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Western Blot (Immunoblot)

Técnicas sorológicas e de biologia molecular no diagnóstico de agentes infecciosos

Dr. Carlos Prudencio

MV, MSc, DSc Genética Pós-doutorado Biotecnologia Pós-doc FMVZ/USP

 

VANTAGENS

 

Alta sensibilidade e especificidade;

 

Reconhecimento de antígenos individuais em um extrato;

Realização

de

perfil

de

reconhecimento

de

antígenos

Cinética de expressão de proteínas celulares

 

Determinação de proteínas imunodominantes;

 

ETAPAS PARA EXECUÇÃO DA TÉCNICA

 

1.

Amostras

2.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

 

3.

Transferência (Blotting)

 

4.

Marcação

5.

Detecção

6.

Imagens

7.

Análises de Imagens

 

20/03/2012

INTRODUÇÃO

Conceito: técnica analítica

Reagentes comerciais

Areas de bnol, bioquímica e imunologia

Relacionado à tecnicas de ELISA e IF

Western blot, Southern blot, Northern blot

DESVANTAGENS

Custo médio a alto;

procedimento

longo

e

diversos pontos;

propenso a erros em

dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

1 - PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

Sonicação ou força mecânica
Sonicação ou
força mecânica
Be gentle! Stay cool!
Be gentle! Stay
cool!

Aula do Prof. João

Quantificação

EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

Detergentes

Lise por congelamento e descongelamento

Shock osmótico

Ultrasonicação

Métodos mecânicos

Digestão enzimática

Tampões de lise e kits de preparação de amostras

Proteção de amostras

Limpeza de amostras (Sample clean up)

Quantificação

ELETROFORESE

• ETAPA 2
• ETAPA 2

CH 2 = CH

 

|

C

= O

-

CH 2 -

CH - CH 2 - CH

 

-

CH 2 -

CH -

 

|

|

|

[ monômeros] determina

 

|

C = O

C

= O

 

C

= O

tamanho dos poros

NH

2

Acrilamida

|

NH 2

|

NH

|

 

|

NH 2

 
  CH | NH 2
  CH | NH 2
 

CH

|

NH

2

  CH | NH 2
CH 2 = CH

CH 2 = CH

|

 

|

C

= O

C=O

- CH 2 - CH -
-
CH 2 -
CH -

|

|

 

-CH

- CH 2 -CH

 

NH

|

C

 

|

C

= O

= O

|

= O

|

CH

2

|

|

NH

NH

2

 

NH 2

 

|

C=O

|

|  
 

CH 2 =CH

Metileno

 

bisacrila

 

mida

(30 % acrilamida (29 acrilamida: 1 bisacrilamida))

 

TAMANHO DO PORO

20/03/2012

2 - ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

TAMANHO FORMA E/OU CARGA.

Mr >5000 ATÉ<200 000.

ETAPA 2

- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) TAMANHO FORMA E/OU CARGA. Mr >5000 ATÉ<200 000. •
GEIS DE POLIACRILAMIDA BISACRILAMIDA CROSS LINK
GEIS DE POLIACRILAMIDA
BISACRILAMIDA
CROSS LINK

ACRILAMIDA

(UNIDADE

MONOMÉRICA)

TAMANHO DO PORO

POLIACRILAMIDA (30% acrilamida; 0,8% N,N´-metilenobisacrilamida, 1 00ML)

T- concentração total de acrilamida

T= (a+b) x 100 = (30+0,8) X 100 = 30%

V

100mL

C - porcentagem de crosslinker

C = b x 100 = 0.8 X 100 =

a + b

30.8

2,6%

POLI
POLI

Solução estoque de Acrilamida e Bisacrilamida 30% T; 2,6% C

(30% acrilamida; 0,8% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML)

(30% acrilamida; 1% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML) (49% acrilamida; 0,5% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML)

Eletroforese

Desnaturante

+

- -
-
-

+

+

– Separação por peso molecular • Não redutora SDS • Redutora DTT – Pontes S-S
– Separação por peso molecular
• Não redutora
SDS
• Redutora
DTT
– Pontes S-S
BMERCAPTANOL

Não desnaturante (Nativa)

Separação por carga, peso e

forma

DTT – Pontes S-S BMERCAPTANOL • Não desnaturante (Nativa) – Separação por carga, peso e forma
SDS - DTT- bM
SDS -
DTT-
bM

ACRILAMIDA

ACRILAMIDA

Sistema descontinuo

Sistema descontinuo
Sistema descontinuo
Sistema descontinuo

20/03/2012

PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

Amostra
Amostra

Preparo tampão da amostra

PREPARACAO DO GEL

PREPARACAO DO GEL

TAMPÕES

TAMPÕES

PROCESSO

PROCESSO FIXAR AMPERAGEM NÃO FIXAR VOLTAGEM

FIXAR AMPERAGEM

NÃO FIXAR VOLTAGEM

Transferência em Tanque

Transferência em Tanque

Transferência

Transferência

20/03/2012

3 - TRANSFERÊNCIA (BLOTTING)

3 - TRANSFERÊNCIA (BLOTTING)

ELETRO-TRANSFERÊNCIA: Semi-dry- SEMI SECO

ELETRO-TRANSFERÊNCIA: Semi-dry- SEMI SECO
Membranas
Membranas

Controle de transferência

Controle de transferência

A) Bloqueio: Proteínas

A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS
A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS
A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS
A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS
A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS
A) Bloqueio: Proteínas EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS

EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS

Anticorpos Primários

Anticorpos Primários SOROLOGIA: AMOSTRAS A SEREM TESTADAS
Anticorpos Primários SOROLOGIA: AMOSTRAS A SEREM TESTADAS

SOROLOGIA: AMOSTRAS A SEREM TESTADAS

20/03/2012

4 - IMUNOMARCAÇÃO

4 - IMUNOMARCAÇÃO Passos: Bloqueiro >>>>Anticorpo Primário >>>>Anticorpo secundário

Passos: Bloqueiro >>>>Anticorpo Primário >>>>Anticorpo secundário

Bloqueio: Detergentes como agentes de bloqueio

Bloqueio: Detergentes como agentes de bloqueio EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS AUMENTAR ESTRINGÊNCIA BLOQUEIO E LAVAGENS

EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS AUMENTAR ESTRINGÊNCIA BLOQUEIO E LAVAGENS

Anticorpos Secundários

Anti - Anticorpos

Tipos de anticorpos

Monoclonais

Policlonais

Enzimas Conjugadas Antígeno
Enzimas Conjugadas
Antígeno

Enzimas

Alkaline phosphatase (AP)

Horseradish peroxidase (HRP).

Fluorophores

Biotinylated secondary antibodies:

Gold-conjugated antibodies:

Radioisotopes:

Amplificação: Biotina/Estreptavidina

Amplificação: Biotina/Estreptavidina AUMENTA SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE

AUMENTA SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE

5 - DETECÇÃO

5 - DETECÇÃO

20/03/2012

AP e HRP = Amplificação/Sensibilidade

AP e HRP = Amplificação/Sensibilidade

Etapas de incubação/lavagens

Etapas de incubação/lavagens

MECANISMO QUÍMICO DE DETECÇÃO

MECANISMO QUÍMICO DE DETECÇÃO DAB /HRP NBT/BCIP/AP LUMINOL

DAB /HRP

NBT/BCIP/AP

LUMINOL

Mechanism of detection chemistries

Mechanism of detection chemistries

Colorimetric HRP systems

Colorimetric HRP systems

6 - IMAGENS

6 - IMAGENS Digital imaging Chemiluminescence detection using film Autoradiography ImageQuant LAS 4000. Sistema de Imagem
6 - IMAGENS Digital imaging Chemiluminescence detection using film Autoradiography ImageQuant LAS 4000. Sistema de Imagem

Digital imaging Chemiluminescence detection using film Autoradiography

ImageQuant LAS 4000. Sistema de Imagem Multifuncional

Typhoon FLA 9500

detection using film Autoradiography ImageQuant LAS 4000. Sistema de Imagem Multifuncional Typhoon FLA 9500

20/03/2012

Colorimetric AP Systems

Colorimetric AP Systems

Colorimetric detection systems

Colorimetric detection systems

7 - ANÁLISES DE IMAGENS

7 - ANÁLISES DE IMAGENS

DETERMINAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE INTERESSE

e
e

-Acompanhar purificação de proteínas -Acompanhar expressão de proteínas (Western blot)

-Isolar proteínas para análise por MS

COLORIMETRIC DETECTION

densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.
densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.
COLORIMETRIC DETECTION densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.
COLORIMETRIC DETECTION densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.
COLORIMETRIC DETECTION densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.
COLORIMETRIC DETECTION densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.

Anticorpos Fluorescentes: Multiplex

is less sensitive than chemiluminescence.

Fluorescentes: Multiplex is less sensitive than chemiluminescence. Multiplos Ags Mesmoo MW Pts de alta e baixa

Multiplos Ags Mesmoo MW Pts de alta e baixa abundancia

20/03/2012

ANÁLISES DE IMAGENS

Normalização com controle constitutivo
Normalização com controle constitutivo

Chemiluminescent detection

LUNINOL
LUNINOL

SENSIBILIDADE

ALTO CUSTO

REAPROVEITÁVEL

Chemiluminescent detection LUNINOL  SENSIBILIDADE  ALTO CUSTO  REAPROVEITÁVEL
HIV
HIV

A western blot is also used as the definitive test for Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease').

used as the definitive test for Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow
used as the definitive test for Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow

Western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection.

[S26]
[S26]
used as a confirmatory test for Hepatitis B infection. [S26] Cirrhosis of the liver as a

Cirrhosis of the liver as a result of Hepatitis B infection

Western blot - Hepatitis B Virus pre S2 Antigen antibody

CRPRUDENCIO@USP.BR

MUITO OBRIGADO!!

20/03/2012

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting.

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting . Description of lanes: Lane 1 -

Description of lanes:

Lane 1 - molecular weight marker Lane 2 - positive patient sample Lane 3 - positive patient sample Lane 4 - monoclonal antibodies for 39 and 41kD bands Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD band Lane 6 - monoclonal antibodies for 39 and 41kD bands Lane 7 - monoclonal antibodies for 31 and 34kD bands Lane 8 - positive control pool

Borrelia burgdorferi CDC Lyme disease reactive Western blot
Borrelia burgdorferi
CDC
Lyme disease reactive Western blot

In veterinary medicine, western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats.

Feline immunodeficiency virus

In veterinary medicine, western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats. Feline immunodeficiency