Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
em
Engenharia
Ambiental,
Ouro Preto, MG
2008
M838D
MOREIRA, DAVI SILVA.
endcrinos
em
mananciais
de abastecimento da Regio Metropolitana de
Pr-gua.
Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br
ii
iii
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeo a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele no
seria possvel completar esta importante etapa na vida.
Ao professor Srgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande
professor nos ensinamentos de vida acadmica e profissional. Ao professor Robson por
ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos.
Aos professores do DEQUI pela dedicao em repassar seus conhecimentos a
todos ns alunos durante a graduao e mestrado.
Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fbio e a Eliane
que ajudaram no projeto sempre que necessrio.
Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto
PROSAB 5.
Aos amigos do laboratrio Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande
amizade e o intercmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evoluo
de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as anlises
complementares.
Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e
piores momentos de UFOP, que j so seis anos. Obrigado!
A UFOP pela bolsa concedida.
A COPASA pela colaborao na coleta das amostras.
E finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmos Saulo e
Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforo vale a pena.
Muito obrigado!
SUMRIO
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1. INTRODUO............................................................................................
2. OBJETIVOS.................................................................................................
3. REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................
3.1. O sistema endcrino..................................................................................
3.2. Perturbadores endcrinos.........................................................................
3.2.1. Mecanismos de Ao dos Perturbadores Endcrinos.............................
3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endcrinos relatados em animais silvestres
e de laboratrio.................................................................................................
3.2.3. Efeitos dos perturbadores endcrinos relatados em humanos...............
3.3. Anlise e monitoramento de Perturbadores Endcrinos em guas
Superficiais........................................................................................................
3.3.1. Metodologias para anlise de perturbadores endcrinos.......................
3.3.2. Monitoramento de perturbadores endcrinos em guas superficiais.....
3.3.3. Tcnicas de remoo de perturbadores endcrinos................................
3.3.4. Consideraes finais................................................................................
4. MATERIAIS E MTODOS.......................................................................
4.1. Desenvolvimento e Otimizao do Mtodo Analtico...............................
4.1.1. Amostragem, filtrao e ajuste do pH ....................................................
4.1.2. Extrao e concentrao dos analitos.....................................................
4.1.3. Secagem e suspenso dos analitos...........................................................
4.1.4. Anlise Cromatogrfica...........................................................................
4.2. Validao do mtodo analtico..................................................................
4.2.1. Estabilidade.............................................................................................
4.2.2. Seletividade..............................................................................................
4.2.3. Curva analtica........................................................................................
4.2.4. Linearidade e Sensibilidade....................................................................
4.2.5. Preciso...................................................................................................
4.2.6. Ensaio de supresso................................................................................
4.2.7. Ensaio de recuperao............................................................................
4.2.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial...................................................
4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos nos Mananciais da
Regio Metropolitana de Belo Horizonte........................................................
5. RESULTADOS E DISCUSSES...............................................................
5.1.Cromatografia Gasosa com Deteco por Ionizao em Chama.............
5.2. Cromatografia Lquida com Deteco por Espectrometria de massas Desenvolvimento do Mtodo Analtico.............................................................
5.3. Validao do Mtodo Analtico para LCMS.............................................
5.3.1. Estabilidade.............................................................................................
5.3.2. Seletividade..............................................................................................
5.3.3. Curva Analtica.......................................................................................
5.2.4. Linearidade e Sensibilidade.....................................................................
5.2.5. Preciso...................................................................................................
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70
vi
SUMRIO (continuao)
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5.3.6 Ensaio de Supresso.................................................................................
5.3.7 Ensaio de Recuperao............................................................................
5.3.8. Ensaio de calibrao interlaboratorial...................................................
5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endcrinos em Mananciais da
Regio Metropolitana de Belo Horizonte.........................................................
5.5 Estimativa de valores crticos de toxicidade dos PE estudados.................
6. CONCLUSES............................................................................................
7. PERSPECTIVAS.........................................................................................
8. REFERNCIAS...........................................................................................
71
73
74
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100
vii
LISTA DE FIGURAS
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Figura 3.1: rgos do sistema endcrino.......................................................
Figura 3.2: Funcionamento do hipotlamo.....................................................
Figura 3.3: Estruturas qumicas de alguns perturbadores endcrinos
comumente encontrados em guas superficiais...........................
Figura 3.4: Disfunes endcrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista;
(c) efeito antagonista....................................................................
Figura 3.5: Diagrama esquemtico para preparao e anlise dos
perturbadores endcrinos.............................................................
Figura 3.6: Etapas da extrao por fase slida para isolamento de
compostos de interesse.................................................................
Figura 3.7: Exemplo dos dois passos genericamente associados aos
imunoensaios: A) Imobilizao do receptor especfico ao
suporte, seguido de incubao aps a adio da amostra
contendo estrognios e de anticorpos; B) Adio da soluo
adequada ao tipo de deteco pretendida.....................................
Figura 4.1: Diagrama geral para preparao e anlises dos PE. ....................
Figura 4.2: Cartucho SPE C18 500mg Unitech.............................................
Figura 4.3: Sistema de extrao em fase slida utilizado para extrao dos
analitos de interesse das amostras ambientais..............................
Figura 4.4: Reao de Silanizao a partir dos analitos a serem
derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o
reagente de derivatizao utilizado (BSTFA)..............................
Figura 4.5: Diagrama esquemtico de funcionamento do espectrmetro de
massas on-trap time-of-flight..................................................
Figura 4.6: Frmula Estrutural da Fenolftalena............................................
Figura 4.7: Localizao dos 3 mananciais estudados na Regio
Metropolitana de Belo Horizonte................................................
Figura 4.8: Contribuio das ETAs no abastecimento da Regio
Metropolitana de Belo Horizonte.................................................
Figura 4.9: Vista area ETA Rio das Velhas..................................................
Figura 4.10: Local de amostragem para gua bruta do manancial Rio das
Velhas..........................................................................................
Figura 4.11: ETA Vargem das Flores...............................................................
Figura 4.12: Vista area ETA Vargem das Flores............................................
Figura 4.13: Vista area da ETA Sistema Morro Redondo..............................
Figura 4.14: ETA Morro Redondo...................................................................
Figura 5.1: Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeo de
mistura de padres em diferentes concentraes. ........................
Figura 5.2 Curva de calibrao obtida com a mistura dos padres
analisados......................................................................................
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ix
LISTA DE TABELAS
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Tabela 3.1: Seminrios, comits e relatrios de avaliao sobre os
Perturbadores Endcrinos.............................................................
Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribudos aos perturbadores endcrinos em
animais..........................................................................................
Tabela 3.3: Classificao de alguns perturbadores endcrinos (adaptado de
Mol et al. 2000)............................................................................
Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes..
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de
nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais.........
Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endcrinos em guas
superficiais....................................................................................
Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoo de perturbadores
endcrinos.....................................................................................
Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, frmula molecular, pureza, marca e
nmero CAS dos compostos determinados..................................
Tabela 4.2: Descrio do procedimento de extrao com cartucho Unitech
C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extrao
simultnea dos trs compostos de interesse..................................
Tabela 4.3: Condies de anlise dos Perturbadores endcrinos por
cromatrografia gasosa...................................................................
Tabela 4.4: Condies de anlise dos PE por cromatrografia lquida
acoplada espectrometria de massas............................................
Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas........................
Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinao de nonilfenol,
estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores..................
Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinao dos Perturbadores
Endcrinos na Regio Metropolitana de Belo Horizonte ETA
Morro Redondo.............................................................................
Tabela 5.1: Tempo de reteno, rea obtida em relao concentrao e
limite de deteco dos compostos analisados por cromatografia
gasosa...........................................................................................
Tabela 5.2: Frmulas moleculares, tempos de reteno, ons primrios
(ms1) e secundrios (ms2) caractersticos para cada padro
utilizado........................................................................................
Tabela 5.3: Variao da concentrao dos compostos em relao ao tempo
de preparo das amostras................................................................
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90
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xii
LISTA DE NOTAES
APEO
BPA
BSTFA
CAS
CETESB
CG
CG-FID
CGMS
CSTEE
DAD
DDE
DDT
DES
DIC
E1
E2
E3
EDC
EE2
EM
ESI
ETA
ETE
FE
FM
H2SO4
HCl
HPLC
IEH
IPCS
IUPAC
LC
LCMS
LCMS-ITTOF
MSTFA
MTBSTFA
4NP
Alquilfenis Polietoxilados
Bisfenol A
N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida
Chemical Abstract Service
Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
Cromatografia Gasosa
Cromatrografia Gasosa com deteco por Ionizao em Chama
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia lquida)
Diclorodifeniltricloroetileno
Dicloro-difenil-tricloro-etano
Dietilestilbestrol
Detector de Ionizao em Chama (para cromatografia Gasosa)
Estrona
Estradiol
Estriol
Endocrine Disrupting Chemicals
Etinilestradiol
Espectrometria de Massas
Eletronspray ionization
Estao de tratamento de gua
Estao de tratamento de esgoto
Fase estacionria
Fase mvel
cido Sulfrico
cido Clordrico
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
Institute for Ecological Health
Programa Internacional de Segurana Qumica
International Union of Pure and Applied Chemistry
Cromatografia Lquida
Cromatografia Lquida acoplada a Espectrometria de Massas
Cromatografia Lquida acoplada a Espectrometria de Massas. Deteco por
Ion Trap e Time of Flight
N-metil-n-trifluoroacetamida
N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida
4-nonilfenol
xiii
Nonilfenol ou n-nonilfenol
Nonilfenol Polietoxilado
Organizao para a Cooperao e Desenvolvimento Econmico
Organizao Mundial da Sade
Anlise de componente principal
Perturbadores Endcrinos
Poluentes Orgnicos Persistentes
Regio Metropolitana de Belo Horizonte
Extrao por fase slida
Microextrao em fase slida
Substncias Txicas Persistentes
Unio Europia
Agncia de Proteo Ambiental do Reino Unido
Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos
Detector ultravioleta na regio do visvel
Vitelogenina
xiv
RESUMO
Alguns compostos orgnicos classificados como Perturbadores Endcrinos (PE) so
encontrados em guas superficiais e tm atrado a ateno da comunidade cientfica
devido alterao que eles causam no sistema endcrino da fauna aqutica e ao
potencial risco sade humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormnios
(17-estradiol, 17-etinilestradiol) e subprodutos da degradao de surfactantes noinicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, h poucos trabalhos nacionais
publicados abordando o monitoramento e a remoo de PE de guas naturais, no
havendo ainda uma legislao que regulamente a emisso de hormnios e nonilfenis
no ambiente ou que estabelea padres de potabilidade para tais compostos. Sendo
assim, essa dissertao teve como objetivo desenvolver metodologia analtica para
quantificao de 17-estradiol (E2), 17-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em
amostras de gua superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em trs
mananciais de abastecimento da Regio Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A
quantificao dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de
cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) aps extrao e
concentrao em cartuchos tipo C18. A recuperao dos PE pelo processo de extrao
em fase slida variou de 90 a 96% ao passo que os limites de deteco do mtodo
foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L-1 para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Aps validao do
mtodo analtico, foi feito o monitoramento do afluente e da gua filtrada (em filtro de
areia) de trs estaes de tratamento de gua (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio
das Velhas) da regio Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os trs compostos
monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol
esteve presente em todas amostras de gua bruta, na faixa de concentrao de 44 a 1.918
ng.L-1. Os compostos 17-estradiol e 17-etinilestradiol foram determinados em apenas
15% das amostras, na faixa de concentrao de 2 a 54 ng.L-1. As anlises das amostras
coletadas nas ETAs aps o filtro de areia mostraram que as etapas de pr-clorao,
coagulao, sedimentao e filtrao no foram capazes de remover, em sua totalidade,
os PE monitorados.
xv
ABSTRACT
Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been
found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to
their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the
potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine
properties, the hormones (17-estradiol 17- ethinylestradiol) and a by-product of the
degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There
are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no
Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water.
Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 estradiol (E2), 17 -ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of
surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area,
Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid
chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being
extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase
extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical
procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L-1 for E2, EE2 and NP, respectively.
After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered
water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das
Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results
showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the nnonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to
1,918 ng.L-1. The estrogens 17-estradiol and 17 -ethinylestradiol were detected in
only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of
samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination,
coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely
removing the EDC present in the raw water.
Keywords: Endocrine Disruptors Compounds; organic microcontaminants; Water
Quality; Water Treatment; mass spectrometry
xvi
1. INTRODUO
A gua hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do
planeta. Seus mltiplos usos so indispensveis a um amplo espectro das atividades
humanas. Devido a crescente degradao dos corpos dgua, as preocupaes com o uso
e destino tm mobilizado pessoas de diversas reas acadmicas a pesquisas cientficas
com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.
A partir da dcada de 70, o interesse da comunidade acadmica e a criao de
rgos de proteo ambiental, como a Agncia de Proteo Ambiental dos Estados
Unidos
(USEPA),
promoveram
um
crescimento
de
pesquisas
envolvendo
ii)
iii)
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analtica para a
deteco e quantificao dos perturbadores endcrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) em amostras de gua usando cromatografia acoplada a
espectrometria de massas (LCMS).
Objetivos especficos:
Monitorar, pelo perodo de um ano, a gua de trs mananciais da regio
metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presena de NP, E2 e EE2;
Avaliar, de forma geral, a eficincia das etapas de pr-clorao, coagulao,
sedimentao e filtrao, empregadas nas estaes de tratamento de gua (ETA)
monitoradas, na remoo de NP, E2 e EE2.
3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1. O sistema endcrino
D-se o nome de sistema endcrino ao conjunto de rgos que apresentam como
atividade caracterstica a produo de secrees denominadas hormnios, que so
lanados na corrente sangnea e iro atuar em outra parte do organismo, controlando
ou auxiliando o controle de sua funo. Os rgos que tm sua funo controlada e/ou
regulada pelos hormnios so denominados rgos-alvo (Guyton 1988).
Os hormnios influenciam praticamente todas as funes dos demais sistemas
corporais. Freqentemente o sistema endcrino interage com o sistema nervoso,
formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer
ao endcrino a informao sobre o meio externo, ao passo que o sistema endcrino
regula a resposta interna do organismo a esta informao. Dessa forma, o sistema
endcrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenao e regulao das
funes corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os rgos do sistema
endcrino. As propriedas dos rgos do sistema endcrino sero discutidas a seguir.
so
responsveis
pela
manuteno,
reproduo,
desenvolvimento
e/ou
Organizao
Agncia Ambiental Federal
Alem
Agncia Proteo Ambiental
Americana (USEPA)
Ministrio do Meio Ambiente e
Energia da Dinamarca
1996
USEPA
1996
USEPA
1997
1998
USEPA
USEPA
1998
1999
1999
2001
2002
2002
2002
2003
2004
Objetivos do Estudo
Discusso sobre evidncia e impactos dos PE e riscos
potenciais que podem causar em humanos e animais
Seminrios para avaliar os riscos sade e efeitos
ambientais dos PE
Avaliao dos efeitos de substncias estrognicas no
desenvolvimento e nas funes do sistema
reprodutivo masculino
Seminrio para desenvolvimento de estratgia para
avaliar o risco dos PE no ambiente
Desenvolvimento de programa de testes e anlises
(screening) para avaliar a ao dos PE
Relatrio sobre os PE presentes no meio ambiente
Reviso e discusso das informaes cientficas
disponveis sobre PE
Desenvolvimento de mtodos de ensaio para os PE
Reviso da literatura existente e opinio cientfica nas
evidncias dos PE, em particular, avaliao dos riscos
ecolgicos e diretrizes de ensaios toxicolgicos
Identificao do problema dos PE, suas causas,
conseqncias e definio das medidas adequadas
para dar uma resposta ao problema
Primeiro relatrio sobre o progresso dos trabalhos da
comunidade europia sobre os PE
Programa COMPREHEND: Avaliao das
evidncias dos PE no ambiente aqutico na Europa
Avaliao dos mtodos de ensaios para as substncias
estrognicas
Avaliao global do estado da arte da cincia dos PE
Relatrio de avaliao do progresso internacional da
pesquisa dos PE
Segundo relatrio sobre o progresso dos trabalhos
sobre os PE.
10
Figura 3.4 - Disfunes endcrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito
antagonista (Ghiselli, 2006).
11
Contaminante
Efluente de
ETE
Peixe
17-Estradiol
17etinilestradiol
Estrona
Octilfenol
Nonilfenol
Butilfenol
Bisfenol A
Mamfero
Bisfenol A
PCB
DDE e DDT
Rptil
17-Estradiol
DDT
Aves
Anfbio
DDE
Efluente de
ETE
Efeitos
Feminizao de Peixes
Declnio da Reproduo
Referncia
(Allen et al. 1999)
(Robinson et al. 2003)
(Allen et al. 1999; Sol et al.
2000; Sol et al. 2003)
(Krner et al. 2000)
(Panter et al. 2000)
(Hartley et al. 1998)
Declnio da Reproduo
(Shioda e Wakabayashi 2000)
Anomalia no sistema reprodutivo de
ratos
(Markey et al. 2002)
Alta mortalidade de golfinhos
(Aguilar e Borrell 1994)
Concentraes anormais de
(Guillette et al. 1996;
hormnios sexuais no plasma e
Guillette et al. 1999; Milnes
anomalias morfolgicas nas gnadas
et al. 2002)
Induo da sntese de VTG no
sangue e alteraes na produo de
ovos de tartaruga
(Irwin et al. 2001)
Feminizao de Gaivotas machos
(Fry e Toone 1981)
Anomalia no sistema reprodutivo
(Bitman et al. 1968)
Nascimento prematuro de aves
(Damstra et al. 2002)
Induo sntese de VTG no sangue
e hermafroditismo
(Bogi et al. 2003)
12
13
14
Uso
Agricultura (ex: DDT)
Contraceptivos, agentes de crescimento (ex:
estradiol e etinilestradiol)
Detergentes, cosmticos, agroqumicos
Produtos de degradao dos APEOs (ex:
nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes
Fluidos para refrigerao / subprodutos da
combusto
Plastificantes
Ocorrncia natural em plantas
Produo de polmeros, degradao de plsticos
(policarbonatos)
15
2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os
casos, a quantificao dos perturbadores endcrinos nas concentraes ambientais
normalmente feita com espectrmetros de massa, dada sua elevada especificidade.
Outro mtodo de anlise baseado em tcnicas enzimticas ou bioensaios tambm tm
sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do
mtodo tem favorecido o uso das tcnicas cromatogrficas na anlise de perturbadores
endcrinos (Farr et al. 2007)
Basicamente, a determinao dos PE em amostras aquosas envolve trs etapas:
amostragem, pr-concentrao e anlise. Para a determinao de perturbadores
endcrinos necessrio usar critrios analticos rigorosos para que as vrias etapas,
como amostragem, transporte, estocagem e anlise, tenham o menor erro possvel, tendo
em vista a baixa quantidade dos PE (g.L-1 a ng.L-1) nas amostras ambientais (Liu et al.
2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de anlise dos PE.
16
17
variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et
al. 2005). Os cidos mais utilizados para a correo do pH so o clordrico (HCl) ou o
sulfrico (H2SO4).
Concentrao e eluio dos compostos de interesse
Os PE so, em sua maioria, compostos orgnicos hidrofbicos encontrados em
baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos no consegue
detect-los nas concentraes usualmente encontradas, uma etapa de concentrao
usualmente necessria (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considervel
interesse no desenvolvimento de novos mtodos seletivos para extrao e isolamento
dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A
seletividade da fase estacionria um importante parmetro, uma vez que um dos
principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as anlises posteriores
feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais
utilizada para contornar esses problemas tem sido a extrao em fase slida (Solid
Phase Extration - SPE). A SPE uma tcnica de separao lquido-slido que, do ponto
de vista prtico, pode ser descrita como uma cromatografia lquida, onde se usa uma
pequena coluna aberta, denominada cartucho de extrao, que contm a fase slida (o
correspondente fase estacionria em cromatografia).
No procedimento de extrao a amostra contendo o analito de interesse
colocada no topo do cartucho e aspirada atravs dele pela aplicao de um pequeno
vcuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase
slida, de forma a ser posteriormente eludo com um pequeno volume de solvente, e
essa etapa de eluio permite a determinao do grau de concentrao necessrio para a
anlise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente
eludo. Se houver contaminantes que possam interferir na anlise, uma lavagem e/ou
clean-up precede a eluio, com a utilizao de um solvente que tenha afinidade pelo
contaminante e no pelos compostos de interesse. Em muitos casos, onde a amostra no
precisa ser filtrada, a prpria etapa de extrao em fase slida funciona como clean-up
(Lanas 2004a). A Figura 3.6 exemplifica as etapas envolvidas na extrao em fase
slida.
18
Figura 3.6 - Etapas da extrao por fase slida para isolamento de compostos de
interesse (Lanas 2004a)
Atualmente um grande nmero de cartuchos de SPE est disponvel de modo
que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicaes. Um adsorvente genrico
capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos especficos
exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado a interao hidrofbica
e as fases slidas mais reportadas nos trabalhos so as compostas de octadecil (C18) e
slica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extrao por fase slida para
os perturbadores endcrinos nonilfenol e estradiis.
Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes
Cartuchos
Descrio
Fabricante
Oasis HLB Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona)
Waters
C18
Polimericamente ligado, octadecil (18% C) Vrios
C18/ENV+ C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno IST
Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficincia de recuperao dos
PE em relao ao tipo de cartucho SPE. A concluso obtida foi que o melhor cartucho
para adsoro de alquilfenis e estrognios o conhecido como Oasis HLB 500mg. O
maior inconveniente na utilizao deste tipo de cartucho o preo, cerca de cinco vezes
superior aos cartuchos de eficincia de recuperao semelhante, como o DSC-18. Dessa
forma, fases estacionrias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relao custobenefcio.
Uma das grandes desvantagens obtidas na extrao em fase slida a quantidade
de amostra a ser coletada para anlise. Para uma concentrao de 1000 vezes, por
exemplo, necessita-se, em mdia, de 1 litro da amostra, e o tempo de extrao pode ser
bastante demorado, podendo chegar a at 3 horas (Wang et al. 2005). Kuch e
Ballschmiter (2001) e Snyder et al (1999) alcanaram baixos limites de deteco de
19
20
21
Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A)
Imobilizao do receptor especfico ao suporte, seguido de incubao aps a adio da
amostra contendo estrognios e de anticorpos; B) Adio da soluo adequada ao tipo
de deteco pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).
Os mtodos cromatogrficos implicam em interaes fisico-qumicas entre os
compostos presentes na amostra e a coluna cromatogrfica, e sua aplicao permite a
anlise qualitativa ou quantitativa de vrios microcontaminantes de interesse ambiental.
A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura atravs de sua
distribuio em duas fases: uma estacionria (fixa na coluna cromatogrfica) e outra
mvel. A cromatografia acoplada espectrometria de massas, seja lquida ou gasosa,
apresenta-se como a tcnica analtica mais robusta, abrangente, reprodutvel e sensvel,
para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentao disponvel combina
baixos limites de deteco e reprodutibilidade analtica atravs do monitoramento de
ons pr-selecionados.
A cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CGMS) tem sido
uma tcnica comumente empregada, apesar de a cromatografia lquida acoplada
espectrometria de massas (LCMS) ter ganhado popularidade. O pr-requisito necessrio
para anlise em cromatografia gasosa que o analito de interesse seja volatilizvel e
termicamente estvel, muito embora a derivatizao possa ser usada em alguns casos
para superar esta limitao. Tradicionalmente, a cromatografia gasosa necessita do
emprego de derivatizao para determinar compostos estrognicos, e os compostos mais
utilizados com tal finalidade so o MSTFA (n-metil-n-trifluoroacetamida), BSTFA (nbis(trimetilsilil)trifluoroacetamida)
MTBSTFA
(n-metil-n-(tert-
22
gasosa,
Matsumoto
et
al
(2002)
utilizaram
anidrido
de
23
24
comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as tcnicas de
cromatografia (tanto gasosa como lquida) acopladas espectrometria de massas so as
mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqncia, cromatografia acoplada a
detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescncia. Quando a cromatografia
gasosa utilizada percebe-se que a derivatizao por reaes de silanizao preferida
e que os reagentes mais utilizados para tanto so o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA.
As tcnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de deteco na ordem de
0,15 a 2,0 ng.L-1 para os PE investigados. Valores baixos de limite de deteco
dependero do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as
tcnicas de anlise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de deteco semelhantes.
A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais o estradiol (E2) e o
nonilfenol (NP) so os compostos frequentemente presentes, sendo o etinilestradiol
(EE2) sempre presente em menor quantidade. Em esgotos domsticos in natura, os
compostos E2 e EE2 foram encontrados com mais freqncia que o NP. Um dos
possveis fatores a maior degradao/adsoro dos alquilfenis ao longo da rede de
coleta. A Tabela 2.5 mostra ainda que apenas o trabalho de Beck et al (2005) investigou
a presena de PE em gua marinha. As amostras foram coletadas em um esturio
prximas da ETE municipal de uma cidade alem com 90.000 habitantes. Os valores
mdios encontrados para EE2 e NP foram de 17,9 e 6,3 ng.L-1, respectivamente.
De acordo com a Tabela 3.5, tambm pode ser observado que as maiores
concentraes de PE foram reportadas em trabalhos feitos no continente americano e
asitico, onde se verificou valores mdios acima de 100 ng.L-1 para NP e E2. Apesar da
grande quantidade de trabalhos europeus relacionados, no foram encontradas grandes
quantidades de estrognios em guas superficiais, e os valores mximos de estradiol e
de etinilestradiol reportados foram de 13,9 ng.L-1 e 17,9 ng.L-1, respectivamente. Dos
trabalhos feitos na Europa salta aos olhos o monitoramento feito por Azevedo et al
(2001) em Portugal, onde se verificou a presena de nonilfenol em concentraes de at
10 mg.L-1. Como grande parte dos trabalhos feitos com guas superficiais de cidades
europias no detectou nenhum dos trs PE destacados (NP, E2 e EE2) provvel que
estes se encontravam abaixo do limite de deteco analtico (Jeannot et al, 2004;
Matsumoto et al, 2002). Tais resultados indicam que os PE podem estar presentes no
ambiente em valores na ordem de pg/L, tornando-se necessrio pesquisar novos
mtodos para anlise e extrao bem como tcnicas que permitam avaliar a
estrogenicidade de tais compostos em baixas concentraes.
25
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais.
Fonte de
Origem
Rio
Referncia
Tipo de
extrao
Localizao
Portugal
(Azevedo et al. 2001) Vrios locais
Oasis HLB
Mar Bltico
gua
SPE
(Beck et al. 2005)
(Parte Alem) Marinha
(Oasis HLB)
Frana
Efluente
(Bruchet et al. 2004)
Domstico
SPE C18
Espanha
SPE C18 e
(Farr et al. 2007)
Rio
NH2
Campinas
SPE
(Ghiselli 2006)
(Brasil)
Rio
(Oasis HLB)
Cidade do
(Gibson et al.) 2008
Mxico
Nascente
SPE C18 ou
(Mxico)
(Oasis HLB)
Pequim
(Hu et al. 2005)
(China)
Rio
SPE C18
Frana e
Efluente
SPE C18 ou
(Jeannot et al. 2002)
Canad
domstico (Oasis HLB)
(Kolpin et al. 2002)
(Komori et al. 2004)
Estados
Unidos
ETEs
(Japo)
(Kuch e Ballschmiter
2001)
Alemanha
Roma
(Itlia)
Efluente
Domstico
Efluente
domstico
Rio
Rio
Lquido Lquido
SPE
(Oasis HLB)
SPE
(LiChrolut
EN)
SPE
(Oasis HLB)
Tipo de
deteco
Reagente de
Derivatizao
CG-MS
(0,01 a 10)x106
NA1
NA
LC-MS/MS
3,1 a 6,3
< 4,0
2,1 a 17,9
CG-MS
LC-MS/MS
Kit ELISA
PFPA
<0,1x103
10,0
2,5
NA
0,5 a 1,1
<1,0
CG-MS
MTBSTFA
(1,1 a 1,8)x103
(1,8 a 6,0)x103
(1,3 a 3,5)x103
CG-MS/MS
BSTFA +
Piridina
1,8 a 8
0,01 a 0,02
0,04 a 0,08
NA
< 0,1
< 0,1
< 2,0
< 2,0
< 5,0
(0,8 a 40)x10
9,0 a 93,0
73 a 831
LC-MS/MS
CG-MS/MS
LC-MS/MS BSTFA (para CGMS)
TMS (para
CG-MS
hormnios)
NA
27 a 220
N.D2
CG-MS
Cloreto de
pentafluorbenzoila
(para alquilfenis)
6,7 a 134
0,15 a 3,6
0,10 a 5,1
LC-MS/MS
(1,3 a 1,5)x103
2,0 a 6,0
N.D
LC-MS/MS
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais (continuao...)
Referncia
(Liu et al. 2004a)
(Liu et al. 2004b)
(Matsumoto et al.
2002)
(Mibu et al. 2004)
(Mol et al. 2000)
(Quintana et al.
2004)
(Raimundo 2007)
(Snyder et al. 1999)
(Sol et al. 2000)
(Ternes et al. 1999)
(Wang et al. 2005)
(Wang et al. 2008)
1
Fonte de
Tipo de
Tipo de
Localizao
Origem
extrao
deteco
East Sussex Sedimento Microondas e
(Reino Unido)
de Rio
Slica Gel
CG-MS
East e West
SPE
Sussex
Rio
(Oasis HLB)
CG-MS
(Reino Unido)
Japo
LCRio
SPE C18
Fluorescncia
Japo
SPE
Rio
(Oasis HLB)
LC-MS/MS
Holanda
Rio
SPE C18
CG-MS
Espanha
SPE
Rio
(Oasis HLB)
CG-MS/MS
Campinas
LC-DAD
(Brasil)
LCSPE
(Oasis HLB)
Fluorescncia
Rio
Estados
SPE
LCUnidos
PFA
Fluorescncia
Rio
(fluorpolmero)
Kit ELISA
Espanha
Rio
SPE C18
LC-DAD-MS
Brasil
Efluente
Domstico
SPE C18
CG-MS
Tianjin,
gua
(China)
reutilizada
SPE C18
CG-MS
Tianjin,
SPE (Filtro de
China
Rio
cigarro e C18)
LC-UV
Reagente de
Derivatizao
BSTFA
2,9 a 7,5
1,3 a 5,5
2,0 a 7,6
BSTFA
< 0,8
14 a 17
< 0,8
CDPP
NA1
<0,65
<0,65
MTBSTFA
(0,10 a 0,25)x103
< 4,0
NA
< 300
NA
< 50,0
MSTFA
NA
3,0-13,9
< 5,0
(0,017 a 0,22)x103
(0,045 a
1,31)x103
(0,106 a 4,3)x103
0,16 a 1,17
(0,02 a 0,64)x103
0,27 a 2,82
NA
0,25 a 0,55
NA
MSTFA
NA
21,0
<1,0
MTBSTFA
1,0 a 7,0
1,0 a 4,0
6,9
NA
(1,3 a 1,5)x103
NA
NA no analisado
27
Tabela 3.5: Compilao de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em guas superficiais (continuao...)
Referncia
(Yang et al. 2006)
(Zhang et al. 2008)
Localizao
Guangdong,
(China)
Reino Unido
Fonte de
Origem
Tipo de
extrao
Tipo de
deteco
Reagente de
Derivatizao
Rio
SPME
SPE
(Oasis HLB)
CG-MS
MSTFA
98 a 102
NA1
CG-MS
No Informado
NA
11,8
NA
Rio
NA no analisado
28
A Tabela 3.5 mostra que grande parte das amostras aquticas analisadas indicou
a presena de PE em concentraes que variaram de 1,8 a 10000 ng.L-1 para o NP e de
0,01 a 6000 ng.L-1 para o E2 e 0,04 a 3.500 ng.L-1 para EE2. Apesar de a Tabela 3.5 s
ter apresentado trs PE, salienta-se que muitos dos trabalhos relatados detectaram ainda
a presena de outros PE, tais como bisfenol A e estrona (Lagan et al. 2004; Raimundo
2007; Wang et al. 2005). Trabalhos brasileiros como de Ghiselli (2006) e Raimundo
(2007) detectaram tambm em guas brasileiras o estrognio natural progesterona, o
estrognio sinttico levonorgestrel e os xenoestrognios dietilftalato, dibutilftalato e
octilfenol. Compostos considerados PE, mas que enquadram em outras classes como
pesticidas e HPAs, tambm foram analisados e detectados por Ghiselli (2006) e
Raimundo (2007).
A Portaria 518/2004 do Ministrio da Sade no determina os valores mximos
permitidos das substncias analisadas em gua de abastecimento. Outros rgos
mundiais como a Agncia Ambiental Americana (USEPA) e a Organizao Mundial da
Sade (OMS) tambm no apresentam valores mximos permitidos devido falta de
comprovao concreta dos limites txicos dos PE. A Tabela 3.5 mostra que so poucos
os trabalhos realizados em guas brasileiras. Os resultados apresentados por Ghiselli
(2006) e Raimundo (2007) indicaram uma quantidade de estradiol e etinilestradiol
superior quela normalmente encontrada em guas estrangeiras. Clculos de
concentraes mdias encontradas em trabalhos internacionais apresentaram valores de
34 ng.L-1 para E2 e 5,5 ng.L-1 para EE2 enquanto que trabalhos brasileiros, feitos na
bacia do rio Atibaia em Campinas-SP (Ghiselli, 2006), chegaram a concentraes
mximas de 6,0 x 103 ng.L-1 para E2 e 3,5 x 103 ng.L-1 para EE2.
No h muitos resultados publicados de monitoramento de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em guas superficiais. Alm disso, os artigos disponveis
relatam o monitoramento destes PEs em diferentes tipos de corpo dgua localizados
em diferentes pases, o que torna a comparao de resultados difcil e limitada. A
quantidade existente de um PE no ambiente depende de vrios fatores. Locais onde h
uma forte presena da agricultura e pecuria possuem tendncia de conterem pesticidas
e hormnios, enquanto que esgotos domsticos possuem uma maior probabilidade de
conter alquilfenis. A Tabela 3.6, adaptada de Raimundo (2007), resume os possveis
perturbadores endcrinos presentes de acordo com a fonte de poluio.
29
Esgoto domstico
Deflvio pecurio
Natural
Tipos de
Perturbadores endcrinos presentes
fontes
Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena, pesticidas,
bifenilas policloradas (PCB), hidrocarbonetos
policclicos aromticos (HPA), retardantes de chama,
pesticidas, dioxinas
Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena.
Difusa Hormnios naturais e sintticos, antibiticos,
frmacos veterinrios
Difusa HPA, estrognios naturais e fitoestrognios
30
de 0,7 ng.L-1 para E2, 0,8 ng.L-1 para EE2 e 1,8 ng.L-1 para NP. Infelizmente maiores
informaes a respeito do tratamento (Ex. tempo de contato, temperatura...) no so
informados no artigo.
Outros estudos em escala laboratorial (Alum et al. 2004; Huber et al. 2003)
indicaram que os estrognios so rapidamente oxidados com baixas doses de oznio (1,5
mg.L-1 e tempo de contato de 10 minutos) que so usadas em estaes de tratamento de
gua potvel, alcanando altas remoes (> 97%). Contudo, como no caso anterior,
apesar da atividade estrognica ter diminudo consideravelmente, uma estrogenicidade
residual permaneceu, provavelmente, devido aos subprodutos de oxidao e a no
remoo completa.
Rudder et al. (2004) estudaram um sistema de filtro biolgico em conjunto com o
xido de mangans (MnO2) para oxidao dos PE em esgoto domstico, e obtiveram
eficincias de 81,7% na remoo de EE2. O MnO2 oxidou os micropoluentes em
molculas menores, que junto com o Mn2+ foram degradados biologicamente, sendo o
mangans reoxidado (Mn4+) re-depositado no reator MnO2.
Os processos oxidativos avanados (POAs) tambm so bons candidatos para a
remoo de PE em guas e efluentes. A reviso da literatura mostra que os seguintes
processos j foram investigados para a degradao de perturbadores endcrinos em
ambientes aquticos: O3/H2O2, H2O2/UV, Fenton, TiO2/UV. A fotocatlise com TiO2
tem sido bastante estudada na degradao de estrognios (17-estradiol, estrona) e
outros PE, alcanando boas remoes dos poluentes (Bila e Dezotti 2007; Veras 2006).
A Agncia Ambiental Americana (USEPA 2001) realizou um estudo para
avaliar quais processos no tratamento de gua podem ser usados para remoo de
alguns PE. O relatrio conclui que a melhor tecnologia disponvel no tratamento de
gua para remoo de pesticidas, ftalatos, alquilfenis, alquilfenis etoxilados e PCB
o processo de filtrao em CAG (Carvo Ativado Granular). O carvo ativado em p
(CAP) comumente usado no tratamento de gua potvel para remoo de
micropoluentes. Alguns autores investigaram o uso de processos de filtrao com
carvo ativado na remoo dos PE, tais como, E2, bisfenol A e EE2, e os resultados
mostraram que so alcanadas remoes maiores que 99% de eficincia em com
concentraes iniciais do poluente de aproximadamente 100 ng.L-1, onde foi utilizado
concentraes de 5 a 50mg.L-1 de carvo ativado em p (Fuerhacker et al. 2001; Yoon
et al. 2003). Veras (2006) estudou a capacidade de remoo do estradiol por Carvp
31
ativado em p (CAP) e a remoo chegou a 100% com o carvo ativado a partir de osso
bovino com uma concentrao de carvo de 20 mg.L-1.
Outra tecnologia que pode ser usada na remoo de PE so os processos de
membrana. De fato, a aplicao de processos com membranas de nanofiltrao (NF),
ultrafiltrao (UF) e osmose reversa (OR) em plantas de tratamento de gua tem
aumentado de forma significativa (Mierzwa et al. 2005; Van der Bruggen e
Vandecasteele 2003). H poucos trabalhos publicados sobre a remoo de PE por
processos de membranas, mas o trabalho de Mierzwa et al (2005) relataram eficincia de
remoo acima de 90% para EE2 e NP usando membranas de ultrafiltrao.
A Tabela 3.7 resume os dados disponveis na literatura relacionados s
eficincias de remoo de E2, EE2 e NP por diferentes tcnicas de tratamento de gua.
Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoo de perturbadores endcrinos.
Tecnologia
Ozonizao
PE estudados
E2, EE2, NP1
Remoo
53% (E2)
71% (EE2)
21% (NP)
> 97%
> 95%
Ozonizao
E2, EE2
Adsoro por carvo
E2
Ativado em p
Separao com utilizao de
EE2, NP
> 90%
Membranas
Filtro biolgico com MnO2
EE2
81,7%
1
E2 estradiol; EE2 etinilestradiol; NP - nonilfenol.
Referncia
Wang et al (2005)
Alum et al (2004)
Veras et al (2006)
Mierzwa et al (2005)
(Rudder et al. 2004)
32
33
4. MATERIAIS E MTODOS
Para que se pudesse desenvolver um procedimento analtico capaz de identificar
e quantificar os possveis PE em amostras ambientais, o trabalho experimental foi
dividido em trs etapas. Na primeira etapa do trabalho foi adaptado, a partir da literatura
pertinente, um procedimento para a determinao do nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, utilizando SPE-LCMS-IT-TOF. A segunda etapa consistiu na validao
do mtodo empregado, e na terceira etapa foram analisadas amostras de gua superficial
de trs mananciais da RMBH em doze campanhas amostrais.
A escolha de E2, EE2 e NP como micropoluentes a serem monitorados, alm de
sua importncia ambiental, tambm devido ao fato de outros pesquisadores no mbito
do PROSAB, Edital 5, estarem realizando pesquisas com estes micropoluentes em
outros estados brasileiros. Dessa forma, os resultados obtidos podero ser comparados
com outros pesquisadores da rede.
34
informaes sobre os trs padres analticos utilizados nesse trabalho, enquanto que a
Figura 4.1 apresenta um procedimento geral de preparao e anlises dos PE
monitorados neste trabalho. Os nmeros apresentados no fluxograma da Figura 4.1,
sero utilizados para melhor identificao dos procedimentos descritos posteriormente
neste captulo.
Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, frmula molecular, pureza, marca e nmero CAS dos
compostos determinados.
Massa
Molar
(g/mol)
CAS1
Marca
Pureza
Nome IUPAC2
Estrognio Natural
17-estradiol
C18H24O2
272,1776
50-28-2
SigmaAldrich
97%
estra-1,3,5(10)trieno-3,17-diol
Estrognio Sinttico
17C20H24O2
etinilestradiol
296,1776
57-63-6
SigmaAldrich
98%
19-norpregna1,3,5(10)-trien20-ino-3,17diol
C15H24O
220,1827
Pestanal
94%
n-nonilfenol
C15H24O
220,1827
84852-1513
104-40-5
Riedel-de
Han
99.9%
4-n-nonilfenol
Composto
Xenoestrognio
Nonilfenol
mistura tcnica
4 - Nonilfenol
1
Frmula
Molecular
CAS: Chemical Abstract Service, 2 IUPAC: International Union of Pure and Applied
Chemistry
35
O acetato de etila utilizado no preparo das amostras foi de grau CG (SigmaAldrich), enquanto que o metanol utilizado na separao cromatogrfica e no preparo de
amostras foi de grau HPLC (JT Baker). A gua utilizada como fase mvel em todas as
anlises foi deionizada em sistema de gua ultra pura TKA com resistividade igual a
0,058 S.
36
Descrio
Filtrao de 5,0 mL de acetato de etila
Condicionamento Filtrao de 5,0 mL de metanol
Filtrao de 5,0 mL de gua deionizada
Extrao
Filtrao de 1,0 L de amostra em pH=3,0 (vazo aproximada: 5mL .
min-1)
Secagem
Aplicao de vcuo por 20 minutos
Eluio
Filtrao de duas alquotas de 5 mL de acetato de etila (vazo
aproximada: 1,0 mL . min-1)
A extrao foi realizada utilizando-se uma bomba de vcuo (Fanem) por meio da
fixao dos cartuchos em um sistema de manifold com capacidade para 16 estraes
simultneas (Figura 3.3). Para a etapa de eluio, tubos de ensaio de vidro (16,0 x 1,5
cm) foram utilizados para armazenar o acetato de etila eludo, conforme a tabela 4.2.
37
Figura 4.3 Sistema de extrao em fase slida utilizado para extrao dos analitos de
interesse das amostras ambientais.
38
O vial foi fechado e colocado sob uma temperatura constante de 75C durante 45
minutos.
O extrato derivatizado foi levado para anlise no CG-FID Varian CP 3380 no
39
40
e especificidade dos ons. Pode ser utilizado para obter uma larga variedade de
informaes analticas que so importantes para anlise estrutural (shimadzu). A Figura
4.5 mostra o diagrama de funcionamento do espectrmetro de massas de acordo com a
metodologia utilizada.
Figura 4.5 Diagrama esquemtico de funcionamento do espectrmetro de massas ontrap time-of-flight (fonte: Shimadzu, 2007)
No desenvolvimento da anlise cromatogrfica foi avaliada a deteco dos
compostos usando como fase mvel (FM) acetonitrila/gua e metanol/gua. Para isso
foram estudados trs parmetros: FM, vazo da FM e tipo de eluio (isocrtica ou
gradiente). A vazo da fase mvel escolhida foi 0,2 mL min-1 com a utilizao dos
solventes metanol/gua definida a partir da anlise dos picos dos compostos obtidos com
vazes que variaram entre 0,1 e 0,3 mL min-1. O mtodo de eluio por gradiente obteve
melhores resultados cromatogrficos. O volume de injeo foi mantido em 5 L durante
todas as anlises. Uma vez que a concentrao da amostra foi multiplicada por um fator
de 1000 vezes, grande quantidade e variedade de compostos orgnicos estiveram
presente no extrato, o que resultou em uma amostra de elevada complexidade. Devido a
isso, foi utilizada uma pr-coluna apenas, uma vez que a separao dos compostos no
ocorreria em colunas convencionais (colunas maiores). Para as anlises foram utilizadas
pr-colunas Phenomenex C18 (4,0 mm x 2,0 mm). A freqncia de troca ocorreu a cada
100 anlises aproximadamente, devido a durabilidade menor das pr-colunas. Maiores
informaes da anlise so apresentados na Tabela 4.4.
41
Pr-Coluna
Vazo da Fase Mvel
Gradiente de concentrao
(gua e metanol)
Shimadzu LCMS-IT-TOF
CBM-20A (Controlador de Sistema)
DGU-20A3 (Degaseificador)
LC-20AD (Propulso de Solventes)
SIL-20 (Injetor Automtico)
IT-TOF (Espectrmetro de massas)
Phenomenex C18 (ODS) (4,0 mm x 2,0 mm)
0,2 mL . min-1 (metanol e gua)
*Variao de 30 a 85% de metanol em 5 minutos;
*Estabilizao a 85% de metanol por 3 minutos;
*Aumento para 100% de metanol e estabilizao
por 8 minutos;
*Reduo para 0% de metanol e estabilizao por
2 minutos;
*Aumento para 30% de metanol e estabilizao
por 5 minutos.
Tempo total de anlise: 23 minutos.
5l (injeo automtica)
Argnio (gs de coliso)
Nitrognio (gs de nebulizao). Presso: 100kPA
200C
1,65 kV
Eletronspray ionization (ESI) - modo negativo
100 a 350
Nonilfenol: m/z = 219,17
Estradiol: m/z = 271,17
Etinilestradiol: m/z = 295,17
Nonilfenol: 30 milisegundos
Estradiol: 100 milisegundos
Etinilestradiol: 100 milisegundos
42
4.2.1. Estabilidade
A estabilidade das amostras e padres foi verificada em termos de temperatura e
tempo. Nesse trabalho foi construda uma curva analtica com novos padres a cada
anlise e os extratos eludos das amostras foram analisados em um perodo mximo de
43
15 dias. Alm disso, todos os padres e amostras foram conservados em freezer a -20C
e protegidos da luz, envoltos em papel alumnio.
A estabilidade dos padres foi analisada com cinco solues contendo os trs
compostos de interesse em concentraes de 5 a 400 g.L-1 em trs momentos
diferentes: logo que o padro foi preparado; depois de 1 ms de preparo; 24 horas aps
ter sido analisado, porm tendo ficado a temperatura e luz ambiente. A estabilidade das
amostras foi avaliada atravs da anlise do extrato da amostra do Rio das Velhas na
primeira campanha amostral em trs momentos: imediatamente aps ter preparado o
extrato; aps 1 e 6 meses que o extrato foi preparado e mantido sob as condies de
preservao (freezer a -18C).
4.2.2. Seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medio pelo detector selecionado, sem causar um sinal visvel no teste de
especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do
efeito tambm pode depender da sua concentrao (INMETRO 2007).
A seletividade do mtodo cromatogrfico foi determinada por meio da avaliao
da pureza dos picos cromatogrficos obtidos, tanto para os padres como para os
compostos presentes nas amostras, comparando-se os espectros de massas obtidos para
os padres empregados na calibrao do LC/MS com amostras que continham os
compostos. A avaliao foi feita por meio dos ons primrios (ms1) e secundrios (ms2)
obtidos para cada composto, portanto uma maneira segura de diferenciar o composto
analisado de um interferente presente na matriz (IMMETRO 2007; Ribani et al. 2004).
44
45
(1)
(2)
46
melhor caminho para resolver o problema de clculo destes limites foi utilizar o mtodo
descritos nas equaes 1 e 2. Neste trabalho ambos os limites de deteco e
quantificao foram determinados e calculados usando os softwares LCMS Solutions,
Microsoft Excel e Microcal Origin.
4.2.5. Preciso
A repetitividade geralmente dependente da concentrao do analito e, deste
modo, deve ser determinada para um diferente nmero de concentraes. O coeficiente
de variao (CV%) pode ser mais til neste caso, pois foi normalizado com base na
concentrao e deste modo ele praticamente constante ao longo da faixa de interesse,
contanto que esta no seja muito grande (INMETRO 2007). O Coeficiente de Variao
calculado de acordo com a equao 3:
CV = DP/CMD x 100
(3)
Onde:
DP = desvio padro;
CMD = concentrao mdia determinada
47
(4)
Onde:
Af = rea do composto de interesse na amostra fortificada aps todo o processo de
extrao e eluio (no vial);
Am = rea da amostra sem a fortificao (branco)
At = rea terica em relao quantidade de padro adicionado a amostra. Calculado
pela curva de calibrao.
48
(5)
onde:
C1 = concentrao determinada na amostra fortificada;
C2 = concentrao determinada na amostra no fortificada;
C3 = concentrao adicionada.
49
50
51
Alm de monitorar a qualidade da gua dos mananciais Rio das Velhas, Vargem
das Flores e Morro Redondo no que se refere presena de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol, a dissertao tambm buscou avaliar, ainda que de forma preliminar, a
ocorrncia dos PE estudados na gua parcialmente tratada (antes da etapa de
desinfeco). Para tanto, a partir de Junho de 2007, amostras foram coletadas no s na
entrada das ETAs dos trs mananciais avaliados, mas tambm aps a etapa de filtrao,
podendo assim, avaliar a eficincia do tratamento clssico (exceto desinfeco) na
remoo de E2, EE2 e NP. A eficincia de remoo foi calculada conforme a equao 6:
Eficincia de Remoo (%) = 100 (CAb - CAt)/CAb
(6)
onde:
CAt = concentrao determinada na gua aps o processo de filtrao;
CAb = concentrao determinada na gua bruta;
As amostras foram coletadas com o auxlio de um frasco previamente
ambientado com a prpria gua a ser coletada, ou diretamente em frascos de vidro mbar
de 1 litro de capacidade tambm ambientados. Em cada ponto de amostragem foram
coletados cerca de 3L de amostra. Em cada recipiente de amostragem foram adicionados
5mL de metanol para fins de inibio microbiana, e em seguida os frascos foram
fechados e colocados em caixa trmica com gelo para seu transporte. Durante todo o
perodo de amostragem foram utilizadas luvas de ltex e todas as amostras foram
preservadas a 4 C, em refrigerador, at a extrao dos compostos de interesse, o que foi
feito em at 48 horas da coleta.
Anterior ao processo de extrao das amostras de gua bruta, medidas de pH,
turbidez, cor verdadeira (fev/07 jan/08) e cor aparente (set/07 jan/08) foram feitas
para uma possvel correlao destes parmetros com as concentraes dos PE presentes
na amostra a partir de anlises estatsticas dos dados (Sousa et al. 2006). As anlises
fsico qumicas foram feitas baseadas na metodologia descrita no livro Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, considerado livro de referncia
para anlises em gua e efluentes (Eaton et al. 2005).
As extraes e eluies das amostras foram feitas em laboratrios devidamente
equipados para anlise de gua localizados no Departamento de Engenharia Sanitria e
Ambiental da UFMG (DESA-UFMG) por pessoas previamente treinadas para tal
funo. No laboratrio, alquotas da gua coletada foram preparadas para a extrao em
duplicata. As amostras foram previamente filtradas a vcuo em sistema tipo manifold
52
Figura 4.10 Local de amostragem para gua bruta do manancial Rio das Velhas
53
Entrada da ETA
(antes da prclorao)
Efluente do filtro
Ms
Fevereiro/07
Maro/07
Abril/07
Maio/07
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
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Entrada da ETA
(antes da prclorao)
Efluente do filtro
Ms
Fevereiro/07
Maro/07
Abril/07
Maio/07
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
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Entrada da ETA
(antes da prclorao)
Efluente do filtro
Ms
Fevereiro/07
Maro/07
Abril/07
Maio/07
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
57
5. RESULTADOS E DISCUSSES
Este captulo est estruturado em 4 partes de forma a apresentar os resultados de
acordo com as etapas descritas a seguir:
Criao de um mtodo analtico para CG-FID (testes preliminares) 1 parte. Neste
tpico ser mostrado apenas procedimentos iniciais de anlise dos PE por cromatografia
gasosa com detector de ionizao em chama. Durante os testes foram usados padres
sintticos e apenas quatro amostras de gua bruta e, devido aos resultados obtidos, no
foi desenvolvido um processo de validao para o mesmo.
Criao de um mtodo analtico para LCMS (completo) 3 partes. As anlises
utilizando a tcnica de cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas
obtiveram resultados satisfatrios e, portanto, foi desenvolvido todo o processo
necessrio para a utilizao do mtodo como padro para o monitoramento dos PE em
mananciais da RMBH. Os processos de desenvolvimento e validao do mtodo
analtico consistiram desde a etapa de pr-concentrao dos analitos a anlise
instrumental por LCMS-IT-TOF totalizando 3 partes: Desenvolvimento, validao e
monitoramento dos PE.
58
Para uma melhor separao dos picos, os padres de anlise foram preparados
em acetato de etila. Como este teste foi feito em maro de 2007 e o padro nonilfenol
mistura tcnica (n-nonilfenol) foi utilizado apenas no ltimo perodo de anlise
(Outubro/2007 a Janeiro/2008), apenas os padres 4-nonilfenol (4NP), estradiol (E2) e
etinilestradiol (EE2) foram utilizados no desenvolvimento do mtodo.
Os padres de E2, EE2 e 4NP foram preparados em cinco concentraes
diferentes (Tabela 5.1) na faixa de 50 a 185. mgL-1 a partir da soluo estoque
(1000mg.L-1).
Tabela 5.1: Tempo de reteno, rea obtida em relao concentrao e limite de
deteco dos compostos analisados por cromatografia gasosa.
Padres
4-Nonilfenol
(4NP)
17-Estradiol
(E2)
17-Etinilestradiol
(EE2)
Concentrao
(ppm)
184,93
123,28
92,46
84,06
52,84
166,67
111,07
83,33
75,73
47,66
166,67
111,07
83,33
75,73
TR (min)
reas
12,455
12,438
12,432
12,411
12,415
19,251
19,232
19,225
19,208
19,209
19,813
19,796
19,794
19,777
3691088
2078226
1435391
1238373
685394
1308655
711236
448051
350391
58367
360243
214430
130077
112679
Limite de deteco do
Equipamento
28,21mg.L-1
41,87 mg.L-1
36,62 mg.L-1
A Figura 5.1 mostra que no houve grande variao no tempo de reteno dos
compostos analisados (desvio padro de 0,015 min para EE2 e 0,018 min para 4NP e
E2), e a Figura 5.2 mostra que as curvas de calibrao obtidas tiveram uma boa
correlao linear. Portanto, para a faixa de concentrao analisada, h possibilidade
determinar por CG-FID a concentrao dos PE estudados.
A partir dos limites de deteco obtidos para cada composto, de acordo com a
Tabela 5.1 e a Figura 5.2, pode-se concluir que a senbilidade do 4-NP foi melhor, pois
ele resultou em maior coeficiente angular. O sinal obtido com o 4-NP foi o de maior
intensidade de resposta frente tcnica utilizada.
59
Figura 5.2 Curva de calibrao obtida com a mistura dos padres analisados.
Considerando que se pode obter, durante a tcnica de extrao em fase slida, um
fator de concentrao de 1000 vezes, os valores mnimos de nonilfenol, estradiol e
etinilestradiol que poderiam ser quantificados por CG-FID seriam de 28g.L-1, 41 g.L-1
e 36 g.L-1 respectivamente.
Apesar de o CG-FID resultar em relativamente baixos valores de deteco,
trabalhos internacionais como de Wang et al (2005) e Yang et al. (2006) quantificaram o
4-NP, o etinilestradiol e o estradiol em amostras de gua superficiais com concentraes
mximas de 50ng. L-1, inviabilizando assim o uso de GCFID para monitoramento
ambiental de guas superficiais. Contudo, a tcnica de extrao em C-18 seguida de
derivatizao e anlise por CG-FID, desde que validada, poderia ser utilizada no
monitoramento de estradiol, etinilestradiol e 4-nonilfenol presentes em amostras de
esgotos sanitrios, ou em experimentos de tratamento de gua em escala de bancada ou
piloto em que a gua fortificada com os padres resultando em concentraes mais
elevadas desses PE.
60
Quatro amostras teste do rio das Velhas foram utilizadas para verificao da
presena dos PE nas concentraes estabelecidas pelo mtodo. Uma amostra preliminar
(Rio das Velhas fev./2007) foi analisada por CG-FID, no sendo detectado nenhum dos
trs compostos de interesse nos limites obtidos pela a metodologia. Os resultados no
puderam ser diretamente comparados com anlises por LCMS devido ausncia do
equipamento no perodo que os ensaios foram feitos por CG-FID (fevereiro /2007).
Contudo, como ser visto posteriormente, o composto nonilfenol esteve presente de
forma consistente em todos os mananciais pesquisados, e provavelmente estava presente
na amostra analisada por CG-FID.
De acordo com os resultados obtidos em relao ao limite de deteco para a
tcnica utilizada, no foram feitos testes para validao e recuperao, pois a
metodologia no poderia ser utilizada para o monitoramento dos PE nos mananciais
escolhidos.
5.2. Cromatografia Lquida com Deteco por Espectrometria de massas Desenvolvimento do Mtodo Analtico
O mtodo analtico envolveu a extrao, concentrao dos analitos da amostra e a
sua determinao por LCMS-IT-TOF. H vrios mtodos descritos na literatura (Tabela
3.5), porm ainda no h nenhum mtodo padro para a determinao desses compostos
em matrizes aquticas. O que se encontra nos artigos dessa rea so procedimentos de
extrao e determinao aplicados a vrias classes de compostos, como os estrognios
(Lagan et al 2004) ou os fenis (Liu et al 2004a), por exemplo. Portanto, essa primeira
etapa do trabalho consistiu no desenvolvimento de um mtodo analtico compatvel com
os equipamentos utilizados, de forma a permitir a determinao simultnea de estradiol,
etinilestradiol e nonilfenol em guas superficiais.
Inicialmente foi estudada a melhor separao cromatogrfica para os trs analitos
(E2, EE2 e 4NP) usando eluio isocrtica com fase mvel composta por
acetonitrila/gua e metanol/gua, ambas com 75% de metanol ou acetonitrila e 25%
gua. A vazo de 0,2 mL.min-1 foi escolhida devido a melhor resoluo dos picos
obtidos em comparao s vazes de 0,1 e 0,3 mL.min-1. Para o estudo de eluio por
gradientes de fase mvel foram utilizados apenas os solventes metanol/gua j que
acetonitrila/gua obteve um baixo sinal de resposta.
61
62
63
Frmula
Molecular
C15H24O
Tempo de
Reteno
(min)
7,12
on Primrio
(ms1)
m/z (negativo)
219.17
4-nonilfenol
n-nonilfenol
C15H24O
6,65
219.17
Estradiol
C18H24O2
4,85
271.17
Etinilestradiol
C20H24O2
4,95
295.17
Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos ons precursores ms1 e ms (modos negativo)
caractersticos de cada composto.
No decorrer do trabalho, anterior as anlises de validao e monitoramento, foi
trocado o 4-nonilfenol (4-NP) por nonilfenol mistura tcnica (n-nonilfenol ou NP), uma
vez que a amostra ambiental continha outros ismeros de nonilfenol alm do 4-NP. A
troca dos padres foi feita no sentido de permitir a confirmao do tipo de nonilfenol
presente nas amostras, uma vez que o tempo de reteno dos ismeros de nonilfenol e a
64
intensidade do sinal observado no modo ms1 eram semelhantes. Dessa forma a distino
entre os padres foi baseada nos fragmentos de nonilfenol obtidos no modo ms2. O 4-NP
basicamente produzia apenas um tipo de fragmento (m/z = 106.04) enquanto que o NP
mistura tcnica produzia dois fragmentos de grande intensidade e bastante frequentes
nas amostras analisadas (m/z = 119.06 e 147.04). Esse resultado indicou que as amostras
analisadas continham, alm do 4-NP, outros ismeros de nonilfenol, o que tambm foi
observado por outros pesquisadores (Guenther et al. 2005).
As condies de preparo dos cartuchos de SPE e da pr-coluna foram avaliadas
usando a metodologia descrita nas Tabelas 4.2 e 4.4. As pr-colunas foram trocadas
quatro vezes devido a sua vida til ser menor em relao s colunas tradicionais, que so
a cada 120 anlises aproximadamente, ou em caso de uma separao ineficiente dos
compostos. As quatro pr-colunas utilizadas mantiveram-se adequadas ao uso durante
todo o perodo de trabalho. A verificao era feita com os padres em estudo onde era
avaliado o tempo de reteno e a intensidade dos ons obtidos.
5.3.1. Estabilidade
De acordo com as anlises para a verificao da estabilidade nos padres e
amostra em diferentes momentos, constatou-se que houve conformidade do sistema
cromatogrfico, ou seja, no ocorreu grande variao no tempo de reteno e nos
resultados obtidos para a concentrao das amostras. A Tabela 5.3 apresenta a variao
da concentrao dos compostos presentes na amostra Rio das Velhas (fevereiro e
dezembro de 2007). A estabilidade foi avaliada com a anlise da amostra imediatamente
eluda e aps um e seis meses de conservao (mantido em a -20 oC sob ausncia de
luz). As amostras foram analisadas de acordo com o procedimento descrito na Tabela
4.4, sendo que quantificao dos compostos E2 e EE2 foi feita por padro externo (Rio
das Velhas Fev/07) e interno (Rio das Velhas Dezembro/07). O NP foi quanticado
apenas por padronizao externa.
65
0
0
5.3.2. Seletividade
A seletividade do mtodo cromatogrfico empregado tambm foi verificada
injetando-se os brancos de laboratrio obtidos, e observando se havia ou no picos na
regio do tempo de reteno dos compostos de interesse, conforme descrito por Lanas
(2004b). A pureza dos picos cromatogrficos obtidos para os compostos identificados
nas amostras tambm foi avaliada, por meio da comparao dos respectivos espectros de
massas com aqueles obtidos para os padres.
De acordo com a Figura 5.5, no branco (metanol HPLC) observa-se a ausncia de
picos nos tempos de reteno de E2 e EE2 enquanto que um pico de baixa intensidade
aparece na regio do NP, que mostra a presena de interferentes durante a anlise. Como
pode ser observado na Figura 5.5, o interferente no apresenta os fragmentos
caractersticos (ms2) do NP (Tabela 5.2), confirmando que o pico apresentado no
matanol no se trata do alquilfenol em questo. Devido a presena do interferente, a
anlise de NP s deve ser feita com a confirmao de seus ons secundrios, pois a
presena de apenas um pico com m/z = 219,17 no suficiente para a caracterizao do
mesmo.
Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausncia de picos para E2, EE2
(Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presena de interfente no tempo de reteno do
NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito).
66
A Figura 5.6 apresenta uma amostra coletada na entrada da ETA Morro Redondo
qual foi adicionada os padres de E2, EE2 e NP nas concentraes de 100g.L-1 para
os estrognios e 200g.L-1 para o alquilfenol. De acordo com os picos obtidos para os
compostos (ms1 e ms2), o mtodo cromatogrfico seletivo para a maioria dos
compostos, tanto na determinao dos ons primrios quanto secundrios, pois a
presena dos espectros relativos dos PE utilizados confirmada na Figura 5.6. A
determinao empregando o detector de massas ion trap time of flight (IT-TOF),
possibilita a identificao no cromatograma, do pico referente ao analito de interesse, o
que feito pelo espectro de massas caracterstico de cada composto, uma vez que a
mquina obtm espectros de altssima resoluo. A comparao pode ser feita pelo
cromatograma dos picos obtidos nos cromatogramas da amostra de Morro Redondo
(Figura 5.6), gua bruta, onde foi adicionado 200 g.L-1 do NP e 100 g.L-1 de E2 e
EE2, comprovando, portanto, a capacidade de anlise dos PE nos analitos na matriz.
Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (gua bruta) com adio de estradiol e
etinilestradiol (100 g.L-1, quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 g.L-1, quadro da
direita).
67
processo de preparao). A fenolftalina pde ser usada como padro interno devido a
sua estrutura qumica ser semelhante a dos estrognios E2 e EE2, a alta sensibilidade de
anlise (tanto no modo negativo quanto positivo) e a sua ausncia nas amostras
localizadas na RMBH. Sendo assim, foi possvel obter a concentrao de E2 e EE2 a
partir da razo entre a rea dos estrognios com a rea da fenolftalena. Para a curva
analtica utilizando a padronizao interna e externa, foram consideradas apenas as reas
dos picos dos ons primrios, pois os espectros ms2 dos PE no apresentaram linearidade
durante a anlise.
Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) para cada um dos trs
padres foram determinados pelo mtodo baseado na relao sinal-rudo, no qual os
resultados so apresentados na Tabela 5.4.
Tabela 5.4 Faixa de trabalho, limite de deteco (LD) e limite de quantificao (LQ)
dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF.
Composto
4-nonilfenol c
n-nonilfenol d
17-Estradiol d
17-Etinilestradiol d
Faixa de trabalhoa
(mg . L-1)
0,030 a 0,400
0,030 a 0,400
0,005 a 0,200
0,005 a 0,200
LD b
(ng . L-1)
c
d
4,9
6,5
1,4
0,9
LQ b
(ng . L-1)
16,4
21,8
4,7
3,0
68
69
140000000
120000000
rea
100000000
80000000
Estradiol
Etinilestradiol
4-Nonilfenol
60000000
40000000
20000000
0
0
50
100
150
200
250
300
Concentrao (g/L)
Figura 5.7: Curvas analticas obtidas com solues-padro dos quatro padres de PE.
5.3.5. Preciso
A preciso instrumental (do mtodo cromatogrfico empregado) foi determinada
em condies de repetibilidade, isto , os resultados foram obtidos utilizando-se vrias
injees em uma mesma amostra, no mesmo laboratrio, com o mesmo equipamento e
mesmo operador, e em um curto intervalo de tempo (determinao feita em um nico
dia), atravs da injeo automtica em sete replicatas de duas solues-padro. A Tabela
5.6 fornece os coeficientes de variao calculados para as reas obtidos aps sucessivas
injees do padro.
De acordo com a Tabela 5.6, os coeficientes de variao foram inferiores a 20 %
para todos os compostos, apresentando-se prximos a 5 % para o estradiol e
etinilestradiol e de 12% para o nonilfenol. Esses valores foram considerados suficientes
para a anlise em solues padro, pois geralmente o valor mximo de CV definido de
acordo com o procedimento empregado, a concentrao na amostra, o tipo de matriz e a
finalidade do mtodo.
70
Tabela 5.6 Repetibilidade dos resultados obtidos para solues-padro dos trs PE
expressa por meio do coeficiente de variao (CV).
Composto
E2
EE2
NP
8,4
10,6
4,5
71
Tabela 5.7 Resultados dos testes de supresso realizados com amostras coletadas na
entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008).
E21
EE22
NP3
Fenolftalena
Substncia
a 2579879 39655940 11787781
21315526
rea mdia obtida pelo spike
b
2842807 42105894 11563345
22864172
rea terica
c
9,25
5,82
-1,94
6,77
Supresso (%)
1- Estradiol; 2 Etinilestradiol; 3 Nonilfenol
a
Valor subtrado da amostra sem adio.
b
Calculada atravs da equao obtida com a padronizao externa.
c
Calculado a partir da equao 4, item 4.2.6.
A utilizao da fenolftalena como padro interno pode ser usada para a correo
das reas de E2 e EE2, uma vez que a supresso dos estrognios e da fenolftalena foram
bastante semelhantes. De acordo com Ribani et al (2004), o mtodo de padronizao
interna extremamente til, especialmente pelo fato de que ela independe de pequenas
mudanas em variveis experimentais.
A padronizao interna muito utilizada para a quantificao dos compostos por
cromatografia lquida e gasosa (Gibson et al. 2007; Wang et al. 2005; Yang et al. 2006;
Zhang et al. 2006). Geralmente, compostos deuterados so utilizados para comparar seu
comportamento em relao aos no-deuterados, uma vez que possuem a mesma estrutura
e praticamente no esto nas amostras (Snyder 2007). Mas a dificuldade de importao e
o alto custo desses compostos dificultam a utilizao destes para tal fim em instituies
brasileiras. A utilizao da fenolftalena apresenta bons resultados obtendo uma boa
relao custo/benefcio sendo uma grande aliada na confiabilidade dos resultados
adquiridos.
Devido a estes fatores e a grande quantidade de NP nas amostras, no foi
observado seu efeito supressivo, uma vez que no houve diminuio da rea de seus
picos na amostra. Portanto, a curva de calibrao de nonilfenol no poder ser
determinada em funo do padro interno, pois a fenolftalena sofre o processo de
supresso e a sua utilizao pode comprometer os resultados. Pelos resultados obtidos,
os clculos de concentrao com base na fenoltalina como padro interno foram feitos
apenas com E2 e EE2. Em todas amostras que foram adicionadas fenolftalena como
padro interno foram observadas variaes de intensidade, confirmando o efeito
supressivo.
A Tabela 5.8 apresenta a variao do efeito supressivo da fenolftalena
encontrado em algumas amostras de gua bruta. Os resultados mostram que a variao
72
73
% Rec.
106,45
83,15
98,86
EE2 (ng.L-1)
C.Esp. C. Obs. % Rec.
20
21,75
108,75
100
79,77
79,77
200
165,61
82,80
NP (ng.L-1)
C.Esp. C. Obs. % Rec.
300
288
96
74
bem diferentes. O NP foi o composto que teve a maior divergncia dos 3 analisados,
sendo que o 4NP foi detectado com uma concentrao cerca de 30 vezes menor para o
mtodo ELISA em relao ao valor obtido por LCMS.
Em relao amostra Rio das Velhas fev/2008 podemos observar que as maiores
divergncias ocorreram em relao ao EE2 e E2. Apesar do valor de EE2 ter sido 10
vezes menor para o mtodo ELISA, vale salientar que o valor obtido por LCMS
encontra-se abaixo do Limite de Quantificao (3,0 g. L-1), podendo gerar valores
imprecisos. Quanto ao E2, o fato dele no ter sido detectado por LCMS e ter sido
detectado no kit ELISA pode ser devido ao mtodo ELISA no quantificar somente o
17-Estradiol durante a anlise do estradiol. De acordo com Nogueira (2003) e Farr et
al (2007) o mtodo ELISA pode sofrer interferncia de diversos estrognios como a
estrona, estriol e estradiol sendo que os traos de estrognios podem interferir nas
anlises de NP e vice versa, o que justificaria a concentrao mais elevada de NP na
amostra bruta e menor quantidade nos padres de NP comparados a metodologia do
LCMS. Portanto este fator pode explicar parte da discrepncia dos resultados obtidos.
Tabela 5.10 - Resultados obtidos pela calibrao interlaboratorial entre UFOP e CIRRA.
Amostras
Concentrao
terica
200g. L-1
200g. L-1
15g. L-1
15g. L-1
35g. L-1
35g. L-1
280 g. L-1
8,78 g. L-1
0,28 g. L-1
24,3 g. L-1
5,2 g. L-1
17,3 g. L-1
15,2 g. L-1
42 g. L-1
42 g. L-1
75
no pode ser detectado com grande eficincia. Considerando que a metodologia LCMS
analisa todos os ismeros de NP com m/z de 220,19 a dosagem de NP deveria ser mais
exata em relao ao mtodo de imunoensaio.
350
Precipitao (mm)
300
250
200
150
100
50
0
feb/07 mar/07 apr/07 may/07 jun/07
jul/07
76
77
-1
Concentrao (ng. L )
2000
1500
1000
500
Nonilfenol (n=72)
-1
Concentrao (ng. L )
60
50
40
30
20
10
0
Etinilestradiol (n=14)
Estradiol (n=14)
Figura 5.9: Box-plot da concentrao dos trs compostos determinados nos mananciais
estudados em todas as campanhas amostrais. gua Bruta.
78
Morro Redondo
Bruta gua Filtrada
42,8
N.A
41,8
N.A
40,1
N.A
176,6
N.A
318,8
5,7
329,2
226,8
865,7
151,5
747,3
565,4
554,3
229,4
310,2
265,3
575,6
577,8
605,5
472,1
79
2500
Concentrao (ng.L-)
2000
1500
1000
500
0
fev
mar
abr
mai
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
jan
80
Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas Nov. 2007 e
as diferentes fragmentaes (ms) de seus ismeros (esquerda). Exemplos de estruturas
qumicas de 5 dos 550 Ismeros de nonilfenol existentes (direita). Fonte: Guenther et al,
2005.
As concentraes encontradas para o NP so at de nove vezes maiores do que
quelas encontradas em mananciais de Campinas onde Raimundo (2007) utilizou a
tcnica de Cromatografia Lquida acoplada ao detector Arranjo de Diodo (HPLC-DAD)
para a deteco de nonilfenol (ismeros). Em relao aos trabalhos internacionais
publicados, a concentrao de NP encontrada nos trs mananciais estudados
semelhante aos valores encontrados em Roma (manancial no informado), Itlia (Lagan
et al. 2004) e corresponde a 30% dos valores mdios encontrados em Guangdong
(manancial no informado), China (Yang et al. 2006).
Apesar dos valores encontrados nas guas da Regio Metropolitana de Belo
Horizonte serem relativamente altos em comparao a maioria dos dados de
monitoramento apresentados na Tabela 3.5, vale salientar que o mtodo utilizado neste
trabalho quantificou todos os ismeros de nonilfenol presentes, utilizando o padro de
nonilfenol mistura tcnica, enquanto que alguns trabalhos quanticaram o NP com base
na presena do nonilfenol linear ou 4-NP (Kolpin et al. 2002; Wang et al. 2005). O 4-NP
no foi detectado na maioria das amostras analisadas nesse trabalho, e tal afirmao
81
baseada no monitoramento dos ons secundrios com valores de m/z iguais a 106.04,
especficos para o 4-NP.
A Figura 5.12 apresenta a variao da concentrao de NP ao longo do ano nos
trs locais de amostragem. A maior variabilidade foi verificada no reservatrio de
Vargem das Flores, onde se observou uma variabilidade na concentrao de NP em at 3
ordens de magnitude, enquanto que a menor diferena foi encontrada no Rio das Velhas
onde as concentraes mdias e mediana foram em torno de 250 ng. L -1. De Modo
geral, os trs locais apresentaram 75% dos dados com concentraes variando de 40 a
500 ng. L -1 mostrando que os trs locais apresentam semelhana quanto a quantidade de
nonilfenol.
2000
-1
Concentrao (ng.L )
1500
1000
500
Morro Redondo
(n=24)
82
100
90
Morro Redondo
80
70
60
50
40
30
20
10
0
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
jan
83
2008). A presena de tais emisses mostra que a atividade antrpica contribui para as
emisses de NP nas regies estudadas.
O E2 foi detectado em 14 das 72 amostras de gua bruta analisadas nesse
trabalho. A Tabela 5.12 e a Figura 5.14 apresentam as concentraes desse esteride
determinadas nas amostras durante as campanhas.
Tabela 5.12 - Concentrao de 17-estradiol (ng . L-1) encontrada durante as campanhas
de amostragem.
Concentrao (ng.L-)
Morro Redondo
Bruta gua Filtrada
< L.D.
N.A
< L.D.
N.A
< L.D.
N.A
6,2
N.A
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
8,5
5,9
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
84
85
Concentrao (ng.L-)
Morro Redondo
Bruta gua Filtrada
< L.D.
N.A
< L.D.
N.A
< L.D.
N.A
< L.D.
N.A
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
13,0
7,9
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
< L.D.
35,0
22,1
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
86
que possvel haver variaes na concentrao dos PE na gua bruta ao longo do dia.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
jan
Figura 5.16: ndice de remoo (gua bruta gua filtrada) de EE2 nas campanhas de
junho 2007 a janeiro 2008.
Um levantamento preliminar em relao presena do bisfenol A nos corpos
dgua foi avaliado no final da campanha de monitoramento, quando o padro de tal
composto foi adquirido. O bisfenol A uma substncia amplamente utilizada nos
processos industriais. A principal aplicao como monmero na produo de
policarbonato e resinas-epxi alm de aditivos de resinas de polister-estireno
insaturadas e retardantes de chama. Compostos persistentes biodegradao, possuem
um tempo de meia-vida em guas superficiais de 1 a 150 dias. A maior contribuio
devida aos processos de produo e manufatura do bisfenol A, despejos de efluentes
industriais sem tratamento adequado, e uma pequena contribuio pode ser atribuda
lixiviao dos produtos finais de consumo como embalagens plsticas (USEPA, 2001).
De acordo com as 12 amostras coletadas durante o perodo de janeiro de 2008,
em 100% dos casos foi confirmada a presena deste PE, inclusive aps o tratamento
(exceto desinfeco) nas ETAs. A Figura 5.17 apresenta a amostra de Rio das Velhas
onde pode ser observada a presena do composto e a estrutura qumica do Bisfenol A.
87
88
Figura 5.18: Anlise quimiomtrica das amostras referentes aos meses de jun/07 a
set/07 com base no PCA
Tabela 5.14 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (gua bruta).
Meses
Fevereiro/07
Maro/07
Abril/07
Maio/07
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
pH
7,8
8,1
7,4
7,6
7,4
6,8
7,8
6,8
6,0
5,9
6,3
6,1
Turbidez (uT)
11,5
14,3
67,5
5,7
3,6
4,3
6,9
5,4
13,1
217,0
56,1
93,3
N.A.: No analisado
89
Tabela 5.15 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (gua bruta).
Meses
pH
Fevereiro/07 7,6
7,8
Maro/07
7,2
Abril/07
7,9
Maio/07
Junho/07
7,1
Julho/07
7,3
Agosto/07
7,3
Setembro/07 7,1
Outubro/07
6,6
Novembro/07 7,6
Dezembro/07 7,2
Janeiro/08
6,8
Turbidez (uT)
4,7
2,3
4,8
2,7
1,4
2,1
3,9
N.A.
3,3
2,0
2,9
2,1
N.A.: No analisada
Tabela 5.16 Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o perodo de
fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (gua bruta).
Meses
Fevereiro/07
Maro/07
Abril/07
Maio/07
Junho/07
Julho/07
Agosto/07
Setembro/07
Outubro/07
Novembro/07
Dezembro/07
Janeiro/08
pH
7,4
7,8
7,2
7,5
7,9
6,9
7,6
6,9
6,4
7,6
6,6
5,8
Turbidez (uT)
3,2
3,6
3,9
1,9
1,3
0,7
0,7
0,6
2,1
2,1
2,5
18,1
N.A.: No analisado
90
Morro Redondo
8
7
pH
6
5
4
3
2
1
0
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
Dez
Jan
Figura 5.19: Variao do pH nas amostras de gua bruta dos trs mananciais durante o
perodo de monitoramento.
250
Morro Redondo
Turbidez (uT)
200
150
100
50
0
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
Dez
Jan
Figura 5.20: Variao da turbidez nas amostras de gua bruta dos trs mananciais
durante o perodo de monitoramento.
91
10000
Morro Redondo
1000
100
10
1
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
Dez
Jan
Figura 5.21: Variao da cor aparente nas amostras de gua bruta durante o perodo de
monitoramento nos 3 mananciais.
25
Morro Redondo
20
15
10
0
Set
Out
Nov
Dez
Jan
Figura 5.22: Variao da cor verdadeira nas amostras de gua bruta durante o perodo
de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais.
De acordo com a Tabela 5.14 e a Figura 5.19 pode-se observar que o pH
manteve-se na faixa de 6 a 8 durante todo o perodo de amostragem nos 3 mananciais
92
com uma mdia em torno de 7,1. A Tabela 5.15 e a Figura 5.17 mostram que os menores
ndices de turbidez foram encontrados nos locais de Vargem das Flores e Morro
Redondo (exceto janeiro 2008) onde ambos obtiveram uma mdia de 2,4 uT. Conforme
esperado, o Rio das Velhas (ambiente ltico) teve as maiores variaes de turbidez onde
foram encontrados valores de 3,6 uT (junho) a 217 uT (novembro). As mesmas
consideraes podem ser feitas para a cor aparente (Tabela 5.16 e Figura 5.18) que,
como esperado, teve grande correlao com a turbidez. A cor verdadeira, determinada
aps filtrao da amostra (Tabela 5.16 e Figura 5.21), manteve-se abaixo de 6,0 uC para
Morro Redondo e Vargem das Flores, enquanto que o Rio das Velhas obteve o valor
mdio de 12,5 uC chegando a um valor mximo de 20,0 uC durante o ms de novembro.
Este resultado tambm pode ser visto analisando-se a Figura 5.23 que apresenta a
anlise quimiomtrica dos dados de PCA, feita com a compilao dos parmetros
utilizados neste trabalho, com exceo da cor verdadeira, que s foi analisada nos meses
finais da campanha de monitoramento. De acordo com a Figura 5.23 podemos observar
que todos os parmetros so independentes entre si, com exceo da turbidez e cor
aparente, cujos valores da 1 e 2 componentes principais aparecem agrupados no grfico
PCA1 versus PCA2. Conforme discutido anteriormente, este resultado j era esperado.
PCA 2
0,25
C1
Cor Aparente
Estradiol
Etinilestradiol
Nonilfenol
PH
Turbidez
0,00
-0,25
-0,50
-0,75
-0,50
-0,25
0,00
0,25
0,50
0,75
PCA 1
Figura 5.23: Anlise da Componente principal (PCA) dos seis parmetros utilizados
para o monitoramento dos mananciais escolhidos.
93
Estradiol
Espcie e perodo
de exposio (dias)
Rato
(1 a 18)
Camundongo
(13 a 19)
Ratos
(uma gerao)
Etinilestradiol
Camundongo
(0 a17)
Dose
Efeitos
0,08 a 8
mg/kg/dia
(ingesto oral)
25 a 300
g/camundongo
(subcutneo)
0,003 a 4,12
mg/kg/dia
(ingesto oral)
0,002 a 200
g/kg/dia
(ingesto oral)
De 10 a 50 mg.Kg-1, reduo
dos testculos e epiddimo,
reduo do nmero de
espermas.
De 0,02 a 2 g/kg/dia:
diminuio da prstata
94
encontrados nas guas da RMBH encontraram-se bem abaixo dos valores supostamente
txicos estimados. Para os estradiis, sabidamente mais estrognicos que o nonilfenol,
os valores encontrados nos mananciais (3 a 54 ng.L-1 para E2 e 1,5 a 36 ng.L-1 para EE2)
caem dentro da faixa calculada como supostamente txica para a sade humana.
Contudo preciso salientar que tais compostos foram detectados em poucas amostras e
95
que toda essa anlise est sendo feita com os valores encontrados na gua bruta. Como
visto anteriormente o tratamento convencional remove parcilamente os PE estudados, e
bem provvel que a etapa final de desinfeco (no avaliada nesse estudo) consiga, de
forma efetiva, reduzir a concentrao de NP, E2 e EE2 para valores inferiores queles
considerados txicos. De qualquer forma estudos posteriores so necessrios para avaliar
se a clorao da gua consegue remover perturbadores endcrinos promovendo
simultaneamente reduo na estrogenicidade da gua.
96
6. CONCLUSES
O presente trabalho avaliou a presena de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol
em trs mananciais de abastecimento da regio metropolitana de Belo Horizonte
(RMBH). Este trabalho pode contribuir para o entendimento de uma rea onde dados
deste tipo de levantamento so escassos devido atualidade do tema. A partir da
identificao e monitoraramento de E2, EE2 e NP, considera-se este trabalho pioneiro
em Minas Gerais uma vez que a comunidade cientfica no dispe, at o momento, de
tais informaes.
De modo geral, os procedimentos analticos empregando amostragem, extrao
por SPE e anlise por LCMS se mostraram eficientes na determinao dos trs
compostos de interesse usando um volume de amostra igual a 1 litro. As concentraes
de 17-estradiol e 17-etinilestradiol e nonillfenol, presentes na faixa de nanogramas por
litro, s foram possveis de serem determinadas devido elevada sensibilidade e
seletividade obtida com o detector por espectrometria de massas on-trap - time-of-flight.
Devido aos teores encontrados nas guas, recomenda-se que as anlises sejam feitas por
este tipo de aparelho, pois obteve um limite de deteco aproximadamente mil vezes
menor em relao ao CG-FID, onde tambm foram apresentados excelentes parmetros
de linearidade e separao, mas um alto limite de deteco.
Os parmetros de validao verificados para o procedimento proposto
aumentaram a confiabilidade dos resultados apresentados, uma vez que ainda no se tem
um mtodo oficial para a determinao simultnea desses compostos. Esse procedimento
poder ainda servir como base para se iniciar estudos de monitoramento desses
compostos em diversas matrizes aquticas e, futuramente, adicionar outros compostos
como o bisfenol-A que foi detectado em anlises preliminares nas amostras do ms de
janeiro 2008.
O alquilfenol NP foi o composto que esteve presente em todas amostras em
concentraes elevadas (44 a 1900 ng.L-1) quando comparado com a literatura
internacional. Por sua vez, os hormnios E2 e EE2 foram identificados em apenas 15%
das amostras na faixa de concentrao de 3 a 54 ng.L-1 para o E2 e de 1,5 a 36 ng.L-1
para o EE2.
Em relao remoo dos compostos aps o processo de pr-clorao,
coagulao, sedimentao e/ou filtrao, utilizado nas ETAs estudadas, observou-se que
tais operaes unitrias no removeram completamente os perturbadores NP, E2 e EE2,
97
98
7. PERSPECTIVAS
Para trabalhos futuros, sugere-se um estudo mais abrangente da presena de NP,
E2 e EE2 em outros corpos dgua, como guas subterrneas, por exemplo, uma vez que
muitos municpios utilizam essa fonte para abastecimento pblico. Tambm seria
interessante um estudo que avaliasse a eficincia das estaes de tratamento de gua e
esgoto com relao remoo destes compostos, bem como a aplicao de mtodos de
tratamento
complementares
que
promovam
degradao
completa
desses
contaminantes.
A avaliao da capacidade de biodegradao das substncias nas guas naturais
brasileiras e a formao de derivados mais ou menos txicos que os compostos originais
tambm poderiam ser melhores estudadas futuramente. E finalmente, devido a presena
de E2, EE2 e NP nas amostras durante o monitoramento, sugere-se um levantamento de
outros possveis compostos, preferencialmente fenis, devido a presena de nonilfenol e
bisfenol A. Um novo levantamento preliminar poderia ser feito utilizando mtodos de
varredura mais amplos (m/z de 100 a 5000 por exemplo) nos dois modos de deteco
por espectrometria de massas (positivo e negativo).
99
8. REFERNCIAS
AFH
Anantomia
e
Fisiologia
Humanas,
[http://www.afh.bio.br/endocrino/endocrino1.asp], acessado em abril de 2007
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