cuantitativos

Nested PCR:
5

Producto obtenido del primer PCR

Producto obtenido en el segundo PCR