Componetes Vino

TESIS DOCTORAL
Estudio analtico de compuestos

voltiles en vino.
Caracterizacin quimiomtrica de
distintas denominaciones de origen
M Trinidad Cedrn Fernndez
TESIS DOCTORAL
Estudio analtico de compuestos

voltiles en vino.
Caracterizacin quimiomtrica de
Universidad de La Rioja
Servicio de Publicaciones
2004
Esta tesis doctoral, dirigida por las doctoras D. Cecilia Senz Barrio y D. Susana Cabredo Pinillos, fue leda el 6 de
mayo de 2004, y obtuvo la calificacin de Sobresaliente Cum Laude por Unanimidad.
Edita: Universidad de La Rioja

Servicio de Publicaciones
ISBN 84-689-0190-3
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE QUMICA
ESTUDIO ANALTICO DE COMPUESTOS VOLTILES

EN VINO. CARACTERIZACIN QUIMIOMTRICA DE
DISTINTAS DENOMINACIONES DE ORIGEN
Memoria presentada en la Universidad de La Rioja

para optar al Grado de Doctor por M Trinidad
Cedrn Fernndez
Marzo 2004
Este trabajo se ha subvencionado parcialmente con los

proyectos de investigacin API-99/A17 y API-00/A28,
concedidos por la Universidad de La Rioja.
Un experto es aqul que ya ha

cometido todos los errores posibles
en una materia muy concreta.
Niels Henrik David Bohr, fsico dans
(1885-1962).
PREFACIO
Los problemas tcnicos originados al aplicar el concepto de calidad
en la elaboracin del vino, entendidos como el cumplimiento de las
especificaciones establecidas por la normativa vigente para cada
Denominacin de Origen, pueden resolverse de un modo cientfico,
mediante las aportaciones de la Qumica Analtica al conocimiento del vino
y sus constituyentes. Dentro de estos parmetros, se consideran de
especial relevancia los compuestos voltiles responsables del aroma. Por
ello, el conocimiento de este producto, en relacin a la composicin
aromtica, tiene la finalidad de asegurar la limpieza, modo de elaboracin y
envasado e incluso evitar fraudes y falsificaciones que surgen como
competencia de mercado.
El objetivo principal de este trabajo ha sido profundizar en el
conocimiento del vino poniendo a punto un mtodo que permita analizar
compuestos voltiles. Este sistema elimina el gran inconveniente del
anlisis sensorial, que tradicionalmente se ha utilizado para caracterizar los
aromas y que no es otro que la subjetividad propia de cada catador. La
relevancia de esta aportacin reside en la aplicabilidad de esta tecnologa
al proceso de elaboracin, a la certificacin de calidad de cara al consumo
y como consecuencia de sto a la salud de la poblacin.
Solamente en pocas recientes, los mtodos analticos han permitido
poner en prctica el estudio mencionado para la determinacin de
compuestos minoritarios.
En la primera parte de este trabajo se han descrito tanto las tcnicas

de separacin y preconcentracin ms modernas (SPME o microextraccin
en fase slida, SPE o extraccin en fase slida y microextraccin por
desmezcla), as como otras mas convencionales que se siguen utilizando
como mtodos de referencia (ELL o extraccin lquido lquido), hacindose
un estudio comparativo entre ellas. Cabe resaltar los resultados obtenidos
con SPME, que adems de ser una tcnica rpida, fcil y verstil, puede
considerarse eficaz y fiable, por lo se est imponiendo su uso en
numerosos campos.
Los compuestos voltiles seleccionados, se eligieron por
considerarse representativos de distintos grupos qumicos, adems de
valorar su influencia y contribucin al aroma final del vino.
La segunda parte del trabajo trata de un estudio estadstico dirigido
a la caracterizacin y tipificacin del vino de distintas zonas vitivincolas.
Aplicando sencillos conocimientos quimiomtricos, como son el Anlisis
Discriminante, el Anlisis Cluster y el Anlisis de
Componentes
Principales, hemos conseguido relacionar vinos entre s, en cuanto a sus
caractersticas, referidas a su contenido en voltiles. Siguiendo este
procedimiento, cabe la posibilidad de crear un modelo que permitiera situar
un vino dentro de su Denominacin geogrfica.
A pesar del tiempo y del esfuerzo dedicado a esta investigacin, me
produce un gran respeto e incluso cierto temor, reducir algo tan sutil como
el aroma de un vino a una coleccin de grficos, frmulas y variables. El
vino siempre ha sido para la cultura occidental un producto mgico, casi
espiritual, que ya elaboraban egipcios, griegos o romanos y que ha ido
perfeccionndose lentamente, paso a paso, generacin tras generacin
con las aportaciones de annimos agricultores y criadores.
Si tan solo un vaso de bon vino" es el pago que nuestro poeta ms
ilustre consideraba apropiado por escribir el primer poema en lengua
castellana:
"Quiero fer una prosa en romn paladino,

en cual suele el pueblo fablar con su vezino,
ca non so tan letrado por fer otro latino
bien valdr, como creo, un vaso de bon vino"
(Gonzalo de Berceo. Milagros de Ntra. Seora)
un buen pago por este trabajo sera que pudiera contribuir, siquiera
mnimamente, a mejorar ese vaso de buen vino que ya se elaboraba en
estas tierras desde tiempo inmemorial, aunque todava quede mucho por
aprender.
AGRADECIMIENTOS
A todos los profesores que han contribuido y permitido realizar esta
Tesis, por los medios tcnicos que han puesto a mi disposicin, por la
ilusin que surgi en lo que hacamos, por las ideas, apoyo y por la
confianza que mostraron en m, sobre todo mis directoras de tesis: Ceci y
Susana, que son las que me han enseado todo lo que s de Qumica
Analtica.
A todos los compaeros que me han prestado su inestimable ayuda y
disposicin, tanto en los trmites entretenidos como en los tediosos, que
participaron en trabajo, cafs y charlas y que me ha dado la oportunidad de
conocerles, llegando a tener una gran amistad.
As mismo me gustara hacer constar mi agradecimiento al
Departamento de Qumica, sin cuyos medios no hubiera podido realizar
este trabajo, y tambin a los diferentes Consejos Reguladores de las
distintas Denominaciones de Origen, sobretodo al de La Rioja, sin cuyo
apoyo no hubiera conseguido todas las muestras para el estudio.
Y por ltimo, a la persona y personitas a las que dedico esta
memoria, ya que me brindaron su apoyo en todo momento y me animaron
en los tiempos ms duros, a vosotros, mi familia, por estar ah.
A todos, estoy para siempre agradecida.
A Julio, Lucas y Laura
Soy de las que piensan que la ciencia tiene una

gran belleza. Un sabio en su laboratorio no es
solamente un terico, es tambin un nio
colocado ante los fenmenos naturales que le
impresionan como un cuento de hadas.
Marie Curie
ndice general
Parte I: MTODOS DE EXTRACCIN Y DETERMINACIN
Captulo 1: Introduccin
1.- Introduccin ......................................................................... 7
1.1.- Historia del vino ......................................................................8
1.2.- Componentes del vino ..........................................................17
1.2.1.- Componentes de sabor azucarado.............................17
1.2.2.- Componentes de sabor cido.....................................18
1.2.3.- Componentes de sabor salado...................................18
1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente............19
1.2.5.- Otros componentes ....................................................20
1.3.- El aroma del vino .........................................................21
1.4.- Compuestos responsables del aroma del vino ............26
1.5.- Determinacin de los compuestos aromticos ............31
1.5.1.- Tcnicas de aislamiento o separacin........................31
1.5.2.- Tcnicas de determinacin.........................................34
Captulo 2: Objetivos
2.- Objetivos.............................................................................................. 47
Captulo 3: Instrumentacin y reactivos
3.- Instrumentacin y reactivos .....................................................51
3.1.- Instrumentos y aparatos .......................................................51
3.1.1.- Determinaciones cromatogrficas ..............................51
3.1.2.- Determinaciones por CG-Masas ................................51
3.1.3.- Acoplamiento CG-EAM UV-Visible.............................54
3.1.4.- Otros aparatos y materiales........................................55
3.2.- Reactivos ..............................................................................57
3.2.1.- Patrones de compuestos voltiles ..............................57
3.2.2.- Disolventes .................................................................57
3.2.3.- Sales...........................................................................58
Captulo 4: Ensayos previos y optimizacin del mtodo

cromatogrfico
4.- Ensayos previos y optimizacin del mtodo
cromatogrfico ...........................................................................63
4.1.- Asignacin de seales y eleccin de compuestos ...............63
4.2.- Eleccin del patrn interno ...................................................71
4.3.- Eleccin del disolvente .........................................................72
4.4.- Condiciones cromatogrficas. Optimizacin del mtodo......73
4.4.1.- Caudal de gases ........................................................74
4.4.2.- Columna cromatogrfica ...........................................75
4.4.3.- Programa de temperatura ..........................................77
4.4.4.- Volumen de inyeccin ................................................80
4.4.5.- Condiciones ptimas ..................................................81
4.5.- Caractersticas analticas .....................................................83
4.6.- Mtodos de cuantificacin ....................................................86
4.6.1.- Rectas de calibrado....................................................87
4.6.2.- Patrn interno .............................................................87
4.6.3.- Comparacin entre los mtodos de cuantificacin.....88
4.7. Clculo de los rendimientos de extraccin ............................89
Captulo 5: Procedimientos de extraccin empleados

5.- Procedimientos de extraccin empleados ................................ 93
Captulo 6: Extraccin lquido-lquido en discontinuo
(ELLd)
6.- Extraccin lquido-lquido en discontinuo (ELLd) ................... 97
6.1.- Introduccin ..........................................................................97
6.2.- Procedimiento operativo.......................................................99
6.3.- Optimizacin de variables ..................................................100
6.3.1.- Disolvente.................................................................101
6.3.2.- Volumen de muestra ................................................104
6.3.3.- Condiciones ptimas ................................................105
6.4.- Caractersticas analticas ...................................................106
6.5.- Cuantificacin en muestras de vino real.............................107
6.5.1.- Rectas de calibrado..................................................108
6.5.2.- Patrn interno ...........................................................108
Captulo 7: Extraccin lquido-lquido en continuo

(ELLc)
7.- Extraccin lquido-lquido en continuo (ELLc) ...................... 113
7.1.- Introduccin ........................................................................113

7.2.- Material especfico..............................................................113
7.3.- Procedimiento operativo .....................................................114
7.4.- Optimizacin de variables...................................................114
7.4.1.- Disolvente .................................................................115
7.4.2.- Tiempo de extraccin ...............................................117
7.5.- Caractersticas analticas....................................................120
7.6.1.- Rectas de calibrado................................................121
7.6.2.- Patrn interno.........................................................121
Captulo 8: Extraccin lquido-lquido con ultrasonidos

(ELLus)
8.- Extraccin lquido-lquido con ultrasonidos (ELLus) ...........127
8.1.- Introduccin ........................................................................127
8.2.- Procedimiento operativo .....................................................128
8.3.1.- Disolvente .................................................................129
8.3.2.- Sales.........................................................................132
8.3.3.- Otras variables..........................................................134
Captulo 9: Microextraccin por desmezcla

I: Detector FID
9.- Microextraccin por desmezcla.
I: Detector FID ....................................................................... 143
9.1.- Introduccin ........................................................................143
9.2.- Procedimiento operativo .................................................144
9.3.1.- Tipo y volumen de disolvente ...................................146
9.3.2.- Tipo y cantidad de sal...............................................150
9.3.3.- Tiempo de agitacin .................................................153
9.5.1.- Rectas de calibrado ..................................................157
9.5.2.- Patrn interno ...........................................................157
9.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos ...................159
Captulo 10: Microextraccin por desmezcla

II: Detector de absorcin molecular UV-Visible
10.- Microextraccin por desmezcla.
II: Detector de absorcin molecular UV-Visible ................165
10.1.- Introduccin ......................................................................165
10.2.- Procedimiento operativo...................................................167
10.3.- Optimizacin de variables ................................................168
10.4.- Caractersticas analticas .................................................178
10.5.- Clculo de rendimientos ...................................................180
Captulo 11: Extraccin en fase slida (SPE)

11.- Extraccin en fase slida (SPE) .............................................. 183
11.1.- Introduccin ......................................................................183
11.3.1.- Volumen de muestra .............................................189
11.3.2.- Volumen de elucin ................................................191
11.3.3.- Condiciones ptimas ..............................................192
11.5.- Cuantificacin en muestras de vino real...........................193
11.5.1.- Rectas de calibrado................................................194
11.5.2.- Patrn interno .........................................................195
11.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos de
extraccin ............................................................................196
Captulo 12: Microextraccin en fase slida (SPME)

12.- Microextraccin en fase slida (SPME) .............................201
12.1.- Introduccin ......................................................................201
12.3.- Estudios previos ...............................................................213
12.6.- Cuantificacin en muestras de vino real...........................224
Captulo 13: Estudio comparativo de los distintos

mtodos de extraccin empleados
13.- Estudio comparativo de los distintos mtodos de
extraccin empleados ..................................................................229
Parte II.- APLICACIN QUIMIOMTRICA

Captulo 14: Introduccin
14.- Introduccin ...........................................................................239
Captulo 15: Objetivos
15.- Objetivos ................................................................................249
Captulo 16: Procedimiento experimental
16.- Procedimiento experimental ................................................253
16.1.- Estudio de vinos de distinto tipo .......................................253
16.1.1.- Anlisis en componentes principales......................257
16.1.2.- Anlisis lineal discriminante....................................262
16.1.3.- Anlisis cluster........................................................268
16.2.- Estudio preliminar con vinos de distinta Denominacin ...270
16.2.3.- Anlisis cluster........................................................281
16.3.- Estudio ampliado con vinos de distinta Denominacin.....283
16.3.3.- Anlisis cluster........................................................291
Captulo 17: Conclusiones

17.- Conclusiones .........................................................................295
BIBLIOGRAFA Y APNDICES
- Bibliografa.................................................................................299
- Apndices ..................................................................................331
Apndice A.- Constantes cromatogrficas .............................331
Apndice B.- Tiempos de retencin ........................................333
Apndice C.- Representaciones CG-Masas............................335
Apndice D.- Rectas de calibrado en diclorometano...............343
Apndice E.- Rango de concentraciones en vino real y
frmulas de los compuestos voltiles ........................................353
Apndice F.- Programas BASIC utilizados .............................355
Apndice G.- Resultados quimiomtricos.

Distinto tipo de vino ....................................................................359
Apndice H.- Resultados quimiomtricos.
Distinta denominacin de origen (estudio preliminar).................381
Apndice I.- Resultados quimiomtricos.
Distinta denominacin de origen (estudio ampliado).................. 403
Apndice J.- Tablas y figuras ..................................................438
PARTE I: MTODOS DE EXTRACCIN Y

DETERMINACIN
Las operaciones previas a la introduccin de la muestra en el sistema

cromatogrfico constituyen un aspecto muy importante y de gran transcendencia.
Las dificultades en este tipo de preparaciones y los errores que pueden originarse
en esta etapa previa pueden ser ms determinantes que los que se derivan del
proceso cromatogrfico propiamente dicho.
La tcnica instrumental empleada es la Cromatografa de Gases (CG),
donde la muestra inyectada debe ser representativa de la muestra total, evitndose
su deterioro (como es en nuestro caso la volatilizacin, la descomposicin qumica
o trmica, la accin microbiolgica, etc.) desde su adquisicin, hasta la
introduccin en el sistema cromatogrfico.
La preparacin de la muestra para CG comprende una serie de
operaciones, cuya funcin principal es la de adecuar y conservar la porcin de
muestra tomada para su introduccin en la unidad de inyeccin del cromatgrafo
de gases. El vino se trata de una muestra compleja, y esto junto con que los
requerimientos exigidos son cada vez ms elevados supone un reto importante
para la Qumica Analtica. En general, son escasas las muestras que pueden
introducirse directamente en el cromatgrafo, por lo que es preciso, casi siempre,
alguna operacin previa, como ha sido nuestro caso.
Con la finalidad de evitar dificultades derivadas de la complejidad de la
matriz las operaciones realizadas son, en general, procesos fsico-qumicos en los
que se emplean dos fases, para llevar a cabo una separacin, con o sin
preconcentracin. Los mtodos que se van a utilizar en este trabajo, y que se vern
con ms detalle en los apartados correspondientes son: extraccin lquido-lquido
(discontinuo, continuo y ultrasonidos) (ELLd, ELLc y ELLus respectivamente),
microextraccin por desmezcla, extraccin en fase slida (SPE) y microextraccin
en fase slida (SPME).
CAPTULO 1
Introduccin
- Historia del vino
- Componentes del vino
- Componentes de sabor azucarado
- Componentes de sabor cido
- Componentes de sabor salado
- Componentes de sabor amargo y astringente
- Otros componentes
- El aroma del vino
- Compuestos responsables del aroma del vino
- Determinacin de los compuestos aromticos
- Tcnicas de aislamiento o separacin

- Tcnicas de determinacin
INTRODUCCIN
7
__________________________________________________________________
1.- INTRODUCCIN
El presente estudio nace de la necesidad de mejorar el conocimiento de un
producto vital en nuestra Comunidad Autnoma, como es el vino, con la finalidad
de ampliar el campo de conocimiento de parmetros todava muy desconocidos
como son los responsables del aroma, que a lo largo de la memoria denominaremos
con frecuencia como compuestos aromticos, no por ello refirindonos a
compuestos con estructura qumica aromtica.
El problema tcnico de la calidad, entendida como el cumplimiento de las
propiedades intrnsecas y las especificaciones de tipo legal, se resolver mejor
cunto ms se conozca del vino, sus constituyentes y las transformaciones que
tienen lugar en l (por lo que el anlisis qumico y sensorial tiene cada vez ms
peso). Innovar y disear nuevos productos ser casi siempre el resultado de
avances cientficos basados en el anlisis qumico y sensorial. Se piensa incluso en
la posibilidad de crear un sistema, que permita evitar fraudes de competencia de
mercado, cada vez ms habituales en el mundo de la vitivinicultura.
Las caractersticas organolpticas de un producto lo deben hacer atractivo al
consumidor. Son importantes la consistencia, el sabor y las apreciaciones y
sensaciones gustativas debidas al aroma. Por ello, caracterizar un producto en
relacin a su composicin aromtica, es tanto como asegurar su limpieza, modo de
elaboracin y envasado, e incluso evitar fraudes y falsificaciones.
Tradicionalmente, el anlisis sensorial ha sido la herramienta bsica para la
caracterizacin del aroma. A pesar de las normas establecidas para estandarizar la
metodologa (CEE, OIV, ISO, etc.), las caractersticas de un vino nunca dejarn de
estar sometidas a la subjetividad del degustador. Adems, el anlisis sensorial no
nos proporciona informacin sobre la composicin qumica del vino, por ello se
trata de un instrumento limitado a la bsqueda de las causas de determinadas
alteraciones y la tipificacin del producto segn su origen, variedad, etc.
No pretendemos con este trabajo mejorar un producto, sino ampliar los
conocimientos qumicos que se tienen sobre l, de modo que puedan facilitar el
protocolo de actuacin en el mercado, tanto nacional como internacional. Adems,
el anlisis de los aromas de una matriz tan compleja como es el vino es tan largo y
complicado, que merece la pena el esfuerzo para ampliar su conocimiento.
El objetivo de este trabajo es conseguir un estudio exhaustivo, analtico,
cientfico y qumico de alguno de los compuestos aromticos que contiene el vino,
con la finalidad de contribuir a un mejor conocimiento de ste.
8
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
Abordamos el tema desde distintos puntos de vista: queremos profundizar en

los compuestos voltiles que forman el vino, conocer su significado sensorial y
optimizar unas condiciones de extraccin, de modo que nos permitan separar de
forma efectiva los compuestos a tratar.
1.1.- Historia del vino1

El vino, del latn, Vinum, es el licor alcohlico que se obtiene del zumo de la
uva exprimida y fermentado. Algunos autores sitan los orgenes de la vid en Asia
Central, mientras otros aseguran que su origen es europeo. Lo que s se puede
afirmar, es que el vino era conocido por todos los pueblos antiguos. La revelacin
del proceso de esa elaboracin se atribuye a Osiris, entre los egipcios, y a
Dionisios, entre los griegos. Por su parte, los hebreos afirman que fue No el
primero en cultivar la vid. Los romanos heredaron la aficin al vino de los griegos,
gracias a las vias plantadas por los etruscos.
La viticultura debe su mayor desarrollo a la propagacin del cristianismo,
por ser el vino necesario para la celebracin de la misa. Durante la Edad Media la
elaboracin del vino fue un menester importante en los monasterios. Cada uno
posea su propio viedo de donde se extraan los vinos litrgicos. As, los monjes
medievales se pueden considerar precursores de la viticultura y vinicultura, y
dejaron huellas tan claras como los vinos llamados priorato que vienen de la
palabra prior.
Junto al carcter religioso, el vino ha tenido desde la antigedad un gran
valor poltico. Heredoto nos cuenta en su Historia que los persas despus de bien
bebidos, suelen deliberar acerca de los negocios de mayor importancia.
Hacia el Siglo XVI, la vinicultura se practicaba ampliamente en Francia. En
este pas, el monje benedictino Dom Perignon (1638-1715) introdujo el vino
espumoso. Este monje tuvo la feliz idea de utilizar tapones de corcho para sus
botellas para evitar que la fermentacin secundaria producida en el vino de
champagne despus de embotellado, explosionara el tapn que se utilizaba hasta
entonces que era de lana y lacre. Utilizando el corcho, tcnica aprendida de los
espaoles, y una botella ms gruesa, la segunda fermentacin pudo desarrollarse,
dando origen al champagne. Fue entonces cuando pronunci sus conocidas
Barea Surez E., Historia del Vino I y II, (2003)

www. lavidyelvino. iespana.es
INTRODUCCIN
9
__________________________________________________________________
palabras: Venez vite mes frres, je bois des toiles! (Venid rpido hermanos,
estoy bebiendo estrellas!).
Si el vino es conocido desde antiguo en el mundo, no lo es menos en Espaa
desde que en el ao 2200 a.C., los Tartesos llegaron a la Pennsula Ibrica y no
slo conocan el vino, sino que comercializaban con l.
Con la dominacin romana el comercio floreci de tal manera, que en el ao
20 de nuestra era se enviaron 20 millones de nforas de vino espaol a Italia, a lo
que Diocleciano puso freno para evitar la ruina de los viedos de Italia. Los vinos
de la poca se clarificaban con ceniza, arcilla, resina, etc., luego se envasaban en
nforas de barro, tapadas con corcho o yeso y se dejaban envejecer hasta diez aos,
a veces junto a las chimeneas para que tuvieran cierto sabor ahumado.
Los visigodos, grandes consumidores de vino, aumentaron la produccin.
San Isidoro de Sevilla dedica varios captulos en sus Etimologas a la vid y el vino,
que corra en abundancia en aquella poca, hasta el extremo de que San Jernimo
avisa a los jvenes que deben huir del vino como del veneno, no sea que por el
calor de su juventud beban y perezcan.
Con la llegada de los rabes, nuestros viedos fueron en principio
devastados o abandonados por la prohibicin a sus fieles de beber vino, ya que el
profeta les haba prometido para el otro mundo, muchsimo ms vino del que les
negaba en ste. Sin embargo, la arraigada costumbre vincola de los espaoles,
unido a que el Corn no prohbe la plantacin y cultivo de la vid, hizo que el
consumo de vino persistiese.
Con el avance de la reconquista, los monjes comenzaron la repoblacin de
cepas, porque el rito cristiano exiga la produccin de vino. Tambin el Camino de
Santiago fue una va de comunicacin e intercambio de todo tipo de ideas,
conocimientos, lenguas y culturas, y por l entraron nuevas variedades de uva,
como la Albario, al parecer de origen alemn, trada por monjes cistercienses. El
Camino tambin fue gran impulsor del comercio de vinos, que renace plenamente
en los siglos XVI y XVII.
Durante el siglo XVIII se inici un proceso en la enologa espaola con
nuevos tipos de vid procedentes, sobre todo, de Francia e Italia que se plantan en
estacas y en injertos.
Por esta poca lleg a ser tan grande la produccin de vino en La Rioja, que
sobrepasaba el consumo general, agravado porque el excedente de vino no se poda
almacenar ms de un ao y medio motivado por los mtodos rudimentarios
10
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
utilizados en su elaboracin. Tal era la abundancia que casi siempre se tena que
tirar vino. Para solucionar estos problemas, en 1787 se cre la Real Sociedad
Econmica de Cosecheros de La Rioja Castellana, la cual regulaba la elaboracin y
exportacin de estos vinos a sus clientes habituales, los mercados vascos y
montaeses. Pero la expansin del Rioja no llegara hasta el siglo XIX.
El siglo XIX se caracteriza por dos grandes acontecimientos. El primero fue
la transformacin de las tcnicas artesanales en nuevos procedimientos industriales
sumado a la implantacin del ferrocarril como mtodo de transporte. Y por otro
lado, a finales del siglo XIX y principios del XX una devastadora plaga, la invasin
de la filoxera, que ya haba arrasado los grandes viedos en el resto de Europa.
Pasadas estas calamidades, a principios del siglo XX comienza a florecer
una nueva actividad vincola. Josep Ravents, despus de varios viajes a la
Champagne obtiene su primera botella de vino espumoso en su bodega.
Con el siglo XIX lleg a los viedos gallegos el oidium, enfermedad que
oblig a azufrar los viedos, consiguiendo que fuera regenerndose el comercio del
vino. Pero por el ao 1885, un hongo llamado mildiu atac de nuevo a los
viedos y tuvieron que ser tratados con un producto a base de sulfato de cobre,
llamado caldo bordels.
La evolucin de la calidad viene dada por la Convencin de Pars en 1883,
por el Acuerdo de Madrid en 1891 y sobre todo por el de Lisboa en 1958, sobre la
proteccin de las Denominaciones de Origen como mtodo de proteccin de la
calidad de los vinos. En 1970 se crea el Instituto Nacional de Denominaciones de
Origen.
El siglo XX fue trascendente para el vino en cuanto a la evolucin de su
calidad, gracias a las investigaciones de Pasteur en la tecnologa aplicada a la
elaboracin del vino y a las Estaciones de Viticultura y Enologa situadas en zonas
estratgicas productoras del pas.
Es el siglo en el que se produce una evolucin tcnica que sirve al desarrollo
y divulgacin de la Enologa por todo el pas, con la creacin del Instituto Nacional
de Investigaciones Agronmicas en los aos 30. Anteriormente, por los aos 20, se
crea la Oficina Internacional de la Via y el Vino para resolver los problemas que
surjan en la vid y en el vino, dividida en tres secciones: viticultura, enologa y
legislacin.
Posteriormente, se crea la Unin Internacional de Enlogos, donde se
incluyen las Asociaciones de Enlogos de los grandes pases productores de vino.
INTRODUCCIN
11
__________________________________________________________________
Por los aos treinta, concretamente entre 1931 y 1932 se crea el Estatuto del
Vino, que persigue todo aquello que tienda a distorsionar el mercado de los vinos
de produccin natural. Posteriormente, en 1970, se dicta el Estatuto de la Via, del
Vino y de los Alcoholes, inspirado en los Estatutos de la Oficina Internacional de
la Via y el Vino.
Actualmente, en Espaa, el viedo se encuentra muy implantado, en algunas
zonas con carcter de monocultivo. La superficie de viedo cultivada supone el
33% de la superficie vitcola de la Unin Europea, y el 16% de la superficie
mundial.
En los ltimos aos, Espaa ha pasado de una situacin excedentaria, a una
de equilibrio entre produccin y necesidades, debido fundamentalmente a la
poltica de la Unin Europea y a la mejora cualitativa del viedo, abandonndose la
idea de una gran produccin frente a una significativa mejora de las cualidades del
vino.
Son muchas las denominaciones de origen que existen en Espaa, tal y como
puede observarse en la figura 1-1, donde se muestra un mapa con ellas. A
continuacin se detallan por orden alfabtico, junto con las provincias a las que
corresponden.
Denominaciones de Origen
Abona (Tenerife)
Alella (Barcelona)
Alicante (Alicante)
Almansa (Albacete)
Ampurdn-Costa Brava (Gerona)
Bierzo (Len)
Binissalem (Mallorca )
Bullas (Murcia)
Calatayud (Zaragoza)
Campo de Borja (Zaragoza)
12
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
x
Figura 1-1: Mapa de las Denominaciones de Origen en Espaa.
Cariena (Zaragoza )
Catalua (Barcelona, Tarragona, Lrida, Gerona)
Chacol de Guetaria (Guipzcoa)
Chacol de Vizcaya (Vizcaya)
Cigales (Palencia, Valladolid)
INTRODUCCIN
13
__________________________________________________________________
Cona de Barber (Tarragona)

Condado de Huelva (Huelva)
Costers del Segre (Lrida)
El Hierro (Hierro)
Jerez (Cdiz)
Jumilla (Murcia, Albacete)
La Mancha (Albacete, Ciudad Real, Cuenca, Toledo)
Lanzarote (Lanzarote)
La Palma (La Palma)
Mlaga (Mlaga)
Manchuela (Cuenca, Albacete)
Medina del Campo (Valladolid, Segovia, vila)
Mntrida (Toledo)
Mondjar (Guadalajara)
Montsant (Tarragona)
Monterrei (Orense)
Montilla-Moriles (Crdoba)
Navarra (Navarra)
Peneds (Barcelona, Tarragona)
Pl de Bages (Barcelona)
Pl y Llevant (Mallorca)
Priorato (Tarragona)
Ras Baixas (Pontevedra)
14
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
Ribeira Sacra (Orense, Lugo)

Ribeiro (Orense)
Ribera del Duero (Burgos, Segovia, Soria, Valladolid)
Ribera del Guadiana (Cceres, Badajoz)
Rioja (La Rioja, Navarra, lava)
Rueda (Segovia, vila, Valladolid)
Somontano (Huesca)
Tacoronte-Acentejo (Tenerife)
Tarragona (Tarragona)
Terra Alta (Tarragona)
Toro (Valladolid, Zamora)
Utiel-Requena (Valencia)
Valdeorras (Orense)
Valdepeas (Ciudad Real)
Valencia (Valencia)
Valle de Gimar (Tenerife)
Valle de la Orotava (Tenerife)
Vinos de Madrid (Madrid)
Vinos de Gomera (Gomera)
Ycoden-Daute-Isora (Tenerife)
Yecla (Murcia)
INTRODUCCIN
15
__________________________________________________________________
La Denominacin de Origen Calificada Rioja (DOCa Rioja)

Los antecedentes histricos de la vid en La Rioja se remontan a pocas
antiguas. En la Alta Edad Media, la viticultura y vinicultura estaban ligadas a la
vida monacal, as lo prueban los cartularios de los monasterios de San Milln de la
Cogolla, San Martn de Albelda y Valvanera. Por ejemplo, el monje Gonzalo de
Berceo, primer poeta en lengua romance, escribi en su retiro del Monasterio de
Suso o Yuso en San Milln: quiero fer una prosa en romn paladino, en cual
suele el pueblo fablar con su vezino, ca non so tan letrado por fer otro latino bien
valdr, como creo, un vaso de bon vino (Gonzalo de Berceo. Milagros de Ntra.
Seora).
La primera referencia documental relacionada con los vinos de Rioja data de
1102, cuando el rey Sancho de Navarra los reconoca y protega jurdicamente. En
1787, como ya comentamos anteriormente, se cre la Real Sociedad Econmica de
Cosecheros de Rioja, cuyo objetivo era el fomento del cultivo de la vid, la
elaboracin del vino y el desarrollo de su comercio.
En 1926 se decret la creacin del Consejo Regulador cuya misin era
delimitar la zona del Rioja, controlar la expedicin de la precinta de garanta y
recomendar las medidas legales que se tomaran contra los usurpadores y
falsificadores del nombre Rioja. Sin embargo, hasta 1945, este organismo no
sera legalmente estructurado. Fue en 1953 cuando el Consejo Regulador queda
constituido y en 1970, se aprueba el Reglamento de la Denominacin de Origen y
de su Consejo Regulador adquiriendo as su estructura y funciones.
Las siete variedades vitcolas hoy autorizadas por el Reglamento de la DOCa
Rioja son los varietales tintos Tempranillo, Garnacha, Mazuelo y Graciano y las
variedades blancas Viura, Malvasa y Garnacha Blanca.
La regin vitivincola de La Rioja est enclavada en el Valle del Ebro.
Limita al norte con la Sierra de Cantabria y al sur con la Sierra de la Demanda, lo
que constituye una situacin privilegiada para el cultivo de la vid.
Las 57.000 hectreas de viedo que actualmente componen la DOCa Rioja
se distribuyen entre las Comunidades Autnomas de La Rioja, Navarra y el Pas
Vasco. Su produccin media anual es de 250 millones de litros, de los que el 85%
corresponde a vino tinto y el resto a blanco y rosado.
La pluralidad de terrenos que la constituyen, no supone diferenciacin en
cuanto a la calidad del vino, ya que el Rioja puede ser elaborado con uvas
seleccionadas procedentes de las distintas zonas.
16
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
La diversidad del terreno y del clima, hacen que esta regin vitivincola se
divida en tres subzonas: Rioja Alta, Rioja Alavesa y Rioja Baja (ver mapa de la
figura 1-2)
x Figura 1-2: Mapa de las subzonas en la DOCa Rioja

Rioja Alta: Situada en el margen derecho del Ebro. Es la subzona con ms
superficie de la Denominacin, a la que corresponde el 46% de la produccin. Sus
suelos variados, con predominio de los arcillo-ferrosos, y una pluviosidad media,
permiten obtener unos vinos de calidad, de moderado grado alcohlico y bien
cubiertos de color, aptos para el envejecimiento en barrica. Las variedades
predominantes son el tempranillo (tinta) y la viura (blanca).
Rioja Alavesa: Est en la orilla izquierda del Ebro, aguas arriba de Logroo.
De caractersticas fsicas y ambientales muy parecidas a las descritas en Rioja Alta,
aunque algo ms lluviosa y con suelos calcreos, esta zona produce unos vinos de
calidad, de moderado grado alcohlico y acidez total, aptos tanto para el consumo
como vinos jvenes, como para el envejecimiento en barrica. De ella se obtiene el
22% de los vinos de la Denominacin y predominan las variedades viura y
tempranillo.
Rioja Baja: Situada principalmente en el margen derecho del Ebro, aguas
abajo de Logroo. El 32% de los vinos de Rioja proceden de esta subzona que se
caracteriza por sus suelos fundamentalmente de origen aluvial y una pluviosidad
media. Produce unos vinos de calidad, con grado medio y buen extracto. En los
ltimos aos se ha producido un incremento de la variedad tempranillo, que es
mayoritaria en las uvas tintas, pero con una presencia importante de la variedad
garnacha. En uvas blancas predomina la variedad viura.
INTRODUCCIN
17
__________________________________________________________________
1.2.- Componentes del vino2

Una clasificacin general de los componentes del vino teniendo en cuenta la
participacin en sus caractersticas olfativas y gustativas puede ser la siguiente:
1.2.1.- Componentes de sabor azucarado
1.2.2.- Componentes de sabor cido
1.2.3.- Componentes de sabor salado
1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente
1.2.5.- Otros componentes
1.2.1.- Componentes de sabor azucarado

Estos compuestos transmiten al vino suavidad, y sabor dulce, el cual no es
exclusivo de los azcares, pues otras sustancias qumicamente distintas de los
azcares poseen sabor dulce.
Las sustancias dulces del vino pertenecen a tres grandes grupos:
A) Azcares propiamente dichos. Se encuentran en la uva y permanecen
sin fermentar en los vinos blancos dulces y en pequea concentracin en el vino
blanco seco y tinto. A este grupo pertenecen algunas hexosas (glucosa y fructosa) y
pentosas (arabinosa y xilosa).
La uva apenas contiene sacarosa, adems sta es desdoblada en glucosa y
fructosa por las levaduras durante la fermentacin, por lo cual el vino no contiene
sacarosa. Su presencia por adicin para enriquecer ciertos vinos supone un engao
para el consumidor, aunque sea legal.
B) Polialcoholes. En los vinos se encuentran en mayor o menor
concentracin segn la transformacin sufrida en la fermentacin. Los principales
son: inositol, manitol, arabitol, iritritol y sorbitol.
C) Sustancias con uno o varios radicales alcohol. Se forman durante la
fermentacin alcohlica por oxidacin de los azcares, el principal es el alcohol
etlico, procedente de la fermentacin de la glucosa, aunque tambin se encuentran
el glicerol y el butilenglicol.
2
Badui Dergal S., Qumica de los alimentos, Mxico, (1999)

Mareca Corts I., Origen, composicin y evolucin del vino, Madrid, (1983)
Belitz H.D., Qumica de los alimentos, Zaragoza, (1997)
18
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
Despus del agua, 85% del total del vino, el etanol es el componente ms
importante. La graduacin de los vinos en Espaa vara entre 9 y 15 % (v/v).
El glicerol es el componente ms abundante en el vino despus del etanol (de
5 a 10 g L-1), es un producto resultante de la fermentacin del mosto y contribuye a
endulzar el vino por tener sabor azucarado.
1.2.2.- Componentes de sabor cido

La acidez del vino se atribuye a diversos cidos orgnicos. En la tabla 1-1 se
indican los principales constituyentes de la acidez.
Ac. tartrico
Procedentes de la uva
Ac. mlico
Ac. ctrico
Acidez fija
Acidez total
Ac. succnico
Originados por la fermentacin
Ac. lctico
Ac. actico
x
Acidez voltil
Tabla 1-1: Componentes del vino de sabor cido
En el vino se encuentran adems otros cidos en pequeas cantidades, tales

como el galacturnico, glucornico, pirvico, etc.
La mayor parte de los cidos del vino se encuentran en estado libre y
representan la acidez total. Otra parte se encuentran en forma de sales, y se
determinan por la alcalinidad de las cenizas.
1.2.3.- Componentes de sabor salado

El gusto salado lo comunican al vino las sales de los cidos minerales y de
algunos cidos orgnicos (tabla 1-2). Contiene alrededor de 2 a 4 g L-1 de estas
sustancias.
INTRODUCCIN
19
__________________________________________________________________
Minerales
Otros
ANIONES
CATIONES
Fosfato
Potasio
Sulfato
Sodio
Cloruro
Magnesio
Sulfito
Calcio
Tartrato
Hierro
Malato
Aluminio
Lactato
Cobre
x Tabla 1-2: Componentes del vino de sabor salado
En el vino tambin se encuentran trazas de otros componentes minerales

(oligoelementos) como flor, silicio, yodo, bromo, boro, zinc, magnesio, plomo,
cobalto, cromo, nquel, etc.
1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente

stos son los compuestos fenlicos, conocidos antiguamente como materias
tnicas. Proporcionan a los vinos su color y gran parte de su sabor. La diferencia
entre vinos blancos y tintos se debe a los compuestos fenlicos y explican su
evolucin. Adems, tienen la propiedad de coagular las protenas y de intervenir en
la clarificacin de los vinos por encolado, algunos de ellos tambin intervienen en
las propiedades alimenticias del vino tinto, sobre todo en su riqueza vitamnica y
poder bactericida.
Los compuestos fenlicos pertenecen a cinco grupos qumicos:
A) Antocianos: son los colorantes rojos.
B) Flavonas: de color amarillo, slo estn presentes en cantidades muy
pequeas.
C) steres de los cidos cinmico y benzoico.
20
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
D) Taninos condensados: se localizan en las pepitas, en el hollejo de la uva y

en el raspn.
E) Taninos piroglicos: se encuentran en el vino, aunque no provienen de la
uva. Posiblemente provengan de la adicin de taninos comerciales o de la
madera de los toneles.
1.2.5.- Otros componentes

En este apartado se pueden englobar:
A) Sustancias nitrogenadas: aunque apenas tienen importancia en el sabor,
son importantes como nutrientes indispensables para las bacterias y las levaduras.
Adems de la forma amoniacal, el nitrgeno puede encontrarse en los
mostos y vinos bajo diferentes formas, que se pueden clasificar segn el tamao de
la molcula:
a) Aminocidos: son los componentes elementales de las protenas
y de los polipptidos. De ellos, el cido glutmico es posible que intervenga en el
gusto del vino.
b) Polipptidos: son agrupamientos de aminocidos ms o menos
largos y constituyen la forma ms importante de encontrar el nitrgeno en los
vinos.
c) Protenas: tambin llamadas materia albuminoide. Son de peso
molecular elevado. Se encuentran en estado de macromolculas y tienen carcter
coloidal. Precipitan por el calor y por la presencia de taninos, siendo un problema
para la estabilizacin de los vinos blancos, de los cuales se eliminan en la
clarificacin por tratamiento con colas orgnicas que son tambin protenas.
B) Peptinas, gomas y muclagos: cuando se aaden algunos volmenes de
alcohol al mosto o a un vino, se produce un enturbiamiento, se trata de un poso
gelatinoso. Este sedimento est formado por peptinas, gomas y muclagos.
C) Sustancias voltiles y aromticas: hasta principios del siglo XX el olor
del vino se atribua a una sola sustancia, el cido enntico, poco a poco, con el
avance de la ciencia analtica, se fue corrigiendo el error y ya hacia 1952 se
conocan unos cincuenta componentes del olor del vino. Posteriormente y gracias a
la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas, fundamentalmente la de fase gaseosa,
se han podido separar ms de 1000 componentes del vino, aunque todava no se ha
podido establecer una tarjeta de identidad de cada tipo de vino.
INTRODUCCIN
21
__________________________________________________________________
Las sustancias voltiles del vino, muchas de las cuales son responsables del
aroma, pertenecen a distintos grupos qumicos (cidos, alcoholes, aldehdos,
steres). Este punto se desarrollar en el apartado 1.3.
D) Vitaminas: el vino contiene todas las vitaminas necesarias para la vida y
en l actan como factores de crecimiento indispensables para levaduras y
bacterias.
1.3.- El aroma del vino

El aroma de un vino se describe como la interaccin del sabor y olor que
imparten a cada individuo una experiencia sensorial agradable o no. Las sustancias
aromticas son compuestos voltiles, que se perciben a travs de los receptores del
olor del rgano olfativo. El aroma tiene una base fsico-qumica, pero lo que
realmente cuenta a la hora de consumir un producto es el efecto que produce en el
consumidor.
Para el anlisis sensorial disponemos de dos aparatos quimio-receptores, que
son el gusto y el olfato, siendo el olfato mucho ms importante a la hora de
determinar las caractersticas de un alimento, ya que su intervencin es ms directa,
al percibir los vapores que se encuentran sobre el alimento y porque en la
deglucin vuelve a intervenir mediante la va retronasal. Por ello se utiliza el
trmino anglosajn flavour, que tiene una percepcin global y abarca trminos
castellanos que se quedan cortos como olor o sabor.
Dentro del vino se distinguen varios tipos de aromas: varietales,
prefermentativos, fermentativos y postfermentativos, o bien aromas primarios,
secundarios y terciarios que se describen a continuacin.
Los aromas primarios proceden en parte de la uva3 e incluso las partes
slidas del racimo pueden contribuir en este aspecto y en ocasiones estn presentes
3
Mallouchos A. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 3060-3066, (2003)

Boido E. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 5708-5413, (2003)
DallAgnol I. et al, J. Int. Sci. Vig. Vin., 36, 71-76, (2002)
Lanaridis P. et al, J. Int. Sci. Vig. Vin., 36, 39-47, (2002)
Rosillo L. et al, J. Chromatogr. A, 847, 155-159, (1999)
Hashizume K. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 1333-1337, (1997)
Dimitriadis E. et al, Am. J. Enol. Viticult., 35, 250-258, (1984)
Mareca I., Origen, composicin y evolucin del vino, Madrid, (1983)
22
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
en las hojas en estados fisiolgicos tales que las uvas no los contienen. Dentro del
grano, la mayor parte de los aromas se hallan en el hollejo y clulas contiguas al
mismo, existiendo en menor medida en la pulpa (a excepcin de ciertas variedades
tales como algunos moscateles y malvasas). Las pepitas, tambin pueden
contribuir a ceder algunas sustancias aromticas. Aportan caracteres que hacen
recordar en el vino a ciertas flores, o a frutas, dando tambin en ocasiones notas
herbceas.
Como el aroma primario tiene su origen en la uva, se le asigna tambin el
calificativo de varietal. Son compuestos complejos, en general terpnicos, que
pasan de la uva al vino sin transformacin. Los terpenos se encuentran en los
hollejos de la uva, por lo que para valorar su presencia es muy importante el
proceso de la maceracin, los tratamientos por calor y las infecciones por botritis.
Se trata de sustancias aromticas libres, o de precursores de aromas combinados,
que no son aromticos en s mismos, pero que liberan aromas por hidrlisis cida o
enzimtica. Los ms importantes dentro de los terpenos libres son: linalol, geraniol,
terpineol, nerol, citroneol y dentro de los terpenos combinados el dinodienol.
Los aromas secundarios se forman en la fermentacin que tiene lugar
durante la vinificacin4, variando con las condiciones en las que sta se desarrolle5.
El aroma generado durante la fermentacin obedece a la presencia de steres6,
formados biolgicamente en el interior de las clulas microbianas, aldehdos
precursores que han quedado en el medio como restos en su condicin de
metabolitos intermedios, cetonas, cidos, alcoholes superiores, etc., que
proporcionan en conjunto, la impresin total que da un vino.
La teora de la participacin de los steres en el aroma de los vinos tiene su
importancia y ha sido discutida a lo largo de los aos. Antes de los aos treinta,
cuando no se realizaban anlisis, se les daba mucha importancia. Desde entonces
hasta los sesenta se minimiz en extremo su aportacin al aroma y, posteriormente,
con la utilizacin de la cromatografa de gases se les ha encontrado su sitio en el
aporte total del aroma del vino.
Wildenradt H.L. et al, Am. J. Enol. Viticult., 26, 148-153, (1975)
Cordonnier R., Rev. Fr. Doenol., 53, 15-26. (1977)
Stevens K.L. et al, J. Agric. Food Chem., 14, 249-252, (1966)
4
Frivik S. et al, Am. J. Enol. Viticult., 54, 31-38, (2003)
Aleixandre J.L. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 1889-1893, (2003)
Daz Yubero F. et al, Vitivinicult., 1, 61-68, (1991)
5
Gerbaux V. et al, Am. J. Enol. Viticult., 53, 131-137, (2002)
6
Lpez T., Tesis Doctoral Facultad de Ciencias (Qumicas), Zaragoza, (1987)
Marais J. et al, Vitis, 19, 151-164, (1980)
INTRODUCCIN
23
__________________________________________________________________
Es difcil determinar la influencia sensorial de compuestos individuales, ya

que existen mezclas muy complejas en las que los compuestos interaccionan en lo
que a acciones organolpticas se refiere. A la nariz son diferentes el aroma de la
uva, el del mosto y el del vino a que da origen, y el aroma de este vino va
evolucionando gradualmente con el paso del tiempo, aunque no se conoce bien esta
evolucin. Ciertos constituyentes voltiles desaparecen, otros quedan inalterados y
se observa la formacin de algunos compuestos merced a las levaduras por
mecanismos diversos, bien metablicos o bien por hidrlisis enzimtica. Con todo
ello el vino experimenta un enriquecimiento, tanto cuali como cuantitativo.
En algunas ocasiones los aromas secundarios pueden ser negativos e
indeseables7, las causas pueden ser muy diversas, fermentaciones mal elaboradas,
embotellamientos precoces, levaduras mal seleccionadas o utilizadas inadecuadamente, poca higiene, etc.
Durante el almacenamiento8 y la maduracin de los buenos vinos se
producen modificaciones9 del aroma que conducen al bouquet (aromas
terciarios). Supone en los vinos el equilibrio final, caracterizado por perfumes
delicados y penetrantes, conseguidos una vez cursado el desarrollo que madura a
los vinos. La aparicin del aroma terciario acarrea transformaciones de distinto
orden, no en todos los vinos del mismo modo, y que son originadas por
mecanismos de xido-reduccin complejos y no del todo conocidos10. Los aromas
se desarrollan poco a poco, tanto en la fase de tonel como en la de botella,
alcanzando su mayor auge a los tres o cuatro aos, segn los vinos.
La naturaleza de las sustancias que originan el aroma terciario es tambin
variada: alcoholes, steres, aldehdos, etc. Durante este proceso tienen lugar
reacciones de esterificacin entre cidos y alcoholes y de oxido-reduccin de
compuestos aromticos y fenlicos, que se traducen en una mejora de los
caracteres organolpticos de los vinos y en la transformacin del aroma en lo que
se denomina bouquet. Tambin se pierde el afrutado debido a la disminucin de
7
Chatonnet, P. et al, J. Int. Sci. Vigne Vin, 26, 253-269, (1992)

Bentez P. et al., J. Agric. Food Chem., 51, 6482-6487, (2003)
Prez L. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 5444-5449, (2003)
Prez L. et al, J. Agric. Food Chem., 50, 3272-3276, (2002)
Ibern M. et al, Am. J. Enol. Viticult., 52, 159-164, (2001)
Cutzach I. et al, J. Agric. Food Chem., 48, 2340-2345, (2000)
9
Jimnez N. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 5732-5737, (2003)
Tominaga T. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 1016-1020, (2003)
10
Carnacini A. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 2225-2228, (1997)
Martn B. et al, J. Agric. Food Chem., 40, 475-478, (1992)
8
24
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
algunos steres como el acetato de etilo, succinato de dietilo, etc. y se aportan

aromas especficos de la madera, como son aldehdos furnicos, lactonas,
etilfenoles, etc.
La evolucin del aroma del vino acabado puede ser distinta segn las
circunstancias ambientales impuestas por la tcnica. Una lnea por ejemplo es el
carcter oxidativo en la fase de crianza o aejamiento, y que corresponde a los
vinos llamados "rancios", para esto se mantienen en un envase de madera,
controlando el contacto con al aire y la temperatura ambiental. Componentes
caractersticos correspondientes a este tipo de crianza son el etanal y el cido
actico a mayores concentraciones de las habituales, procedentes de la oxidacin
del etanol.
Otra va tcnica es el aejamiento clsico, caracterstico de los vinos de mesa
de calidad. En este caso, despus de un tiempo en el que se producen oxidaciones
por contacto limitado con el aire, conservando el vino en envase de madera, sigue
la fase real de formacin del bouquet, caracterizada por ambiente esencialmente
reductor, disponiendo el vino en botella bien tapada, en posicin horizontal, cierre
hermtico y temperatura de bodega fresca y constante.
Para alcanzar el mejor estado del aroma hace falta tiempo, aos, diferente de
unos tipos de vinos a otros. Todo vino ofrece su curva de calidad en funcin del
tiempo, con aumento continuado hasta cierto punto en el que presenta un mximo,
a partir del cual disminuye su riqueza.
Asimismo, durante la vinificacin y posterior periodo de conservacin11
puede haber tambin transformaciones nocivas que deben ser cuidadas, en especial
el aumento de la temperatura que volatiliza los compuestos, la aparicin de
acusadas oxidaciones, ataques microbiolgicos12, influencia del corcho13, efecto de
11

Puech J.L., Elaboration et connaissance des spiritieux", (1993)
Rabier P.H. et al, Les eaux de vie traditionnelles dorigine viticole, (1991)
Dubois P., Rev. Fr. Doenol., 120, 19-24, (1989)
Puech J.L., Connais. Vigne Vin, 19, 151-162, (1987)
Nishimura, K. et al, Flavour of distilled beverages, (1983)
Ribereau-Gayon J. et al, Sci. Technol. Vin, 3, 702-719, (1976)
Marche M. et al, Rev. Fr. Dòenol., 57, 1-106, (1975)
Singleton V.L.,Some aspects of wooden container as a factor in wine maturation, (1974)
12
Rocha S. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 865-871, (1996)
13
Boudaoud N. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 1530-1533, (2003)
INTRODUCCIN
25
__________________________________________________________________
los pesticidas14, etc., por lo que todos esos factores, deben ser tenidos en cuenta con
objeto de llegar a la obtencin de vinos de calidad.
En general, todava se sabe poco sobre el bouquet de los vinos, si se
exceptan las sustancias aromticas tpicas de cada variedad. S que est claro
desde hace aos, que los distintos compuestos terpnicos, son muy importantes en
el aroma de los vinos de diversas variedades, o que el vino de Jerez por ejemplo,
tiene una notas particulares de su aroma, generadas en los procesos de
fermentacin en solera (lactonas).
Pero lo cierto es que la bibliografa actual todava no presentan estudios
intensivos sobre la aportacin de los distintos compuestos al aroma del vino.
Hay aromas defectuosos que enmascaran el resto de aromas del vino como
son el pronunciado aroma a sulfhdrico, acetaldehdo o cido actico. Los
compuestos que generan estos defectos forman, sin embargo, parte de la
composicin normal del vino, de ah la importancia del concepto de equilibrio, ya
que pasan a ser defectuosos cuando su concentracin supera un cierto nivel. Lo
mismo ocurre con ciertos compuestos que dan una determinada nota, se encuentran
presentes en muchos vinos, sin embargo slo en algunos de ellos tienen una
concentracin suficiente como para ser percibidos.
Adems, al hablar de concentraciones, se hace de modo relativo, ya que un
mismo compuesto en las mismas concentraciones puede no ser reconocido en dos
vinos de distintas caractersticas, o puede generar distintos aromas como
consecuencia de las interacciones que puede entablar con otros compuestos
presentes.
Queda entonces clara la dificultad que existe a la hora de comprender
totalmente el aroma de un vino desde el punto de vista analtico. Son necesarias
todava, por ello, muchas horas de investigacin para alcanzar una comprensin
total del aroma del vino.
En lo que s se ha avanzado considerablemente es en la racionalizacin de la
cata del vino, donde se han definido distintos grupos de aromas (florales, afrutados,
especiados, madera, qumicos, picantes, etc.). Sin embargo, dichos trminos
corresponden a percepciones integradas por nuestro cerebro, no teniendo por qu
coincidir el olor con un compuesto determinado, aunque recientemente se han
14
Oliva J. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 2830-2836, (1999)
26
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
realizado estudios donde se les dan descriptores aromticos (limn, banana, kiwi,
etc.), que se relacionan con los compuestos voltiles15.
Los avances en estos campos son importantes al igual que curiosos, por
ejemplo en la Universidad Hebrea (Jerusaln)16 han creado un proceso patentado
que enriquece el aroma del vino. Consiste en el aislamiento de un gen responsable
de la produccin de una enzima especial llamada beta glucoserase. Este gen fue
introducido en levaduras de vino que emitieron la enzima durante la produccin del
vino. Las enzimas descomponen los componentes del aroma, brindando al vino
mejores bouquet y sabor. De modo que gracias a estos esfuerzos, vinos simples
pueden convertirse en variedades mucho mejores, con un aroma mejorado.
1.4.- Compuestos responsables del aroma del vino

Ya se ha comentado que las sustancias aromticas son compuestos voltiles
que se detectan con los receptores olfatorios y se encuentran en los alimentos en
distintas cantidades. Los componentes voltiles conocidos se ordenan por
alimentos y tipos de compuestos en tablas que se actualizan y publican
peridicamente17.
De los compuestos voltiles slo una pequea proporcin tiene importancia
desde el punto de vista del aroma. nicamente se consideran sustancias aromticas
aquellas cuya concentracin en el alimento es superior a su umbral olfativo o
gustativo.
Se denomina umbral olfatorio o umbral de reconocimiento a aquella
concentracin de un compuesto que resulta suficiente para reconocerlo por su olor.
Se mide como valor de la actividad aromtica (OAV) de un compuesto x y se
calcula de acuerdo a la siguiente ecuacin:
OAV
15
Cx
Ax
Moio L. et al, Vignevini, 29, 115-123, (2002)

Siegel-Itzkovich J., M.F.A., Israel, revista en www.mfa.gov.il, (2001)
17
Maarse H. et al, Volatile compounds in food. Qualitative and quantitative data, (1990)
16
INTRODUCCIN
27
__________________________________________________________________
(Cx es la concentracin del compuesto x en el alimento; Ax es la concentracin

umbral olfatoria del compuesto x en el alimento).
Se puede distinguir entre aromas activos e inactivos, segn el valor de
actividad aromtica de un compuesto en una matriz determinada. Los compuestos
aromticos activos, son aqullos cuyo parmetro es superior a 1. En este sentido,
Etivant18 aporta algunos datos referidos al aroma del vino:
1.- Sustancias con valores de aroma comprendidos entre 1 y 20 son: etanol,
lactatos de los alcoholes de fsel, acetato de etilo, steres etlicos de los cidos
grasos de 6, 8 y 10 tomos de carbono y alcoholes isoamlicos.
2.- Sustancias con valores de aroma entre 0.1 y 2 son: 3-hidroxipropionato
de etilo, isobutanol, feniletanol, hexanol, nanolactona, 1,1-dietoxietano, 4-etilfenol,
4-etilguaiacol, y 2,3-butanodiona.
3.- Sustancias con valores de aroma comprendido entre 0.001 y 1 son:
cidos isobutrico, hexanico, octanico y decanico, 3-hidroxibutanona,
benzaldehdo, sulfuro de dimetilo, metionol y eugenol.
4.- Sustancias caractersticas del olor de vinos diversos, y con valores de
aroma comprendidos entre 1 y 10: cinamato de etilo, linalol, geraniol y nerol
(Moscatel), damascenona (Riesling y Chardonnay), 4-vinilguaiacol (Traminer),
1,1-dietoxietano (Jerez), 2-metoxi-3-isopropilpirazina y 2-metoxi-3-pirazina
(Sauvignon), lactonas de roble (vinos envejecidos en barriles nuevos), vitispirano
(vinos blancos envejecidos) y TDN o 1,1,6-trimetil-1,2,-dihidronaftaleno (Riesling
envejecidos).
En la tabla 1-3 se muestran los datos sensoriales de algunos compuestos
presentes en el vino, el umbral olfatorio, las concentraciones habituales en vinos
tintos y la aportacin global.
18
Etivant P.X., Volatile compounds in foods and beverages, (1991)
28
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
COMPUESTOS
ALCOHOLES
MAYORITARIOS
Etanol
Propanol
Isobutanol
1-Butanol
2,3-Metilbutanol
Pentanol
Heptanol
Octanol
Alcohol benclico
E-Feniletanol
ALCOHOLES HERBCEOS
2-Hexenol
3-Hexenol
Hexanol
ACETATOS DE ALCOHOLES
SUPERIORES
Acetato de propilo
Acetato de butilo
Acetato de isobutilo
Acetato de amilo
Acetato de isoamilo
Acetato de hexilo
Acetato de feniletilo
Acetato de etilo
STERES ETLICOS DE
CIDOS GRASOS
Propanoato de etilo
Isobutirato de etilo
Hexanoato de etilo
Octanoato de etilo
Decanoato de etilo
x
DESCRIPCIN
SENSORIAL
UMBRAL
OLFAT. (1)
C (mg L-1)
APORTAC.
GLOBAL (2)
Alcohlico, fuerte
Alcohlico, dulzn
Alcohlico
Alcohlico
Alcohlico, vinoso,
yodoformo, dulzn, pltano
14000
300-500
100-500
150
60-180
120000
5-125
9-174
tr-8.5
87-564
m.s.
p.s.
s.
i.
m.s
Alcohlico, yodoformo
Alcohlico, graso
Alcohlico, graso
Almendra amarga
Floral, rosa, polen
64.4
5.2
0.8
7.5-200
tr-5.1
i.
tr-0.05
i.
0.09-1.5
0.008-0.42 ?
4-197
Manzana verde, herbceo

Hoja verde, herbceo
Alcohlico, dulzn,
almendra verde, herbceo
1.1-5.2
0.05
0.01-0.85
0.3-12
?
?
s.-m.s.
Disolvente, frutal, qumico

Frutal, dulzn, fresa sinttica
Frutal, pltano, fresa sinttica
Dulce, frutal, pltano
Pltano, manzana, frutal
Manzana madura, frutal
Rosa, miel, dulzn
Disolvente, pegamento,
dulzn, frutal
4.74
1.83
?
0.1
0.16-1.0
0.67-2.4
1.8
12.3
tr-0.02
0.01-1.2
tr-0.04
0-23
0-4.8
0.02-8.0
0.15-257
p.s./ s.
i.
p.s./ s.
i.
m.s.
s.
s.
m.s.
Fruta sinttica, manzana

Frutal, manzana, papaya
Frutal, manzana, anisado
Frutal, manzana, dulzn
Frutal, caprlico, dulzn,
disolvente
1.8
0.1
0.08
0.58
0.51
tr-20
0.1-1.0
tr-3.4
0.05-3.8
tr-2.1
s./m.s.
m.s.
m.s.
s./ m.s.
s.
Tabla 1-3: Descripcin aromtica, umbrales olfatorios y contribucin al aroma del

vino.
(1) UMBRAL OLFATORIO, (2) APORTACIN GLOBAL, i.=insignificante; p.s.=poco
significativa s.=significativa; m.s.=muy significativa; tr=trazas.
INTRODUCCIN
29
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
OTROS COMPUESTOS
Lactato de etilo
J-Nanolactona
1,1-Dietoxietano
2,3-Pentanodiona
4-Etilfenol
4-Etilguaiacol
x
DESCRIPCION
SENSORIAL
UMBRAL
OLFAT.
C (mg L-1)
APORTAC.
GLOBAL
Frutal, jabonoso
Caramelo de coco
Frutal, fresco, verde
Cuero, fenlico, medicinal,
madera
Especiado, clavo, carne
ahumada, quemado,vainilla
150
0.03-0.4
?
0.14
0.17-382
0-0.05
?
0.01-0.1
0-6.0
s.
p.s.(?)
p.s.
p.s.
s./ m.s.
0.03
0-3.0
s./ m.s.
Tabla 1-3: Continuacin.
Se han descrito muchos compuestos que pueden contribuir, en distinto

grado, al aroma final del vino. Para algunos de ellos se han encontrado
correlaciones positivas entre su concentracin y la calidad del aroma final, pero
para otros, sin embargo parece existir un umbral superior, por encima del cual la
calidad del vino disminuye. Esto es especialmente significativo en los alcoholes
superiores y el acetato de etilo19. En cuanto a la existencia de correlaciones
positivas, el caso ms claro es el de los steres de fermentacin de vinos blancos.
Los estudios realizados por De Wet20, Simpon y Miller21, van der Merwe y van
Wyk22, Shinohara y Watanabe23, Marais24, Marais y Pool25, Bertuccioli 26 y
Romano27 ponen de manifiesto la importancia de estos compuestos en los vinos
jvenes, particularmente en los blancos.
La mayor parte de los estudios realizados en este campo indican la
aportacin de los compuestos cuantitativamente mayoritarios, como son alcoholes
de fsel y steres, lo que permite explicar una parte del aroma, como es su
vinosidad y estructura, pero no permiten explicar otras notas del aroma del vino.
19
Simpson R.F. et al, Food Technol. Aust., 31, 516-522, (1979)

Ribreau-Gayon P., Wine Aroma in Flavour of Foods and Beverages, (1978)
20
De Wet P. et al, Proccess. SAF. Oenol. Vitc., 3, 28-42, (1978)
21
Simpon R.F. et al, Vitis, 23, 143-158, (1984)
22
Van der Merwe C.A. et al, Am. J. Enol. Vitic., 32, 41-46, (1981)
23
Shinohara T. et al, Agric. Biol. Chem,. 45, 2903-2905, (1981)
24
25
26
Bertuccioli M.S. et al, Vini dItalia, 3, 27-36, (1984)
Bertuccioli M.P. et al, Evaluating wine quality by the aplication of statistical methods to
analytical CG data. Sensory quality in foods and beverages: Definition, Measurement, and
Control, (1983)
27
Romano F. et al, The aromatic substances of grapes and wines, (1989)
30
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
Un caso que hace referencia a esta dificultad, son las lactonas y su

contribucin al aroma. Tradicionalmente se les consideraba compuestos
importantes en vinos de Jerez28 y aunque se han encontrado lactonas en el aroma de
algunos vinos29, los datos sensoriales, apuntan a que su contribucin es
insignificante, excepto en el caso de los vinos de Jerez o en vinos envejecidos en
barrica 30. Sin embargo, otros investigadores31 muestran que la aportacin sensorial
de la J-nonalactona de ciertos vinos elaborados con las varidades Pinot Noir,
Merlot, Cavernet Sauvignon y Zifandel, puede ser significativa.
Respecto al papel que juegan las variedades, hasta el momento no se ha
dilucidado. Por otra parte, es conocida la influencia de la maceracin y de los
primeros tratamientos de los mostos, y cmo afectan al aroma final del vino.
Numerosos autores han tratado este tema y se ha concluido, que la maceracin es
un proceso importante para la extraccin de determinados compuestos
aromticos32. La maceracin en fro de mostos blancos es muy interesante33. Sin
embargo, todava no est muy claro qu compuestos aromticos son los
responsables de las notas afrutadas en vinos macerados.
Se ha estudiado tambin la influencia de determinados compuestos presentes
en uvas, precursores aromticos, que aunque no sean voltiles contribuyen
significativamente en el aroma final del vino. Numerosos estudios han demostrado
este efecto y tambin se ha encontrado que no slo los compuestos terpnicos
pueden participar en el aroma varietal, sino que otros compuestos sintetizados por
otras vas distintas, como el cido shikmico y algunos carotenoides, pueden jugar
un importante papel. Los compuestos estudiados por Williams y su equipo34,
haban sido descritos como constituyentes del aroma y se haba hablado de rutas
metablicas importantes35, pero no se haba demostrado la importancia de estos
precursores como contribucin al aroma final del vino.
28
Criddle W. J. et al, Am. J. Enol. Vitic., 34, 61-71, (1983)

Martn B. et al, J. Agric. Food Chem., 39, 1501-1503, (1991)
29
Sakato K. H. et al, Am. J. Enol. Vitic., 26, 70-74, (1975)
30
Maarse H. et al, Volatile compounds in food. Qualitative and quantitative data, (1989)
31
Nakamura S. et al, J. Food Sci., 53, 1243-1244, (1988.)
32
Baumes R. et al, Conn. Vigne Vin, 22, 209- 223, (1988)
Arnold R. A. et al, Am. J. Enol. Vitic., 30, 179-181, (1979)
33
Franco Aladrn, E., Informe de vinificacin de las bodegas piloto de la Estacin de
Viticultura y Enologa de Movera (Zaragoza), (1988-1989)
34
Williams P. J. et al, The aromatic substances of grapes and wines, (1989).
35
Versini G. et al, LEnotecnico, 9, 595-600, (1983)
INTRODUCCIN
31
__________________________________________________________________
1.5.- Determinacin de los compuestos voltiles

1.5.1.- Tcnicas de aislamiento o separacin
El inters por conocer la composicin de los aromas ha estado siempre
presente en la Enologa. Sin embargo, su estudio no ha sido posible hasta pocas
recientes, debido a la inexistencia de mtodos analticos capaces de determinar la
constitucin en compuestos minoritarios, de manera que slo la cata era el
procedimiento til para discernir sobre este tipo de compuestos.
Los procedimientos de aislamiento de los compuestos voltiles del vino del
resto de la matriz estn basados en distintas propiedades fsico-qumicas como son
la volatilidad, la solubilidad en distintas fases orgnicas inmiscibles con la matriz y
la capacidad de ser adsorbidos selectivamente sobre ciertos materiales. Los
compuestos mayoritarios no necesitan su preconcentracin a partir de los vinos,
sino que la inyeccin directa en el cromatgrafo o bien la inyeccin en espacio de
cabeza36, permite detectarlos, ya que tienen una concentracin lo suficientemente
alta como para poder ser registrados por los detectores habituales. Sin embargo,
hay otro grupo, que se encuentran en concentraciones tan pequeas que necesitan
ser extrados y concentrados para poder ser determinados, stos son los voltiles
minoritarios (son la mayora, exceptuando metanol, etanol, los alcoholes
superiores, acetato de etilo, acetaldehdo, formiato de etilo, propanal, 2,3
butanodiol, glicerina, otros steres y los cidos que contribuyen a la acidez voltil).
Algunos de los mtodos que se utilizan para concentrar los voltiles de baja
concentracin requieren demasiado tiempo, o suponen una gran manipulacin, lo
que puede conducir a distintos tipos de error, algunos tienen baja reproducibilidad
o bien pueden producir alteraciones de los voltiles originales cuando se superan
determinadas temperaturas, tambin pueden formarse nuevos compuestos, e
incluso puede que la fraccin de aroma determinada no sea representativa de la
muestra37. Por ello se piensa que lo ms prximo a la composicin real de un vino
se conseguir utilizando un mtodo con la mnima manipulacin posible, en el que
36
Gassiot M. et al, Afinidad, 5, 207-212, (1983)

Noble A.C. et al, Vini dItalia, 11, 325-340, (1982)
37
Nnez A. J. et al, Chromatographia., 21, 44-48, (1986)
Nez A. J. et al, Chromatographia, 18, 153-158, (1984)
Sugisawa C.R., Prerequisites for sample preparation in flavour analysis, in Analysis of
volatiles, (1984)
Shimizu J., Agric. Biol. Chem., 46, 2265-2274, (1982)
Stan Kung M., Am. J. Enol. Vitic., 3, 187-190, (1980)
Drozd J. et al, J. Chromatogr. A, 165, 141-165, (1979)
32
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
los compuestos analizados sean los que realmente definen el aroma, con alta
reproducibilidad, y a ser posible que pueda controlarse de modo automtico.
Dentro de las tcnicas de aislamiento y separacin utilizadas con matrices de
vino cabe destacar38:
x El arrastre de las sustancias voltiles por medio de un gas inerte y posterior
recuperacin en piezas refrigeradas. Es un mtodo propuesto ya en 196039 y su
posterior aplicacin al vino fue utilizada por otros investigadores40. Consiste en
desplazar los vapores del vino con un gas inerte, por ejemplo el nitrgeno41,
que borbotea en el vino y arrastra preferentemente las sustancias de mayor
tensin de vapor.
x La extraccin por medio de un disolvente orgnico y posterior eliminacin de
ste por destilacin es una tcnica conocida desde muy antiguo. Ya sobre 1940
se utiliz42 emplendose distintos disolventes como el ter de petrleo y
pentano. Desde entonces han sido muchos los disolventes empleados43, as
como sus mezclas44. Se utilizan indistintamente embudos de decantacin45,
extractores en continuo46, as como tcnicas con ultrasonidos47. Las variables
son muy numerosas, siendo las ms importantes el tipo y cantidad de
disolvente, el volumen de muestra a tratar y el tiempo de extraccin.
38
Cela R. et al, Tcnicas de separacin en Qumica Analtica, (2002)

Varclcel M. et al, Tcnicas Analticas de separacin, (1988)
39
Nawar W. et al, Anal. Chem., 32, 1534-1535, (1960)
40
Rankine B. C., J. Sci. Food Agric., 4, 79-91, (1963)
41
Ortega-Heras M. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)
Mato F. et al, Ann. Quim., 79, 121-132, (1983)
42
Moio L. et al, Ital. Food Sci., 3, 265 (1995)
Van Wyk C.J. et al, J. Food Sci., 32, 313-333, (1976)
Peynaud E., Rev. Vitic., 87, 362-382, (1937)
43
Blanch G. P. et al, Food Chem., 56, 439-444, (1996)
Carnacini A.B. et al, Am. J. Enol. Vitic., 31, 131-136, (1980)
Cobb C.S. et al, J. Agric. Food Chem., 17, 656-658, (1978)
Cobb C. S. et al, J. Agric Food Chem, 25, 197-199, (1978)
44
Usseglio Tomasset L., Bull. OIV, 623, 19-34, (1983)
Drawert F. et al, Vitis, 5, 351-376, (1966)
45
Cobb C. et al, J. Agric. Food Chem., 26, 197-199, (1978)
46
Gutirrez A.R. et al, Vitivinicultura, 9, 44-47, (1990)
47
Mecozzi M. et al, J. Chromatogr. A, 963, 363-373, (2002)
INTRODUCCIN
33
__________________________________________________________________
x La destilacin y extraccin simultneas fue un mtodo desarrollado

inicialmente para el estudio de aceites esenciales vegetales48 y posteriormente
ha sido aplicado a los vinos por algunos autores.49 No obstante, ha sido poco
estudiado.
x La desmixtura o microextraccin es un mtodo de concentracin conseguido
por saturacin de sales minerales, y posterior adicin o no de disolvente como
fase orgnica, por medio del cual, algunos compuestos poco solubles en agua
pasan a la fase alcohlica, o bien a la fase orgnica que se forma si se utiliza un
disolvente. La tcnica consiste en aadir al vino las sales en proporciones
adecuadas, agitar y disolver, aadir el disolvente (en caso de utilizarse) y dejar
que se produzca la separacin de fases encontrndose en la fase alcohlica u
orgnica los compuestos extrados50.
x Extraccin con fluidos supercrticos. Es una tcnica que emplea un disolvente
en condiciones supercrticas. Estos disolventes presentan propiedades
intermedias entre un gas y un lquido, lo que favorece su penetracin en
diferentes matrices y, por tanto, la solubilizacin de los solutos. Su aplicacin
como tcnica de preparacin de muestras a escala analtica ha abierto nuevas
perspectivas, no solamente porque sus aplicaciones simplifican la preparacin
de la muestra, sino porque se ha planteado la posibilidad de la automatizacin
de todo el proceso analtico. Donde ms se ha utilizado es en el campo
medioambiental y en el anlisis de alimentos, incluido el vino51.
x Anlisis por espacio de cabeza. El vino se satura con una sal soluble para
disminuir la presin de vapor del agua y establecido el equilibrio lquido- vapor
se cromatografa esta ltima fase52.
48
Likens S. T. et al, Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 64, 5-13, (1964)
Mesias J.L. et al, Sem. Vitiv., 32, 519-523, (1987)
50
Senz C. et al, Chromatographia, 51, 221-226, (2000)
51
Karasek P. et al, J. Chromatogr. A, 1002, 13-23, (2003)
Levy J.M., Supercritical fluid sample preparation: A selective extraction strategy, LCGC, (2000)
Smith R.M., J. Chromatogr. A, 856, 83-115, (1999)
52
Castro R. et al, J. Chromatogr. A, 995, 11-20, (2003)
Rodrguez-Bencomo J. J. et al, J. Chromatogr. A, 991, 13-22, (2003)
Conde J.E. et al, Food Chem., 80, 125-133, (2003)
Nez A. J. et al, Chromatographia, 21, 44-48, (1986)
Brander C. F. et al, Am. J. Enol. Vitic., 31, 69-75, (1980)
Drozd J. et al, J. Chromatogr. A., 165, 141-165, (1979)
Murray K. E. et al, J. Chromatogr A., 135, 49-55, (1977)
49
34
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
x Extraccin en fase slida o Solid Phase Extraction53 (SPE). Consiste en hacer

pasar la disolucin que contiene los analitos a estudiar sobre una fase slida
que los adsorbe de manera especfica. Con ella se reduce el uso de disolventes
orgnicos y la utilizacin de material caro y frgil.
x Tambin una tcnica de pervaporacin se ha venido utilizando recientemente
en la industria enolgica54. Consiste en la separacin de voltiles del vino a
travs de una membrana colocada en un pervaporador. A travs de esta
membrana pasan los compuestos en estudio a una cmara donde se recogen en
un portador en el que se disuelven para ser medidos posteriormente.
x La microextraccin en fase slida o Solid Phase Microextraction (SPME), es
la tcnica ms actual y prometedora, adems de por su sencillez por los buenos
resultados obtenidos55. Consiste en la utilizacin de una fase estacionaria donde
se adsorben los analitos a estudiar directamente de la matriz, sin utilizar
disolventes orgnicos. Debido al xito alcanzado se viene utilizando en
numerosos campos: qumicos, medioambientales, alimentarios, forenses, etc.
x Recientemente un nuevo mtodo de extraccin, ha sido introducido en el
anlisis de compuestos orgnicos en matrices acuosas. La tcnica se llama " stir
bar sorptive extraction" (SBSE)56. Utilizando una varilla de agitacin recubierta
con una fase de silicona, los compuestos orgnicos pueden ser extrados de
muestras acuosas. Los resultados obtenidos son muy buenos.
Finalmente, comentar que son muchos los mtodos de extraccin que han
sido desarrollados para la determinacin de voltiles en el vino. Sin embargo, est
generalmente admitido que ninguno de ellos cubre todas las necesidades
requeridas. Para cada problema en concreto la tcnica a aplicar es distinta y para
conocer todos los compuestos aromticos, es necesario combinar distintos mtodos
de extraccin que nos den un conocimiento ms completo de estos57.
1.5.2.- Tcnicas de determinacin

Una vez que se han obtenido los extractos y que contienen los compuestos a
estudiar, el siguiente paso es su determinacin.
53
Arrhenius S.P. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 1085-1090, (1996)

Luque de Castro M. D. et al, J. AOAC Int., 86, 394-399, (2003)
55
Lord H. et al, J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)
56
Dez J. et al, J. Chromatogr. A, 1025, 263-267, (2004)
Sandra P. et al, J. Chromatogr. A, 928, 117-126, (2001)
David F. et al, J. Microcolumn Sep., 11, 737-747, (1999)
57
Ortega-Heras M. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)
54
INTRODUCCIN
35
__________________________________________________________________
Fue alrededor de 1960 cuando aparecieron nuevas tcnicas de anlisis, en

especial la cromatografa gaseosa (CG), que permiti introducir al estudio de los
aromas, nuevas y numerosas aportaciones efectuadas por distintos autores58, que
marcaran la pauta de posteriores trabajos.
Sobre los aos 50, antes de la introduccin de la CG, el anlisis de los
voltiles del vino se realizaba partiendo de cantidades muy grandes de material,
que eran sometidos a destilaciones fraccionadas y cromatografa en columna59 con
el objeto de obtener fracciones enriquecidas de las distintas familias de
compuestos. La separacin final se realizaba por cromatografa de papel o en capa
fina y la identificacin, mediante la aplicacin sobre las placas cromatogrficas de
distintos reveladores ms o menos selectivos. De esta forma y tras un tedioso
trabajo se consiguieron identificar y cuantificar algunas decenas de compuestos.
En la mayora de los casos, la informacin obtenida era de tipo cualitativo,
debido a la pequea capacidad de resolucin de las tcnicas cromatogrficas
empleadas entonces. Por ello, los primeros investigadores en este campo estuvieron
centrados, sobre todo, en el tratamiento de la muestra antes del anlisis, y a ellos
debemos, en gran medida, la mayor parte de los mtodos de aislamiento utilizados
en la actualidad.
La CG es una tcnica analtica de separacin que ha experimentado un gran
desarrollo desde sus inicios. Adems, sus posibilidades han ido amplindose a
medida que se ha mejorado la instrumentacin (columnas capilares, integradores
computerizados, sistemas de gradiente de temperatura, nuevos detectores, etc.).
Esta tcnica cromatogrfica es la que ofrece mejor poder de resolucin para los
compuestos voltiles. Su principal limitacin se encuentra en la labilidad de los
solutos, los cuales deben ser estables a la temperatura requerida para su
volatilizacin.
En CG la fase mvil es un gas, mientras que la fase estacionaria puede ser un
slido adsorbente, un lquido retenido en un soporte slido (como es el caso de las
58
Cordonnier R., Rev. Fr. Doenol., 53, 15-26, (1977)

Bayonove C., Ind. Alim. Agric., 88, 1559-1567, (1971)
Ribereau-Gayon P., et al, Bull. O.I.V., 44, 428-466, (1971)
Suomalainen H. et al, J. Inst. Brewing, 73, 477-484, (1967)
Webb A.D. et al, Adv. Appl. Microbiol., 15, 317-353, (1963)
Khun R. et al, Angew. Chem. Int. Edit, 67, 32-41, (1955)
59
Garoglio P. G.,Nuovo trattato di enologa, (1953)
36
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
columnas empaquetas) o un lquido impregnando la pared interna de una columna

capilar.
La CG acta globalmente como instrumento, ya que realiza tanto la
separacin como las determinaciones cuali y cuantitativas de los compuestos en
estudio. Por tanto, se encuadra dentro de las tcnicas de separacin que tienen
incorporado un sistema de deteccin.
En CG, la mezcla a separar, una vez volatilizada, se hace pasar a travs de la
columna con la ayuda de un gas inerte, basndose la separacin en la distinta
velocidad de los compuestos a su paso por sta, los cuales van llegando a
continuacin al sistema de deteccin. Las seales del detector se registran
adecuadamente obtenindose una serie de picos que constituyen el cromatograma.
La posicin de los picos (tiempo de retencin) se utiliza con fines cualitativos,
mientras que el rea o la altura de los mismos se relaciona con la concentracin de
los compuestos.
Los componentes de un cromatgrafo de gases son:
x Sistema de suministro del gas portador, generalmente es una botella de gas a
presin, con un manorreductor a la salida y con un sistema de regulacin y
medida del caudal. Su misin es llevar la mezcla de los solutos desde que se
introduce en el sistema cromatogrfico hasta la salida del detector, pasando a
travs de la columna donde se produce la separacin. Debe ser qumicamente
inerte y no interaccionar ni con la columna ni con los componentes de la
mezcla.
x Sistema de introduccin de la muestra, cuya configuracin vara en funcin del
estado fsico de la misma y el tipo y capacidad de la columna utilizada. Este
sistema pone en contacto la muestra con la corriente de gas portador.
x Sistema de control de la temperatura. Existen tres zonas del cromatgrafo
donde esta variable debe controlarse: en la zona de inyeccin, en la columna y
en el detector. Desde el punto de vista de la separacin cromatogrfica, es en la
columna donde mayor incidencia tiene esta variable, ya que de ella depende el
xito de la separacin. Para controlar la temperatura de la columna, sta est
situada en el denominado horno del cromatgrafo, que dispone de un sistema
de calefaccin elctrico con un sistema de ventilacin adecuado, regidos ambos
por un sistema electrnico.
x Columna, se trata del componente principal del cromatgrafo, ya que es donde
se produce la separacin de los compuestos. En ella se encuentra la fase
INTRODUCCIN
37
__________________________________________________________________
estacionaria (lquida o slida). Presenta distintas medidas o tamaos segn el

tipo de aplicacin.
x Sistema de deteccin, situado a la salida de la columna. A travs de l pasa el
gas portador con los compuestos ya separados. Cada vez que pasa un
compuesto se genera una seal elctrica que es amplificada adecuadamente.
x Registrador, al que llega la seal elctrica amplificada y da lugar al
cromatograma. A partir del mismo se obtienen los datos cuali y cuantitativos.
x Integrador- computador, es el sistema informtico incorporado al cromatgrafo
para la toma y tratamiento de datos. Realiza automticamente las operaciones
de integracin de picos, medida de los tiempos de retencin, clculos con
estndares e imprime el informe final del anlisis.
La incorporacin de la CG y la columna capilar en el anlisis del aroma, ha
permitido la identificacin y cuantificacin de los voltiles del vino. Sin embargo,
todava el estudio de un extracto tan complejo no es tarea fcil.
La inyeccin cromatogrfica es un parmetro importante a valorar, ya que la
precisin del proceso cromatogrfico viene determinada por la calidad de la
inyeccin. Las formas de inyeccin ms comunes son:
x Split60o divisin de flujo, donde una vez volatilizada la muestra se desprecia
un fraccin del volumen inyectado, por lo que frente a otros tipos de inyeccin
requiere una superior concentracin del extracto.
x Splitless61o flujo sin dividir, donde una vez volatilizada, toda la muestra pasa
a la columna.
x On-column62o en columna, donde la muestra no sufre un paso previo de
volatilizacin, sino que se inyecta directamente en la columna en forma lquida.
Las tres tcnicas permiten el anlisis de muestras que contengan una cierta
cantidad de no voltiles, las dos primeras por quedar retenidas en el inyector, y la
60
Ortega C. et al, J. Chromatogr. A, 923, 205-214, (2001)

Condon R. D., Anal. Chem., 31, 1717-1723, (1959)
61
Grob K. et al, J. Chromatogr. Sci., 7, 584-589, (1969)
62
Grob K., J. HRC & CC, 1, 263-265, (1978)
Schomburg G. et al, J. Chromatogr. A, 142, 87-89, (1977)
38
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
ltima si se coloca una precolumna que peridicamente sea reemplazada o

limpiada.
La inyeccin ms utilizada tradicionalmente en el anlisis de los aromas es
en split. Las razones son varias: su sencillez, dar bandas cromatogrficas ms
estrechas, permite introducir muestras sucias y los tiempos de retencin que se
obtienen son muy reproducibles.
Ahora bien, la inyeccin en split obliga a despreciar la mayor parte de la
muestra inyectada, por lo que comparando con otras tcnicas de inyeccin, requiere
una concentracin de extracto superior.
La inyeccin en splitless evitara tener que concentrar la muestra de forma
tan exhaustiva. Sin embargo, difcilmente va a poder aplicarse a extractos
aromticos obtenidos segn esquemas clsicos63.
Finalmente, la inyeccin en columna, no resulta prctica con muestras
sucias, como son la mayora de las que se obtienen con las operaciones de rutina
en el estudio de los aromas.
Por tanto, la inyeccin en el cromatgrafo tambin es algo complejo desde el
punto de vista cuantitativo. Se complica, adems, si el extracto tiene compuestos
no voltiles.
La CG es muy til cuando pretendemos identificar los compuestos que
determinan una caracterstica aromtica conocida. Por lo tanto, es necesario
conocer los umbrales a partir de los cuales el producto mejora o se desvirta.
La informacin que nos pueda suministrar la CG en el control de calidad
ser mayor cuanto mejor conozcamos el perfil cromatogrfico de la fraccin
aromtica de nuestro producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de
datos del producto en las diferentes etapas de elaboracin y en diferentes aadas, y
relacionar estadsticamente compuestos con ciertas anomalas.
Fue entre 1976 y 1982 cuando comenz a utilizarse la determinacin de
compuestos con contribucin al aroma para tratar de establecer clasificaciones
63
Grob K, Classical Split and Splitless Injection in Capillary GC, (1988)

Grob K. et al, J. HRC & CC, 1, 57-61, (1978)
INTRODUCCIN
39
__________________________________________________________________
varietales64. Por esta poca tambin comienzan a estudiarse los vinos portugueses
desde el punto de vista de los voltiles65.
Adems, otros investigadores, aplican los mtodos de la cromatografa
gaseosa, para la identificacin de compuestos66, comenzando a trabajarse en vinos
varietales concretos, como el Moscatel Blanco del Piamonte67. Por esa misma
poca se elabora un estudio sobre la aplicacin del arrastre por nitrgeno para la
determinacin de steres68. Al mismo tiempo que otros investigadores hacen lo
propio, pero refiriendo el estudio al aroma de mostos y uvas.
Tambin en esa misma poca (1982), se conocen estudios sobre vinos de
Borgoa69 y vinos italianos70, mediante el uso de columnas capilares.
Son muchos los autores y los libros que a partir de entonces se conocen
sobre los aromas de bebidas alcohlicas71 y en concreto sobre el vino. Se efectan
tambin distintos trabajos sobre los aromas de diferentes variedades de Vitis
Vinifera72, al igual que un grupo de investigadores del Instituto de Fermentaciones
Industriales que destacan en la tarea del conocimiento de los voltiles en el vino73.
Actualmente, los numerosos trabajos de investigacin que existen dan
informacin abundante sobre la composicin de los aromas en uva, vino y
aguardientes diversos74.
64
Noble A.C., Vini dItalia, 11, 325-340, (1982)

Da Cunha A. et al, Ann. Inst. vino Porto, 32, 243- 251, (1979)
Da Cunha A. et al, Ann. Inst. vino Porto, 32, 253- 269, (1979)
66
Donath- Jobbagy A. et al, Qual. wines, 20, 245-253, (1979)
Shinohara T. et al, Agri. Biol. Chem. , 40, 2475-2477, (1976)
67
Usseglio-Tomasset T. et al, Ann. I. Sperim. loenolog. Asti, 80, 3-13, (1980)
Usseglio-Tomasset T., Ann. I. Sperim. loenolog. Asti, 482, 47-56, (1980)
Usseglio-Tomasset T. et al, Vignevini, 103, 33-38, (1979)
68
Maynar J.I., Sem. Vitivin., 70, 2463-2467. (1980)
69
Dubois P. et al, Rev. Fr, Doenol., 4, 51-53, (1982)
70
Bertuccioli M et al, Vini dItalia, 3-4, 62-68, (1982)
Bertuccioli M. et al, Vini dItalia, 6, 149-156, (1982)
Carnaccini A. et al, Vini dItalia, 6, 106-112, (1982)
71
Nykanen L. et al, Aroma of beer, wine and distilled alcoholic beverages, (1983)
Piggot J.R., Flavour of distilled beverages: origin and development, (1983)
72
Mesas J.L. et al, Rev. Fr. Doenol., 4, 55-60, (1982)
73
Gassiot M. et al, Afinidad, 5-6, 207-212, (1983)
74
Peinado R. A et al, Food Chem., 84, 585-590, (2004)
Hummel T. et al, Appetite, 41, 197-202, (2003)
65
40
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
Sin embargo, a pesar de la cantidad de estudios y datos sobre el tema, no se

ha llegado todava a establecer conclusiones definitivas, que hagan posible la
diferenciacin absoluta de distintos tipos de vino. Esto es debido por una parte, a la
riqueza y variedad de los propios compuestos aromticos del vino (una sustancia
presente en una pequea cantidad, puede ser responsable del aroma caracterstico
de un vino, mientras que otras en mucha mayor proporcin no parecen afectar en la
misma medida), y por otra, las tcnicas de anlisis resultan complejas al tener que
determinar sustancias en concentraciones tan bajas.
En el vino se han identificado ms de 1000 compuestos voltiles (esta
cantidad avanza a medida que avanzan los sistemas de deteccin) con una
concentracin total de 0.8-1.2 g L-1, que tienen un papel importante en la calidad y
tipifidad del vino, confirindole su personalidad, aunque hasta ahora slo se tiene
la certeza de que unos pocos participan en el aroma. Muchos de ellos se sabe que
existen, pero no se conoce su significado para la cata. Tampoco debemos pensar
que los identificados con la nariz son los de mayor concentracin.
Algunos de los componentes del vino se encuentran en cantidades
inapreciables, por lo que es necesario el tratamiento previo de las muestras con
objeto de proceder a la concentracin de dichos componentes.
Estas razones han inducido al desarrollo de diversas metodologas,
propuestas por distintos autores,75 las cuales muestran en comn: la utilizacin de
la CG; los gases portadores ms utilizados son el nitrgeno y el helio; las columnas
son variadas, destacando las Carbowax 1520 y 20M, ESD, FFAD, DEGS, OV1,
Poropack Q y Tenax Gc y el detector ms utilizado es de ionizacin de llama
(FID). An as, la bsqueda de nuevos productos sigue siendo un proceso
complejo.
Aunque HPLC (cromatografa lquida de alta resolucin) se ha utilizado para
separacin y cuantificacin76, realmente no es una buena alternativa. La eficacia en
la separacin es un problema, el anlisis es largo, y el acoplamiento con masas
(HPLC-MS) es todava bastante complicado, sin embargo la deteccin por
acoplamiento de CG y MS, se viene utilizando con frecuencia para el anlisis de
aromas, de manera que est sustituyendo al FID. Desde el punto de vista de la
separacin analtica, resulta ms ventajoso hacer acoplamientos con tcnicas
75
Ribereau-Gayon P., Bull. O.I.V., 44, 428-466, (1971)

Prillinger F., Bull, OIV, 44, 548-560, (1971)
Cordonnier R., Bull. OIV, 44, 1128-1148, (1971)
76
Escobal A. et al, J. Chromatogr. A, 823, 349-354, (1998)
INTRODUCCIN
41
__________________________________________________________________
basadas en distintos principios, los cuales han sido utilizados, aplicados con xito
en la separacin e identificacin de aromas complejos77.
Una propuesta que proporciona un gran conocimiento sobre los voltiles de
determinadas matrices, como es el vino, es el caso de la CG Multidireccional
(CGMD). Aunque la introduccin de la columna capilar optimiz la separacin de
compuestos, la utilizacin de una sola columna en matrices complejas, como es el
vino, a menudo no es suficiente para separar determinados analitos. La CGMD
permite la conmutacin de varias columnas de distinta fase estacionaria y con ello
la posibilidad de optimizar el anlisis segn la tcnica utilizada. Una fraccin del
eluato de la primera puede ser desviada hacia la segunda antes de llegar al
detector78. Este dispositivo puede automatizarse, pero tiene la desventaja de que es
necesario duplicar la instrumentacin.
Los estudios clsicos, por as llamarlos, nos permiten obtener una
informacin, sobre todo, de compuestos mayoritarios, pero sin embargo, hay notas
del aroma que no pueden explicarse con datos cuantitativos extrados de un
cromatograma. Por esto, la tendencia para responder a estas cuestiones es la
realizacin de ensayos olfatomtricos. Estos se basan en desviar el flujo de salida
de la columna hacia un portal de olfaccin de forma que puedan ser registrados los
olores y la intensidad de cada uno de los compuestos eluidos a travs de la columna
capilar.
La deteccin olfatomtrica o sniffing permite determinar el perfil
aromtico de los vinos a partir del anlisis cromatogrfico.
El olfatmetro puede ser un portal olfatorio donde un panel de jueces,
debidamente entrenados, huelen los extractos a la salida del cromatgrafo79, o
77
Kourkoutas Y. et al, Food Chem., 82, 353-360, (2003)

Kotseridis Y. et al, J. Enol. Viticult, 49, 44-48, (1998)
Perez M.S. et al, Chromatographia, 47, 427-432, (1998)
Chamblee T. S. et al, J. Agric. Food Chem., 39, 162-169, (1991)
Maarse H. et al, Distilled beverages flavour, (1989)
Chamblee T. S. et al, J. Chromatogr. A, 330, 141-151, (1985)
Teitelbaum C.L., J. Agric. Food Chem., 25, 466-470, (1977)
78
Eshwar J. et al, J. Agric. Food Chem., 50, 5797-5802, (2002)
Wright D.W., Food Sci Tech., 79, 113-141, (1997)
79
Schneider R. et al, J. Chromatogr. A, 936, 145-157, (2001)
Charles M. et al, J. Agric. Food Chem., 48, 70-77, (2000)
Hashizume K. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 1333-1337, (1997)
Priser C. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 3511-3519, (1997)
Guth H., J. Agric. Food Chem., 45, 3022-3026, (1997)
42
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
bien un olfatmetro electrnico o nariz electrnica80 que puede entrenarse para

reconocer y diferenciar el aroma del vino normal, frente a olores anmalos, y en
consecuencia clasificar las muestras. Para ello basta con someter la muestra a un
espacio de cabeza que se hace incidir en un grupo de sensores, midiendo la
respuesta de stos. Una vez puesto a punto el sistema, cada determinacin es
cuestin de minutos.
A pesar de que las apreciaciones nasales son ms discriminantes y
reproducibles que las bucales y que en la descripcin de la singularidad de un vino
la evaluacin por nariz es la ms apropiada, hay notas como las herbceas, de
madera o pimienta, por ejemplo, que se perciben mejor por la boca. Para simular la
va retronasal se han introducido tcnicas que retienen las percepciones
retronasales en un polmero, previo al anlisis olfatomtrico.
Las limitaciones de esta tcnica son la falta de sensibilidad para algunos
compuestos, en los que el umbral de percepcin es menor que el de deteccin y la
incapacidad de interpretar los efectos sinrgicos y antagonistas entre los distintos
compuestos aromticos.
Con la nariz electrnica, lo que se pretende es conseguir rplicas fiables del
olfato, pero con mquinas dotadas de sistemas de deteccin (sensores de gases y
espectrometra de masas) que respondan a la presencia de molculas. Las seales
emitidas por las diferentes muestras son procesadas por sistemas quimiomtricos.
La incorporacin de narices electrnicas en el campo de la enologa es algo
muy reciente81, aunque en otros sectores como son el alimentario, cosmtico o
farmacutico ya ha sido demostrada su efectividad82.
Las perspectivas en enologa son buenas, como en el caso de deteccin de
sustancias anmalas o txicas, algo muy preocupante en la industria alimentaria.
Deibler K.D. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 1616-1618, (1999)

Peter K.C. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 665-670, (1999)
Moio L. et al, Am. J. Enol. Viticult , 46, 393-398, (1995)
Chisholm M.G. et al, Am. J. Enol. Vitic , 45, 201-211, (1994)
80
Garca G. et al, Quim. Anal., 20, 3-11 (2001).
Capone S. et al, Sensor Actuat.-B: Chem., 69, 230-235, (2000)
81
Di Natale C. et al, Sensor Actuat.-B: Chem., 69, 342-347 (2000)
Escudero A. et al, J. Agr. Food Chem., 48, 4268-4272, (2000)
82
Gardner J.W. et al, Electronic noses-principles and applications, (1999)
Gonzlez Y et al, Anal. Chim. Acta, 384, 83-94, (1999)
Tan T. et al, LC-GC Int., 8, 218-225, (1995)
INTRODUCCIN
43
__________________________________________________________________
Tiene las ventajas de que el control puede ser continuo y no necesita personal
cualificado.
En resumen, hemos comentado diversas tcnicas de estudio, que a pesar de
sus limitaciones, proporcionan informacin valiosa y complementaria sobre
diversos aspectos del aroma: caracterizacin organolptica (anlisis sensorial),
composicin qumica cualitativa y cuantitativa del aroma (CG), caracterizacion
aromtica individual de los compuestos (deteccin olfatomtrica) y modelacin
quimiomtrica del aroma global (nariz electrnica).
Se ha investigado mucho ms sobre el aroma del vino que sobre el de las
uvas, en parte por tratarse de una matriz ms manejable, y en parte porque el vino
es al fin y al cabo la evolucin tecnolgica de las uvas.
En esta memoria se han puesto a punto cada una de las siguientes
metodologas, que se ven en profundidad en los captulos correspondientes.
x Extraccin liquido-liquido (ELL). Se han considerado diferentes disolventes y
sus mezclas, diferentes volmenes de fase acuosa y tambin distintos
extractores, tanto en discontinuo, continuo, como con ultrasonidos (captulos 6,
7 y 8 respectivamente).
x Microextraccin por desmezcla, utilizando diclorometano como disolvente de
extraccin y con dos tipos de detectores muy diferentes, de ionizacin de llama
y espectrometra de absorcin molecular ultravioleta visible (FID y EAM-UVVis) (captulos 9 y 10).
x Extraccin en fase slida (SPE), utilizando como fase slida cartuchos
comerciales (Zorbax C18) (captulo 11).
x Microextraccin en fase slida (SPME) en la que los analitos se adsorben
mediante extraccin en espacio de cabeza sobre una fibra de slice fundida
recubierta con una fase estacionaria adsorbente de naturaleza polimrica, sin
necesidad de utilizar ningn disolvente de extraccin (captulo 12).
CAPTULO 2
Objetivos
OBJETIVOS
47
__________________________________________________________________
2.- OBJETIVOS
La finalidad de este trabajo es contribuir al conocimiento de la composicin
del vino, en lo que a determinados compuestos voltiles se refiere y emplear dicho
conocimiento para la clasificacin de vinos.
En el desarrollo de esta memoria se han planteado dos objetivos generales,
que se pueden dividir en otros ms concretos.
Objetivo 1. Realizacin de un estudio analtico para la determinacin de
compuestos voltiles en vino.
x Bsqueda y actualizacin de la bibliografa relacionada con el tema.
x Estudio de diferentes procedimientos de extraccin y su optimizacin: lquidolquido (continuo, discontinuo y ultrasonidos), slido-lquido, microextraccin
por desmezcla y microextraccin en fase slida.
x Puesta a punto de mtodos analticos para la identificacin y cuantificacin de
diferentes aromas del vino, tanto por rectas de calibrado como por patrn
interno. Estudio comparativo de ambos procedimientos.
x Obtencin de las caractersticas analticas en los distintos mtodos.
x Comparacin de las diferentes metodologas estudiadas y seleccin de la ms
adecuada para la determinacin de los compuestos de inters.
x Aplicacin del mtodo seleccionado en muestras de vino procedentes de
distintas denominaciones de origen (Rioja, La Mancha, Valdepeas, Navarra y
Cariena).
Objetivo 2. Realizacin de un estudio quimiomtrico para la caracterizacin de
vinos procedentes de distintas denominaciones de origen.
x Bsqueda y actualizacin de la bibliografa relacionada con el tema.
x Evaluacin inicial de diferentes tcnicas quimiomtricas.
x Clasificacin de las muestras de vino en funcin de su contenido en los
compuestos voltiles objeto de estudio, empleando anlisis componentes
principales, anlisis discriminante y anlisis cluster.
CAPTULO 3
Instrumentacin y reactivos
- Instrumentos y aparatos
- Determinaciones cromatogrficas
- Determinaciones por CG-Masas
- Acoplamiento CG-EAM UV-Visible
- Otros aparatos y materiales
- Reactivos
- Patrones de compuestos voltiles
- Disolventes
- Sales
INSTRUMENTACIN Y REACTIVOS
51
__________________________________________________________________________________
3.- INSTRUMENTACIN Y REACTIVOS

Dentro de este apartado se va a describir la instrumentacin, aparatos y
reactivos generales empleados.
3.1.- Instrumentos y aparatos

3.1.1.- Determinaciones cromatogrficas
x Cromatgrafo de gases Hewlett-Packard (HP) 5890 serie I equipado con
inyector automtico y detector de ionizacin de llama (FID) y software
ChemStation A.05.02 (figura 3-1).
x Cromatgrafo de gases Varian CP-3800 equipado con inyector automtico CP
8200 (preparado para inyeccin directa y SPME) y detector, de ionizacin de
llama (FID), con software Star Chromatography workstation 5.3 (figura 3-2).
3.1.2.- Determinaciones por CG-Masas

Para las determinaciones por CG-MS se utilizaron dos instrumentos:
x HP GDC Plus con rango de masas 0:450 y una versin de software GCD-Plus
A.01.00 1996 (figura 3-3).
x HP 5989B Mass Spectrometer acoplado a un CG 5890 Serie 2 Plus con un
rango de masas 0:2000 y software G1034C versin C.0301 HP 1995 (figura 34).
52
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
x
Figura 3-1: Cromatgrafo de gases HP 5890.
x
Figura 3-2: Cromatgrafo de gases Varian CP-3800.
53
__________________________________________________________________________________
x
Figura 3-3: Cromatgrafo de gases con detector Masas HP GDC Plus.
x
Figura 3-4: Cromatgrafo de gases con detector masas HP 5989B.
54
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
3.1.3.- Acoplamiento CG-EAM UV-Vis

Se lleva a cabo la unin entre dos equipos comerciales, un cromatgrafo de
gases y un espectrofotmetro de absorcin molecular UV-Vis. El primero se trata
de un cromatgrafo (HP) 5890 serie II y el segundo es un equipo de red de diodos
HP8451 A, que lleva incorporado un microprocesador HP 85, junto con otros
perifricos (consola HP 98155 A, unidad de disco HP 9121 y un plotter HP
7475A).
El montaje utilizado se muestra en la figura 3-5. El acoplamiento entre
ambos equipos es directo, es decir, la columna cromatogrfica se une directamente
a la cubeta de medida que se encuentra en el espectrofotmetro. Se emplea una
columna empaquetada SE-30 (Kromxpek A-1411-8A) al 5% metil-silicona y
Chromosorb WHP 80/100 de dimensiones 4 m x 0.125".
(1)
FID
eliminado
x
(2)
(4)
columna
control de temperatura
cromatogrfica
(3) cubeta
Figura 3-5: Cromatgrafo de gases- Espectrofotmetro de absorcin molecular

UV-Visible.
55
__________________________________________________________________________________
El detector FID que llevaba el cromatgrafo se ha eliminado (1) y la parte

final de la columna cromatogrfica (2) (aproximadamente 30 cm) se conecta
directamente a una cubeta de flujo (3) continuo de cuarzo con 1 cm de paso ptico
(Hellma 174 QS ) colocada en el espectrofotmetro de diodos equipado con un
termostatizador por efecto Peltier (HP89090A). Este sistema se utiliza para evitar
la condensacin de los voltiles y es capaz de calentar la cubeta hasta 70 C. En el
caso del montaje de la fotografa, el portacubetas por efecto Peltier est sustituido
por un termostatizador de cubeta construido por nuestro grupo de investigacin que
se utiliz para compuestos con temperaturas de ebullicin ms altas) que las de
nuestros compuestos.
Para calentar la columna que se encuentra fuera del horno se utiliza un
controlador de temperatura (4) diseado en trabajos anteriores por nuestro equipo.
Se emplean una serie de resistencias flexibles (Forflex, TP 15 NTC 8294) que
rodean la columna y la mantienen caliente, a la misma temperatura que el horno. El
sistema consta de un termmetro (modelo 110 de Electricfor) y un termostato
(modelo TY93 de Electricfor), que ofrece continuamente el valor de la temperatura
a la que se encuentra la resistencia y que automticamente corta o acciona el
suministro de energa para su funcionamiento, con la finalidad de mantener la
columna que est fuera del horno en condiciones tales que nos permita mantener
una buena resolucin cromatogrfica.
3.1.4.- Otros aparatos y materiales

x Balanza analtica Sartorius BL120S, de una precisin de 0.0001g.
x Granatario Sartorius BL310, de precisin 10 mg.
x Micropipetas Eppendorf.
x Jeringa Hamilton 0084857 de 50 PL 805 RNE.
x Embudos de extraccin lquido-lquido de 100 y 250 mL (Afora y Pobel).
x Extractores para la ELL en continuo para disolventes ms y menos densos que
el agua (Pobel).
x Bao de ultrasonidos J.P. Selecta S.A., (40 KHz), de 5 litros de capacidad.
x Agitador orbital SBS modelo ABT-4 horizontal (Afora), con regulacin de
velocidad.
56
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
x Tubos para microextraccin con fondo cnico.

x Centrfuga Centronic (Selecta), con cabezal angular, capacidad para 16 tubos
de 15 mL y velocidad mxima de 440 r.p.m.
x Cartuchos Zorbax C18 de Agilent Technologies de 200 mg, 3 mL.
x Fibras para microextraccin en fase slida de Supelco:
1. Naranja: fase estacionaria de Carbowax/Divinilbenceno (CW/DVB) de 65
Pm de grosor.
2. Roja: fase estacionaria de Polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 Pm de
grosor.
3. Verde: fase estacionaria de Polidimetilsiloxano (PDMS) de 7 Pm de
grosor.
4. Blanca: fase estacionaria de Poliacrilato (PA) de 85 Pm de grosor.
x pHmetro Crison modelo GLP 22.
x Ordenador HP Vectra VL 420 DT, con el que se han utilizado distintos
programas:
- Microsoft Office 2000 (Word, Excel, Paint, Power Point )
- Origin 5.0
- SPSS 9.0
- Statgraphics PLus 4.0
- CS Chemdraw 3D Pro 4.0
- Chemdraw Plus 8.0
- Unscrambler 5.0
57
__________________________________________________________________________________
3.2.- Reactivos
Todos los disolventes orgnicos utilizados a lo largo de la memoria son de
calidad HPLC y tanto stos como los reactivos y las sales tienen una pureza mayor
del 99% (exceptuando los compuestos terpnicos: linalol, D-terpineol y geraniol
cuya pureza es del 98%).
3.2.1.- Patrones de compuestos voltiles

x D-Terpineol (Aldrich)
x cido heptanoico (Aldrich)
x 1-Hexanol (Sigma)
x cido hexanoico (Sigma)
x 1-Pentanol (Fluka)
x cido octanoico (Sigma)
x 2-Etilhexanol (Fluka)
x Alcohol benclico (Aldrich)
x 2-Feniletanol (Fluka)
x Decanoato de etilo (Merck)
x 3-Metil-1-butanol (Sigma)
x Etanol (Panreac)
x 3-Octanol (Aldrich)
x Fenol (Carlo Erba)
x 4-Metil-2-pentanol (Merck)
x Geraniol (Aldrich)
x Acetato de 2-feniletanol (Fluka)
x Hexanoato de etilo (Aldrich)
x Acetato de 3-metil-1-butilo (Aldrich) x Linalol (Aldrich)

x cido butanoico (Merck)
x Octanoato de etilo (Sigma)
x cido decanoico (Aldrich)
x Succinato de dietilo (Fluka)
3.2.2.- Disolventes
x Acetona (Merck)
x Hexano (Carlo Erba)
x Diclorometano (Merck)
x Isooctano (Carlo Erba)
x Etanol (Panreac)
x Kaltron (1,1,2-triclorotrifluoroetano)
(Aldrich)
x ter de petrleo (Carlo Erba y

Lab Scan)
x Metil-isobutil-cetona (Panreac)
x ter etlico (Aldrich)
x Pentano (Fluka)
58
T. CEDRN FERNNDEZ
_________________________________________________________________________
3.2.3.- Sales
x Cloruro sdico (NaCl) (Merck)
x Fosfato dicido de sodio dihidratado (NaH2PO4..2 H2O) (Merck)
x Sulfato amnico ((NH4 )2SO4) (Merck)
x Sulfato potsico (K2SO4) (Merck)
x Sulfato sdico (Na2SO4) (Merck)
El agua utilizada para preparar las disoluciones ha sido agua ultrapura,

obtenida de un sistema Millipore Milli-Q.
El vino sinttico se prepar como una disolucin hidroalcohlica al 12 %
(v/v) con un pH entre 3.0 y 3.5 ajustado con cido tartrico.
Todos los compuestos patrn utilizados, as como sus abreviaturas, frmulas,
estado de agregacin, puntos de ebullicin83 y concentraciones de las disoluciones
ms concentradas se muestran en la tabla 3-1, en la que tambin se exponen sus
nombres comunes.
Todas las disoluciones patrn de los compuestos voltiles se han obtenido
a partir del compuesto puro, disuelto en el disolvente a utilizar. Se prepararon en
primer lugar disoluciones concentradas, a partir de las cuales se obtuvieron otras
ms diluidas. En todos los casos las disoluciones ms concentradas se prepararon
por pesada.
83
Catlogos comerciales Supelco.
59
__________________________________________________________________________________
COMPUESTOS
.Acetato de
3-metil-1-butilo
.3- Metil- 1-butanol
.Hexanoato de etilo
.1 Pentanol
.1 Hexanol
.Octanoato de etilo
.2,7-dimetil-1,6octadien-3ol
.cido butanoico
.Decanoato de etilo
.Succinato de Dietilo
.2-(4-Metilciclohex3-enil)-propan-2-ol
.Acetato de
2 feniletilo
.cido. hexanoico
.3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol
.2-Feniletanol
.cido octanoico
.cido decanoico
.Alcohol benclico
.Etanol
.cido gernico
.Fenol
.cido heptanoico
.3-Octanol
.4 -Metil-2- pentanol
.2 -Etilhexanol
ABREV.
FRMULA
EMPRICA*
ESTADO
FSICO
PTO.
EBULL.
(C)
C ( mgL-1)
A3M1B
C7H14O2
lquido
141-142
1168
Linalol
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
C5H12O
C8H16O2
C5H12O
C6H14O
C10H20O2
C10H18O
lquido
lquido
lquido
lquido
lquido
lquido
131-132
167
119-177
157
208
194-197
1900
868
831
1730
987
880
D-Terpineol
AB
DE
SD
T
C4H8O2
C12H24O
C8H14O4
C10H18O
lquido
lquido
lquido
lquido
164
241
217.7
215-217
700
906
1110
537
AFE
C10H12O2
lquido
231-232
1072
Ac. Caprico AH
Geraniol
G
C6H12O2
C10H18O
lquido
lquido
202-203
229-230
876
733
Feniletlico
2FE
Ac. Caprlico AO
Ac. Cprico AD
AB
E
AG
F
C8H10O
C8H16O2
C10H20O2
C7H8O
C2H6O
C10H16O2
C6H6O
lquido
lquido
slido
lquido
lquido
lquido
lquido
220
237
269
205
78-79
250
182
892
766
607
610
532
1150
802
C7H14O2
C8H18O
C6H14O
C18H18O
lquido
lquido
lquido
lquido
223
76
128-131
182-186
1100
1404
640
960
NOMBRE
COMN
Isoamlico
AHp
3O
4M2P
2EH
x Tabla 3-1: Caractersticas de los compuestos utilizados

( * la frmula desarrollada de los compuestos aparece en el apndice E).
CAPTULO 4
Ensayos previos y optimizacin del
mtodo cromatogrfico
- Asignacin de seales y eleccin de compuestos
- Eleccin de patrn interno
- Eleccin de disolvente
- Condiciones cromatogrficas. Optimizacin del mtodo
- Caudal de gases
- Columna cromatogrfica
- Programa de temperatura
- Volumen de inyeccin
- Condiciones ptimas
- Caractersticas analticas
- Mtodos de cuantificacin
- Rectas de calibrado
- Patrn interno
- Comparativa entre los dos mtodos de cuantificacin
- Clculo de los rendimientos de extraccin
ENSAYOS PREVIOS Y OPTIMIZACIN DEL MTODO CROMATOGRFICO
63
__________________________________________________________________________________
4.- ENSAYOS PREVIOS Y

MTODO CROMATOGRFICO
OPTIMIZACIN
DEL
Antes de poner a punto cualquier mtodo de anlisis, independientemente de

la tcnica que se vaya a emplear, es necesario realizar unos ensayos previos. El
objetivo es conocer el comportamiento de los compuestos a estudiar en el sistema
que queremos emplear. Una vez realizados stos, se pasa a la optimizacin
exhaustiva de todos los parmetros que afecten a la determinacin.
Los estudios que se han realizado tienen como objetivos:
x Seleccionar los compuestos voltiles que se emplearn a lo largo de todo el
trabajo.
x Elegir un patrn interno y un disolvente adecuado.
x Conseguir la condiciones cromatogrficas ms idneas.
x Obtener las caractersticas analticas de los compuestos.
x Evaluar los modos de cuantificacin a utilizar y calcular los rendimientos de
extraccin.
4.1.- Asignacin de seales y eleccin de compuestos

El detector de ionizacin de llama ha sido el ms utilizado en CG para el
anlisis de aromas. En los ltimos aos se han ampliado los conocimientos en este
campo gracias a la incorporacin de la Espectrometra de Masas (MS). La
Espectrometra de Masas abarca distintas tcnicas que se emplean para medir las
masas de iones y su abundancia en fase gaseosa. Los pasos que sigue son:
x Generacin de molculas de fase gaseosa.
x Ionizacin de las mismas.
x Separacin segn sus masas.
La Espectrometra de Masas se ha convertido en una de las herramientas ms
verstiles y poderosas del anlisis qumico, y gracias a la variedad de fuentes
T. CEDRN FERNNDEZ
64
__________________________________________________________________
diseadas para vaporizar e ionizar las molculas que inicialmente no son gases, se
ha ampliado su aplicacin al anlisis de casi todo tipo de muestras.
Mediante CG con columna capilar acoplada a Espectrometra de Masas (CGMS), se han separado e identificado numerosos compuestos voltiles,
pertenecientes a diversas familias de aromas89.
Para elegir los compuestos a estudiar, se hizo un anlisis de vino de Rioja
por CG-MS, con la finalidad de identificar las sustancias que lo forman.
Las condiciones cromatogrficas experimentales utilizadas fueron:
temperatura del detector: 210 C
temperatura del inyector: 210 C
temperatura de la interfase: 230 C
gas portador: helio (0.9 mL min-1)
relacin de split 0.2:1
volumen de inyeccin: 2.0 PL
columna polar: Supelcowax 1090
El programa de temperatura utilizado, a partir de datos bibliogrficos y por

la experiencia previa en compuestos similares, fue el siguiente:
4 C min-1
60 C
210 C
3 min
5 min
Tiempo total empleado= 45.5 min
89
90
Demyttenaere J. et al, J. Chromatogr. A, 985, 233-246, (2003)

30m x 0.53 mm I.D., 1 m film thickness de Supelco, Bellefonte, PA, USA
65
__________________________________________________________________________________
El cromatograma obtenido en estas condiciones se representa en la figura

4-1a.
CC
x
Figura 4-1a: Cromatograma obtenido por CG-MS para muestras de vino
Algunos de los compuestos que se detectaron se indican a continuacin:

Alcoholes
-3-Metil-1-butanol
-3-Hexenol
-1-Pentanol
-1-Hexanol
-2-Feniletanol
Terpenos
-D-Terpineol
-Linalol
-Geraniol
cidos
-cido butanoico
-cido octanoico
-cido actico
-cido hexanoico
-cido decanoico
-cido frmico
T. CEDRN FERNNDEZ
66
__________________________________________________________________
steres
-Succinato de dietilo
-Acetato de 3-metil-1-butilo
-Hexanoato de etilo
-cido frmico-2-fenil etil ster
-Dodecanato de etilo (laurato de etilo)
-Octanoato de etilo
-Acetato de 2-feniletilo
-Acetato de hexilo
-Decanoato de etilo
-Nanoato de etilo
Otros
-Benzaldehdo
-2-Etiltiofeno
Este cromatograma lo dividimos en tres zonas (A, B y C), cada una de las
cuales la ampliamos (figura 4-1b) con el fin de ver mejor las seales.
6
A
5
10
7
8
2
1
11
12
15
16
13
14
x
Figura 4-1b: Cromatograma obtenido por CG-MS. Ampliacin por zonas
67
__________________________________________________________________________________
17
x
Figura 4-1b: Continuacin
De entre todos ellos se hizo una seleccin de los 17, que se indican en la
figura. Se eligieron compuestos que pertenecan a diferentes grupos o familias
qumicas (cidos, steres, alcoholes y terpenos). El nombre y abreviatura de cada
uno de ellos as como el n correspondiente a cada seal se indican a continuacin:
1 = Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
10 = Succinato de dietilo (SD)
2 = 3-Metil-1-butanol (3M1B)
11 = D-Terpineol (T)
3 = Hexanoato de etilo (HE)
12 = Acetato de 2-feniletilo (AFE)
4 = 1-Pentanol (1P)
13 = Geraniol (G)
5 = 1-Hexanol (1H)
14 = cido hexanoico (AH)
6 = Octanoato de etilo (OE)
15 = 2-Feniletanol (2FE)
7 = cido butanoico (AB)
16 = cido octanoico (AO)
8 = Decanoato de etilo (DE)

9 = Linalol (L)
17 = cido decanoico (AD)
Los espectros de masas de cada uno de estos compuestos se muestran en el

apndice C.
T. CEDRN FERNNDEZ
68
__________________________________________________________________
El aroma del vino ha atrado desde hace tiempo a numerosos investigadores,

sin embargo todava no esta claro como la interaccin entre el numeroso grupo de
compuestos que lo forman y la matriz vnica, generan todas las notas, matices,
aromas y sabores que forman el vino.
Por ello es importante tambin el estudio de otros compuestos minoritarios o
presentes en concentraciones ms bajas, aunque desde el punto de vista analtico
sean mayores las dificultades, ya que influyen de forma muy importante en el valor
sensorial de los vinos.
A continuacin mostramos en la tabla 4-1 la seleccin de los compuestos en
funcin del grupo qumico al que pertenecen.
ALCOHOLES
TERPENOS
CIDOS
STERES
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
2 Feniletanol
1-Pentanol*
Linalol
D-Terpineol
Geraniol
Ac. octanoico
Ac. decanoico
Ac. butanoico*
Ac. hexanoico*
Acetato de 3-metil-1-butilo
Hexanoato de etilo
Octanoato de etilo
Succinato de dietilo
Acetato de 2-feniletilo
Decanoato de etilo *
x
Tabla 4-1: Compuestos seleccionados

*Estos compuestos se han utilizaron puntualmente a lo largo de la memoria
A continuacin, describimos brevemente los cuatro grupos qumicos de

compuestos seleccionados:
Los steres son, cualitativamente, los constituyentes ms importantes del
vino. Tambin se consideran importantes en el aroma global del vino ya que dan el
tpico afrutado que describe a menudo a stos. Respecto a su origen, la mayora
proceden de las uvas, otro origen es el metabolismo secundario durante la
fermentacin alcohlica o bien se producen a lo largo del tiempo de
almacenamiento, la causa de esta ltima es la esterificacin de cidos con los
alcoholes:
cido + alcohol
ster + H2O
69
__________________________________________________________________________________
Los factores que ms afectan al contenido de steres son todos aquellos

relacionados con la uva (variedad, maduracin, estado sanitario, etc.), condiciones
de fermentacin (temperatura, anaerobiosis estricta, maceracin), las cepas de
levadura y la edad del vino.
Los principales steres que aparecen en los vinos, en correspondencia con
las altas concentraciones de etanol, isobutanol (2-metilpropanol) y alcohol
isoamlico (3-metil-1-butanol) son: steres de etilo, butilo e isopentilo.
El grupo de los steres de los cidos, est compuesto principalmente por etil
derivados. El acetato de etilo a concentraciones altas (mayores de 160 mg L-1) es
desagradable, pero a bajas dosis forma parte del aroma agradable del vino. El
acetato de 3-metil-1-butilo se considera responsable del aroma afrutado de los
vinos jvenes. Los steres de los cidos grasos son muy importantes en el aroma de
vinos blancos. Y a medida que se incrementa el nmero de tomos de carbono, la
percepcin organolptica se acerca ms al sabor jabonoso, alejndose del afrutado.
Los alcoholes, al igual que los steres han sido muy estudiados y son, junto
con ellos, cuantitativamente los compuestos ms importantes formados durante la
fermentacin. Sin embargo, stos al contrario que los steres, nunca han sido
considerados factores de calidad. Se han descrito como picantes, alcohlicos, etc.,
el hexanol, concretamente como herbceo, considerndose nicamente el 2feniletanol como placentero, con olor a rosa, dulce o a perfume.
Su contribucin al aroma no est claramente indicada en todos los casos, y
aun a pesar de su carcter no agradable, muchos autores sugieren que su
contribucin al aroma del vino es de calidad. Contribuyen al sabor dulce de la
bebida. Para que la sensacin sea agradable deben estar equilibrados los sabores
cidos y amargos con el dulce.
Los alcoholes presentan tambin otra peculiaridad, que es su impresin al
tacto en la lengua con sensacin ardiente, debido a su poder deshidratante y
lipodisolvente.
Los monoalcoholes presentan toxicidad que se ha comprobado ser
notablemente creciente con el nmero de tomos de carbono, y as los isoamlicos
tienen una toxicidad unas dieciocho veces superior a la del metanol.
Los alcoholes proceden, en general, de la fermentacin del azcar del vino.
Han sido demostrados dos caminos para explicar el metabolismo de este
compuesto. El primer origen descrito, es el catabolismo de los correspondientes
aminocidos (leucina para el 3-metil-1-butanol, 2 fenilalanina para el 2-feniletanol,
etc.), y el segundo es el anabolismo de aminocidos a travs del catabolismo de los
T. CEDRN FERNNDEZ
70
__________________________________________________________________
azcares. Su concentracin en los vinos puede verse alterada por distintos factores
como el estado de la uva (presencia de Botritis Cinerea), temperatura de la
fermentacin, grado de anaerobiosis, etc. En el caso del 2-feniletanol, influye
considerablemente la edad del vino, parece que es debido a un proceso de
oxidacin de la fenilalanina, sin embargo este incremento en la concentracin del
2-feniletanol con el tiempo no es sistemtico.
El hexanol tiene diferente origen, por una parte es un constituyente
importante de las uvas, y tambin se forma tras una oxidacin enzimtica de los
cidos linoleicos y oleicos durante la fase de despalillado y prensa.
Los terpenos son compuestos que crean un amplio espectro de aromas,
percibido generalmente como muy agradable. Su contribucin al aroma de los
vinos es de ciertas notas florales en el caso de linalol y geraniol y agradable, sin
definir, la contribucin del terpineol. Es decir todos ellos aportan una nota positiva
a la calidad del vino.
Los cidos son compuestos que no se describen como aromas agradables
para el vino, su individual olor se conoce o identifica con el vinagre, la
mantequilla, el queso, aceites vegetales, etc.
Se discuten diferentes vas de formacin, posiblemente el mecanismo es
una va de degradacin E-oxidacin al principio de la fermentacin y un proceso
anablico. Todos los cidos grasos con menos de 5 tomos de carbono no se
consideran de calidad, ya que indican una actuacin bacteriana o bien el inicio de
la fermentacin con levaduras esporgenas. Sin embargo, si el nmero de tomos es
mayor de 5, s constituyen factor de calidad.
De hecho, muy pocos estudios se han encontrado en la bibliografa ms
reciente sobre los cidos concretamente, y este hecho probablemente sea debido a
que su contribucin no se considera positiva.
Sin embargo, ya sobre los aos sesenta Rizzon citaba en un estudio la
relacin positiva entre la concentracin de cidos de 6, 8 y 10 tomos de carbono, y
la calidad del vino. Con esto queda demostrada, la difcil interpretacin sensorial
de estos compuestos respecto al vino.
Los cidos grasos no aparecen, o lo hacen en trazas en las uvas. Proceden de
la sntesis en las fermentaciones, con el tiempo o por bacterias. Los factores que
afectan a su concentracin son: temperatura, oxgeno, pH, etc.
71
__________________________________________________________________________________
Queda demostrada la influencia positiva de la baja temperatura de

fermentacin o una estricta anaerobiosis en el contenido total de cidos grasos.
Tambin determinadas tcnicas como son largos procesos de maceracin o
clarificaciones despus de la fermentacin son procesos que incrementan el
contenido de cidos grasos en el vino, pero no hay muchos ms datos sobre ello.
Una vez seleccionados los compuestos, se prepar una disolucin de vino
sinttico con los compuestos elegidos, y se analiz por CG-Masas, en las
condiciones iniciales citadas anteriormente. El cromatograma obtenido se muestra
en la figura 4-2.
8
10
6
9
13
11
3
12
4
14
5
15
17
16
x
Figura 4-2: Cromatograma obtenido para el vino sinttico por CG-MS

1= Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B), 2= 3-Metil-1-butanol (3M1B),
3= Hexanoato de etilo (HE), 4= 1-Pentanol (1P), 5= 1-Hexanol (1H),
6= Octanoato de etilo (OE), 7= cido butanoico (AB), 8= Decanoato de etilo
(DE), 9= Linalol (L), 10= Succinato de dietilo (SD), 11= D-Terpineol (T),
12= Acetato de 2-feniletilo (AFE), 13= Geraniol (G), 14= cido hexanoico (AH),
15= 2-Feniletanol (2FE), 16= cido octanoico (AO), 17= cido decanoico (AD)
4.2.- Eleccin del patrn interno

Como patrn interno se seleccionaron en un principio, varios compuestos:
cido heptanoico, 3-octanol, 4-metil-2-pentanol y 2-etilhexanol.
T. CEDRN FERNNDEZ
72
__________________________________________________________________
Se prepararon disoluciones en diclorometano con los compuestos en estudio

y los cuatro patrones elegidos. Se comprob cromatogrficamente que el que
mejores resultados daba era el 3-octanol ya que no interfera con ninguno de los
compuestos en estudio y su tiempo de retencin est dentro de los lmites que
marcamos a nuestro programa, adems es un compuesto que responde bien al
detector de ionizacin de llama, como puede observarse en la figura 4-3. El resto
de patrones probados (cido heptanoico, 4-metil-2-pentanol y el 2-etilhexanol se
solapaban con algunos de los compuestos en este estudio).
mVolts
2.0
1.5
1.0
3-OCTANOL (13.435)
0.5
0.0
0.4
12.75
13.00
13.25
13.50
13.75
14.00
Minutes
x
Figura 4-3: Cromatograma obtenido por CG-FID para el patrn interno 3-octanol
4.3.- Eleccin del disolvente

La eleccin del disolvente es fundamental. Por un lado, debe ser adecuado
para que todos los compuestos sean solubles en l, no debe interferir en la
obtencin de los picos cromatogrficos con el resto de compuestos con los que se
trabaja y adems es importante que como caractersticas inherentes:
x tenga baja volatilidad para evitar irreproducibilidad en las medidas,
x sea muy poco soluble en agua y no reaccione con ella,
73
__________________________________________________________________________________
x posea presin de vapor y viscosidad moderadas,

x no forme emulsiones y
x tenga buena estabilidad qumica.
Se estudi la solubilidad de los compuestos seleccionados en distintos
disolventes: diclorometano, ter etlico, hexano, metilisobutilcetona, pentano y
distintas mezclas de pentano/diclorometano (3/2, 2/1). Los compuestos eran
solubles en todos los disolventes utilizados. Con ellos se prepararon disoluciones
con los compuestos en estudio que se pincharon directamente en el cromatgrafo
para calcular los valores de las K con los distintos disolventes (apndice A).
A la vista de los cromatogramas obtenidos, donde las seales eran mayores
con diclorometano, se hizo un estudio preliminar de extraccin lquido- lquido con
el fin de evaluar las caractersticas extractivas de cada uno de ellos. Se observ
que: la MIBC extraa muy mal nuestros compuestos (solamente se obtuvieron
cinco picos claros), en ter de petrleo y pentano se extrajeron todos, pero los
rendimientos de extraccin eran menores que con diclorometano (entre 34-78%
para el ter, y 20-56% para pentano frente al 50-86% para el diclorometano), con el
problema asociado de la volatilidad. Respecto a las mezclas, no mejoraban los
rendimientos obtenidos con diclorometano solo.
Por ello, se eligi diclorometano, ya que adems de su baja volatilidad, su
seal cromatogrfica no interfiere con la de los compuestos utilizados.
4.4.- Condiciones cromatogrficas. Optimizacin del mtodo

Uno de los mayores inconvenientes que se plantea a la hora de determinar
por CG los componentes voltiles de los vinos, reside en la utilizacin de
condiciones tales que permitan obtener separaciones precisas en tiempos de
desarrollo que no resulten excesivamente largos.
Muy probablemente, la puesta a punto del mtodo cromatogrfico constituye
una de las mayores dificultades en el estudio. Resulta necesario seleccionar la
columna y las condiciones que hagan posible las determinaciones con la mayor
sencillez, dentro de la complejidad requerida. As, surgen diferentes
inconvenientes, como la separacin de determinados compuestos, las subidas en la
lnea base de los cromatogramas al utilizar diferentes programas de temperatura, e
incluso otras inherentes al trabajo en s.
T. CEDRN FERNNDEZ
74
__________________________________________________________________
Con la informacin obtenida de los ensayos previos se procedi a la

optimizacin de los distintos parmetros que afectan a la separacin y
determinacin de nuestros compuestos. Algunos de estos parmetros no se
optimizaron, ya que la experiencia previa del grupo de investigacin junto con los
trabajos bibliogrficos ms actuales, nos haban demostrado que eran los idneos.
De los parmetros que afectan a la separacin (caudal de gases, columna
cromatogrfica, programa de temperatura y volumen de inyeccin), los que se
optimizaron fueron, el programa de temperatura y el volumen de inyeccin.
4.4.1.- Caudal de gases

El gas portador es la fase mvil en CG y su misin es la de llevar la mezcla
de solutos que se introduce en el cromatgrafo hasta el detector, a travs de la
columna, donde se produce la separacin. El gas ideal debe ser qumicamente
inerte y no interaccionar ni con la columna ni con los componentes de la mezcla. El
gas utilizado debe ser siempre de gran pureza, es decir libre de sustancias ajenas
tales como el agua, los hidrocarburos y el oxgeno que pueden afectar a la fase
estacionaria. El agua y el oxgeno deterioran ciertas columnas como las de
poliamida o polister, e incluso originan picos "fantasmas" al desplazar impurezas
existentes en la columna. Los hidrocarburos ocasionan ruido de fondo elevado si se
utiliza como detector el FID.
Respecto a los gases, los ms utilizados como portador son nitrgeno, helio,
menos frecuentemente se emplea hidrgeno (tiene la desventaja de su carcter
reductor que afecta la integridad de algunos analitos), argn o incluso dixido de
carbono. La eleccin de uno de ellos depende del tipo de muestra con la que se
trabaje, del tipo de columna y del detector utilizado. Cada uno de estos gases
presenta ventajas e inconvenientes. En nuestro caso, se utiliza por experiencia
previa el helio 4.6 de pureza 99.996%, que tiene la ventaja de ser seguro y puro.
Para obtener resultados reproducibles es esencial conseguir un flujo
constante de fase mvil gaseosa, para correlacionar con fiabilidad los tiempos de
retencin de los estndares con los picos de la muestra problema. A lo largo de
nuestro trabajo se ha utilizado helio con un caudal de 0.9 mL min-1. Se utiliza este
valor porque la bibliografa y la experiencia previa ya nos haban demostrado que
era el ptimo.
Para el detector FID los gases necesarios para mantener la llama son
hidrgeno y aire (30 y 400 mL min-1, respectivamente). Se emplea tambin un
caudal de helio de 30 mL min-1, que acta como gas auxiliar.
75
__________________________________________________________________________________
El flujo de split o relacin de divisin de la muestra, tambin es un

parmetro crtico. En general, la inyeccin con split es la tcnica ms adecuada
para introducir la muestra en las columnas capilares. Este sistema de introduccin
de muestra es menos eficaz para el anlisis de trazas ya que la cantidad de
compuestos que llega a la columna se reduce, llegando a ser insuficiente para el
detector. A partir de estudios anteriores se estableci como ptimo el de relacin
0.2:1 20 (20%, suponiendo que pasa un volumen de 20 de cada 100). Por otro
lado, la inyeccin en splitless o sin divisin de muestra es una tcnica utilizada
para muestras muy diluidas, tales como el anlisis de trazas.
4.4.2.- Columna cromatogrfica

Las columnas ms utilizadas recientemente en CG son las columnas
capilares y son las que se han usado en este trabajo. Un estudio bibliogrfico91
efectuado sobre columnas para este tipo de compuestos destaca que:
x Carbowax 1500: Admite pocas posibilidades de programacin. Por encima de
120 C se produce una deriva muy acusada que obliga constantemente a hacer
correcciones. Y si se trabaja a esa temperatura los tiempos de duracin de los
cromatogramas son excesivamente largos.
x Tenax Q: No hace, en general, buenas separaciones, aunque sirve para algunos
compuestos tambin presentes en el vino, como el 2,3 butanodiol y la glicerina.
x Porapak Q: Es una buena columna para determinar alcoholes mayoritarios,
pero poco til para otros compuestos minoritarios.
x Carbowax 1540: Ofrece buenas separaciones en general, aunque tambin es
demasiado lenta.
x DEGS (Dietilglicolsiloxano): Se obtienen separaciones muy malas para las
fracciones ligeras, quedando los picos anteriores al alcohol isoamlico
enmascarados por el etanol. Si se trata de evitar este problema disminuyendo el
flujo del gas portador o la temperatura, resultan tiempos de retencin muy
largos.
91
Frmont L. et al., J. Nutrition, 128, 1495-1502, (1998)

Method 524.2, "Methods for the Determination of Organic Compounds in Drinking Water",
EPA 600/4-88/039
Griebler C. et al, Environ. Microbiol., 67, 100-109, (2001)
Fischer U. et al, Int. J. Food Sci. & Tech., 35, 81-86, (2000)
T. CEDRN FERNNDEZ
76
__________________________________________________________________
x Trimetilpelargonato: Es una columna muy lenta. Adems, a partir de los 90 C

se producen derivas que solapan los compuestos con tiempos de retencin
elevados, como es el caso del 2-feniletanol.
x HP Innowax: En esta columna la fase polar es equivalente a la fase de
Carbowax, pero con ms estabilidad trmica.
Se eligi como idnea la HP Innowax (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 Pm). Se
trata de una columna polar, con polietilenglicol como fase estacionaria, cuya
estructura qumica es:
HO-CH2 CH2 (O-CH2 CH2) n OH
Una vez seleccionada la columna y los caudales de gases necesarios, se

procedi a la optimizacin del programa de temperatura y el volumen de inyeccin.
Para ello se utilizaron las condiciones iniciales que se muestran en la tabla 4-2. As
mismo, se emplearon disoluciones de DM conteniendo los compuestos
seleccionados (tabla 4-1) a una concentracin entre 0.500 y 200 Pg mL-1.
VARIABLES
CONDICIONES
Detector
Temperatura detector
Columna
Temperatura inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
FID
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (0.9 mL min-1)
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
5 C min-1
Programa de temperatura
x
150 C
225 C
4 min
5 min
Tabla 4-2: Condiciones cromatogrficas iniciales para la optimizacin
77
__________________________________________________________________________________
4.4.3.- Programa de temperatura

La temperatura es un factor clave en CG. Existen tres zonas en el
cromatgrafo en las que debe controlarse esta variable con precisin: la zona de
inyeccin, la columna y el detector.
En la zona de inyeccin la temperatura debe ser lo suficientemente alta como
para vaporizar completamente la muestra y, a su vez, lo suficientemente baja como
para que no se produzca la descomposicin trmica de la misma.
La temperatura de la columna tiene una influencia decisiva en la separacin
cromatogrfica, ya que afecta a la constante o relacin de distribucin de los
compuestos.
En lo referente al control de la temperatura del detector, en principio tanto el
detector como las conexiones entre l y la columna deben estar a una temperatura
adecuada para que no se produzcan condensaciones que daran lugar a prdidas de
componentes menos voltiles, o a un solapamiento entre los picos.
Los estudios iniciales consistieron en obtener los cromatogramas
individuales de cada uno de los compuestos, ya que aunque se dispona de datos
bibliogrficos de partida sobre los tiempos de retencin de algunos de los
compuestos, no todos se correspondan con las caractersticas de la columna
utilizada por nosotros. Para ello, se prepararon disoluciones en diclorometano de
cada compuesto a partir de los patrones puros, las cuales se analizaron en las
condiciones iniciales de trabajo. La temperatura ptima depende de los puntos de
ebullicin de los compuestos; y no debe ser inferior a ellos ya que la retencin sera
muy acentuada.
Una vez identificados perfectamente los compuestos se busc un programa
de temperatura que los separase en el menor tiempo posible, ya que hay
compuestos con tiempos de retencin muy prximos (1-pentanol y hexanoato de
etilo, D-terpineol y succinato de dietilo) que tienen riesgo de aparecer solapados si
el programa de temperatura no se optimiza.
La descripcin de los programas de temperatura (sencillo y mltiple) y la
nomenclatura que se ha utilizado a lo largo del trabajo se indican en las figuras 4-4
y 4-5 respectivamente, en las que:
T. CEDRN FERNNDEZ
78
__________________________________________________________________
tf (minutos)
Tf (C)
ti (minutos)
V (C min-1)
Ti (C)
x Figura 4-4: Programa de temperatura sencillo
tf (minutos)
Tf (C)
t2 (minutos)
T2 (C)
t1 (minutos)
V2 (C min-1)
V1 (C min-1)
T1 (C)
x
Figura 4-5: Programa de temperatura mltiple
Ti (C) es la temperatura inicial a la cual se mantiene el horno al inicio de la

determinacin.
Tf (C) es la temperatura, que alcanza el horno al final de la determinacin.
Cuando el programa es mltiple (figura 4-5), la temperatura final de una rampa es la
temperatura inicial de la rampa siguiente. En este caso denominamos a las temperaturas:
T1 (C), T2 (C) y Tf (C).
ti (min) es el tiempo durante el cual se mantiene el horno a la temperatura inicial
(Ti).
tf (min) es el tiempo, durante el cual se mantiene el horno a la temperatura final
alcanzada (Tf). En el caso de los programas mltiples se denominan t1, t2 y tf.
V(C min-1) es la velocidad a la que el horno se calienta para alcanzar la
temperatura final. En el caso de los programas mltiples se denominan V1 y V2.
Los distintos programas de temperatura ensayados (para rampa simple y

mltiple) se muestran en las tablas 4-3 y 4-4 respectivamente. El programa
seleccionado finalmente se marca en color rojo (S).
79
__________________________________________________________________________________
A
B
C
D
E
F
S
Ti (C)
ti (min.)
v (C min-1.)
Tf (C)
tf (min)
ttotal (min)
150
75
60
70
75
60
60
4
5
3
4
4
3
4
5
4
4
3
5
5
4
225
225
210
225
225
220
170
25
25
5
30
25
20
12
44
67.5
45.5
85.6
59
55
43.5
x Tabla 4-3: Programas de temperatura con una rampa
G
H
I
J
T2
t2
v2
(C min .)
(C)
(min)
6
6
8
6
170
170
175
170
1
1
1
1
T1
t1
v1
(C)
(min)
90
90
110
90
4
4
2
4
-1
Tf
tf
ttotal
(C min .)
(C)
(min)
(min)
10
10
15
10
220
220
225
225
20
25
20
20
43.3
48.3
34.4
43.8
-1
x Tabla 4-4: Programas de temperatura con dos rampas

Para elegir el programa de temperatura ptimo, en primer lugar, se
prepararon mezclas con los compuestos que tenan los tiempos de retencin ms
prximos. La mezcla estaba constituida por hexanoato de etilo, pentanol, succinato
de dietilo y D-terpineol. Esta mezcla se analiz por CG utilizando los programas
descritos anteriormente, y a partir de los cromatogramas obtenidos se observ que
los de rampa mltiple (G-J), en las que varan ligeramente las velocidades de las
rampas, las temperaturas y los tiempos de permanencia utilizados, separaban bien
la mezcla. Desde el punto de vista de la resolucin, estos cuatro programas
permitieron obtener buenos resultados, pero en general, no difieren de los
obtenidos con alguna rampa ms simple como es el caso de la S que fue la
seleccionada.
Posteriormente, se prepar una mezcla en DM con todos los compuestos,
con esta mezcla se ensayaron los diferentes programas de temperatura tanto
simples como en dos rampas.
T. CEDRN FERNNDEZ
80
__________________________________________________________________
Desde el punto de vista de la resolucin, vemos que hay varios programas

que permiten obtener resultados satisfactorios. Elegimos un programa simple (S) y
as disminuamos el tiempo total:
4 (C min-1)
60 C
170 C
4 min
12 min
Tiempo total empleado= 43.5 min
4.4.4.- Volumen de inyeccin

El volumen de inyeccin es otra de las variables a optimizar. Las jeringas
que ms se utilizan oscilan entre 1.0 y 10.0 PL.
En nuestro caso, se compararon los resultados obtenidos con 1.0 y 2.0 PL.
Se prepararon disoluciones con 11 de los 17 compuestos seleccionados
(entre 11.2 y 225 Pg mL-1) en diclorometano, se analizaron en las condiciones
mostradas en la tabla 4-2, a excepcin del programa de temperatura que se emple
el elegido en el apartado anterior.
El estudio se hizo comparando en los cromatogramas obtenidos al inyectar
ambos volmenes, la relacin rea de la seal de compuesto (c.v.)/ rea de la seal
de patrn interno (p.i). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4-5.
81
__________________________________________________________________________________
COMPUESTOS
c.v. / p. i.
(1.0 PL)
c.v. / p. i.
(2.0 PL)
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Hexanol
Octanoato de etilo
cido Hexanico
2-Feniletanol
cido Octanico
cido Decanico
2.140.61
3.200.51
2.760.12
1.090.34
0.9020.050
0.8110.041
2.710.30
5.220.12
1.610.21
1.900.34
1.320.11
2.220.36
2.910.51
2.630.32
1.050.12
1.110.30
1.240.21
2.500.24
5.010.35
1.340.12
1.650.30
1.170.01
x
Tabla 4-5: Eleccin de volumen de muestra a utilizar
Puede observarse en la tabla 4-5 que los resultados no variaron

apreciablemente, optando por ello por utilizar el volumen de 2.0 Pl ya que el
manejo resulta ms fcil.
4.4.5.- Condiciones ptimas

En la tabla 4-6 se muestran las condiciones ptimas para la determinacin
de los compuestos voltiles seleccionados, disueltos en diclorometano.
Utilizando las condiciones ptimas se analiz una disolucin de DM que
contena: acetato de 3-metil-1-butilo, 3-metil-1-butanol, hexanoato de etilo, 1pentanol, 1-hexanol, octanoato de etilo, linalol, succinato de dietilo, D-terpineol,
acetato de 2-feniletilo, geraniol, 2-feniletanol, cido octanoico, cido decanoico, en
el rango de concentraciones entre 11.2 y 225 Pg mL-1. El cromatograma obtenido
se muestra en la figura 4-6, junto con los tiempos de retencin de cada compuesto.
T. CEDRN FERNNDEZ
82
__________________________________________________________________
VARIABLES
CONDICIONES
Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
4 C min-1
x
60 C
170 C
4 min
12 min
Tabla 4-6: Condiciones ptimas de trabajo
mVolts
4
G
(26.362)
3
HE
(8.538)
A3M1B
(5.691)
3M1B
(7.786)
1H (12.144)
OE
(14.614)
1P
(9.017)
T
(22.265)
L
(18.075)
SD
(21.753)
AO
(31.618)
2FE
(27.956)
AD
(38.752)
AFE
(25.454)
0
-1
5
10
15
20
25
30
35
Minutos
x
Figura 4-6: Cromatograma de vino sinttico obtenido en las condiciones ptimas
83
__________________________________________________________________________________
4.5.- Caractersticas analticas

Una vez obtenida una buena separacin de todos los compuestos elegidos, se
pas a estudiar las caractersticas analticas de cada uno de ellos. En concreto, se
obtuvieron las rectas de calibrado para cada compuesto, la sensibilidad, el rango
lineal, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la repetibilidad92.
La sensibilidad del mtodo para cada uno de los compuestos viene dada por
la pendiente de la recta de calibrado. Se expresa en mL Pg-1.
El rango lineal, se define como el rango de concentraciones en el que la
respuesta sigue la ecuacin de una recta es decir, no pierde la linealidad.
El lmite de deteccin (L.D.), se puede definir segn un comit especial de
la American Chemical Society como sigue93: es la concentracin ms baja de un
analito que el proceso analtico detecta de forma fiable (basado en clculos
estadsticos).
La certidumbre estadstica se expresa como lmite de confianza y, por
definicin, el lmite de deteccin de la seal del analito se encuentra en el nivel de
confianza del 99.7%, lo que equivale al triple de la desviacin estndar del fondo
(sb).
Sin embargo, lo anterior slo se refiere a la seal y no a la concentracin.
Para calcular el L.D. en trminos de la concentracin es necesario incluir la
sensibilidad del instrumento al analito o pendiente, y despejando de la ecuacin de
la recta que relaciona los datos determinados experimentalmente se obtiene:
L.D.
92
93
3 sb
pendiente
Rubinson J.F. et al., Qumica Analtica Contempornea, (2000)

Committee on Environmental Improvement. Anal. Chem. 52, 2242-2249, (1980)
T. CEDRN FERNNDEZ
84
__________________________________________________________________
El lmite de cuantificacin (L.C.) aunque no tiene un uso tan amplio como

el de deteccin, tambin se ha calculado. El lmite de cuantificacin se encuentra
donde la seal debida slo al analito es 10 veces la desviacin estndar de la seal
de fondo. Por lo tanto, la seal en el instrumento en este caso ser la seal del
blanco ms la seal del analito.
seal en instrumento = seal b + 10 sb
L. C.
10 s b
pendiente
Los valores de repetibilidad se han calculado como desviacin estndar

relativa porcentual [sr (%)], expresada como una fraccin o porcentaje de la media,
por lo que su valor se expresa en %.
s r %
s
media
u 100
Para el clculo de las caractersticas analticas, se prepararon disoluciones en

diclorometano conteniendo todos los compuestos y se inyectaron en el
cromatgrafo en las condiciones indicadas en la tabla 4-6. Las concentraciones
para cada uno de los compuestos de las disoluciones empleadas para las rectas de
calibrado se muestran en la tabla 4-7. Todas ellas se inyectaron por triplicado. Se
emple 3-octanol como patrn interno a concentracin de 15.8 Pg mL-1 y como
respuesta se emple el rea del compuesto de inters dividido por el rea del patrn
interno.
85
__________________________________________________________________________________
COMPUESTOS
Acet. de 3-metil-1-butilo
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
cido butanico
Decanoato de etilo
D-Terpineol
cido hexanico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanico
cido decanico
x
c (Pg mL-1)
1
0.416
19.0
0.501
0.503
0.502
0.801
0.302
0.401
0.106
0.101
0.201
0.201
0.503
0.201
4.50
7.50
0.601
6.59
130
8.54
3.11
8.23
12.5
5.49
111
1.44
1.78
3.36
6.60
55.4
3.66
70.4
182
317
10.4
602
11.3
5.19
16.5
18.7
11.0
166
2.87
3.52
6.72
4.72
67.0
13.8
212
3.83
0.64
26.2
76.0
17.0
10.4
82.2
1.18
17.6
90.5
8.59
7.03
10.7
18.9
20.6
22.9
1.09
194
1.09
52.4
228
47.5
6.24
31.1
31.2
22.0
62.6
17.2
14.1
20.2
23.6
13.5
31.6
18.2
13.8
18.2
93.6
494
31.7
8.31
43.3
2.76
26.4
34.0
43.1
11.1
13.4
56.5
4.38
42.2
24.3
25.3
24.3
300
750
220
100
240
200
110
140
363
220
100
110
170
100
210
150
250
Tabla 4-7: Concentraciones de las disoluciones empleadas para las rectas de

calibrado
En la tabla 4-8 aparecen reflejados los valores de las pendientes y ordenadas en

el origen (se dan valores medios con un intervalo de confianza del 95%), el lmite
de deteccin, el lmite de cuantificacin, la repetibilidad y el lmite superior
estudiado (no se ensayaron concentraciones superiores por lo que no se sabe si el
rango superior corresponde al lmite superior del rango lineal), apareciendo en el
apndice D las ecuaciones completas con sus respectivos coeficientes de regresin.
El clculo de la sr (%) se hizo con diez disoluciones, con un valor de
concentraciones intermedias del rango estudiado, se midieron tres veces cada una y
a partir de los resultados obtenidos se calcula la s y la media.
T. CEDRN FERNNDEZ
86
__________________________________________________________________
1
COMPUESTOS
Lmite
superior
(Pg mL-1)
Pendiente
(mL Pg -1 )
2
o.o.
L.D.
(intervalo de
(Pg mL-1)
confianza de 95%)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
AB
DE
SD
T
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
300
750
220
100
240
200
110
140
36.0
220
100
110
170
100
210
150
250
0.01730.0003
0.03080.0008
0.01200.0002
0.01840.0004
0.02610.0003
0.02400.0003
0.03910.0003
0.01790.0002
0.05240.0007
0.05630.0011
0.02410.0001
0.2930.008
0.01280.0002
0.5600.001
0.01200.0002
0.02120.0004
0.02420.0003
2.68E-20.42E-2
-1.400.32
2.38 E-20.39E-2
2.65E-20.67E-2
7.30 E-20.90E-2
2.28E-20.25E-2
9.73E-20.87E-2
-6.08E-20.64E-2
7.86E-40.30E-4
0.1200.016
2.17E-20.31E-2
0.1410.019
-2.54E-20.58E-2
8.67E-20.52E-2
-0.1070.016
-0.2910.025
-0.420 0.044
0.0993
0.0544
0.138
0.0333
0.0663
0.0696
0.0363
0.0927
0.0333
0.0323
0.0663
0.0567
0.0960
0.0369
0.142
0.0795
0.0696
6.1
7.5
5.9
2.4
4.8
4.2
1.1
5.0
4.3
5.8
5.3
2.3
3.3
4.4
5.9
4.4
2.8
x
0.0301
0.0165
0.0421
0.0101
0.0201
0.0211
0.0110
0.0281
0.0101
0.00980
0.0201
0.0172
0.0291
0.0112
0.0431
0.0241
0.0211
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
Tabla 4-8: Caractersticas analticas en DM de los compuestos voltiles

o.o.= Ordenada en el origen
2
L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin
4
sr (%) = Desviacin estndar relativa porcentual
1
Para conocer las caractersticas analticas en los diferentes mtodos de

extraccin utilizados lo que se hizo fue volver a preparar disoluciones de los
compuestos a estudiar en DM, llevarlas al CG en las condiciones optimizadas en
cada una de las metodologas, y a los resultados obtenidos aplicarles los
rendimientos para cada uno de los compuestos en las distintas extracciones. Los
resultados se muestran en el apartado de caractersticas analticas de cada captulo.
En el caso de SPME las caractersticas analticas se obtuvieron a partir de
disoluciones de vino sinttico a distintas concentraciones y sometidas al proceso de
extraccin como se expone en el captulo 12.
87
__________________________________________________________________________________
4.6.- Mtodos de cuantificacin

A la hora de cuantificar las muestras de vino real, la metodologa elegida fue
tanto la de patrn interno (p. i.) como la de rectas de calibrado con la finalidad de
hacer un estudio comparativo entre ambos.
4.6.1.- Rectas de calibrado

Es importante que la concentracin de las disoluciones patrn sea lo ms
prxima posible a la del problema, ya que disoluciones diferentes pueden tener
diferentes tipos de interferencias que afecten a la seal.
Para ello se prepararon disoluciones en el disolvente elegido de todos los
compuestos a concentraciones conocidas ms el 3-octanol, las cuales, fueron
inyectadas por triplicado en el cromatgrafo en las condiciones ptimas. A partir
de los datos obtenidos se calculan las rectas de calibrado de ecuacin general:
abC
donde: A es la relacin rea pico compuesto/ rea pico patrn interno

a es la ordenada en el origen
b es la pendiente
c es la relacin Concentracin compuesto/ Concentracin patrn interno
Una vez que tenemos la ecuacin de la recta para cada compuesto, las
muestras de vino real se someten al procedimiento de extraccin, al extracto se
aade el patrn interno en concentracin conocida y se lleva al cromatgrafo. A
partir de los cromatogramas obtenidos se calcula la relacin reacompuesto/reapatrn
interno, y se interpola en las rectas para obtener la concentracin del compuesto en el
extracto. Al resultado se le aplica el rendimiento para cada uno de los compuestos
en los distintos mtodos de extraccin, para calcular la concentracin en el vino.
4.6.2.- Patrn interno

Una alternativa a las rectas de calibrado como mtodo de cuantificacin, es
el mtodo del patrn interno, basado en el clculo de las constantes de
proporcionalidad ("K") entre la seal cromatogrfica (tanto en rea como en altura)
y la concentracin del compuesto voltil, refirindola al patrn interno (3-octanol).
Para ello se prepara una disolucin patrn en el disolvente elegido conteniendo
T. CEDRN FERNNDEZ
88
__________________________________________________________________
todos los compuestos a estudiar ms el patrn interno. Se analizan por CG y a

partir de los cromatogramas obtenidos se calculan los valores de K para cada uno
de los compuestos segn la siguiente ecuacin:
pi
A cv u C pi
k'
cv
A pi u C cv .
donde: Acv es el rea de la seal del compuesto voltil

Api es el rea de la seal del patrn interno
Cpi es la concentracin de patrn interno
Ccv es la concentracin de compuesto voltil
Una vez calculados los valores de las K para cada compuesto, las muestras
de vino real se someten al procedimiento de extraccin correspondiente, se separa
la fase orgnica a la cual se aade el p.i. a concentracin conocida y se lleva al
cromatgrafo. La concentracin del compuesto se calcula segn la siguiente
expresin (ecuacin 1):
C cv
A cv u C pi
K u A pi
(ecuacin 1)
Igual que en el caso de la cuantificacin por rectas de calibrado, al resultado

obtenido se le aplica el rendimiento para cada uno de los compuestos en los
distintos mtodos de extraccin.
Las constantes (K) se muestran en el apndice A, los valores son la media de
todos los datos obtenidos, ya que cada disolucin se prepar por triplicado, y cada
una de ellas se inyect en el cromatgrafo por cuadruplicado.
4.6.3.- Comparacin entre los dos mtodos de cuantificacin

Con la finalidad de hacer un estudio comparativo entre los dos mtodos de
cuantificacin, se realiz un anlisis estadstico con los valores de concentracin
obtenidos.
89
__________________________________________________________________________________
Las variaciones entre estos datos, resultado de ambos mtodos de

cuantificacin, se aslan mediante ensayos de comparacin de medias. Se hace para
cada compuesto una prueba de hiptesis de comparacin de medias en la que se
calcula el nivel de significacin (s) que es la probabilidad de que una igualdad
establecida no se cumpla. Es decir, dicho de otro modo, es el riesgo de que los
valores no se encuentren en el intervalo o lmite de confianza fijado (95%).
Proponemos una hiptesis a contrastar o hiptesis nula (H0) que establece
que la verdadera diferencia media es cero, es decir que el mtodo de cuantificacin
no ha producido ningn cambio en los resultados obtenidos. Si se rechaza la
hiptesis nula, diremos que estamos en presencia de una diferencia
estadsticamente significativa (S), y el valor de la significacin ser menor de 0.05,
en caso contrario de que s sea mayor de 0.05 diremos que la diferencia es no
significativa (NS):
H0 = no hay diferencia entre ambos mtodos de cuantificacin
Si s 0.05 se rechaza la H0 = la diferencia es significativa (S)
Si s! 0.05 se acepta la H0 = la diferencia no es significativa (NS)
Se comprueba con ello la homogeneidad de los datos obtenidos. Para el
estudio se utiliza como sofware estadstico SPSS, y se realiza en cada una de las
metodologas en las que se utilizan los dos mtodos de cuantificacin.
4.7 - Clculo de los rendimientos de extraccin

Para su clculo se utilizaron disoluciones de vino sinttico con todos los
compuestos a estudiar en concentraciones conocidas, sometidas al proceso de
extraccin, al extracto se le aade el p.i. y se inyectadan en el cromatgrafo de
gases.
Obtenidos los valores de Acv y Api (reas de las seales del compuesto y del
patrn interno, respectivamente) y conocida la concentracin de patrn interno y el
valor de la K correspondiente, calculamos la Ccv extrada segn la ecuacin 1. A
partir de estos datos y teniendo en cuenta el volumen final de fase orgnica y los
Pg de compuestos iniciales, se calculan los Pg extrados y el rendimiento de
extraccin (%) de cada compuesto a partir de las frmulas siguientes:
g compuesto extrado
compuesto extrado
C c.v. u Volumen final f.o.
g extrados
g iniciales
u 100
T. CEDRN FERNNDEZ
90
__________________________________________________________________
Como ya se dijo, todos estos estudios se hacen para cada tipo de extraccin,
y se realizan por cuadruplicado, as los valores que aparecen en las tablas de los
rendimientos son la media de los resultados obtenidos en cada ensayo.
CAPTULO 5
Procedimientos de extraccin
empleados
PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS

93
__________________________________________________________________
5.- PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS

Uno de los objetivos planteados en esta memoria es el estudio y
optimizacin de diferentes mtodos de extraccin de los compuestos voltiles a
partir de muestras de vino sinttico y posterior aplicacin a muestras de vino real.
Segn la bibliografa consultada, existen muchos procedimientos para la
extraccin de compuestos voltiles en el vino (captulo 1), hay numerosos trabajos
en este campo y todos encaminados a encontrar un sistema sencillo y prctico para
realizar el estudio de la extraccin.
Los mtodos de extraccin que se han puesto a punto se han seleccionado
adems de por su accesibilidad, por utilizar tanto mtodos clsicos como alguno
ms actual. En la figura 5-1 se muestran los procedimientos utilizados. Para todos
ellos, los extractos obtenidos se analizaron por CG con detector FID y como
estudio particular, tambin los extractos obtenidos con microextraccin por sales se
analizaron por CG con detector de absorcin molecular UV-Visible.
PROCEDIMIENTOS DE
EXTRACCIN UTILIZADOS
EXTRACCIN
LQUIDOLQUIDO
(ELL)
EXTRACCIN
EN FASE
SLIDA
(SPE)
MICROEXTRACCIN
CON SALES
DISCONTINUO
ULTRASONIDOS
CONTINUO
x
Figura 5-1: Procedimientos de extraccin empleados
MICROEXTRACCIN
EN FASE
SLIDA
(SPME)
T. CEDRN FERNNDEZ
94
__________________________________________________________________
La estructura de exposicin seguida en cada una de las metodologas

utilizadas es la siguiente:
1. Introduccin del procedimiento utilizado, en la que se da una explicacin
de la metodologa que va a usarse, anotando los campos en los que se ha
venido utilizando y realizando un estudio bibliogrfico.
2. Material especfico utilizado, si procede, en dicho procedimiento,
independientemente del material ms comn utilizado para todos ellos y
expuesto en el apartado 3 de instrumentacin general.
3. Procedimiento operativo, donde se expone a modo de receta la forma de
trabajo con las condiciones idneas, las cuales se optimizarn en los
apartados siguientes.
4. Optimizacin de las diferentes variables que afectan a la extraccin.
5. Caractersticas analticas de los compuestos seleccionados en dicho
mtodo de extraccin.
6. Cuantificacin en muestras de vino real.
CAPTULO 6
Extraccin lquido-lquido en
discontinuo (ELLd)
- Introduccin
- Procedimiento operativo
- Optimizacin de variables
- Disolvente
- Volumen de muestra
- Cuantificacin en muestras de vino real
- Patrn interno
EXTRACCIN LQUIDO- LQUIDO EN DISCONTINUO (ELLd)
97
__________________________________________________________________________________
6.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN DISCONTINUO

(ELLd)
6.1.- Introduccin
La extraccin lquido-lquido (ELL) es un proceso de transferencia de una o
varias sustancias desde una fase lquida a otra tambin lquida inmiscible con la
primera. El campo de aplicacin es muy amplio, no slo como tcnica de
separacin, sino tambin como mtodo de concentracin de alguna especie previa a
su determinacin, cuando el mtodo analtico utilizado no tiene una sensibilidad
suficiente para detectar y/o cuantificar la baja concentracin de esa especie en la
muestra inicial.
Para conseguir que el proceso sea satisfactorio, adems de la seleccin
adecuada de las condiciones tcnicas de operacin, la composicin de las fases
utilizadas desempea un papel decisivo. Aunque se pueden emplear combinaciones
de dos disolventes orgnicos inmiscibles, generalmente una fase es orgnica (la que
permite la separacin de los compuestos) y otra acuosa (suele ser la que
inicialmente contiene las mezclas de compuestos a separar).
Una vez realizada la extraccin, el extracto, o fase separada que contiene las
sustancias que buscamos, es el que se utiliza en la determinacin.
La ELL en discontinuo (ELLd), consiste en un nico equilibrio entre ambas
fases. Los resultados obtenidos con esta tcnica pueden mejorarse modificando la
relacin de volmenes, ya que esta variable acta como factor multiplicativo de la
relacin de distribucin.
La extraccin est regida por la ley de distribucin, propuesta por Berthelot
y Jungfleisch y desarrollada por Nerst, la cual establece que en el equilibrio, la
relacin de solutos entre dos fases inmiscibles es constante, siempre que dicho
soluto se encuentre en la misma forma en ambas fases94.
94
Cela R. et al.,Tcnicas de separacin en Qumica Analtica, (2002)
T. CEDRN FERNNDEZ
98
__________________________________________________________________
Considerando el equilibrio:
A a A o
donde A es el soluto distribuido entre la fase acuosa (a) y la orgnica (o), la
constante que define este equilibrio se denomina constante de particin (o de
reparto), Kd, y su expresin es:
siendo aA la actividad del soluto en cada fase (que se relaciona directamente con la
Kd
a A o
a A a
concentracin, a travs de los coeficientes de actividad). Para disoluciones diluidas,

actividad y concentracin coinciden.
La constante es proporcional a la solubilidad relativa del soluto en ambas
fases. La proporcin de soluto extrado, depende no slo de la constante de
distribucin, sino tambin de la relacin de volmenes de fase orgnica y acuosa y
de la tcnica utilizada.
Para realizar la extraccin en discontinuo se utiliza un embudo de
decantacin, que es un recipiente, generalmente de vidrio, en forma de pera o
cilndrico. Se cierra al exterior con un tapn de vidrio o tefln situado en la parte
superior y con una llave en la parte inferior. Su volumen debe ser dos o tres veces
superior a la suma de los volmenes de ambas fases, para que se pueda agitar
adecuadamente el sistema. En nuestro caso concreto, los embudos utilizados tenan
un volumen de 100 y 250 mL, pero en el mercado hay de diferentes tamaos.
La muestra de vino y los disolventes se introducen por la parte superior del
embudo y, una vez cerrado, se agita vigorosamente para conseguir el mayor
contacto posible entre las fases y favorecer as la transferencia de una fase a otra de
los compuestos a estudiar. El tiempo que debe durar la agitacin, es otro de los
parmetros a optimizar en cada caso concreto, ya que depende del tiempo que tarda
el sistema en alcanzar el equilibrio de distribucin. El tiempo suele oscilar entre 30
segundos y 30 minutos. Si uno de los disolventes es muy voltil es necesario,
durante la agitacin, dejar escapar el exceso de presin invirtiendo el embudo y
abriendo la llave. Cuando se alcanza el equilibrio, el sistema se deja en reposo
hasta que las fases se separan, lo cual a veces puede ser lento debido a que se
forman emulsiones. El modo de recoger las fases una vez separadas depender de
la densidad relativa de los disolventes utilizados.
99
__________________________________________________________________________________
Adems de la extraccin simple, tambin se utiliza la extraccin por etapas,

que consiste en realizar de modo secuencial un nmero determinado de
extracciones simples retirando despus de cada equilibrio la fase orgnica y
poniendo en contacto la fase acuosa con un volumen nuevo de fase orgnica.
Cuanto mayor es el valor de la relacin de distribucin menor ser el nmero de
extracciones necesarias para conseguir la transferencia de los compuestos a la fase
orgnica.
6.2.- Procedimiento operativo

La metodologa de trabajo que se sigui se muestra a continuacin (figura 61) y se expone a modo de receta con las condiciones ya optimizadas que sern
estudiadas en el apartado siguiente:
Poner en un embudo de decantacin 25.0 mL de vino real, o vino sinttico, que
contenga los compuestos a estudiar. Extraer con 10.0 mL de diclorometano, con
agitacin manual durante 5 minutos. Separar las fases. Tomar 5.0 mL de la
fraccin orgnica, aadir el patrn interno a concentracin conocida e inyectarla
en el cromatgrafo.
25.0 mL de vino o vino sinttico
10.0 mL de diclorometano
Fase acuosa
Fase orgnica
desechar
p.i
C.G.
x
Figura 6-1: Esquema de trabajo en ELLd
T. CEDRN FERNNDEZ
100
__________________________________________________________________
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se expusieron en el

captulo 4, apartado 4.4.5.
6.3.- Optimizacin de variables

El primer paso fue elegir un mtodo inicial, de entre los propuestos en los
datos bibliogrficos y a partir de ste ir haciendo las modificaciones oportunas en
funcin de las variables optimizadas. El mtodo se eligi adems de por la
informacin bibliogrfica, por la experiencia previa en este tipo de extraccin. Los
disolventes y otras variables se van modificando a lo largo del estudio de
optimizacin.
En primer lugar se comprob que a partir de la primera extraccin no se
obtena cantidad apreciable de ninguno de los compuestos seleccionados en
extractos sucesivos. Por este motivo se realiza la extraccin en una sola etapa. El
volumen de disolvente utilizado fue de 10.0 mL, la agitacin siempre manual y el
tiempo de agitacin elegido fue de cinco minutos, ya que la experiencia previa nos
haba demostrado que tiempos mayores a estos cinco minutos, no cambiaban
apreciablemente los rendimientos.
Las disoluciones con las que trabajamos fueron de vino sinttico con los
compuestos seleccionados, que enunciamos a continuacin, en el rango de
concentraciones comprendido entre 13.3 y 96.2 Pg mL-1.
Los compuestos utilizados fueron:
x
1-Hexanol (1H)
x
cido hexanoico (AH)
x
2-Feniletanol (2FE)
x
cido octanoico (AO)
x
3-Metil-1-butanol (3M1B)
x
Hexanoato de etilo (HE)
x
Acetato de 2-feniletilo (AFE)
x
Octanoato de etilo (OE)
x
Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B) x Succinato de dietilo (SD)
x
cido decanoico (AD)
101
__________________________________________________________________________________
6.3.1.- Disolvente
En el primer estudio se realiz una comparacin entre distintos disolventes
de extraccin con diferentes caractersticas extractivas, o bien mezclas de los
mismos95, con la finalidad de mejorar los rendimientos de extraccin obtenidos. Se
fijaron el resto de variables, que son las mostradas en la tabla 6-1 y slo se
modific el disolvente.
Respecto a las condiciones cromatogrficas utilizadas fueron las optimizadas
que se muestran en la tabla 4-6 (pgina 82).
VARIABLES
CONDICIONES
Volumen de muestra
Volumen de disolvente
Tiempo de agitacin
Modo de agitacin
25.0 mL
10.0 mL
5 minutos
manual
x
Tabla 6-1: Condiciones iniciales para la optimizacin en ELLd
La eleccin de los disolventes se hizo en base a las referencias bibliogrficas

encontradas sobre el tema. Los disolventes ensayados se indican a continuacin:
x diclorometano (DM)
x ter de petrleo (EP)
x hexano (HX)
x metilisobutilcetona (MIBC)
x pentano (P)
x pentano/diclorometano (3:2)
x pentano/diclorometano (2:1)
95
Cobb C. et al, J. Agric. Food Chem., 26, 197-199, (1978)
T. CEDRN FERNNDEZ
102
__________________________________________________________________
Para realizar el estudio se prepararon disoluciones de vino sinttico cada una

de las cuales se extrajo con el disolvente objeto de estudio, siguiendo el
procedimiento operativo indicado anteriormente. Finalmente, a los extractos
obtenidos se les aadi el p. i. y se analizaron por CG-FID.
A partir de los resultados experimentales obtenidos y siguiendo la
metodologa de clculo expuesta en el apartado 4-7 de este trabajo, se calcularon
los rendimientos de extraccin que se exponen en la tabla 6-2. Los resultados
mostrados son la media de tres determinaciones, cada una de las cuales se inyect
cuatro veces en el cromatgrafo.
COMPUESTO
DM
EP
HX
MIBC
P/DM
3/2
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
56.82.5
81.10.9
54.21.5
72.92.0
56.93.4
85.31.7
71.82.6
85.81.9
83.40.4
50.22.9
83.24.0
58.02.3
78.20.7
44.31.3
41.21.9
53.23.2
61.01.5
51.02.6
74.21.6
75.10.8
34.12.6
62.13.9
55.12.6
54.30.9
32.11.6
52.21.8
44.43.6
53.11.4
44.12.5
62.11.5
55.20.9
20.02.8
42.23.7
14.03.5
31.12.9
2.300.7
14.12.9
8.200.5
52.25.5
21.21.6
61.03.6
54.03.6
4.200.6
12.31.5
45.32.3
31.41.3
20.21.9
42.01.9
41.13.6
44.12.1
40.12.5
56.11.8
51.10.9
32.32.7
43.03.6
51.12.4
63.11.6
51.41.8
50.11.9
42.13.9
50.02.5
33.02.6
71.31.9
50.20.8
34.02.6
71.13.9
x
P/DM
2/1
52.02.6
61.10.7
50.01.5
50.22.1
40.04.1
49.32.6
34.22.9
68.12.0
50.00.9
32.12.9
69.03.6
Tabla 6-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLd
A partir de los resultados se observa que los mejores rendimientos

corresponden en la mayora de los compuestos a las extracciones realizadas con
diclorometano como puede verse en la figura 6-2, por lo que los estudios se harn a
partir de ahora con diclorometano. Estos datos coinciden con los encontrados en la
bibliografa consultada96. En el caso de la MIBC se puede observar la gran
irreproducibilidad de los resultados obtenidos.
96
Stan Kung M., Am. J. Enol. Vitic., 3, 187-190, (1980)
103
__________________________________________________________________________________
100
80
DM
60
EP
HX
Rendimiento (%)
40
MIBC
P
20
P/DM (3/2)
P/DM (2/1)
0
A3M1B
HE
3M1B
OE
1H
AFE
SD
2FE
AH
AD
AO
Compuestos
x Figura 6-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)

con distintos disolventes en ELLd
Los datos anteriores estn obtenidos con los valores de rea de pico. A modo
de ejemplo, en el anexo 6.1 se indican los rendimientos a partir de la altura de pico
obtenidos con diclorometano.
Anexo 6.1. Rendimientos de extraccin (%) para ELLd con DM respecto a las
alturas y reas
Alturas
reas
56.3r 3.0
56.8r 2.5
3-Metil-1-butanol
81.0r 1.2
81.1r 0.9
Hexanoato de etilo
53.4r 1.3
54.2r 1.5
1-Hexanol
72.6r 2.1
72.9r 2.0
Octanoato de etilo
56.1r 3.6
56.9r 3.4
86.4r 2.1
85.3r 1.7
70.1r 2.2
71.8r 2.6
cido hexanoico
86.0r 2.6
85.8r 1.9
2-Feniletanol
83.5r 0.7
83.4r 0.4
cido octanoico
49.9r 3.1
50.2r 2.9
cido decanoico
81.7r 3.6
83.2r 4.0
T. CEDRN FERNNDEZ
104
__________________________________________________________________
Como puede verse, se obtienen resultados similares utilizando las reas o las
alturas del pico, por lo que a lo largo de esta memoria se emplearn los valores de
las reas.
6.3.2.- Volumen de muestra

Se realizaron distintos estudios de extraccin modificando el volumen inicial
de vino sinttico tomado y procediendo a extraer como se expuso anteriormente
(10.0 mL de DM, agitacin manual durante 5 minutos). Los volmenes de muestra
utilizados fueron 25.0, 50.0, 75.0 y 100 mL. A partir de los cromatogramas
obtenidos se calcularon los rendimientos de extraccin (%) (tabla 6-3).
Comprobamos as, como era de esperar, que el volumen de muestra influye
en los rendimientos obtenidos, de manera que van disminuyendo a medida que
aumentamos el volumen de muestra, por lo que en los ensayos posteriores se
trabaj con un volumen de muestra de 25.0 mL.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
25.0 mL
56.82.5
81.10.9
54.21.5
72.92.0
56.93.4
85.31.7
71.82.6
85.81.9
83.40.4
50.22.9
83.24.0
50.0 mL
75.0 mL
100 mL
39.50.5
67.91.3
36.72.0
58.00.9
40.13.5
73.81.5
55.92.9
74.63.0
70.91.8
34.13.5
70.84.5
31.62.8
59.11.5
29.01.8
46.83.5
31.22.5
66.02.9
46.12.1
67.34.5
61.61.9
24.73.2
62.43.5
24.21.5
52.11.9
23.03.5
39.71.9
25.24.2
58.72.5
37.83.8
61.65.5
56.12.7
20.04.8
54.76.2
Tabla 6-3: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de muestra en

ELLd
105
__________________________________________________________________________________
La figura 6-3 es la representacin grfica de los resultados obtenidos. Se

observa claramente la disminucin en el valor de los rendimientos de extraccin a
medida que se va aumentando el volumen de la muestra.
A3M1B
100
3M1B
HE
80
1H
OE
60
SD
AFE
Rendimiento (%)
40
AH
2FE
20
AO
AD
0
25.0
50.0
75.0
100
Volumen de muestra (mL)
x
Figura 6-3: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)

con distintos volmenes de muestra en ELLd

En la tabla 6-4 se muestran las variables de extraccin optimizadas y las
condiciones cromatogrficas utilizadas en este procedimiento de extraccin, y en la
tabla 6-5 los rendimientos obtenidos para cada uno de los compuestos en estas
condiciones.
T. CEDRN FERNNDEZ
106
__________________________________________________________________
VARIABLES
CONDICIONES
Disolvente
Volumen de muestra
Tiempo de agitacin
Modo de agitacin
Diclorometano
25.0 mL
10.0 mL
5 minutos
Manual
Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
4 C min-1
60 C
170 C
4 min
x
Tabla 6-4: Condiciones ptimas en ELLd
A3M1B 3M1B HE
56.8
x
12 min
81.1
1H
OE
SD
AFE
54.2 72.9 56.9 85.3 71.8
AH
2FE
AO
AD
85.8
83.4
50.2
83.2
Tabla 6-5: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLd)

Se obtuvieron las rectas de calibrado para cada uno de los compuestos
seleccionados. Para ello se prepararon diferentes disoluciones de los compuestos a
estudiar en DM con concentraciones entre 0.500 y 200 Pg mL-1, se les aadi el p.i.
y se inyectaron en las condiciones ptimas. A los valores obtenidos de pendiente,
lmite de deteccin y lmite de cuantificacin se les aplic el rendimiento de
107
__________________________________________________________________________________
extraccin de cada uno de los compuestos en este mtodo de extraccin (tabla 6-5),
tal y como se expuso en el apartado 4-5.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1)
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
L.D.
(Pg mL-1)
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.009670.00017
0.02500.0006
0.006490.00011
0.01910.0002
0.01350.0001
0.04770.0009
0.2100.005
0.01120.0002
0.01010.0001
0.01060.0002
0.02010.0003
-4.91E-20.90E-2
-4.01E-20.31E-2
-3.71E-20.21E-2
-1.01E-30.90E-3
-2.01E-30.92E-3
-6.10E-30.10E-3
-2.01E-20.19E-2
-7.01E-20.71E-2
-5.71E-20.33E-2
-5.40E-20.14E-2
-8.90E-20.05E-2
0.0512
0.0207
0.0774
0.0276
0.0368
0.0113
0.0237
0.0338
0.0512
0.0479
0.0253
0.169
0.0685
0.255
0.0919
0.123
0.0370
0.0787
0.113
0.169
0.158
0.0841
5.0
5.1
4.2
1.7
3.1
2.2
3.2
5.1
4.0
2.2
3.1
x
Tabla 6-6: Caractersticas analticas ELLd

1

3
4
6.5.- Cuantificacin en muestras de vino real

Una vez optimizada la ELLd con muestras de vino sinttico, pasamos a
aplicar la metodologa a muestras de vino reales. Para realizar el estudio
seleccionamos cuatro vinos tintos jvenes del 2001 de la DOCa Rioja.
Se sigui el procedimiento operativo indicado en apartados anteriores y SE
analizaron con las condiciones cromatogrficas que se indican en la tabla 6-4. A
partir de los cromatogramas obtenidos, la cuantificacin se hizo tanto por
interpolacin en las rectas de calibrado, como por el mtodo del patrn interno,
como se expuso en el apartado 4.6.
T. CEDRN FERNNDEZ
108
__________________________________________________________________

Interpolando los valores de rea de pico obtenidos de las muestras de vino,
en las rectas de calibrado, y teniendo en cuenta los rendimientos de extraccin
obtenidos, se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla 6-7.
COMPUESTOS
CONCENTRACIONES (Pg mL-1)

muestra 1
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
5.700.31
2114
5.050.31
31.10.2
4.710.11
1.860.01
nd
3.980.13
15.60.2
15.40.1
2.600.30
muestra 2
4.990.71
2322
5.410.37
30.90.2
4.300.12
1.580.01
nd
3.800.10
16.80.3
12.20.2
2.330.31
muestra 3
5.620.60
2234
5.320.42
29.70.2
4.910.13
1.680.01
nd
3.620.12
10.20.1
13.10.2
2.620.34
muestra 4
5.270.21
2413
5.520.33
30.50.2
4.810.16
1.320.01
nd
3.780.13
17.90.3
13.40.1
2.540.32
Tabla 6-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLd. Rectas de calibrado

(nd: no detectado)
Observamos que las variaciones en los cuatro vinos son pequeas, pues
aunque se trata de vinos elegidos al azar, son vinos de la misma zona geogrfica y
de la misma aada.

Empleando el mtodo del patrn interno, tal y como se expuso en el apartado
4-6, en la tabla 6-8 se indica la concentracin obtenida para cada compuesto en las
cuatro muestras de vino analizadas.
109
__________________________________________________________________________________
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x

muestra 1
muestra 2
muestra 3
muestra 4
5.320.11
2063
4.950.21
29.80.1
4.530.21
1.450.01
nd
4.070.10
14.90.1
15.70.2
2.410.20
4.780.61
2423
5.360.25
29.80.1
3.990.11
1.360.02
nd
3.650.11
15.90.4
12.60.3
2.300.30
5.610.40
2133
5.260.32
29.60.2
5.010.10
1.570.01
nd
4.010.11
15.20.1
12.10.2
2.530.40
5.160.11
2313
5.460.23
30.60.1
4.780.12
1.280.01
nd
3.950.11
17.20.2
13.70.1
2.470.30
Tabla 6-8: Cuantificacin en vino real mediante ELLd. Patrn interno

(nd: no detectado)
Todos los valores de concentraciones encontrados entran dentro de los

mrgenes habituales para este tipo de vinos.
Tambin observamos a partir de los valores obtenidos, que los resultados son
similares utilizando ambos mtodos de cuantificacin. Con la finalidad de conocer
si la diferencia entre los dos mtodos de cuantificacin era significativa o no, se
realiz para cada compuesto una prueba de hiptesis (tal y como se expuso en el
apartado 4.6.3) en la que se calcul la significacin (s). Tomando como
probabilidad al 95% (nivel de confianza), se vi si el valor de la s era mayor de
0.05 con lo cual se aceptaba la hiptesis nula H0, que establece que la verdadera
diferencia media es cero, es decir, no existe diferencia significativa.
En la tabla 6-9 se indican los resultados obtenidos.
T. CEDRN FERNNDEZ
110
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
SIGNIFICACIN
0.252
0.836
0.645
0.783
0.867
0.246
*
0.252
0.282
0.131
0.402
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
Tabla 6-9: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLd)

(NS: no significativa, *: no hay datos)
Como podemos ver, a partir de los resultados obtenidos, para ninguno de los
compuestos analizados existe diferencia significativa entre los valores obtenidos
por ambos mtodos de cuantificacin.
En la figura 6-4 se muestra el cromatograma obtenido en vino sinttico con
la ELLd para los compuestos voltiles seleccionados.
mVolts
3O (13.411)
2.5
2FE
(27.914)
2.0
1.5
1.0
3M1B
(7.801)
A3M1B
(5.779)
1H (12.136)
AFE (25.462)
SD (21.778)
HE (8.627)
AH (26.407)
OE (14.689)
0.5
AO (31.642)
AD (38.781)
0.0
-0.3
5
10
15
20
25
30
35
40
Minutos
x
Figura 6-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLd
CAPTULO 7
Extraccin lquido-lquido en continuo
(ELLc)
- Introduccin
- Material especfico
- Disolvente
- Tiempo de extraccin
- Patrn interno
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO (ELLc)

113
__________________________________________________________________
7.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO EN CONTINUO

(ELLc)
7.1.- Introduccin
Actualmente, aun con la introduccin de nuevos sistemas de extraccin, se
han abierto nuevas lneas de trabajo que reactualizan la ELL en continuo97 ya que
se han producido profundas transformaciones que automatizan los sistemas y
facilitan su uso, respecto a los utilizados anteriormente98.
Estos procesos utilizan flujos de fase acuosa y de disolvente orgnico en
contracorriente, separados a travs de una membrana, por donde se produce el
intercambio de productos. Si el disolvente es voltil puede ser reciclado mediante
destilacin y condensacin. El sistema de preconcentracin, es tal que permite su
adaptacin a sistemas de CG, consiguindose lmites de deteccin espectaculares.
7.2.- Material especfico

El sistema de extraccin es diferente segn la densidad de la fase orgnica
utilizada. Si la fase orgnica es menos densa que la acuosa (figura 7-1a), el
disolvente se introduce gota a gota (1) en la disolucin acuosa mediante un sistema
de inmersin. Cuando el disolvente alcanza un nivel determinado pasa a un matraz
lateral por rebose (2), el cual se encuentra en ebullicin. El disolvente evaporado es
condensado, y se hace pasar nuevamente por la disolucin acuosa. Si el disolvente
es ms denso que la fase acuosa (como es el caso del diclorometano respecto al
vino) (figura 7-1b), se adiciona ste desde la parte superior, tambin mediante
goteo (3), y se va separando al matraz lateral que se encuentra en ebullicin, a
travs de un sistema de vasos comunicantes (4). La ventaja principal de esta tcnica
respecto a la extraccin lquido-lquido en discontinuo es que el disolvente pasa
repetidas veces sobre la disolucin acuosa que contiene los compuestos voltiles.
97
Gutirrez A.R. et al, Vitivinicultura, 9, 44-47, (1990)

Dudruet V. et al, Sci. Aliment., 3, 413-426, (1983)
Etivant P.X., Connaiss. Vigne Vin, 4, 247-265, (1987)
Guichard E. et al, Sci. Aliment., 3, 427-438, (1983)
98
T CEDRN FERNNDEZ
114
__________________________________________________________________
(a)
x
(b)
Figura 7-1: Extractores en continuo para disolventes menos (a) y ms (b) densos que
la muestra

La metodologa de trabajo que se sigui fue la siguiente:
Poner en el extractor 250 mL de muestra (vino o vino sinttico) y 100 mL de
diclorometano. A las dos horas de tener el sistema en funcionamiento tomar 1.0
mL de extracto aadir el patrn interno y analizarlo por cuadruplicado por CGFID.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se expusieron en el

Inicialmente, se realizaron una serie de ensayos previos con un extractor
para disolventes menos densos que el vino, probando en este caso como
disolventes isooctano, hexano y pentano, pero operativamente result funcionar

115
__________________________________________________________________
mal, por lo que en ensayos posteriores nicamente se utiliz el extractor para

disolventes ms densos que la muestra a extraer.
Los compuestos a estudiar fueron los mismos que en la ELLd, y los
parmetros optimizados fueron el tipo de disolvente y el tiempo de extraccin.
7.4.1.- Disolvente
El estudio se hizo con diclorometano (DM) y con una mezcla de
diclorometano/hexano (DM/HX 1/1), ya que segn datos bibliogrficos la mezcla
de disolventes est muy difundida en este tipo de extracciones.
El volumen de muestra utilizado fue 250 mL, el volumen de disolvente 100
mL y el tiempo que estuvo funcionando el sistema trabajando antes de sacar el
extracto fue de dos horas. Al extracto se le aadi el patrn interno (3-octanol) a
concentracin conocida y se analiz por cuadruplicado en el CG-FID.
Una vez obtenidos los cromatogramas, calculamos los rendimientos de
extraccin. Los resultados obtenidos a partir del rea del pico, para los dos
disolventes ensayados se indican en la tabla 7-1.
COMPUESTOS
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Hexanol
Octanoato de etilo
cido hexanoico
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
x
DM
98.72.5
59.92.8
88.42.6
85.910.2
1065
91.14.1
70.54.0
48.34.1
80.14.4
80.92.9
82.71.7
DM/HX (1/1)
46.62.0
55.73.2
81.72.7
60.08.4
92.75.4
72.83.3
58.95.8
36.75.1
73.54.8
71.42.6
76.12.0
Tabla 7-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLc
Como podemos observar los resultados obtenidos con diclorometano son

ms elevados que con la mezcla diclorometano/hexano. Para el diclorometano los
T CEDRN FERNNDEZ
116
__________________________________________________________________
valores resultaron entre 70 y 106% para los steres, entre un 60 y 86% para los
alcoholes y entre un 48 y un 83% para los cidos.
La representacin grfica de los resultados obtenidos se muestra en la figura
7-2.
120
100
80
Rendimiento (%)
60
40
DM
DM/HX
20
A3M1B
HE
3M1B
OE
1H
AFE
SD
2FE
AH
AD
AO
Compuestos
x

con distintos disolventes en ELLc
Los rendimientos de extraccin obtenidos ya sea a partir de reas o de alturas

de picos son similares. Los valores de los rendimientos respecto a las alturas se
muestran en el anexo 7-1.
En el posterior estudio de optimizacin del tiempo de extraccin se utilizar
DM como disolvente de extraccin.

117
__________________________________________________________________
Anexo 7-1. Rendimientos para ELLc respecto a las alturas.
DM
DM/HX
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Hexanol
Octanoato de etilo
cido hexanoico
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
95.62.9
60.12.1
86.72.5
82.012.1
104.46.8
90.85.6
70.03.6
46.73.6
80.55. 7
81.43.9
82.12.6
45.32.3
50.13.4
80.52.7
61.311.4
66.55.1
91.67.2
86.57.2
96.516.5
21.61.9
20.51.6
81.23.9
7.4.2.- Tiempo de extraccin

Para ver la influencia del tiempo de extraccin en los rendimientos, se fueron
tomando alcuotas a intervalos de tiempo de una hora durante 12 horas. El volumen
de extracto sacado se repon cada vez, con la finalidad de referir siempre los
clculos al mismo volumen inicial. Los extractos, una vez aadido el patrn
interno, se analizaron por CG. A partir de los resultados obtenidos (tabla 7-2) se
observ que con dos horas de extraccin era suficiente, ya que pasado este tiempo
se obtenan rendimientos de extraccin prcticamente iguales o menores.
Compuestos
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
1 hora
89.42.9
46.42.1
76.32.9
62.711.9
89.54.7
71.03.2
63.25.1
38.23.0
68.35.7
74.52.9
69.61.4
2 horas
98.72.5
59.92.8
88.42.6
85.910.2
1065.4
91.14.1
70.54.0
48.34.1
80.14.4
80.92.9
82.71.7
3 horas
98.93.0
59.43.0
88.62.1
85.99.7
1065
91.84.4
71.23.7
48.73.6
80.85.7
81.32.4
82.81.3
4 horas
87.61.9
58.72.3
76.81.2
65.89.3
84.85.4
79.41.8
67.54.4
37.52.6
71.43.3
77.21.6
72.40.5
x Tabla 7-2: Rendimientos de extraccin (%) a diferentes tiempos en ELLc
T CEDRN FERNNDEZ
118
__________________________________________________________________
En la figura 7-3 se representan las 7 primeras tomas de muestras, una por

hora, observndose la clara disminucin en los rendimientos a partir de las tres
horas.
A3M1B
120
3M1B
100
HE
1H
80
OE
SD
60
Rendimiento (%)
AFE
40
AH
2FE
20
AO
0
AD
1h
2h
3h
4h
5h
6h
7h
Tiempo
x

a diferentes tiempos en ELLc
Si comparamos los rendimientos obtenidos con la ELLc a las dos horas

(tabla 7-2) con los obtenidos utilizando ELLd con DM (tabla 6-5) se observa que:
para el acetato de 3-metil-1-butilo, hexanoato de etilo, 1-hexanol, octanoato de
etilo, succinato de dietilo y el cido octanoico los valores son ms altos (entre 81 y
106%) en el caso de la extraccin en continuo. Sin embargo para el 3-metil-1butanol, cido hexanoico y 2-feniletanol los rendimientos se ven favorecidos en el
caso de la extraccin en discontinuo, con valores entre 72 y 86%, siendo el valor de
los rendimientos muy similar en el caso del acetato de 2-feniletilo y el cido
decanoico por ambos mtodos (72 y 83% respectivamente en discontinuo y 71 y
83% en el continuo).

119
__________________________________________________________________

Una vez optimizadas las variables seleccionadas en el estudio, en la tabla 7-3
se muestran las condiciones ptimas tanto cromatogrficas como del
procedimiento, y en la tabla 7-4 los rendimientos obtenidos en estas condiciones.
VARIABLES
CONDICIONES
Disolvente
Volumen muestra
Tiempo de extraccin
Diclorometano
250 mL
100 mL
2 horas
Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
4 C min-1
60 C
170 C
4 min
x
Tabla 7-3:Condiciones ptimas en ELLc
A3M1B 3M1B HE
98.7
x
12 min
59.9
1H
OE
88.4 85.9 106
SD
AFE AH
2FE
AO
91.1 70.5 48.3 80.1 80.9
Tabla 7-4: Rendimientos en las condiciones ptimas (ELLc)
AD
82.7
T CEDRN FERNNDEZ
120
__________________________________________________________________

Tambin con este procedimiento de extraccin se obtuvieron las
caractersticas analticas. Para ello se prepararon disoluciones en DM de los
compuestos a estudiar y se analizaron en las condiciones cromatogrficas que se
indican en la tabla 7-3. Teniendo en cuenta el rendimiento de cada uno de los
compuestos de la tabla 7-4, se calcularon: la pendiente, el lmite de deteccin y el
lmite de cuantificacin, como se indica en el apartado 4-5. Tambin se muestra la
ordenada en el origen, y la desviacin estandar relativa porcentual en la tabla 7-5.
4
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1 )
o.o.
(intervalo de confianza
de 95%)
L.D.
(Pg mL-1)
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.01630.0003
0.01850.0005
0.01050.0002
0.02260.0003
0.02570.0002
0.05090.0003
0.2060.007
0.006220.00064
0.009700.00016
0.01760.0003
0.02000.0002
-3.91E-22.9E-3
-3.02E-21.3E-3
-3.54E-22.2E-3
-1.23E-31.9E-4
-1.36E-31.9E-4
-4.21E-31.0E-4
-2.34E-24.9E-3
-6.52E-22.7E-3
-6.73E-20.3E-3
-6.42E-22.1E-3
-6.95E-22.0E-3
0.0306
0.0275
0.0476
0.0236
0.0198
0.0105
0.0244
0.0601
0.0538
0.0298
0.0255
0.103
0.0915
0.157
0.0785
0.0661
0.0349
0.0812
0.201
0.179
0.0996
0.0847
5.6
5.4
4.6
2.8
3.2
3.6
5.6
4.5
2.2
3.1
1.6
x
Tabla 7-5: Caractersticas analticas en ELLc

o.o.= Ordenada en el origen, 2L.D.= Lmite de deteccin,
3
L.C.= Lmite de cuantificacin, 4sr (%) = Desviacin estndar relativa porcentual
1

Una vez optimizado el procedimiento de extraccin, igual que se hizo en la
ELLd, se aplic a muestras de vino reales, utilizando como mtodo de
cuantificacin el patrn interno y las rectas de calibrado.
Para llevar a cabo el estudio se utilizaron cuatro vinos blancos jvenes de la
DOCa Rioja, los cuales se sometieron al proceso de extraccin tal y como se ha
indicado en el apartado 7-3 y con las condiciones ptimas expuestas en la tabla 7-3.
A los extractos se les aadi el patrn interno y se analizaron mediante CG por
triplicado. La cuantificacin se llev a cabo tanto por rectas de calibrado como por
patrn interno. A las concentraciones obtenidas se les aplicaron los rendimientos de
extraccin indicados en la tabla 7-4.

121
__________________________________________________________________

Se realizaron las cuantificaciones como se expuso en el apartado 4-7. Los
resultados en Pg mL-1 obtenidos para cada compuesto se indican en la tabla 7-6.
Compuestos CONCENTRACION
muestra 1
A3M1B
1.060.02
3M1B
96.31.2
HE
0.4840.017
1H
10.11.0
OE
0.5030.112
SD
1.010.04
AFE
nd
AH
1.750.14
2FE
5.050.04
2.120.21
AO
0.3960.053
AD
x
(Pg mL-1)
muestra 2
0.9710.01
94.80.4
0.4770.009
9.100.2
0.3220.124
1.110.09
nd
1.450.12
5.460.13
2.220.20
0.3930.078
muestra 3
0.9810.03
93.30.4
0.4480.041
9.351.70
0.7910.108
0.9320.04
nd
1.490.20
5.210.18
2.140.15
0.4010.045
muestra 4
1.010.01
95.52.4
0.500.01
10.11.3
0.4710.116
1.060.05
nd
1.390.12
5.210.01
2.010.10
0.4250.056
Tabla 7-6: Cuantificacin en vino real mediante ELLc. Rectas de calibrado

(nd: no detectado)

Los resultados obtenidos se indican en la tabla 7-7.
Compuestos CONCENTRACION (Pg mL-1)
muestra 3
muestra 1
muestra 2
A3M1B
1.270.01
1.090.02
0.9800.03
3M1B
98.51.4
96.50.6
96.40.6
HE
0.5320.027
0.4890.019 0.4680.031
1H
10.41.5
10.10.4
9.781.80
OE
0.4930.122
0.3620.104 0.5210.128
SD
1.090.08
1.030.10
0.9610.06
AFE
nd
nd
nd
AH
1.870.26
1.650.24
1.560.26
2FE
5.690.08
5.520.16
5.230.19
2.400.23
2.300.23
2.150.18
AO
0.4200.083
0.4530.089 0.3980.065
AD
x
muestra 4
1.020.02
97.52.5
0.510.02
10.21.4
0.4810.119
1.070.07
nd
1.470.22
5.320.04
2.120.18
0.4450.086
Tabla 7-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLc. Patrn interno

(nd= no detectado)
T CEDRN FERNNDEZ
122
__________________________________________________________________
Todos los valores obtenidos entran dentro de los mrgenes habituales para este
tipo de vinos. El acetato de 3-metil-1-butanol es con diferencia el compuesto que
aparece a concentracin ms alta en los cuatro vinos (98.5, 96.5, 96.4, 97.5
respectivamente). Sin embargo, el acetato de 2-feniletilo no se detect en ninguna
de las muestras analizadas, igual que ocurri en la ELLd.
Si comparamos los resultados obtenidos por ambos mtodos, observamos
que los valores obtenidos son similares. Para conocer si la diferencia entre los
resultados obtenidos para cada compuesto por ambos mtodos de cuantificacin era
significativa o no, se realiz un estudio estadstico de comparacin de medias para
cada compuesto (tal y como se expuso en el apartado 4.6.3). Calculamos la s
(significacin), considerando un nivel de significacin del 95%, se compara el
valor de s obtenido con el 0.05 para ver si es mayor o no. Si s es mayor que
0.05 no existe diferencia significativa entre los valores obtenidos por ambos
mtodos de cuantificacin. Los resultados se indican en la tabla 7-8.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
SIGNIFICACIN
0.073
0.389
0.070
0.161
0.107
0.150
*
0.240
0.253
0.144
0.269
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
Tabla 7-8: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLc)

Como podemos observar, no existe diferencia significativa entre los

resultados obtenidos por ambos mtodos de cuantificacin para ninguno de los
compuestos estudiados.
Finalmente, en la figura 7-4 se muestra un cromatograma obtenido para una
muestra de vino sinttico con la ELLc utilizando las condiciones optimizadas de la
tabla 7-3.

123
__________________________________________________________________
mVolts
3O (13.411)
2.0
2FE (27.914)
1.5
3M1B (7.801)
1H (12.136)
1.0
AFE (25.462)
SD (21.778)
A3M1B
(5.779)
HE (8.627)
AH (26.407)
0.5
OE (14.689)
AO (31.642)
AD (38.781)
0.0
5
10
15
20
25
30
35
40
Minutos
x
Figura 7-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLc
CAPTULO 8
Extraccin lquido-lquido con
ultrasonidos (ELLus)
- Introduccin
- Disolvente
- Sales
- Otras variables
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON ULTRASONIDOS (ELLus)

127
__________________________________________________________________
8.- EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO CON

ULTRASONIDOS (ELLus)
8.1.- Introduccin
El espectro acstico o snico es muy amplio y dentro de l, se puede hacer
una clasificacin de distintos tipos de ondas en funcin de su frecuencia. As se
denominan subsnicas aquellas ondas cuya frecuencia est por debajo de los 20
Hz, snicas son las que presentan frecuencias comprendidas entre 20 Hz y 16 kHz,
y que representan aproximadamente los lmites de audicin, y por ltimo, ondas
ultrasnicas son las que tienen frecuencias superiores a los 16 kHz, y son las que
vamos a tratar en este apartado.
Es a partir de la segunda mitad del siglo XIX cuando comienzan a utilizarse
los ultrasonidos (us) y a conocerse sus aplicaciones.
Las ondas snicas son oscilaciones mecnicas en el tiempo y en el espacio
que tienen lugar en el seno del material en el que se propagan. A diferencia de las
ondas electromagnticas, los sonidos slo pueden propagarse en medios materiales.
Dichos medios influyen en la velocidad de propagacin y en la atenuacin99. Los
ultrasonidos causan diferentes cambios en el medio que atraviesan que se explican
mediante distintos mecanismos como son: calentamiento, cavitacin, efectos
estructurales, compresiones y descompresiones, turbulencias y otros.
Las aplicaciones de los ultrasonidos tienen efecto en un amplio nmero de
campos. De hecho, ha nacido una nueva rama de la qumica que intenta descubrir
las ventajas de los efectos de los ultrasonidos que se llama sonoqumica. Los
efectos mecnicos y fsicos de los ultrasonidos se utilizan para mejorar la limpieza
de superficies, mejorar los procesos de deshidratacin, secado y filtracin, inactivar
microorganismos y enzimas, romper clulas, desgasificar lquidos, mejorar los
procesos de transferencia de calor, acelerar los procesos de extraccin, ayudar en
procesos en los que la difusin de sustancias est presente, etc.
Existen tambin numerosos estudios referentes a la utilizacin de
ultrasonidos en el vino, tanto como mtodo de extraccin lquido-lquido asistida
99
Benson, C., Ultrasnica, (1972)
128
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
por ultrasonidos100, como en otros campos como son distintas tcnicas de
aceleracin de la maduracin o envejecimiento de diferentes vinos101.

El procedimiento de extraccin consisti en:
Poner en un vaso de precipitados de 100 mL, 25.0 mL de disolucin matriz (vino
sinttico con los compuestos a estudiar o muestras de vino real). Aadir 10.0 mL
de disolvente (diclorometano) y 4 g de NaCl. Cerrar el vaso con parafilm dejando
una pequea salida de aire mediante una aguja pinchada sobre ste, y sonicar
durante 15 minutos (procurando mantener el agua del bao a temperatura
ambiente mediante renovacin peridica de la misma). Posteriormente dejar en
reposo unos minutos para separar adecuadamente las fases. Tomar 5.0 mL del
extracto orgnico, aadir el p.i. e inyectar en el cromatgrafo de gases.
Todas las extracciones se realizaron por triplicado y cada extracto se inyect
por triplicado en el cromatgrafo, tomando como resultado de cada experimento
los valores medios de las nueve inyecciones realizadas. Como parmetro de
cuantificacin se emple la relacin de reas.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se muestran en el

Cuando se estudia un procedimiento de extraccin, existen una serie de
variables que deben optimizarse. En esta tcnica se optimizaron las variables que
se consideraron ms relevantes. No se incluye la temperatura del bao de
100
Cocito C. et al, Food Chem., 2, 311-320, (1995)

Bru E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,
Almendralejo, (1997)
Hernanz D. et al, Talanta, 50, 413-421, (1999)
101
Chingzu Chang A., Food Chem., 86, 61-68, (2004)
Chingzu Chang A. et al, Food Chem., 79, 501-506, (2002)

129
__________________________________________________________________
ultrasonidos ya que segn la bibliografa102 el cambio de esta variable no mejoraba

apreciablemente los rendimientos y adems complicaba la metodologa de trabajo.
As las variables de trabajo a optimizar fueron:
x Tipo de disolvente
x Adicin o no de sales (tipo y concentracin)
x Volumen de muestra
x Volumen de disolvente
x Tiempo de extraccin o sonicacin
Para optimizar el mtodo, las disoluciones con las que trabajamos fueron de
vino sinttico, con los compuestos seleccionados, que enunciamos a continuacin:
x D-Terpineol (T)
x cido decanoico (AD)
x 1-Hexanol (1H)
x cido hexanoico (AH)
x 1-Pentanol (1P)
x cido octanoico (AO)
x 2-Feniletanol (2FE)
x Hexanoato de etilo (HE)
x 3-Metil-1-butanol (3M1B)
x Linalol (L)
x Acetato de 2-feniletilo (AFE)
x Octanoato de etilo (OE)
x Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B) x Succinato de dietilo (SD)
8.3.1.- Disolvente
Inicialmente, se optimiz el disolvente a utilizar en la extraccin, para ello se
fijaron los valores del resto de variables (volumen de muestra = 25.0 mL, volumen
de disolvente = 10.0 mL, tiempo de extraccin = 20 minutos y sin sal).
102
Br E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,

130
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
Los disolventes que se ensayaron fueron:
x Hexano (HX)
x Metilisobutilcetona (MIBC)
x ter de petrleo (EP)
x Pentano (P)
x Diclorometano (DM)
x ter etlico (EE)
Una vez llevado a cabo el proceso de extraccin y acondicionado el extracto,
se inyect en el cromatgrafo de gases. A partir de los resultados experimentales
obtenidos y siguiendo la metodologa de clculo expuesta en el apartado 4.7 de este
trabajo, se calcularon los rendimientos de extraccin y los valores obtenidos (%) se
indican en la tabla 8-1.
COMPUESTOS
HX
MIBC
EP
DM
EE
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
31.20.5
nd
nd
nd
nd
nd
40.44.0
20.13.1
13.11.3
31.23.1
16.22.9
nd
31.10.1
23.10.4
11.10.6
23.10.3
25.10.1
14.20.3
30.11.5
21.19.0
15.31.7
21.11.3
12.11.9
nd
26.20.3
41.91.2
9.200.91
31.40.1
27.10.6
30.20.6
31.11.0
29.11.1
nd
20.11.1
15.00.9
nd
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
nd
6.130.11
21.10.2
24.10.1
7.100.13
16.10.4
nd
nd
nd
12.01.1
41.12.1
18.01.6
19.21.0
nd
nd
nd
20.10.2
8.120.11
27.10.1
13.10.5
26.10.1
22.11.2
nd
nd
nd
12.11.1
31.21.5
15.16.1
52.11.6
15.01.6
nd
nd
32.40.2
17.10.3
70.00.1
29.70.5
38.50.1
22.30.9
6.120.9
11.40.1
nd
11.01.4
50.11.0
25.06.0
23.41.4
25.11.8
nd
nd
x Tabla 8-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en ELLus

(nd= no detectado)
La representacin grfica de estos resultados se muestra en la figura 8-1, en

la que cada una de las barras corresponde a uno de los compuestos, en orden de
salida en el cromatograma.

131
__________________________________________________________________
80
A3M1B
M1B
HE
60
P
H
OE
L
40
SD
Rendimiento (%)
T
AFE
20
AH
FE
AO
AD
HX
MIBC
EP
DM
EE
Disolvente

con distintos disolventes en ELLus
Como podemos observar, con hexano se extraen pocos compuestos.

Utilizando metilisobutilcetona, pentano o ter etlico no se extraen en ningn caso
octanoato de etilo, linalol, cido octanoico ni cido decanoico, siendo el
diclorometano con el que se obtienen ms compuestos y con mejores rendimientos
de extraccin. Por ello, es ste el disolvente que se utilizar a lo largo del resto del
estudio.
132
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
8.3.2.- Sales
Es importante que la separacin completa de las fases sea en el menor
tiempo posible, para ello hay que evitar la formacin de emulsiones estables,
utilizando por ejemplo un agente salino103.
Para comprobar la influencia de sales sobre los rendimientos de extraccin,
inicialmente y a partir de las referencias bibliogrficas se realizaron una serie de
ensayos previos.
Partiendo de muestras de 25.0 mL de vino sinttico, que contenan todos los
compuestos en estudio, se realiz la extraccin con 10.0 mL de diclorometano. Se
hicieron diferentes ensayos variando la cantidad de sal, en este caso NaCl entre 1 y
5 g. Se sigui el procedimiento de extraccin indicado anteriormente y los
extractos, una vez acondicionados, se analizaron por CG.
A partir de los resultados obtenidos se observ que los mejores resultados se
obtenan utilizando 4 g de NaCl. Los rendimientos estuvieron entre el 9% (para el
cido octanoico) y el 81% (para el D-terpineol), sin embargo para cantidades ms
pequeas de sal no suban del 55% para ninguno de los compuestos, y para 5 g de
NaCl los rendimientos no mejoraban, con el problema aadido de disolver esa
cantidad de sal. Una vez que comprobamos que con 4 g de cloruro sdico se
obtenan los mejores rendimientos de extraccin, repetimos los ensayos utilizando
distintas sales en diferentes proporciones.
Las sales a estudiar para completar el estudio fueron:
x Sulfato amnico anhidro (SA)
x Fosfato sdico dihidratado (FS)
Tambin se estudi la mezcla SA/FS ya que segn nuestra experiencia104, la
combinacin de estas sales poda favorecer la extraccin. A partir de los
cromatogramas obtenidos se calcularon los rendimientos de extraccin que se
103
Bru E.R. et al, Jornadas de vitivinicultura y enologa de Tierra de Barros 19 ed.,

104
Senz C. et al, Chromatographia, 51, 221-225, (2000)

133
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
NaCl (4 g)
SA (4 g)
SA/FS (2 g/2 g)
Sin sal
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
38.40.3
55.20.1
20.20.1
42.50.1
38.70.1
41.40.1
43.20.1
28.10.5
81.20.5
39.91.1
49.81.6
32.50.2
9.160.21
23.50.1
12.10.6
23.60.9
2.310.11
25.40.1
23.40.8
22.30.0
23.70.6
13.50.1
54.20.5
24.50.1
25.20.3
18.30.2
2.410.02
4.220.11
13.20.1
22.20.1
3.140.10
25.60.1
24.50.2
22.10.1
26.20.2
14.50.1
57.00.1
24.80.6
26.40.1
14.70.2
3.110.12
6.310.19
26.21.3
41.91.2
9.200.91
31.40.1
27.10.6
30.20.6
32.40.2
17.11.3
70.06.1
29.71.5
38.58.1
22.31.9
6.120.91
11.40.1
x
Tabla 8-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintas sales en ELLus
La representacin grfica de estos resultados se muestra en la figura 8-2.

A3M1B
100
3M1B
HE
1P
80
1H
OE
60
L
SD
T
Rendimiento (%)
40
AFE
AH
20
2FE
AO
AD
NaCl
SA
SA/FS
sin sal
Sal
x
Figura 8-2: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin

(%) con distintas sales en ELLus
134
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
En todos los casos se extraen todos los compuestos, y a partir de los
resultados vemos que con cloruro sdico se obtienen los mayores rendimientos de
extraccin. Por otro lado, los rendimientos en la disolucin que no llevaba sal son
mayores que cuando se utiliza sulfato amnico o la mezcla. Por todo esto, para el
resto de los estudios consideramos la sal ptima el cloruro sdico (4 g).
8.3.3.- Otras variables

Una vez optimizado el disolvente y el tipo y cantidad de sales, para
optimizar las otras variables (volumen de muestra, volumen de disolvente y tiempo
de extraccin), se realiz un diseo factorial considerando para cada variable o
factor dos niveles (tabla 8-3), siendo stas las variables independientes y la relacin
entre las reas de compuesto y p.i. la variable dependiente.
xi : VARIABLES
Nivel +
x1 : Volumen de muestra (mL)

x2 : Volumen de disolvente (mL)
x3 : Tiempo de extraccin (min)
50.0
10.0
30
Nivel 25.0
5.0
15
x Tabla 8-3: Variables y niveles considerados para el diseo factorial

Este diseo fue un 23 con dos puntos centrales, todos los experimentos se
realizaron por duplicado y fueron aleatorizados para evitar errores de sistema,
obteniendo as 20 experimentos a realizar.
La ecuacin del modelo es:
y = E0 + E1 x1 + E2 x2 + E3 x3 + E12 x1 x2 + E23 x2 x3
El programa estadstico utilizado para realizar el diseo fue Statgraphics, en

la tabla 8-4 se muestra la matriz de experimentos.

135
__________________________________________________________________
EXPERIMENTOS
VARIABLES CODIFICADAS
x1
x2
x3
x
37.5
50
25
50
25
25
50
25
50
37.5
0
+
+
+
+
0
0
+
+
+
+
0
0
+
+
+
+
0
1 -12
2 -18
3 -19
4 -13
5 -16
6 -20
7 -14
8 -15
9 -11
10 -17
VARIABLES SIN CODIFICAR

x1
x2
x3
7.5
5
10
10
5
10
5
5
10
7.5
22.5
15
30
15
15
15
30
30
30
22.5
Tabla 8-4: Matriz experimental del 23+2

Donde: x1= Volumen de muestra (mL), x2= Volumen de disolvente (mL), x3= Tiempo de
extraccin (min)
El estudio del tiempo de extraccin se decidi no alargarlo ms all de los 30

minutos, para evitar problemas de degradacin de los compuestos ms lbiles. Una
vez procesados los datos obtenidos de los experimentos realizados, los valores de
los coeficientes obtenidos se muestran en la tabla 8-5.
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
E0
E1
E2
E3
E12
E23
-15766.0
-15480.7
-19997.3
-14963.7
-19076
-16673
-23510
17003
28281
-1194.83
-456.68
13618.5
-730.05
2946.75
322.15
395.92
324.72
425.08
485.76
116.78
631.15
-81.45
-66.96
159.93
255.96
-282.05
12.94
-51.04
3139.65
3219.1
4016.8
5608.4
4287.07
4107.2
4646.23
-419.43
-867.6
2564.72
2002.2
2455.02
371.08
215.4
285.15
145.26
359.53
-123.26
149.79
376.03
264.61
-433.84
-944.87
-172.06
-250.83
-540.03
-3.78
68.63
-48.93
-63.46
-61.37
-106.09
-80.19
-49.06
-99.57
-11.47
-27.09
-46.16
-44.60
-31.79
-4.97
-5.97
-72.98
-43.04
-94.89
-81.21
-62.95
-112.66
-38.90
20.83
88.33
-45.27
-13.53
-34.25
-9.82
6.21
x Tabla 8-5: Valor de los coeficientes de ajuste en el diseo 23 + 2
136
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
Se hace un estudio del anlisis de la varianza (ANOVA) para ver la
significacin de los efectos o coeficientes de ajuste.
La influencia de un factor viene indicada por la magnitud "F". Las variables
con el valor de "F" por encima de 5.318 tienen influencia significativa a un nivel de
significacin del 5% (o bien por la magnitud "s", donde los efectos con valores de
"s" menores de 0.05 tienen una significacin a un nivel de confianza del 95%).
La tabla 8-6 muestra estas significaciones y las direcciones de los
parmetros.
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
V muestra
V dte
(x1)
NS
NS
S(+)
S(-)
NS
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
Interaccin
Interaccin
Interaccin
(x2)
Tiempo
extraccin
(x3)
(x1 x2)
(x2 x3)
(x1 x3)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(+)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
S(-)
NS
S(-)
S(-)
NS
NS
S(+)
S(+)
S(-)
S(-)
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
S(+)
NS
NS
Tabla 8-6: Resultados de significacin y direccin de los parmetros obtenidos en el

diseo factorial. S= significativo, NS= no significativo
Se observa que para todos los compuestos las variables significativas son el
volumen de disolvente, el tiempo de extraccin y la interaccin entre el volumen de
muestra y el volumen de disolvente, el volumen de muestra y la interaccin entre el
volumen de disolvente y el tiempo de extraccin fue significativa en la mayora de
los casos, resultando no significativa (a excepcin del 2FE) la interaccin entre el
volumen de muestra y el tiempo de extraccin.

137
__________________________________________________________________
La direccin de la significacin viene marcada por el signo del efecto

(positivo para el nivel ms alto y negativo para el nivel ms bajo), como puede
verse tambin en la tabla 8-6, la significacin en el volumen de muestra est
afectada por un signo negativo en todas las variables significativas excepto para el
hexanoato de etilo, el volumen de disolvente significativo en todos los casos tiene
signo positivo, el tiempo de extraccin es negativo excepto para el linalol y el
cido decanoico, y el signo de las interacciones que son significativas tienen signo
negativo para la interaccin x1 x2 y mayoritariamente negativo para la interaccin
x2 x3.
Tambin en este estudio se observ que no haba diferencia significativa
entre los distintos grupos en las rplicas.

Una vez optimizadas todas las variables, las condiciones ptimas de trabajo
se muestran en la tabla 8-7.
PARMETROS
CONDICIONES
Disolvente
Sal
Volumen de muestra
Tiempo de extraccin
Diclorometano
NaCl 4 g
25.0 mL
10.0 mL
15 min
Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
4 C min-1
60 C
4 min
x Tabla 8-7: Condiciones ptimas en ELLus
170 C
12 min
138
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
Los valores de los rendimientos obtenidos en estas condiciones se muestran
en la tabla 8-8.
A3M1B
3M1B HE
38.4
55.2
x
1P
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
20.2 42.5 38.7 41.4 43.2 28.1 81.2 39.9
49.8
32.5
9.16
23.5
Tabla 8-8: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLus)

Se procedi a calcular las caractersticas analticas con esta metodologa de
trabajo para cada uno de los compuestos utilizados. Para ello se prepararon
diferentes disoluciones en DM con los compuestos a estudiar ms el p.i. y se
inyectaron en el cromatgrafo en las condiciones cromatogrficas optimizadas. A
los valores obtenidos en el extracto orgnico se les aplic los rendimientos tal y
como se expuso en el apartado 4.5. Los datos se muestran en la tabla 8-9.
Para el estudio de la reproducibilidad o precisin del mtodo expresado
como sr (%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron tres
extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por
triplicado.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.006510.00012
0.01710.0004
0.002420.00004
0.007820.00017
0.01020.0001
0.01000.0001
0.01680.0003
0.01570.0001
0.01950.0031
0.1170.001
0.006470.00009
0.003900.00006
0.001940.00004
0.005670.00007
-0.2080.013
-0.2260.014
-0.06810.51E-2
-0.08720.0031
-0.3720.094
-0.1770.010
-0.2450.033
4.02E-31.49E-4
0.03100.41E-2
0.7310.024
0.9950.078
1.090.02
0.4410.052
0.1960.054
x
2
o.o.
L.D.
(intervalo de
(Pg mL-1)
confianza de 95%)
0.0781
0.0295
0.207
0.0238
0.0517
0.0508
0.0255
0.0343
0.0246
0.0431
0.0581
0.130
0.261
0.0897
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
0.261
0.0980
0.691
0.0791
0.173
0.168
0.0847
0.110
0.0820
0.141
0.190
0.431
0.867
0.297
5.4
5.7
4.5
2.8
4.2
2.1
2.6
6.2
2.9
5.3
3.6
5.1
4.1
3.4
Tabla 8-9: Caractersticas analticas ELL-us

o.o.= Ordenada en el origen, 2L.D.= Lmite de deteccin
3
L.C.= Lmite de cuantificacin, 4sr (%) = Desviacin estndar relativa porcentual
1

139
__________________________________________________________________

Optimizado el mtodo de extraccin y calculadas las caractersticas
analticas, pasamos a cuantificar muestras de vino real. Para este procedimiento
nicamente se utilizaron las rectas de calibrado como mtodo de cuantificacin. El
mtodo se aplic a muestras de cuatro vinos tintos jvenes de la DOCa Rioja.
Una vez sometidas las muestras al proceso de extraccin y separadas las
fases a los extractos se les aadi el p.i. y se analizaron por triplicado en el
cromatgrafo. Los resultados obtenidos se indican en la tabla 8-10.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
SD
T
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
CONCENTRACIONES (Pg/mL)
muestra 1
muestra 2
muestra 3
muestra 4
3.68 1.10
168 26
0.821 0.010
0.422 0.001
12.0 1.1
3.71 0.02
nd
1.610.21
nd
5.10 1.31
1.22 0.60
9.420.22
1.41 0.12
0.601 0.010
3.08 1.00
152 22
0.754 0.001
0.502 0.011
11.2 1.1
2.81 0.12
nd
1.520.12
nd
5.01 1.11
1.71 0.12
8.910.23
1.14 0.12
0.611 0.010
3.52 1.14
176 18
1.181 0.101
0.431 0.012
11.9 1.1
3.34 0.01
nd
1.660.11
nd
4.91 1.21
1.32 0.11
9.120.01
1.21 0.13
0.632 0.022
4.01 1.11
143 23
0.9810.121
0.512 0.022
10.2 1.0
2.91 0.11
nd
1.45 0.21
nd
4.63 1.02
1.53 0.10
9.320.12
1.02 0.33
0.622 0.022
Tabla 8-10: Cuantificacin en vino real mediante ELLus. Rectas de calibrado

(nd: no detectado)
Finalmente, en la figura 8-3 se muestra un cromatograma obtenido a partir

de una disolucin de vino sinttico sometida al proceso de extraccin lquidolquido con ultrasonidos.
140
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________
mVolts
5
FE (27.911)
4
3M1B (7.738) 1P(8.965)
1H (12.084)
AH (26.331)
3
SD (21.719)
FEA (25.407)
L (18.027)
T (22.215)
AO (31.583)
A3M1B (5.648)
EH (8.494)
3O (13.347)
EO (14.578)
AD (38.673)
0
-0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
x Figura 8-3: Cromatograma. Vino sinttico, ELLus
CAPTULO 9
Microextraccin por desmezcla
I: Detector FID
- Introduccin
- Tipo y volumen de disolvente
- Tipo y cantidad de sal
- Tiempo de agitacin
- Cuantificacin en vino
- Patrn interno
- Efecto de la matriz en los rendimientos de
extraccin
- Aplicacin a otros compuestos
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR FID

143
__________________________________________________________________
9.- MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA

I: DETECTOR FID
9.1.- Introduccin
La aplicacin de la microextraccin por desmezcla es un procedimiento que
se desarroll con posterioridad a la ELL en el estudio de voltiles en matrices
lquidas y homogneas como pueden ser el mosto y el vino.
La microextraccin por desmezcla se basa en utilizar un disolvente orgnico
muy inmiscible en agua y adicionar sobre la fase acuosa una elevada concentracin
de sales, disminuyendo as la capacidad solvatante del agua, favoreciendo la
desmezcla de las dos fases, as como la solubilidad en la fase orgnica de los
compuestos a extraer.
La adicin de sales es un fenmeno fsico-qumico bien conocido desde hace
tiempo. Se fundamenta en el tipo de interacciones que existen en una disolucin
acuosa que contiene una cierta cantidad de un soluto orgnico. La solubilidad de un
soluto orgnico en un medio acuoso es funcin de la capacidad de sus molculas de
unirse a la estructura de puentes de hidrgeno del agua. Por supuesto, estas
molculas orgnicas no tendrn la misma capacidad que las del agua para formar
parte de la red, pero s se adherirn lo suficiente como para solubilizarse.
La introduccin de una especie inica fuertemente disociada en el medio
acuoso, requiere que las molculas del agua se orienten en torno a los iones de la
disolucin. En esta situacin, la estructura de la red de puentes de hidrgeno de la
disolucin acuosa se ve alterada, y este hecho provoca que las molculas orgnicas,
presentes en esa disolucin, integradas en la estructura de los puentes de hidrgeno,
encuentren ahora, una mayor dificultad para participar de la red, de forma que su
solubilidad disminuye.
Esta prdida de solubilidad puede originar la separacin de la disolucin
original en dos fases, una principalmente acuosa que contiene casi toda la sal
disuelta y otra principalmente orgnica, aunque conteniendo una pequea
proporcin de sal y agua, hasta llegar a un punto de saturacin en el que el sistema
no admite ms sal.
T. CEDRN FERNNDEZ
144
__________________________________________________________________
El equilibrio depende sobre todo de la temperatura, de las sales y del

disolvente orgnico. Tambin es importante valorar en la eleccin de la sal la
tendencia que tenga a formar o no emulsiones y el pH que origina.
En un comienzo, este tipo de extraccin se utiliz tan solo en muestras cuya
composicin en voltiles no era muy elevada. Sin embargo, actualmente se aplica a
diversas matrices agroalimentarias, utilizando un tratamiento previo de la muestra,
de forma que est lo ms homognea y limpia posible.
Ya en 1959 Fouassin105 emple la microextraccin para determinar alcoholes
superiores en aguardientes y licores utilizando como sal K2CO3. Ms adelante se
utiliz tambin esta tcnica para los compuestos del vino106, y Ribereau-Gayon y
colaboradores107 la ha utilizado para el estudio de los terpenos en uvas. En este
captulo se muestran los resultados obtenidos empleando dicho procedimiento para
el anlisis de compuestos voltiles en vino108.
La microextraccin por desmezcla es otra alternativa a ELL convencional.
Con ella se consiguen altos grados de preconcentracin, y una de las caractersticas
ms importantes es que no requiere ningn material especial, emplendose como
recipientes de extraccin tubos de ensayo de fondo cnico, con el objeto de
favorecer la separacin de las fases.

El procedimiento operativo utilizado en la microextraccin se indica a
continuacin:
x En un tubo de microextraccin se ponen las diferentes proporciones de sales
optimizadas (1.5 g de sulfato amnico anhidro y 0.6 g de fosfato sdico
dihidratato), que son las responsables de la desmezcla.
x Se aaden 10.0 mL de vino o vino sinttico que contiene los compuestos a
estudiar y se agita (mecnicamente), hasta completa disolucin de las sales.
105
Fouassin A. et al, Ferment. Ind. Alim., 14, 206-216, (1959)

Ortega C. et al, J. Chromatogr. A., 923, 205-214, (2001)
Mesas J.L. et al, Rev. Agroquim. Tecnol. Aliment, 21, 114-129, (1981)
Dubois P. et al, Ann. Technol. Agri.,18, 241-247, (1969)
Singleton V.L. et al, Am. J. Enol. Vitic, 12, 7-8, (1961)
107
Ribereau-Gayon et al, J. Agric. Food Chem., 23, 1042-1047, (1975)
108
Sanz C. et al, Chromatographia, 51, 221-225, (2000)
106

145
__________________________________________________________________
x Se adicionan 2.0 mL de diclorometano, como agente de extraccin.

x Se somete a agitacin mecnica durante 30 minutos.
x Se centrfuga durante 10 minutos a 3000 rpm y se recoge la fraccin de
disolvente o fase orgnica.
x El extracto recogido, una vez acondicionado, se analiza por cromatografa de
gases con detector FID.
Las condiciones cromatogrficas generales utilizadas son las que se
muestran en al captulo 4, apartado 4.4.5, exceptuando el programa de temperatura
que el utilizado en este caso fue:
6 C min-1
10 C min-1
90 C
170 C
220 C
4 min
1 min
20 min
tiempo empleado= 43.33 min

Las variables optimizadas en este procedimiento fueron:
x
Tipo y volumen de disolvente
x
Tipo y cantidad de sal
x
Tiempo de agitacin
Y los compuestos utilizados:

x 1-Hexanol (1H)
x Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)
x cido butanoico (AB)
T. CEDRN FERNNDEZ
146
__________________________________________________________________
x Decanoato de etilo (DE)

x Succinato de dietilo (SD)
9.3.1.-Tipo y volumen de disolvente

Para optimizar el disolvente partimos de unas condiciones que consideramos
oportunas, ya que nuestro grupo de trabajo haba investigado en ello109, las cuales
se muestran en la tabla 9-1.
VARIABLES
CONDICIONES
Sal (tipo y cantidad)
Tiempo de agitacin
1.0 mL
(NH4 )2SO4 / Na3PO4 .2H2O (1 g/1 g)
30 minutos
x
Tabla 9-1: Condiciones iniciales de trabajo
En cuanto al tipo de disolvente, segn la bibliografa consultada, la

extraccin con Freon 11 es considerada a menudo como la ms interesante, pero su
bajo punto de ebullicin plantea un gran nmero de dificultades tcnicas, que
requieren un costoso aparataje, como equipos refrigerados, cmaras
termostatizadas a bajas temperaturas, etc.
En nuestro caso los disolventes utilizados fueron:
x Kaltron (1,1,2- triclorotrifluoroetano) (K)
x Diclorometano (DM)
x Kaltron/ diclorometano (1/1) (K/DM)
x Hexano (HX)
x Isooctano (IO)
x Metilisobutilcetona (MIBC)
109
Sanz C. et al, Mikrochim. Acta, 122, 267-277, (1996)

147
__________________________________________________________________
El estudio de optimizacin se realiz con muestras de vino sinttico en las

que los compuestos a extraer estaban en un rango de concentraciones de 0.500 a
200 Pg mL-1.
Siguiendo el procedimiento operativo indicado en el apartado 9-2 se
obtuvieron los cromatogramas correspondientes para cada disolvente estudiado.
Cada experimento se realiz por duplicado y el extracto, una vez acondicionado,
se inyecto tres veces en el cromatgrafo.
A partir de los resultados obtenidos se observ que los rendimientos de
extraccin con kaltron fueron los ms altos, pero no eran reproducibles, por lo que
se desech tanto ste como la mezcla kaltron/diclorometano. La causa de la baja
reproducibilidad del kaltron y de sus mezclas parece ser debida a la columna polar
que se utiliza, ya que tiene muchos grupos polares tipo cidos y aldehdos.
Con la MIBC se observ que no se extraan todos los compuestos,
obtenindose cromatogramas con menos picos y ms pequeos. Los resultados
obtenidos con los otros tres disolventes ensayados se muestran en la tabla 9-2. Los
rendimientos se calcularon tanto por rectas de calibrado como por patrn interno,
pero los resultados fueron muy similares, por lo que slo se muestran los obtenidos
con las rectas de calibrado.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
x
Diclorometano
Hexano
Isooctano
72.02.1
39.13.2
68.43.3
51.25.0
65.24.0
12.42.2
57.13.4
55.44.3
35.31.2
39.12.2
56.02.1
42.13.1
38.22.1
22.33.1
71.42.3
40.14.2
54.23.4
10.42.3
46.23.7
36.24.1
31.11.1
41.42.1
35.42.2
23.51.1
24.13.3
19.14.4
78.13.5
31.54.3
52.52.2
12.43.4
37.14.2
23.43.2
29.12.0
40.01.0
22.13.2
12.11.1
Tabla 9-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en

microextraccin por desmezcla y detector FID
Como podemos ver a partir de los resultados y en la representacin grfica

correspondiente (figura 9-1) es con el diclorometano con el disolvente que, en
T. CEDRN FERNNDEZ
148
__________________________________________________________________
general, se obtienen mayores rendimientos de extraccin, a excepcin del

hexanoato de etilo (HE) que se extrae en mayor cantidad utilizando isooctano.
100
A3M1B
3M1B
80
HE
1H
60
OE
Rendimiento (%)
AB
DE
40
SD
AH
20
AFE
AO
AD
DM
HX
IO
Disolvente

con distintos disolventes en microextraccin por desmezcla y detector FID
Para estudiar la influencia del volumen del disolvente en los rendimientos de

extraccin se realiz este estudio utilizando diferentes volmenes de diclorometano
(2.0, 1.0 y 0.50 mL).
El procedimiento operativo utilizado fue el indicado anteriormente.
En la tabla 9-3 se muestran los resultados obtenidos y la representacin
grfica en la figura 9-2. Como puede verse, no se aprecian grandes diferencias
entre los tres volmenes ensayados, pero puesto que era ms cmodo trabajar con
los 2.0 mL de disolvente fue ste el volumen empleado en sucesivos estudios.

149
__________________________________________________________________
Volumen DM
(mL)
COMPUESTOS
0.50 mL
1.0 mL
2.0 mL
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
73.22.0
38.32.1
69.43.1
50.25.1
65.24.0
11.02.1
57.13.2
56.44.4
35.21.0
40.22.1
57.32.3
42.03.0
72.33.0
39.21.0
68.34.1
51.31.6
65.42.6
12.53.1
57.04.1
55.21.0
35.62.6
39.32.6
56.23.2
42.01.2
73.32.2
39.22.4
69.13.0
51.04.1
66.34.3
12.12.1
57.42.4
56.34.2
35.22.0
41.02.5
57.11.3
43.41.1
x
Tabla 9-3: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes

de diclorometano en microextraccin por desmezcla y detector FID
80
A3M1B
3M1B
60
HE
1H
OE
40
AB
Rendimiento (%)
DE
SD
20
AH
AFE
AO
AD
0.50
1.0
2.0
Volumen de dte (mL)

con distintos volmenes de diclorometano en microextraccin por desmezcla
y detector FID
T. CEDRN FERNNDEZ
150
__________________________________________________________________
9.3.2.-Tipo y cantidad de sal

Otro parmetro importante para conseguir un buen rendimiento de
extraccin es la cantidad de sales que se debe aadir. As, una vez optimizado el
volumen y tipo de disolvente pasamos a optimizar la sal en cuanto a tipo y cantidad
utilizada.
El grupo de investigacin tena experiencia con esta tcnica aplicada a la
extraccin de pesticidas en disoluciones acuosas110, por ello las sales con las que se
inici este estudio fueron:
x Sulfato amnico anhidro (SA).
x Fosfato sdico dihidratado (FS).
x Cloruro sdico (CS).
Estas sales tienen la propiedad de disolverse rpidamente, y no tienen
tendencia a formar emulsiones.
El estudio se realiz con sales puras (FS, SA y CS) en diferentes cantidades
y con mezclas de SA/FS, FS/CS en distintas proporciones (ver tabla 9-4).
Se prepararon disoluciones de vino sinttico que contenan los compuestos a
estudiar y siguiendo el procedimiento operativo indicado en el apartado 9.2 se
estudi la influencia de la proporcin de sales. Los extractos una vez
acondicionados se analizaron por CG.
A partir de los cromatogramas obtenidos se calcularon los rendimientos de
extraccin. Los porcentajes obtenidos se indican en la tabla 9-4 y la representacin
grfica correspondiente en la figura 9-3.
110
Sanz C. et al, Microchim. Acta, 122, 267-277, (1996)

151
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
FS
SA/FS
SA/FS
SA/FS
SA/FS
0.6 g
0.5/0.6 g
1.0/0.6 g
1.5/0.6 g
2.0/0.6 g
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
58.13.0
21.31.0
53.44.1
36.12.1
56.33.3
4.010.10
45.02.4
45.11.3
19.53.1
27.42.1
42.43.1
37.62.0
61.22.0
26.32.1
55.43.2
41.55.0
59.04.4
6.420.61
47.13.3
47.04.4
24.31.2
31.42.1
46.12.0
40.03.5
80.15.0
41.13.1
73.31.2
57.33.5
77.22.5
12.20.2
63.42.3
63.73.4
40.21.6
44.14.8
62.01.2
53.12.0
77.13.0
54.03.1
70.14.4
60.04.2
78.33.3
41.23.4
62.03.1
62.41.0
43.23.2
47.12.0
62.14.1
54.31.0
57.01.1
36.44.0
52.33.2
43.21.0
56.41.1
18.31.0
45.04.2
44.12.3
30.23.5
34.45.4
44.23.1
39.14.1
COMPUESTOS
SA
FS/CS
FS/CS
CS
CS
0.5 g
1.0/1.5 g
2.0/0.6 g
2.0 g
3.0 g
58.13.0
23.02.0
52.03.1
38.12.3
56.03.2
4.040.03
45.13.3
45.22.4
20.43.3
28.34.2
44.03.1
40.01.1
66.02.2
40.13.0
60.01.2
49.13.0
64.34.3
21.00.2
52.15.4
53.23.2
35.41.0
38.12.0
51.04.0
44.24.1
56.12.1
33.05.0
51.42.3
42.04.0
55.25.2
15.10.4
45.01.5
47.16.0
29.04.1
33.43.2
44.03.3
41.13.1
56.04.0
34.13.1
51.14.2
42.32.2
55.22.3
20.30.3
44.13.0
45.15.1
30.12.5
34.13.2
44.11.1
37.04.0
48.11.2
35.24.3
43.33.6
37.31.5
46.51.3
27.11.2
38.02.2
37.11.0
27.43.1
29.04.1
37.42.0
31.44.0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
x Tabla 9-4: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos con las sales estudiadas en
microextraccin por desmezcla y detector FID
T. CEDRN FERNNDEZ
152
__________________________________________________________________
100
A3M1B
3M1B
80
HE
1H
OE
60
AB
DE
Rendimiento (%)
40
SD
AH
20
AFE
AO
AD
FS
0.6
SA/FS
1.0/0.6
SA/FS
0.5/0.6
SA/FS
2.0/0.6
SA/FS
1.5/0.6
FS/CS
1.0/1.5
SA
0.5
CS
2.0
FS/CS
2.0/0.6
CS
3.0
Sal
x Figura 9-3: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%) obtenidos

con las sales estudiadas en microextraccin por desmezcla y detector FID
Como podemos observar, los mejores resultados se obtienen con la mezcla

SA/FS en las cantidades 1.0/0.6 y 1.5/0.6, no habiendo en general mucha diferencia
entre ambos, aunque se obtienen rendimientos ligeramente mayores con la mezcla
1.5/0.6. Con sta los cidos se extraen entre 41 y 62%; los alcoholes entre 54 y
60% y los steres entre 47 y 78%. Utilizando CS se obtienen los rendimientos ms
bajos.

153
__________________________________________________________________
9.3.3.- Tiempo de agitacin

Ya optimizado el disolvente y las sales se repiti el estudio variando el
tiempo de agitacin. A partir de las referencias bibliogrficas111, se probaron 30
minutos y una hora de agitacin. Para ello se utiliz un sistema de agitacin
mecnica (agitador orbital SBS de Afora). Se prepararon disoluciones de vino
sinttico se procedi a la extraccin y, una vez acondicionados los extractos, se
analizaron por CG-FID.
Por los resultados obtenidos (tabla 9-5), los cuales se representan
grficamente en la figura 9-4, vemos que no existe diferencia entre utilizar 30 o 60
minutos de agitacin, as que por comodidad se toman los 30 minutos como tiempo
ptimo de agitacin.
COMPUESTOS
TIEMPO
30 min
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
77.03.1
54.11.1
70.24.0
60.02.4
78.41.0
41.32.9
62.62.1
62.22.1
43.71.0
47.23.3
62.12.4
54.04.2
60 min
78.13.2
53.52.6
69.33.3
61.51.1
77.91.4
40.63.2
63.12.0
61.82.1
44.31.3
45.43.2
63.12.1
53.83.9
x Tabla 9-5: Rendimientos de extraccin (%) segn el tiempo de agitacin

empleado en microextraccin con sales y detector FID
111
Ortega C. et al, J. Chromatogr. A., 923, 205-214, (2001)

Bertand A., Ann.Technol. Agric., 27, 231-233, (1978)
T. CEDRN FERNNDEZ
154
__________________________________________________________________
90
A3M1B
80
3M1B
HE
70
1H
OE
60
AB
DE
Rendimiento %
50
SD
AH
40
AFE
AO
30
AD
30
60
Tiempo de agitacin (minutos)
x
Figura 9-4: Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%) segn

el tiempo de agitacin empleado en microextraccin con sales y detector FID

155
__________________________________________________________________

Una vez estudiadas todas las variables, las condiciones ptimas de trabajo se
muestran en la tabla 9-6.
PARMETROS
CONDICIONES
Disolvente
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
Diclorometano
SA/FS(1) (1.5 g/0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
2.0 mL
Temperatura del detector

Columna
Temperatura del inyector
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
6 C min-1
x
10 C min-1
90 C
170 C
220 C
4 min
1 min
20 min
Tabla 9-6: Condiciones ptimas de trabajo en microextraccin por desmezcla

SA/FS: sulfato amnico anhidro/fosfato sdico dihidratado
(1)
Los valores de los rendimientos en estas condiciones se muestran en la tabla

9-7.
A3M1B 3M1B HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
77.0
60.0
78.4
41.3
62.6
62.2 43.7
47.2
62.1
54.0
x
54.1
70.2
Tabla 9-7: Rendimientos en las condiciones ptimas en microextraccin por

desmezcla
T. CEDRN FERNNDEZ
156
__________________________________________________________________

Para obtener las caractersticas analticas se prepararon diferentes
disoluciones en DM con los compuestos en estudio y se inyectaron en las
condiciones cromatogrficas optimizadas. Una vez aplicados los valores de los
rendimientos de los compuestos en este mtodo de extraccin, tal y como se
expuso en el apartado 4-5, los resultados se muestran en la tabla 9-8.
como sr (%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron, como en casos
anteriores, tres extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se
inyectaron por triplicado.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1 )
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
L.D.
(Pg mL-1)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
0.01320.0002
0.01650.0004
0.01010.0001
0.01690.0001
0.01880.0002
0.008020.00008
0.03270.0004
0.03500.0006
0.006210.00009
0.1380.001
0.01320.0002
0.01310.0002
-0.02700.0020
-0.06310.0010
-0.02410.0011
1.330.01
-0.07010.0031
-0.02320.0022
-4.850.01
0.06100.0011
-0.007010.00010
-0.1210.012
-0.2210.031
-0.02130.0091
0.0390
0.0307
0.0598
0.0335
0.0266
0.0680
0.0161
0.0155
0.0674
0.0365
0.0389
0.0387
0.129
0.104
0.198
0.113
0.0885
0.224
0.0533
0.0511
0.226
0.124
0.128
0.120
6.1
7.5
5.9
2.4
4.8
4.2
1.1
5.0
4.3
5.8
5.3
2.3
x
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
Tabla 9-8: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla

2
3
4
1
9.5.- Cuantificacin de muestras de vino real

Optimizado el procedimiento de extraccin se pas a aplicarlo a muestras de
vino real. Se tomaron diferentes vinos de la DOCa Rioja (tinto, rosado y blanco).
Siguiendo el procedimiento de extraccin indicado en el apartado 9.2 y con las

157
__________________________________________________________________
condiciones optimizadas se aplic a las muestras de vino. Los extractos una vez
acondicionados se analizaron por CG con detector FID.
La cuantificacin se realiz mediante rectas de calibrado y por patrn
interno.
9.5.1.- Rectas de calibrado.

Interpolando los valores de rea de pico de los cromatogramas obtenidos en
las rectas de calibrado, y aplicando para cada compuesto el valor del rendimiento
en las condiciones ptimas se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla
9-9.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
x

muestra 1
muestra 2
muestra 3
(blanco)
(rosado)
(tinto)
6.010.2
4696
1.300.11
34.30.3
2.020.42
3.510.22
0.1710.021
4.810.31
3.930.52
28.90.4
13.80.7
0.960.12
5.610.62
4574
1.460.21
34.60.6
1.630.11
3.620.13
0.1960.023
4.620.66
4.120.72
25.80.3
11.30.6
1.150.52
6.620.32
4733
2.300.12
35.90.7
2.560.33
3.850.32
0.2110.012
3.110.41
2.920.81
16.60.6
3.910.41
1.610.31
Tabla 9-9: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por desmezcla.

Rectas de calibrado

Para utilizar el mtodo del patrn interno, previamente se calcularon los
valores de las constantes en el disolvente a utilizar como se expuso en el apartado
4-6. Una vez aplicados, como en el caso anterior, a los valores obtenidos los
rendimientos en las condiciones ptimas, los resultados se indican en la tabla 9-10.
T. CEDRN FERNNDEZ
158
__________________________________________________________________
COMPUESTOS

muestra 1
muestra 2
(blanco)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
x
6.120.21
4876
1.420.12
34.60.3
2.130.42
3.640.21
0.1680.011
4.930.31
4.020.53
28.30.3
12.60.7
1.850.42
(rosado)
5.930.61
4554
1.420.01
34.20.2
1.920.63
3.410.92
0.2010.001
4.920.42
3.920.72
27.90.2
11.80.8
1.310.24
muestra 3
(tinto)
7.120.31
4707
2.220.12
35.20.4
2.420.81
3.710.62
0.2100.012
3.200.73
2.810.91
16.10.1
3.620.6
1.600.12
Tabla 9-10: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por desmezcla.

Patrn interno
Como podemos ver, se obtienen resultados similares utilizando ambos

mtodos de cuantificacin.
Para conocer si la diferencia entre los resultados obtenidos por ambos
mtodos de cuantificacin era significativa o no, se realiz para cada compuesto un
test de significacin de comparacin de medias, calculando para ello el valor del
estadstico s y comparndolo con el valor de 0.05 trabajando con un 95% de
significacin. Para que la diferencia sea significativa el valor de s calculado debe
ser menor que 0.05. En la tabla 9-11 se muestran los resultados obtenidos para cada
una de las muestras.

159
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
s
(rosado)
(blanco)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
0.111
0.038
1.000
0.463
0.559
0.553
0.380
0.122
0.482
0.742
0.571
0.029
NS
S
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
S
0.101
0.143
0.975
0.485
0.497
0.621
0.402
0.201
0.385
0.693
0.465
0.136
s
(tinto)
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
0.212
0.145
0.896
0.356
0.603
0.621
0.296
0.121
0.502
0.805
0.498
0.148
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
x Tabla 9-11: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (microextraccin por

desmezcla). (NS: no significativa, S: significativa)
Como podemos observar nicamente se observ diferencia significativa en

dos compuestos (3M1B y AD) en la muestra de vino blanco, para las muestras de
vino rosado y tinto la diferencia result ser no significativa para todos los
compuestos.
9.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin

Para comprobar si exista efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
se realiz un estudio adicionando a nuestras muestras de vino blanco cantidades
conocidas de cada uno de los compuestos a dos niveles. Se realiz la extraccin en
las condiciones optimizadas y los resultados obtenidos se muestran en la tabla 912. En estos resultados estn corregidas las cantidades de cada compuesto que
contena el vino.
T. CEDRN FERNNDEZ
160
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
Concentracin (Pg mL-1)

aadida
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AB
DE
SD
AH
AFE
AO
AD
2.0
3.5
150
300
0.5
1.0
12.0
25.0
0.7
1.5
1.0
2.0
0.05
0.10
1.5
2.5
1.5
3.0
9.0
18
4.0
8.0
0.6
1.2
Rendimientos
(%)
80.02.8
82.83.4
55.32.0
56.61.8
70.03.1
67.02.9
60.04.1
61.23.6
77.14.2
80.04.3
35.02.3
37.52.1
60.03.0
60.01.9
63.34.2
64.03.7
46.62.0
48.32.1
52.22.5
51.13.1
62.51.6
63.71.4
51.61.4
52.52.1
x Tabla 9-12: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos por adicin estndar en

muestras de vino
Si comparamos estos rendimientos con los obtenidos con muestras de vino

sinttico (tabla 9-7) vemos que son similares, por lo que deducimos que no existe
efecto matriz.

161
__________________________________________________________________
Un cromatograma obtenido para una muestra de vino tinto utilizando la

microextraccin con sales en las condiciones ptimas se muestra en la figura 9-5.
x
Figura 9-5: Cromatograma. Vino tinto, microextraccin por desmezcla

Los compuestos en orden progresivo son: 3M1B; 3M1B; HE; 1H; 3O (p.i.);
OE; AB; DE; SD; AH; AFE; AO; AD
Como conclusin de este estudio, podemos decir que la microextraccin

aplicada a compuestos voltiles en muestras de vino es un mtodo eficaz y rpido y
que consume poco volumen de disolvente.
CAPTULO 10
Microextraccin por desmezcla
II: Detector de Absorcin Molecular
UV-Visible
- Introduccin
- Clculo de rendimientos
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR AM-UV-VISIBLE
165
__________________________________________________________________________________
10.- MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA

II: DETECTOR DE ABSORCIN MOLECULAR
ULTRAVIOLETA-VISIBLE
10.1.- Introduccin
Como ya vimos en los objetivos de esta primera parte del trabajo (captulo
2), una de las finalidades era la bsqueda y evaluacin de nuevos mtodos de
anlisis de los compuestos voltiles en el vino. Se pens en la utilizacin de un
detector de absorcin molecular ultravioleta visible (AM UV-Vis) para el
cromatgrafo de gases, por considerarlo novedoso, ya que no se conoca nada en
este campo y nuestro grupo de investigacin tena gran experiencia al respecto.
Una contribucin importante a la espectrometra de absorcin molecular
(EAM) surgi con la llegada de los detectores de red de diodos. Hasta entonces, la
obtencin de un espectro fiable de un gas generado era muy complicado. La
incorporacin de estos detectores al espectrofotmetro permite obtener un espectro
de absorcin molecular desde 190 hasta 820 nm en 0.1 segundos.
La primera vez que se mencion en la bibliografa el acoplamiento de este
detector para cromatografa de gases fue en 1962112, se usaba un tubo caliente para
transportar las muestras desde el cromatgrafo hasta una clula de absorcin en el
espectrofotmetro. Posteriormente otros estudios han sido publicados113, y ya en
1998 apareci un detector comercial (Inscan AB, Suecia) basado en un sistema
descrito por Lagesson y colaboradores114. Dichos autores han seguido trabajando
en este tema115.
La alternativa de utilizar un espectrofotmetro de absorcin molecular como
detector en CG se desarroll en el departamento de Qumica (rea de Qumica
Analtica) de la UR, ya que desde 1986 se vena desarrollando una lnea de
112
Kaye W. et al, Anal. Chem., 34, 287-282, (1962)

Van Engelen D. L. et al, J. Chromatogr. A, 441, 191-198, (1987)
Driscoll J.N. et al, J. Chromatogr. A, 63, 441-447, (1988)
Bornhop D.J. et al, Rev Sci. Instrum.,63, 191-196, (1992)
Bornhop D.L. et al, J. Chromatogr. A, 684, 259-262, (1994)
Hackett M. et al, J. Chromatogr. A, 243, 695-699, (1995)
114
Lagesson V. et al, Anal. Chem., 61, 1249-1254, (1989)
115
Lagesson V. et al, J. Chromatogr. B, 672, 1-6, (1995)
Lagesson V. et al, Chromatographia, 867, 187-206, (2000)
113
166
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
investigacin encaminada a la sistematizacin y obtencin de procedimientos

analticos para la determinacin de diferentes compuestos. Estos procedimientos se
basaban en la generacin de una fase voltil a temperatura ambiente y posterior
medida de la absorcin molecular de dicho gas.
En la primera etapa de la investigacin, el objetivo era la determinacin de
especies capaces de formar hidruros covalentes voltiles utilizando procedimientos
discontinuos de generacin, para ello se dise un sistema de generacin de
voltiles en el laboratorio. Durante esta etapa se estudi116 la generacin de los
hidruros ms frecuentes, As, Sb, Se, Sn, Bi, Te, Ge y se realizaron estudios de
interferencias sobre estas especies, tambin se utiliz este sistema para determinar
el in NH4+ por formacin de amoniaco117, S= y SO3= por generacin de sulfuro de
hidrgeno118 y dixido de azufre119. Asimismo, se abord la determinacin de
mezclas binarias de As-Sb, As-Se, Sb-Se y de Se-Bi. Aprovechando la diferente
cintica de generacin de los hidruros desde los diferentes estados de oxidacin, se
realiz tambin un estudio de determinacin simultnea de As(III) y As (V) en una
muestra de vidrio120.
En una segunda etapa, se buscaron procedimientos para incrementar la
sensibilidad de las determinaciones e incorporar nuevas especies que pudieran ser
determinadas. Para ello se dise un sistema que se utiliz para la determinacin
simultnea de As(III), Sb(III), Se (IV) y Sn (II)121 , mezclas de sulfuro y sulfito122,
as como de mezclas de tiocianato, sulfuro y sulfito (el tiocianato se volatiliz a
sulfuro de carbonilo123).
En todos los estudios anteriores se consegua la generacin de la fase voltil
a temperatura ambiente. Con el fin de ampliar el nmero de compuestos que
pueden ser determinados por EAM UV-Vis se pens en la posibilidad de obtener
los voltiles calentando. Para ello se plante el acoplar un cromatgrafo de gases a
un espectrmetro de absorcin molecular ultravioleta visible. De esta forma se
consegua volatilizar los compuestos y a la vez se poda obtener una separacin
116
Sanz J. et al, Fresen. Z Anal. Chem., 330, 510-515, (1988)

Sanz J. et al, Analyst, 113, 1387-1391, (1988)
Sanz J. et al, Analusis., 21, 27-32, (1993)
117
Sanz J. et al, Mikrochim. Acta, 110, 193-199, (1993)
118
Sanz J. et al, Anal. Letters, 25, 2095-2105, (1992)
119
Cabredo S. et al, Mikrochim. Acta, 127, 239-242, (1997)
120
Sanz J. et al, Anal. Chim. Acta, 225, 113-120, (1991)
121
Cabredo S. et al, Anal. Chim. Acta, 300, 321-327, (1995)
Cabredo S. et al, Talanta, 46, 631-638, (1998)
122
Cabredo S. et al, Talanta , 42, 937-943, (1995)
123
Cabredo S. et al, Anal. Chim. Acta, 318, 377-383, (1996)
167
__________________________________________________________________________________
cromatogrfica. El desarrollo de este acoplamiento supuso el trabajo de una Tesis

Doctoral defendida en la Universidad de La Rioja en 1997124. En ella, adems del
desarrollo instrumental que supone125, se lleva a cabo la determinacin de
derivados del benceno126 y de hidrocarburos aromticos policclicos127 entre otros
compuestos.
El trabajo que se plantea en este captulo es la utilizacin de dicho
acoplamiento para la determinacin de un grupo de compuestos voltiles presentes
en el vino128.
Dichos compuestos son:
x 3-Metilo-1-butanol (3M1B)
x Alcohol benclico (AB)
x 1-Hexanol (1H)
x Etanol (E)
x 1-Pentanol (1P)
x Fenol (F)
x Geraniol (G)

El procedimiento de extraccin consisti en:
x En un tubo de microextraccin se ponen 1.5 g de sulfato amnico anhidro ms
0.6 g de fosfato sdico dihidratado, que son las sales responsables de la
desmezcla.
x Se aaden 10.0 mL de la disolucin de vino sinttico que contiene los
compuestos a estudiar y se agita (mecnicamente), hasta completa disolucin.
x Se adiciona 2.0 mL de ter de petrleo, como agente de extraccin.
124
Sanz-Vicente. I., Tesis Doctoral, Universidad de La Rioja, (1997)

Galbn J. et al, Fresen. J. Anal. Chem., 355, 406-412, (1996)
Sanz-Vicente I. et al, Chromatographia, 48, 535-541, (1998)
Sanz-Vicente I. et al, J. Chrom. Sci., 37, 126-132, (1999)
126
127
128
Cedrn T. et al, Talanta, 57, 555-563, (2002)
125
168
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
x Se somete a agitacin durante 30 minutos.

x Se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm y se recoge la fraccin de
disolvente o fase orgnica.
x El extracto recogido, una vez acondicionado, se analiza por triplicado en el
cromatgrafo de gases con el acoplamiento (ver descripcin del aparato en el
apartado 3.1.3).
Las condiciones de trabajo se muestran en la tabla 10-1.
PARMETROS
CONDICIONES
Volumen y tipo de disolvente

Tipo y cantidad de sal
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
2.0 mL de ter de petrleo

sulfato amnico a./fosfato sdico d. (1.5 /0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
Columna
Temperatura cubeta
Tiempo de integracin
Gas portador
Volumen de inyeccin
Chromosorb WHP 80/100 (empaquetada)

265 C
70 C
MEASURE 3,6,0,600
Nitrgeno 25 mL min-1
50.0 PL
20 C min-1
90 C
170 C
1 min
1 min
x Tabla 10-1: Condiciones de trabajo en microextraccin por desmezcla en CG- EAM

UV-Vis

Se han estudiado distintos parmetros que afectan a la separacin y
determinacin de los compuestos voltiles. Nuestro grupo ya tena experiencia en
esta tcnica y haba estudios previos hechos, tal y como se coment tambin en el
apartado 10.1. La cubeta de cuarzo de flujo de 1 cm de paso ptico ya se haba
usado al igual que el ter de petrleo como disolvente, el nitrgeno como gas
portador y la T de cubeta (se eligi 70 C para que los compuestos no
condensaran). Con la finalidad de encontrar los parmetros idneos para la
separacin de nuestros compuestos se hicieron varios diseos de experimentos.
169
__________________________________________________________________________________
Para preparar las disoluciones estndar se disolvieron los patrones de los

compuestos en el disolvente a utilizar y posteriormente se realizaron las diluciones
necesarias. El ter de petrleo fue el disolvente elegido para esta tcnica, ya que no
absorba en ese rango de longitudes de onda, dando mejores resultados que el
diclorometano
El primer diseo usado fue un Plackett-Burman. Se trata de un diseo
especial para determinar la significacin de los parmetros. El nmero de factores
es n-1, y el nmero de experimentos n, donde n es un mltiplo de cuatro. En este
caso concreto n=8 y se realizaron los experimentos por duplicado.
Siete factores o variables se consideraron inicialmente:
x Temperatura del inyector
x Flujo de nitrgeno
x Programa de temperatura del horno
x Volumen de inyeccin
x Saludo (es una variable duma)
x Temperatura de la cubeta
x Tiempo de integracin
Este ltimo factor se refiere al modo de hacer la medida. Para ello es

necesario incorporar al espectrofotmetro programas BASIC adecuados, los
utilizados podemos verlos en el apndice F. Los programas a utilizar dependern
de la informacin que queramos obtener. Estos programas utilizados fueron
diseados en trabajos anteriores. Para que el instrumento realice las medidas es
necesario indicrselo con una sentencia que tiene la siguiente estructura
MEASURE a, b, c, d, donde a, b, c, y d son nmeros que indican segundos. El
primero, "a" es el tiempo que realmente est midiendo en cada ciclo, "b" es el
tiempo que transcurre desde que empieza a tomar un dato hasta que empieza a
adquirir el siguiente (lo llamado duracin del ciclo), "c" es el tiempo de retardo
(tiempo que transcurre desde que se le da la orden de medir hasta que realmente
empieza, que en nuestro caso es cero) y el ltimo "d", indica el tiempo total que
estar adquiriendo datos.
170
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
Para poner a punto el procedimiento para determinar una serie de

compuestos mediante esta tcnica, los pasos a seguir fueron los siguientes:
1. Realizar sus espectros de absorcin molecular UV-Visible en fase gas.
Para estos estudios no es necesario un programa especial. Este estudio es
primordial, primero porque nos permite elegir la longitud de onda idnea,
y segundo porque obtenerlos en fase lquida puede dar informacin falsa
ya que los espectros tienden a desplazarse. Los espectros obtenidos al
inyectar las disoluciones individuales de cada uno de los compuestos en el
cromatgrafo, se muestran en la figura 10-1.
2. Elegir una longitud de onda de medida en la que absorban todos los
compuestos y realizar los estudios de optimizacin que sean necesarios, ya
que cuando el solapamiento espectral es grande, los mejores resultados se
obtienen con mtodos multilongitud de onda, mientras que si es pequeo es
conveniente utilizar el mtodo clsico de medida a una nica longitud de
onda. En este caso, la longitud de onda utilizada es la misma en todo el
programa, de manera que la medida resulta ms rpida y cmoda. En este
caso concreto se eligi 190 nm para hacer la optimizacin.
3. Seleccionar la longitud de onda de medida ms adecuada para cada
compuesto y realizar los estudios de caracterizacin analtica trabajando a
diferentes longitudes de onda. En este caso, la longitud de onda de medida
se puede ir cambiando a lo largo del cromatograma.
171
__________________________________________________________________________________
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Etanol
Long. Onda (nm)

A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Long. Onda (nm)

A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
1-Pentanol
Long. Onda (nm)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
3-Metil-1-butanol
Hexanol
Long. Onda (nm)
Alcohol benclico
Long. Onda (nm)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Long. Onda (nm)

A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Fenol
2-Feniletanol
Long. Onda (nm)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Geraniol
Long. Onda (nm)
x Figura 10-1: Espectros de absorcin molecular en fase gas de los compuestos
172
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
Para realizar el diseo de Plackett-Burman se eligieron siete variables

(factores) con dos niveles cada uno, los cuales se indican en la tabla 10-2. Estos
niveles se seleccionaron basndonos en trabajos anteriores y en ensayos previos.
xi : VARIABLES
x1
x2
x3
x4
x5
x6
x7
: Temperatura
del inyector (qC)

-1
: Flujo de nitrgeno (mL min )
: Temperatura del horno (qC)
: Volumen de inyeccin (PL)
: Saludo
: Temperatura de la cubeta (qC)
: Tiempo de integracin (s)
Nivel -
Nivel +
265
25
(1)
30
SI
70
MEASURE 3,6,0,600
300
40
(2)
50
NO
140
MEASURE 2,5,0,600
x Tabla 10-2: Factores y niveles considerados en el diseo de Plackett-Burman

(1): 120 qC (1 minuto) a 20 qC min-1 hasta 200 qC (1 min)
(2): 90 qC (1 minuto) a 20 qC min-1 hasta 170 qC (1 min)
El nmero de experimentos totales fueron 16 ya que se hizo una rplica de

los ocho. Adems, stos fueron aleatorizados. Se utiliz el programa Unscrambler
donde se obtuvo la matriz experimental, la cul se muestra en la tabla 10-3.
Si consideramos el error experimental por distribuciones estadsticas
conocidas, pueden hacerse distintas consideraciones:
a) Los errores experimentales deberan ser independientes en cada uno de los
experimentos.
b) La varianza del error experimental debera ser constante en todo el
dominio experimental.
Sin embargo, el sistema puede estar influenciado por situaciones que no
estn aleatorizadas y producir errores sistemticos. Por ello, se procura corregir
esto aleatorizando la metodologa de trabajo. Esta precaucin transforma los
errores del sistema en aleatorios.
173
__________________________________________________________________________________
EXPERIMENTOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
x
FACTORES
x1
x2
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
x3
+
+
+
+
+
+
+
+
-
x4
x5
+
+
+
+
+
+
+
+
x6
+
+
+
+
+
+
+
+
-
x7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Tabla 10-3: Matriz experimental con el diseo de Plackett-Burman, x1= T del inyector,
x2= flujo de nitrgeno, x3= T del horno, x4= volumen de inyeccin, x5 = saludo, x6= T
de la cubeta, x7= tiempo de integracin
En nuestro caso, con la finalidad de simplificar el programa de medida, el

espectrofotmetro se program como ya comentamos a 190 nm, longitud de onda a
la que absorben todos los compuestos a estudiar. Las respuestas o variables
dependientes son la resolucin entre los picos. Trabajamos con ocho compuestos,
por lo que el nmero de respuestas que obtenemos son siete:
x R12 (etanol y 1-pentanol)
x R23 (pentanol y 3-metil-1-butanol)
x R34 (3-metil-1- butanol y hexanol)
x R45 (hexanol y fenol)
x R56 (fenol y bencilalcohol)
x R67 (bencil alcohol y 2-feniletanol)
174
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
x R78 (2-feniletanol y geraniol)

El clculo de la resolucin (R) se hizo siguiendo la frmula:
t 2 t1
1 / 2 (Z1 Z 2 )
donde: t1 es el tiempo al que sale el primer pico en el cromatograma,

t2 el tiempo al que sale el segundo pico,
1 la anchura del primer pico a mitad de altura y
2 la anchura del segundo pico a mitad de altura.
Una vez introducidos los valores de resolucin obtenidos en cada uno de los
experimentos, se tratan estos datos con el programa SPSS y se obtienen con un
estudio de ANOVA los valores de los efectos de las variables (95%), lo que
muestra si las variables son significativas o no lo son, en funcin del valor de p
(valor de significacin). Estos resultados se muestran en la tabla 10-4.
Variables
R12
R23
R34
R45
R56
R67
R78
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Flujo de nitrgeno
Temperatura del horno
Volumen de inyeccin
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Saludo
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Temperatura de la cubeta
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
x
Tabla 10-4: Resultados obtenidos en el diseo de Plackett- Burman,

(S= significativo, NS= no significativo)
175
__________________________________________________________________________________
A la vista de esta tabla, queda de manifiesto que las variables significativas

son tres, las dos continuas (flujo de nitrgeno y tiempo de integracin) y otra
discontinua (T del horno).
Una vez estudiados los resultados y con la finalidad de realizar un sencillo
diseo, se tomaron en consideracin las dos variables continuas significativas y se
realizo un diseo factorial, eligiendo como rampa de temperatura (variable
discontinua) la siguiente:
20 C min-1
90 C
170 C
1 min
1 min
El diseo factorial propuesto es un 22 con dos factores y dos niveles cada

factor y con dos puntos centrales. Se hizo una rplica por cada experimento,
resultando un total de 12, todos ellos aleatorizados. La inclusin de dos puntos
centrales se hizo con la finalidad de observar si exista curvatura, adems de que
tambin ayudan junto con las rplicas a calcular los coeficientes de varianza. Esta
tcnica de optimizacin (22+2 puntos centrales) tiene la ventaja de dar informacin
sobre los efectos y las interacciones entre los factores. La variable dependiente es
la resolucin entre los picos cromatogrficos (obtenidos a 190 nm), las variables
independientes son el flujo de nitrgeno (x1) y el tiempo de integracin (x2). La
matriz experimental y el modelo se obtuvieron utilizando Statgraphics. Los valores
de las respuestas y la matriz experimental se muestran en la tabla 10-5.
176
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
Experim.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Puntos normalizados
x1
x2
0
0
+
+
0
0
+
+
-
0
0
+
+
0
0
+
+
Resolucin
Variables
flujo
25
36
36
40
40
25
25
36
36
40
40
25
tiempo int.
R12 R23 R34 R45 R56 R67 R78
2,5,0,600
3,7,0,600
3,7,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,7,0,600
3,7,0,600
3,6,0,600
2,5,0,600
3,6,0,600
4.2
3.7
3.6
3.3
2.2
4.8
4.2
3.6
3.7
3.3
2.2
4.9
1.6
1.0
1.1
1.4
1.0
1.7
1.5
1.1
1.1
1.4
1.0
1.5
4.4
4.3
3.9
4.0
2.5
4.7
4.1
4.0
4.1
4.1
2.6
4.6
5.0
5.0
4.5
3.7
3.1
5.1
4.9
4.6
4.9
3.7
3.2
4.9
1.6
1.7
1.6
2.0
1.7
3.0
1.7
2.0
1.7
2.1
1.8
2.8
3.1
2.3
2.2
2.0
1.4
1.7
2.9
2.2
2.2
2.1
1.5
1.9
3.1
4.3
3.9
2.2
2.3
3.5
3.1
4.0
4.2
2.3
2.4
3.4
x Tabla 10-5: Matriz experimental y resultados del diseo 22+2
La ecuacin general del modelo es:

y = E0 + E1 x1 + E2 x2+ E3 x1x2
donde y es la variable respuesta, xi son los factores y Ei son los coeficientes de
ajuste de las diferentes variables, siendo E0 una constante de la variable respuesta.
En nuestro caso, y es la resolucin, x1 es el flujo de nitrgeno y x2 el tiempo
de integracin. Para ver que variables influyen con ms fuerza incluyendo el signo
o direccin, si haba interaccin entre ellas y si los bloques de las rplicas eran o no
significativas (al 95%) se hizo un clculo de los efectos donde el valor dep nos
hizo ver que, en todos los casos, la interaccin entre los dos efectos era
estadsticamente no significativa (p mayor de 0.05), por tanto E3 es prcticamente
cero. Adems no haba diferencias significativas entre los distintos grupos de
rplicas, ya que el efecto del bloque tambin tena un valor menor a 0.05.
Una vez observados los valores de significacin de las variables en estudio,
se calcularon los valores de los coeficientes de ajuste, los cuales se muestran en la
tabla 10-6.
177
__________________________________________________________________________________
E0
3.15
1.45
1.70
5.13
0.178
4.37
2.62
R12
R23
R34
R45
R56
R67
R78
E1
-0.108
-0.0268
-0.0676
-0.0877
-0.0276
-0.0353
-0.0390
E2
0.0153
0.00272
0.0166
0.00820
0.0113
0.00380
0.00705
x Tabla 10-6: Valor de los coeficientes de ajuste en el

diseo 22+2 en CG-EAM UV-Vis
Podemos, por tanto, concluir que el flujo de nitrgeno es el factor que

influye ms (ya que el valor absoluto de sus coeficientes es mayor que los valores
de los coeficientes del tiempo de integracin), pero al nivel ms bajo (25 mL min1
), ya que en todos los casos los coeficientes tienen valor negativo. El tiempo de
integracin, es para todas las respuestas estadsticamente significativo y positivo
Una vez finalizado el estudio estadstico y teniendo en cuenta los ensayos
previos y los estudios anteriores, se puede concluir que las condiciones ptimas son
las que se muestran en la tabla 10-7.
PARMETROS
CONDICIONES
Disolvente
Tiempo de agitacin
Volumen de muestra
ter de petrleo
SA/FS(1) (1.5 g /0.6 g)
30 minutos
10.0 mL
2.0 mL

Flujo de nitrgeno
Volumen de inyeccin
Temperatura de la cubeta
Temperatura del horno
265 C
25 mL min-1
50 L
70 C
MEASURE 3,6,0,600
x
20 C min-1
90 C
170 C
1 min
1 min
Tabla 10-7: Condiciones ptimas para la microextraccin por desmezcla en CG- EAM
UV-Vis. (1) SA/FS: sulfato amnico anhidro/fosfato sdico dihidratado
178
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
Optimizadas las condiciones, el cromatograma obtenido con esta tcnica

para la mezcla de los compuestos voltiles en ter de petrleo se muestra en la
figura 10-2.
etanol
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
fenol
1-pentanol
3-metil-1-butanol
geraniol
alcohol benclico
2-feniletanol
hexanol
TIEMPO (S)
x
Figura 10-2: Cromatograma. Voltiles en ter de petrleo, microextraccin por

desmezcla en CG- EAM UV-Vis

Una vez optimizadas las condiciones qumicas e instrumentales, se procedi
a realizar los estudios de calibracin de cada uno de los compuestos.
Se inyectaron las disoluciones preparadas con los ocho compuestos en ter
de petrleo y los valores de las absorbancias para cada pico se consideraron como
parmetros de cuantificacin.
La composicin de dichas mezclas se estableci preparando cinco
disoluciones en ter de petrleo con concentraciones diferentes de los distintos
compuestos, la forma de aleatorizar las concentraciones en las disoluciones se hizo
179
__________________________________________________________________________________
de la siguiente forma: en ocho cajas (una por compuesto) se colocaron cinco piezas
de papel, una por cada valor de concentracin, para la mezcla primera se toma un
papelito de cada caja de manera que la concentracin final de la mezcla en cada
uno de los compuestos es totalmente aleatoria. Se procede del mismo modo para
las cinco mezclas. Las disoluciones quedan establecidas segn la tabla 10-8:
COMPUESTOS
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
disoluciones
1
(Pg mL-1)
2
966
3720
3230
1987
91.2
147
252
336
1490
3968
2842
2484
114
128
101
252
1876
3472
3617
1490
45.6
202
151
302
2208
4213
3876
993
148
73.6
63.2
151
2484
2976
4134
1738
34.2
55.5
202
201
x Tabla 10-8: Concentraciones de las disoluciones para el estudio de calibracin en

CG-EAM UV-Vis
La tabla 10-9 muestra las caractersticas analticas de los compuestos:

valores de las pendientes de las rectas de calibrado, lmites de deteccin (LD) y
desviacin estandar relativa porcentual sr (%). Los valores de R2 en las rectas
fueron en todos los casos mayores de 0.99.
COMPUESTOS
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
x
Pendiente
(mL Pg-1)
LD
(Pg mL-1)
sr
(%)
1.08 E-4
1.02 E-4
9.03 E-5
9.51 E-5
2.85 E-3
5.95 E-4
8.31 E-4
4.21 E-4
62.0
66.0
74.1
71.0
2.30
11.1
8.11
16.0
3.0
8.1
6.0
4.2
2.1
5.0
4.0
6.1
Tabla 10-9: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla en

CG-EAM UV-Vis
180
T. CEDRN FERNNDEZ
__________________________________________________________________________________
10.5.- Clculo de rendimientos

Una vez optimizadas las variables que afectan a la separacin de los
compuestos se realiz la aplicacin de la metodologa a muestras de vino sinttico.
Se prepararon tres muestras de vino sinttico con los 8 compuestos en un
rango de concentraciones entre 50.0 y 2000 Pg mL-1, se sometieron al
procedimiento de extraccin y la fase orgnica separada se inyect en el
cromatgrafo de gases (50.0 PL). Tal y como se indic en el apartado 4.7 se
calcularon los rendimientos de extraccin a partir de los valores de las K que
aparecen en el apndice A. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 10-10.
Como observamos, en el vino sinttico los rendimientos obtenidos estn
entre 30 y 48%, excepto para el 3 metil-1-butanol- cuyo valor fue del 17% y para el
alcohol benclico que se extrae por encima del 100%.
Este sistema de acoplamiento tiene el problema de la sensibilidad, por ello
no se hizo un estudio cuantitativo en muestras reales de vino (tabla 10-10), aunque
consideramos que puede ser una importante y novedosa lnea de actuacin. Lo que
se hizo fue calcular los rendimientos en vinos reales por el mtodo de la adicin
estndar, aadiendo diferentes concentraciones de los ocho compuestos en tres
vinos blancos de Rioja. En todos los casos, los rendimientos obtenidos por este
mtodo fueron similares a los de los vinos sintticos, exceptuando el caso del
hexanol cuyo valor fue del 68% para el vino real, frente al 48% en el caso de
muestras sintticas.
COMPUESTOS
Etanol
1-Pentanol
3-Metil-1-butanol
1-Hexanol
Fenol
Alcohol benclico
2-Feniletanol
Geraniol
x
Rendimiento (%)
en vino sinttico
Rendimiento (%)
en vino real
32.6
35.0
17.1
48.5
34.5
108
31.9
30.3
31.9
29.9
18.1
68.0
32.2
101
30.1
28.9
Tabla 10-10: Rendimientos de extraccin(%) en microextraccin por desmezcla en

CG-EAM UV-Vis
CAPTULO 11
Extraccin en fase slida (SPE)
- Introduccin
- Volumen de muestra
- Volumen de elucin
- Patrn interno
- Efecto de la matriz en los rendimientos de
extraccin
EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)

183
__________________________________________________________________
11.- EXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPE)
11.1.- Introduccin
Con el fin de conseguir mejores rendimientos de extraccin en la
preconcentracin de voltiles, se hicieron ensayos con otra metodologa de trabajo:
la extraccin en fase slida o Solid Phase Extraction (SPE). Con ella se ha
reducido el uso de disolventes orgnicos y se han evitado problemas como la
incompleta separacin de fases y la utilizacin de material ms frgil y caro, como
en el caso de la ELL que est siendo desplazada, en la mayora de los casos, por
nuevas tcnicas.
La forma de operar con esta tcnica consiste en hacer pasar la disolucin que
contiene los analitos a estudiar sobre una fase slida que los adsorbe de manera
especfica. Tras la adsorcin, los analitos son extrados con una pequea cantidad
de disolvente que tiene ms afinidad por ellos que la fase slida.
Son numerosas las fases slidas que existen en el mercado al igual que sus
aplicaciones. La fase slida puede ser un disco de papel de filtro de pocos
centmetros de dimetro qumicamente modificado, hasta una pequea columna
empaquetada, un cartucho tubular en forma de jeringa hipodrmica o un pequeo
embudo empacado parcialmente con pequeas partculas adsorbentes.
Se requiere mayor superficie para retener cantidades mayores de analito, de
manera que la cantidad de fase slida que se emplea depende del volumen de
muestra y de la concentracin de analitos presentes.
Las superficies de las fases slidas se clasifican por un conjunto de atributos
qumicos en polares o no polares; cidas, neutras o bsicas; hidroflicas o
hidrofbicas y catinicas o aninicas. As, los diferentes tipos de fases permiten
aislar distintas clases de compuestos.
Ya en 1982 Williams et al129 utilizaron C18 como fase slida para extraer
compuestos voltiles en vino y en 1985 Gunata et al130 utilizaron resina XAD-2
129
130
Williams P.J. et al, J. Chromatogr. A, 235, 471-480, (1982)

Gunata Y.Z. et al, J. Chromatogr. A, 331, 83-90, (1985)
T. CEDRN FERNNDEZ
184
__________________________________________________________________
con el mismo fin, y a partir de entonces son numerosos los trabajos encontrados
con stas y con otras fases slidas131.
Tambin se han producido avances respecto a la posibilidad de automatizar
esta metodologa y se han descrito sistemas que permiten realizar todos los pasos
del pretratamiento de forma automtica132.
Segn se describe en la bibliografa consultada133, adems de la experiencia
que se tena sobre este tema en nuestro grupo de trabajo134, la fase slida ms
utilizada para la preconcentracin y separacin de los voltiles en alimentos es la
C18, por lo que fue sta la que se utiliz (Zorbax C18).
Se trata de un cartucho de jeringa tradicional de 3 mL, empaquetado con 200
mg de relleno. El relleno es una estructura de octadecil silano (ODS) (ver figura
11-1), enlazado covalentemente a la superficie de una partcula de slice, con un
tamao promedio de poro de 80 .
x Figura 11-1: Estructura qumica del relleno del cartucho (ODS)

Los compuestos se retienen en fase reversa, que consiste en separaciones,
donde la matriz (fase polar o moderadamente polar) se separa en una fase
estacionaria no polar. La retencin de los analitos orgnicos en los materiales de
131
Wadat K. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 4362-4366, (1997)

Wertens D.R. et al, Am. J. Enol. Vitic., 44, 275-284, (1993)
Edwards C.G. et al, J. Agric. Food Chem., 38, 311-320, (1990)
Gelsomini N. et al, J. High Resolut. Chromatogr., 13, 352-355, (1990)
132
Marvin C.H. et al, Anal. Chem., 62, 1495-1498, (1990)
133
Arrhenius S.P. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 1085-1090, (1996)
Gianotti S. et al, LÈnotecnico, 32, 61-64, (1991)
134
Senz C. et al, Mikrochim. Acta, 122, 267-277, (1996)
Senz C. et al, Analusis., 23, 255-257, (1995)

185
__________________________________________________________________
SPE es debida, principalmente, a fuerzas de atraccin de van der Waals o fuerzas

de dispersin.
El proceso de separacin de los compuestos se representa en la figura 11-2.
Al pasar la muestra se adsorben tanto los compuestos de inters como impurezas.
La eleccin del disolvente adecuado hace que en la elucin, obtengamos los
compuestos en estudio.
(a)
(b)
matriz
dte
impureza
compuesto
disolvente
x Figura 11-2: Fase slida (a) y elucin selectiva en SPE y smbolos (b)
T. CEDRN FERNNDEZ
186
__________________________________________________________________
La extraccin en fase slida es un proceso en etapas que se muestra

grficamente en la figura 11-3.
1. El primer paso es la seleccin del tubo o cartucho.
2. Acondicionamiento o activacin de la fase slida con un volumen de
disolvente.
3. Adicin de la muestra. El volumen mximo que se puede adicionar
viene marcado para cada aplicacin y condiciones de uso. El paso de la
muestra se hace lentamente utilizando en nuestro caso un mbolo que
provoca una presin y la hace pasar. El flujo de paso de la muestra,
puede afectar la retencin de los compuestos. Generalmente, ste no
suele exceder de 5 mL min-1.
4. Posibilidad de lavado para eliminar impurezas.
5. Elucin de los compuestos a analizar. Se hace con un pequeo
volumen de disolvente que desplaza los compuestos de inters. El flujo
lento tambin favorece en este paso.
x Figura 11-3: Pasos en SPE

187
__________________________________________________________________
x
Figura 11-3: Continuacin
En la figura 11-4 se muestran una serie de cartuchos comerciales de

diferentes volmenes para SPE.
x Figura 11-4: Cartuchos comerciales para SPE
T. CEDRN FERNNDEZ
188
__________________________________________________________________

El procedimiento utilizado se indica a continuacin:
x Acondicionamiento. La fase slida (Zorbax C18) sobre la que se hace la
extraccin necesita una activacin previa antes de su uso. En nuestro caso
se utilizan 3 mL de metanol seguidos de 3 mL de agua destilada que se
inyectan manualmente a travs de la fase slida con el mbolo de una
jeringa.
x Se pasan 10.0 mL de la muestra a analizar a travs del cartucho de fase
slida.
x Se eluyen los compuestos de la muestra que contiene los compuestos objeto
de estudio con 3.0 mL de diclorometano.
x Se aade el patrn interno al extracto y se analiza, por triplicado, por
cromatografa de gases con detector FID.
Las condiciones cromatogrficas son las que se muestran en el captulo 4,
apartado 4.4.5.

En este procedimiento se optimizaron las siguientes variables:
x Volumen de muestra
x Volumen de elucin
Los compuestos con los que trabajamos fueron:
x 1-Hexanol (1H)
x Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)

189
__________________________________________________________________
11.3.1.- Volumen de muestra

Para optimizar el volumen de muestra, se realiz un estudio con distintos
volmenes de sta (10.0 mL y 25.0 mL). El estudio, como en los anteriores
captulos de otros mtodos de extraccin, se realiz con diclorometano como
eluyente. Para ello se prepar una disolucin de vino sinttico en la que la
concentracin de los compuestos a analizar fue de 35.4 a 120 Pg mL-1. El volumen
de disolvente utilizado fue de 5.0 mL (aunque se hizo una segunda extraccin con
otros cinco mL para asegurar que no quedaban analitos en el cartucho). Al extracto
obtenido se le aadi el p.i. (3-octanol).
Para cuantificar se utiliz el mtodo del patrn interno tomando la seal de
rea de los cromatogramas obtenidos como parmetro de cuantificacin. Los
valores de K correspondientes a cada compuesto respecto al patrn interno 3octanol se muestran en el apndice A. Los resultados obtenidos (rendimientos) se
indican en la tabla 11-1 y su representacin grfica en la figura 11-5.
Rendimiento (%)
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
10.0 mL muestra
25.0 mL muestra
70.91.3
90.20.4
68.32.2
83.71.2
78.20.7
83.82.9
78.30.9
85.71.8
75.61.4
79.00.6
76.21.0
60.22.3
73.51.2
54.30.9
73.00.3
58.11.7
65.61.4
65.90.8
72.52.3
56.32.5
56.03.1
48.02.8
x Tabla 11-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de muestra en

SPE
T. CEDRN FERNNDEZ
190
__________________________________________________________________
x

con distintos volmenes de muestra en SPE
Si se analizan los resultados, se observa que con los 25.0 mL no mejoran

respecto a utilizar 10.0 mL. Por ello se considera el volumen de 10.0 mL de
muestra a introducir en la fase slida idneo por las caractersticas del cartucho.
Los porcentajes de extraccin en este caso estn en un rango entre 68% y 84% para
steres, entre 76% y 90% para alcoholes y entre 76% y 86% para cidos. Esta
tcnica es sencilla, cmoda y consume poco disolvente orgnico.

191
__________________________________________________________________
11.3.2.- Volumen de elucin.

Para estudiar la influencia del volumen de elucin se realizaron dos estudios:
x Eluyendo con 5.0 mL de disolvente dos veces consecutivas y a continuacin,
una vez acondicionados los extractos, se analizaron por cromatografa de gases
(5+5).
x El segundo ensayo consisti en pasar primero 3.0 mL, a continuacin se volvi
a eluir con otros 2.0 ml y por ltimo se pasaron otros 2.0 mL. Las tres
fracciones, una vez acondicionadas, se analizaron por separado (3+2+2).
Observamos directamente en los cromatogramas (reas de los picos
cromatogrficos) que los compuestos se eluyen prcticamente en los tres primeros
mL utilizados, aunque se extraen algunos de los compuestos en los siguientes 2 mL
como puede verse en la representacin grfica de la figura 11-6. Por ello elegimos
como volumen de elucin 3 mL de diclorometano ya que la cantidad de analitos
que se obtiene con los 2 mL restantes se puede considerar despreciable.
16000
14000
A3M1B
12000
3M1B
HE
10000
1H
8000
OE
SD
6000
AFE
4000
AH
2FE
Area
2000
AO
AD
3.0
2.0
2.0
Volumen de elucin (mL)
x Figura 11-6: Representacin grfica del volumen de elucin

utilizado en SPE (3+2+2)
T. CEDRN FERNNDEZ
192
__________________________________________________________________

Una vez optimizadas las variables en estudio, las condiciones ptimas de
trabajo se muestran en la tabla 11-2.
CONDICIONES
PARMETROS
Disolvente
Volumen de muestra
Volumen de elucin
Diclorometano
10.0 mL
3.0 mL
Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de Split
Volumen de inyeccin
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.2:1
2.0 PL
4 C min-1
60 C
170 C
4 min
12 min
x Tabla 11-2: Condiciones ptimas en SPE
Los rendimientos obtenidos con estas condiciones se muestran en la tabla

11-3.
A3M1B
3M1B HE
71.6
91.1
x
1H
OE
SD
AFE AH
2FE
AO
67.6 83.2 78.7 84.3 76.4 84.8 74.7 78.1
Tabla 11-3: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (SPE)
AD
76.4

193
__________________________________________________________________

Se procedi a hacer las rectas de calibrado con esta metodologa de trabajo
para cada uno de los compuestos utilizados. Para ello se prepararon diferentes
disoluciones de los compuestos en estudio (incluido el p.i.) entre 0.500 y 200 Pg
mL-1 en DM y se inyectaron en las condiciones optimizadas. A los valores de
pendiente, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin (tal y como se expuso en
el apartado 4.5) se aplicaron los rendimientos de extraccin de cada compuesto en
esta metodologa. Los resultados se muestran en la tabla 11-4. Como parmetro de
cuantificacin se emple el rea del pico cromatogrfico.
como sr (%) (desviacin estndar relativa) se realizaron tres extracciones de una
disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por triplicado.
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1 )
o.o.
(intervalo de
confianza de 95%)
L.D.
(Pg mL-1)
L.C.
(Pg mL-1)
sr
(%)
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
0.01220.0002
0.02820.0007
0.01010.0001
0.02170.0002
0.01890.0002
0.04720.0009
0.2240.006
0.01210.0002
0.008960.00015
0.01660.0003
0.01860.0002
-4.81 E-20.02E-2
-1.21E-20.31E-2
-4.03E-20.03E-2
-5.10E-20.61E-2
-1.01 E-0.11E-2
-2.53E-20.82E-2
-8.21E-20.12E-2
-2.64E-20.73E-2
-3.62E-20.31E-2
-1.93E-20.40E-2
-1.03E-20.52E-2
0.0416
0.0183
0.0621
0.0245
0.0268
0.0114
0.0224
0.0343
0.0574
0.0312
0.0276
0.137
0.0611
0.208
0.0814
0.0891
0.0367
0.0745
0.114
0.190
0.101
0.0909
4.0
3.1
1.2
2.7
4.1
2.2
3.2
3.1
2.0
2.6
3.2
x
Tabla 11-4: Caractersticas analticas en SPE,

1

3
4
2

Una vez optimizado el procedimiento de extraccin se pas a aplicarlo a
muestras de vino real. Para ello seguimos el mismo protocolo de actuacin,
haciendo pasar la muestra de vino (10.0 mL) a travs de la fase slida y posterior
T. CEDRN FERNNDEZ
194
__________________________________________________________________
elucin con 3.0 mL de DM. Al extracto se le aade el patrn interno y se inyecta

en el cromatgrafo por triplicado. Para ello se utilizaron cuatro muestras de vino
tinto joven de la DOCa Rioja.

Interpolando los valores de rea de pico de los cromatogramas obtenidos en
las rectas de calibrado, y aplicando para cada compuesto el valor del rendimiento
en las condiciones ptimas se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla
11-5.
COMPUESTOS
CONCENTRACIN (Pg mL-1)

muestra 1
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
3.390.22
4776
4.090.11
27.90.3
1.880.40
2.820.22
nd
5.990.52
30.10.3
9.060.71
3.420.41
muestra 2
3.550.30
4657
4.300.01
29.30.2
1.970.32
2.960.14
nd
6.390.61
31.50.6
9.510.50
3.590.11
muestra 3
3.620.21
4675
4.370.21
29.80.4
2.010.51
3.090.32
nd
6.410.42
32.20.2
9.690.60
3.660.71
muestra 4
3.250.20
4684
3.920.19
26.70.34
1.840.48
2.720.74
nd
5.760.31
28.80.4
8.690.21
3.280.30
x Tabla 11-5: Cuantificacin en vino real mediante SPE. Rectas de calibrado

(nd: no detectado)

Para utilizar el mtodo del patrn interno previamente se calcularon los
valores de las constantes en el disolvente a utilizar como se expuso en el apartado
4.6. Una vez aplicados, como en el caso anterior, a los valores obtenidos, los
rendimientos en las condiciones ptimas, los resultados se indican en la tabla 11-6.

195
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x

muestra 1
muestra 2
3.420.12
4696
4.110.21
26.80.3
1.680.42
2.760.16
nd
5.740.41
29.00.2
8.960.70
3.310.31
3.450.22
4635
4.270.10
27.10.1
1.950.26
2.940.13
nd
6.370.41
30.50.5
9.210.41
3.540.12
muestra 3
3.190.11
4593
4.130.11
28.70.6
2.110.51
3.100.34
nd
6.260.41
31.90.2
9.590.62
3.650.70
muestra 4
3.820.24
4624
3.980.19
27.70.3
1.960.46
2.870.70
nd
5.940.31
28.90.4
9.190.22
3.470.27
Tabla 11-6: Cuantificacin en vino real mediante SPE. Patrn interno

(nd= no detectado)
Observamos, a partir de los valores obtenidos, que los resultados son

similares utilizando ambos mtodos de cuantificacin.
Con la finalidad de conocer si la diferencia entre los resultados por ambos
mtodos de cuantificacin era significativa o no, como se ha venido haciendo en
metodologas anteriores, se realiz, para cada compuesto una prueba estadstica de
comparacin de medias en la que se calcul la significacin (s). Tomando como
probabilidad el 95%, para ver si el valor de la s era mayor de 0.05, en cuyo caso
se aceptaba la hiptesis nula, es decir, no exista diferencia significativa entre los
resultados dados por ambos mtodos de cuantificacin.
En la tabla 11-7 se indican los resultados obtenidos.
T. CEDRN FERNNDEZ
196
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
SIGNIFICACIN
0.469
0.322
0.122
0.145
0.611
0.743
*
0.514
0.931
0.714
0.128
NS
NS
NS
NS
NS
NS
*
NS
NS
NS
NS
x Tabla 11-7: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (SPE)

Vemos que para ninguno de los compuestos estudiados existe diferencia

significativa entre los resultados por ambos mtodos.
11.5.3.- Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin

Con la finalidad de validar el mtodo y comparar los rendimientos de
extraccin de las muestras de vino sinttico, con las muestras de vino real y
comprobar si existe efecto matriz, se realiz un estudio adicionando a nuestras
muestras de vino real cantidades conocidas de cada uno de los compuestos a dos
niveles. Se realiz la extraccin con las condiciones optimizadas y los resultados
obtenidos se muestran en la tabla 11-8. En estos resultados estn corregidas las
cantidades de cada compuesto que contena el vino.
Si comparamos estos rendimientos con los obtenidos con muestras de vino
sinttico (tabla 11-3) vemos que son similares, por lo que deducimos que no existe
efecto matriz.

197
__________________________________________________________________
COMPUESTOS

aadida
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
2FE
AO
AD
x
10.0
22.0
150
300
1.52
3.13
10.0
25.0
1.51
3.00
2.50
4.02
5.03
10.0
1.41
2.82
10.0
20.0
3.51
7.04
0.812
1.72
Rendimiento
(%)
70.11.1
69.51.3
92.70.7
91.71.1
66.42.1
64.52.0
84.01.6
84.81.3
79.50.8
76.70.9
83.73.1
84.82.8
71.80.7
71.20.8
86.52.1
86.22.3
74.11.1
74.51.2
80.30.8
77.10.7
75.01.1
76.71.2
Tabla 11-8: Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin
En la figura 11-7 se muestra un cromatograma de vino sinttico obtenido por

SPE para los compuestos voltiles seleccionados.
T. CEDRN FERNNDEZ
198
__________________________________________________________________
mVolts
1.75
3-octanol
(13.406)
1.50
1.25
AFE
(25.468)
1.00
1H
(12.123)
0.75
A3M1B
(5.769)
HE
(8.611)
0.50
2FE
(27.921)
SD (21.772)
3M1B
(7.793)
AH
(26.413)
OE
(14.679)
AO
(31.653)
AD
(38.778)
0.25
0.02
5
10
15
20
25
30
35
40
Minute
x Figura 11-7: Cromatograma. Vino sinttico, SPE
CAPTULO 12
Microextraccin en fase slida (SPME)
- Introduccin
- Estudios previos
MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)

201
__________________________________________________________________
12.- MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME)
12-1.- Introduccin
Con la finalidad de ampliar el estudio realizado hasta ahora sobre los
diferentes mtodos de extraccin, se propuso la utilizacin de un nuevo mtodo de
extraccin, que complementase los mtodos clsicos. Los ms utilizados a lo largo
de la historia, respecto a los voltiles en vino son mtodos tediosos, largos y
generalmente requieren elevados volmenes de muestra y de disolvente, lo que
puede llevar a contaminar la muestra, por ello se pens en la Microextraccin en
Fase Slida o Solid Phase Microextraction (SPME) como alternativa, ya que con
este mtodo se resolvan algunos de los problemas mencionados, como la cantidad
de muestra, el tiempo de preparacin, disolvente, etc., adems de tener las ventajas
de la simplicidad, rapidez, sensibilidad, fcil automatizacin e incluso mejora de
los lmites de deteccin.
La Microextraccin en Fase Slida, desarrollada en 1990 por Pawliszyn y
colaboradores135 es una novedosa tcnica de extraccin, en la que se utiliza una
fase estacionaria apropiada para cada tipo de compuestos con los que se trabaje. Se
introduce como una tcnica que no necesita disolventes en la preparacin de la
muestra y sobre todo destaca la pequea cantidad de muestra que se necesita.
En esta tcnica, una pequea proporcin de fase de extraccin dispersa en un
soporte slido se expone a la muestra por un periodo de tiempo definido, pasado el
cual se produce un equilibrio entre las distintas fases. El nmero de fases que
intervienen en el equilibrio son tres: matriz o muestra, fibra y fase gas.
Equilibrio de distribucin entre las fases del sistema
Todo el analito que existe en la matriz, una vez alcanzado el equilibrio,
queda distribuido en tres fases, la fase de la muestra matriz (L), la fase de la fibra
(F) y la fase gas (G) (ver figura 12-1).
135
Pawliszyn J. et al, Anal. Chem., 62, 2145-2148, (1990)
T. CEDRN FERNNDEZ
202
_________________________________________________________________________
K1 = CL/CG
K2 = CF/CL
K3 =CF/CG
G
F
C0 VL= CGVG+ CLVL+ CFVF
x
Figura 12-1: Equilibrio en tres fases de la fibra en muestras

lquidas
En dicho equilibrio, los compuestos voltiles iniciales presentes en la

muestra, se distribuirn en las diferentes fases siguiendo el balance de materia que
se muestra a continuacin:
C0 VL = CF VF + CG VG + CLVL
(ecuacin 1)
donde C0 es la concentracin inicial de analito en la matriz, VL es el volumen de la

fase lquida, CF, CG y CL son las concentraciones del analito en el equilibrio en la
fibra, fase gaseosa y fase lquida respectivamente, y VF y VG son los volmenes de
la fibra y de la fase gaseosa.
En el equilibrio, la proporcin de concentraciones en las tres fases viene
descrita por las constantes de equilibrio:
K1 = CL / CG
K2 = CF / CL
K3 = CF / CG

203
__________________________________________________________________
donde K1, K 2 y K3 son las constantes de equilibrio entre la fase lquida y la gas,
entre la fibra y la fase lquida y entre la fibra y la fase gas.
A la cantidad de analito retenido en la fibra se le denomina nfibra= CF VF.
Si en la ecuacin 1 multiplicamos todos los miembros por CF VF/CL,
empleamos los valores de las constantes K1 y K2 y reagrupamos trminos, queda:
C0 VL CF VF /CL= CF VF CF VF /CL+ CG VG CF VF /CL+ CLVL CF VF /CL
n fibra
K 2 u VF u VL
u Co
K 2 u VF K1 u VG VL .
La masa extrada en la fibra es proporcional a la concentracin inicial del

analito, cuando se mantienen constantes los volmenes de las fases. Adems, la
posicin de la fibra en el sistema no influye en la cantidad extrada en el equilibrio.
Estas expresiones se simplifican en dos situaciones lmites:
1.- Si VL es mucho mayor que K2 x VF + K1 x VG esto implicara que:
nfibra = K2 x VF x C0
Es decir, si la suma del volumen de fase de la fibra por K2 y el volumen de
la fase gas por K1 es despreciable frente al VL, ste no influye en la cantidad de
analito extrada.
2.- Si por el contrario VL + K1 x VG es mucho menor que K2 x VF esto
implicara que:
nfibra = VL x C0
Es decir, cuando el volumen de la muestra ms el producto K1 x VG es

despreciable frente al VF x K2, se produce extraccin exhaustiva, esto ocurre con
muestras de volumen muy pequeo y analitos con valores de K2 muy grandes. Al
aumentar el volumen de muestra, aumenta la cantidad de analito extrada hasta
alcanzar un valor a partir del cual la cantidad extrada no depende del volumen de
muestra.
T. CEDRN FERNNDEZ
204
_________________________________________________________________________
Se han considerado numerosos soportes de fase estacionaria para SPME,

como son: fibras, tubos, discos, partculas en suspensin, etc. Las ms utilizadas136
son las fibras y los tubos para SPME.
La SPME puede acoplarse a varios tipos de tcnicas analticas: CG137,
HPLC138 y CL139 y se aplica a una variedad amplia de compuestos140, tanto polares
como no polares, en muestras gaseosas, lquidas o slidas, especialmente para la
extraccin de compuestos orgnicos voltiles y semivoltiles. Sin embargo, el
instrumento ms utilizado con SPME es el cromatgrafo de gases, con el que se
utilizan fibras comerciales.
La fibra propiamente dicha es una fase estacionaria de polmeros unida a una
varilla adjunta, con una cubierta protectora. sta se inserta en una jeringa diseada
con un sistema de mbolo que le permite ser introducida y sacada, y que adems es
posible reutilizar y reemplazar. En las figuras 12-2 y 12-3 se muestran la fibra en el
soporte y su sistema de ensamblaje en el cromatgrafo de gases, respectivamente.
Hay varios tipos de fibras comerciales y su utilizacin depende del tipo de
compuesto seleccionado. La afinidad de la fibra por el analito en estudio es funcin
de la polaridad de ambos. En general, los compuestos voltiles requieren un
polmero ms denso que otros compuestos menos voltiles. Con estos polmeros
ms densos, el proceso es de adsorcin, ya que los analitos quedan en la capa
superficial del polmero. Adems, las fibras con rellenos ms densos requieren ms
tiempo para alcanzar el equilibrio de extraccin, pero tienen mayor sensibilidad. En
el caso de que el polmero sea menos denso, los analitos penetran tambin en los
poros de ste, producindose un proceso de adsorcin y absorcin
simultneamente. Por este motivo, es habitual encontrar en la bibliografa ambos
trminos.
136
Mestres M. et al, J. Chromatogr. A , 835, 137-144, (1999)

Heather L. et al, J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)
137
Castro R. J. Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
Franciola S. et al, Am. J. Enol. Viticult, 54, 158-162, (2003)
Monje M.C. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 111-117, (2002)
Lopez R et al, J. Chromatogr. A, 966, 167-177, (2002)
138
Gonzlez C., J. Chromatogr. A, 896, 373-379, (2000)
139
Eisert R., Anal. Chem., 27, 103-109, (1997)
140
Kataoka H. et al, J. Chromatogr. A, 880, 35-62, (2000)

205
__________________________________________________________________
x
x
Figura 12-2: Fibra con soporte para SPME
Figura 12-3: Fibra ensamblada al cromatgrafo con el

sistema de agitacin
T. CEDRN FERNNDEZ
206
_________________________________________________________________________
Comercialmente, para facilitar el manejo e identificar con ms facilidad cada

una de las fibras, en funcin del polmero que contengan se les asigna un color
(figura 12-4). En ella los colores utilizados representan los colores de las fibras.
Los analitos polares son atrados por fases polares, por ejemplo poliacrilato
(blanca) o carbowax (naranja). Las fibras con mayor espesor de capa son idneas
para compuestos voltiles, incluso pueden utilizarse para menos voltiles, pero se
requieren mayores tiempos de extraccin; las ms finas, tipo polidimetilsilano
(amarilla o verde) de 7 y 30 Pm, son mejores para molculas grandes. Por otro
lado, las fibras porosas con revestimientos de carboxen (negra) divinilbenceno
(naranja), tambin pueden retener analitos pequeos y son ideales para analitos C2C6. Entre ellas tambin existen fibras con dos rellenos diferentes como se muestra
en la figura.
x
Figura 12-4: Fibras comerciales y propiedades: PDMS: polidimetilsilano,

CAR: carboxen, DVB: divinilbenceno, CW: carbowax, TPR: resina templada,
PA: poliacrilato

207
__________________________________________________________________
Las fibras estn compuestas de diversas sustancias orgnicas, principalmente

polmeros, y antes de utilizarlas debemos acondicionarlas para retirar todo tipo
de contaminantes. Para ello, se introducen en el inyector el tiempo que determine el
fabricante y a la temperatura sealada por ste, de forma que se eliminen los
residuos que puedan estar adheridos a la fibra.
Sin embargo, las fibras tienen el inconveniente de ser frgiles y se rompen
fcilmente, incluso pueden estropearse o daarse con la insercin y agitacin.
Adems, compuestos de elevado peso molecular, como son las protenas, se pueden
adsorber irreversiblemente, cambiando as las propiedades de la fase estacionaria,
volvindola inutilizable. La vida media de la fibra es aproximadamente de 100
extracciones, dependiendo de la matriz y del tipo de extraccin utilizado, ya sea
por espacio de cabeza o por inyeccin directa, en la que la fibra dura para un menor
numero de extracciones.
La fase estacionaria acta de esponja concentrando los analitos orgnicos de
la matriz en su superficie durante la adsorcin y los cuales posteriormente sern
desorbidos para ser analizados (figura 12-5). La muestra se coloca en un vial, el
cual est tapado con un sptum. Cuando la jeringa de SPME perfora el sptum y la
fibra entra en el vial es cuando se establece el equilibrio entre las distintas fases
(matriz, fase gaseosa y fibra), una vez adsorbidos los analitos en la fase de la fibra,
sta se extrae y se lleva al inyector del cromatgrafo donde una vez introducida la
fibra son desorbidos los analitos.
x
Figura 12-5: Proceso de adsorcin y

desorcin en la fibra.
T. CEDRN FERNNDEZ
208
_________________________________________________________________________
La temperatura de desorcin es aproximadamente igual al punto de

ebullicin del compuesto menos voltil, y el tiempo de desorcin depende de la
temperatura del inyector y de la proporcin de flujo del gas portador alrededor de
la fibra. La fibra se inserta en el inyector del cromatgrafo de gases y los analitos
son volatilizados y transportados a la columna cromatogrfica.
Tal y como se ha comentado anteriormente existen dos modos principales de
emplear la fibra: espacio de cabeza (HS-SPME) e inyeccin directa (DI-SPME).
Existe otra posibilidad que consiste en la utilizacin de una membrana protectora
que recubre la fibra141, pero es un mtodo mucho menos utilizado.
En espacio de cabeza la fibra no entra en contacto con la disolucin (figura
12-6a), slo se expone a la fase de vapor o gaseosa de la muestra y en la inyeccin
directa, la fibra se introduce directamente en la disolucin (figura 12-6b).
(a)
x
141
(b)
Figura 12-6: SPME en (a) espacio de cabeza y (b) inyeccin directa

209
__________________________________________________________________
La eficacia de cada una de estas tcnicas depende de las propiedades de los

analitos y de la matriz de la muestra. En general DI-SPME es ms sensible que HSSPME pero para los analitos ms voltiles se utiliza HS-SPME ya que de lo
contrario, los compuestos no voltiles se concentran en la fibra y reducen su vida
media as como la reproducibilidad de la extraccin.
El campo de aplicacin de esta tcnica es muy numeroso y en distintas reas,
tal y como lo demuestra el gran nmero de publicaciones que han aparecido en los
ltimos aos como por ejemplo, medio ambiente, clnico y forense, de higiene
industrial o alimentacin. A continuacin se citarn algunos ejemplos.
En el ao 2000 Lord y Kataoka en colaboracin con Pawliszyn publicaron
dos importantes revisiones, una sobre la evolucin de la SPME en lo que a
instrumentacin142 se refiere y otra sobre aplicaciones de esta tcnica en anlisis de
alimentos143.
Existen numerosos trabajos en los que se emplean matrices acuosas, como es
el caso de contaminantes en agua144, donde los resultados fueron muy fructferos
indicando que la SPME es una tcnica muy vlida, consiguindose valores
interesantes en los LD (hasta 0.001 Pg mL-1 para algunos compuestos) tanto para
voltiles como para semivoltiles, incluidos fenoles y pesticidas.
En el caso de matrices ms complejas, una buena alternativa es la utilizacin
del espacio de cabeza con SPME. Dentro del campo de anlisis clnicos y forenses,
se han analizado muestras de sangre y orina145, se ha determinado etanol, acetona e
isopreno en aliento humano146 y alcohol y drogas en fludos corporales, as, existen
numerosos estudios sobre determinacin de anfetaminas147, cocana, antidepresivos
tricclicos148, nicotina u otros anestsicos locales.
De la misma forma, se han determinado compuestos voltiles orgnicos
existentes en productos farmacuticos149, que estn frecuentemente contaminados
debido a procesos de fabricacin.
142

Kataoka H. et al, J. Chromatogr. A, 880, 35-62, (2000)
144
Wu I. et al, J. Chromatogr. A, 976, 357-367, (2002)
Gonzlez C. et al, J. Chromatogr. A, 896, 373-379, (2000)
145
Xilan C. et al, J. Chromatogr.y B, 802 , 239-245, (2004)
146
Grote C. et al, Anal Chem., 69, 587-592, (1997)
147
Nagasawa N. et al, Forensic Sci. Int., 78, 185-191, (1996)
148
Kumazawa T. et al, J. Forensic. Toxicol., 13, 25-31, (1996)
149
Urruty L. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 1519-1522, (1997)
143
T. CEDRN FERNNDEZ
210
_________________________________________________________________________
Siguen probndose nuevas aplicaciones cada da, investigndose y

desarrollando el anlisis de protenas bsicas y de matrices ms complejas como
muestras biolgicas, o incluso simples clulas, para las que se han diseado fibras
de dimensiones muy pequeas.
Otra aplicacin que resulta de gran inters es el anlisis de alimentos y
bebidas150, tanto alcohlicas como no alcohlicas. Las matrices que se han
empleado son muy diferentes y, en la mayora de los casos se estudia el contenido
en compuestos responsables del aroma. As, se ha analizado queso151, plantas152,
frutas153, trufas blancas y negras154, aceite155 o bebidas de cola156.
El vino157 es una matriz en la que se han determinado numerosos analitos:
pesticidas, compuestos de azufre o nitrogenados, compuestos responsables del
aroma y sus distintas familias, etc. Sin duda, el estudio del aroma es uno de los
aspectos de mayor inters en la actualidad, por lo que existe tambin gran cantidad
de bibliografa referida a la determinacin de compuestos responsables del
mismo158, como alcoholes, steres, o cidos.
Una familia de compuestos que juega un importante papel dentro del aroma
del vino son los terpenos. Dentro del mundo enolgico en particular, son los nicos
compuestos integrantes del aroma de las uvas, a los que se les ha asignado un claro
papel en el aroma final de los vinos (linalol, terpineol, nerol, geraniol). De acuerdo
De la Calle Garca D. et al, J. High Resolut. Chromatogr., 19, 257-263, (1996)
Urruty L. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 3871-3878, (1996)
Page D. et al, J. Chromatogr. A, 648, 199-204, (1993)
150
Fitzgerald G. et al, J Chromatogr. A, 896, 351-359, (2000)
151
Jaillais B. et al, Talanta, 48, 747-753, (1999)
152
Coleman W.M. et al, J. Chromatogr. Sci, 36, 401-405, (1998)
153
Ibaez E. et al, Food Chem., 63, 281-286, (1998)
154
Pelusio F. et al, J. Agric Food Chem., 43, 2138, (1995)
155
Yang X. et al, J. Agric Food Chem., 42, 1925-1932, (1994)
156
Hawthorne S et al, J. Chromatogr. A, 603, 185-191, (1992)
157
Rodrguez J.J. et al, J. Chromatogr. A, 991, 13-22, (2003)
Mestres M. et al, J. Chromatogr. A, 945, 211-219, (2002)
Rodrguez J.J. et al, J.Chromatogr. A, 963, 213-223, (2000)
Vas G. et al, Am. J. Enol. Viticult, 49, 100-104, (1998)
Boyd-Boland A. et al, J. Chromatogr. A, 704, 163,(1995)
158
Mejas R. et al, J.Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
Matisova E. et al, J. Chromatogr. A, 960, 159-164, (2002)
Pino J. et al, J. Chromatogr A, 954, 51-57, (2002)
Holt R.U., et al, J. Chromatogr. A, 937, 107-114, (2000)

211
__________________________________________________________________
con el trabajo de Rapp159, los terpenos tienen la caracterstica de no cambiar su

estructura durante el proceso de fermentacin.
De la pequea parte que se conoce sobre el aroma final del vino, los
terpenos, constituyen, de momento, los nicos compuestos a los que se les asigna
un valor claramente varietal, es decir, son los compuestos a los que cabe atribuir
una parte importante de la diferenciacin de los aromas de los vinos que proceden
de distintas variedades de uvas. Seguramente, no sern los nicos, ya que cada vez
van apareciendo ms compuestos sintetizados en la uva, por diferentes rutas
metablicas, bien diferenciadas de las terpnicas.
Desde Austerweil en 1946160 hasta los trabajos de Ribereau-Gayon en
1975161 las investigaciones iban dirigidas al estudio del aroma libre, es decir de los
compuestos responsables del aroma directamente, ignorando la existencia de
compuestos ligados a ciertas molculas no voltiles, y por tanto no odorgenos.
Compuestos como el linalol, terpineol, nerol, geraniol y los xidos de
algunos de ellos, estn presentes en numerosos estudios, sin embargo no se
detectan ni limoneno, ni mirceno, ni citroneol, ni farnisol, entre otros; incluso hay
compuestos, cuyas frmulas estn sin identificar, con propiedades muy similares a
las del linalol. Se llega a afirmar, que hay determinadas variedades que no poseen
terpenos, en contra de algunos estudios anteriores162.
Posteriores estudios corroboraron la validez de estos datos. En 1978
Wagner163, demostr estadsticamente la relacin entre el contenido en linalol y
geraniol de una cepa y su carcter de moscatel. Tambin cada vez van apareciendo
ms compuestos en forma de terpenos oxidados, confirmndose la hiptesis de que
eran muchos los compuestos que simultneamente formaban el aroma del vino en
las variedades tipo moscatel. As, en 1981, Williams identifica 22 terpenos en uvas
moscatel164 y Etievant en 1983 ms de 30, incluyendo una valoracin de su
contribucin al aroma165.
159
Rapp A., Wine Analysis, (1988)

Austerweil G., Ind. Parfum, (1946)
161
Ribereau-Gayon et al, J. Agric. Food Chem., 23, 1042-1047, (1975)
162
Stevens K.L. et al, J. Agric. Food Chem., 17, 1102-1106, (1969)
Stevens K.L et al, J. Agric. Food Chem., 15, 378-381, (1967)
163
Wagner R. et al, Gen. Am. Vigne, 429-434, (1978)
164
Williams P.J. et al, Am. J. Enol. Vitic., 32, 230-235, (1981)
165
Etivant P.X, et al, J. Sci. Food Agric., 34, 393-493, (1983)
Etivant P.X. et al, J. Sci. Food Agric., 34, 497-504, (1983)
160
T. CEDRN FERNNDEZ
212
_________________________________________________________________________
As como en un principio los estudios iban dirigidos a las variedades de

moscatel, en la ltima dcada los estudios se han ampliado y han abierto
horizontes, dirigidos a la explotacin tecnolgica de los precursores aromticos,
para la produccin de vinos y de otros productos con aromas varietales marcados y
diferentes a los hasta ahora producidos.
Dada la importancia demostrada de estos compuestos en el aroma final del
vino, se ha considerado oportuno incluir en nuestro estudio166 algunos terpenos en
la mezcla de voltiles que se vena utilizando hasta ahora. As, los compuestos
utilizados fueron:
x D-Terpineol (T)
x Acetato de-3-metil-1-butilo (A3M1B)
x cido octanico (AO)
x 1-Hexanol (1H)
x Geraniol (G)
x 1-Pentanol (1P)
x Linalol (L)

El procedimiento utilizado es muy sencillo, la muestra no precisa
preparacin ni se emplean disolventes para su extraccin, es por ello que se
considera como una alternativa atractiva para estudiar los compuestos voltiles en
vino. Adems, es una tcnica con la que se obtienen valores muy buenos en los
factores de preconcentracin.
El procedimiento de extraccin (realizado por triplicado) se indica a
continuacin:
A 10.0 mL de vino sinttico o real se aadi 0.1 g de NaCl y 0.1 g de (NH4)2SO4,
para favorecer el paso de los voltiles a la fase gas. Se tomaron tres alcuotas de
0.80 mL que se colocaron en tres viales capsulados, para realizar una sola
inyeccin en cada vial. Como en casos anteriores, se emple 3-octanol como
patrn interno
166
Cabredo S. et al, Chromatographia, en prensa

213
__________________________________________________________________
El proceso de adsorcin se hizo en espacio de cabeza y con agitacin durante 10

minutos, pasados los cuales la fibra (Carbowax-divinilbenceno o fibra color
naranja) se somete al proceso de desorcin de 2 minutos en el cromatgrafo de
gases.
Las condiciones cromatogrficas utilizadas son las que se muestran en el
12.3.- Estudios previos

Antes de pasar a la optimizacin de los parmetros que influyen en la
extraccin se realizaron unos estudios preliminares con la finalidad de tener un
conocimiento previo del sistema.
Para evaluar y comparar los resultados obtenidos en diferentes condiciones,
se calcularon factores de preconcentracin. sta es una variable que no suele
utilizarse pero en este caso lo consideramos ms apropiado al concentrarse el
analito en la fibra. Para ello se calcularon, como en casos anteriores, los valores de
las K preparando una disolucin en diclorometano con todos los compuestos
voltiles en estudio que fue inyectada en el cromatgrafo. Por otro lado se
prepararon disoluciones de vino sinttico a concentraciones conocidas (c1), una vez
sometidas al mtodo de extraccin las concentraciones obtenidas (c2) se calcularon
con los valores de las K mencionados. Se considera factor de preconcentracin
a la relacin c2/c1.
En nuestro caso, los estudios previos a la optimizacin se centraron en el
tipo de extraccin, relacin de split, tiempo de adsorcin, tipo de fibra y nmero de
viales en el cromatgrafo para cada muestra.
x Respecto al tipo de extraccin, los mtodos ms utilizados, como ya se ha
mencionado son la inyeccin directa (DI-SPME) y el espacio de cabeza (HSSPME). Ambos casos fueron comparados calculando el factor de
preconcentracin para cada uno de los compuestos voltiles. Para ello
preparamos una disolucin de vino sinttico con todos los compuestos en
estudio ms el patrn interno a concentracin conocida, la cual fue sometida a
ambos tipos de extraccin, tanto HS-SPME como DI-SPME utilizando las
condiciones cromatogrficas que se indican en el apartado 4.4.5. Los resultados
de estas determinaciones se muestran en la tabla 12-1. Puede verse que son
resultados similares, por ello la opcin elegida es la de espacio de cabeza. La
T. CEDRN FERNNDEZ
214
_________________________________________________________________________
bibliografa167 consultada ya muestra que generalmente se utiliza HS-SPME, ya

que adems de prolongar la vida de la fibra, en la DI-SPME la fibra debe
limpiarse con agua antes de cada extraccin y equilibrarla en el inyector del
cromatgrafo de gases.
COMPUESTOS
FACTORES DE PRECONCENTRACIN
DI-SPME
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
0.6110.051
2.390.11
5.400.17
4.360.14
2.390.23
3.950.29
1.800.03
2.940.20
4.200.28
9.860.63
3.230.13
15.50.7
HS-SPME
0.5900.041
2.410.12
5.230.15
4.660.23
2.760.30
4.420.03
1.820.03
2.830.19
3.810.26
7.180.60
3.140.11
17.70.8
x Tabla 12-1: Factores de preconcentracin con SPME en inyeccin directa y en

espacio de cabeza
x En segundo lugar se estudi la posibilidad de inyeccin en split o splitless. Se

eligi la opcin del split, ya que en splitless la seal del etanol era
excesivamente grande. La relacin de split se optimiz posteriormente en el
diseo de Plackett-Burman, utilizando un rango determinado por la experiencia
del grupo de trabajo en este tema, junto con los datos obtenidos de la
bibliografa.
x Respecto al tiempo de extraccin (o tiempo de adsorcin), en la bibliografa
estudiada se observa que el rango es muy amplio (de 5 minutos a 4 horas).
Nuestros experimentos nos demostraron que tiempos por encima de los 10
167
Castro M. et al, J. Cromatogr. A, 995, 11-20, (2003)

Rodrguez J.J. et al, J. Cromatogr. A, 991, 13-22, (2003)
Mestres M. et al, J. Cromatogr. A, 945, 211-219, (2002)
Whiton R.S. et al, Am. J. Enol. Viticult, 51, 379-382, (2000)
De la Calle D. et al, J. High Resolt. Chromatogr., 21, 373-377, (1998)

215
__________________________________________________________________
minutos no mejoraban los factores de preconcentracin e incluso puede llegar a

descontrolarse el equilibrio con el tiempo y empobrecer la precisin en las
medidas.
x Otro de los parmetros estudiados fue el nmero de viales a utilizar para cada
una de las muestras (nmero de inyecciones por vial). Para ello se prepararon,
por un lado, tres viales diferentes con 0.80 mL de muestra en cada uno de ellos,
los cuales fueron sometidos a SPME. Por otro lado se prepar otro vial con
otros 0.80 mL de muestra en el cul se introdujo la fibra tres veces
consecutivas. Se observ en este estudio que la seal decreca en los
progresivos pinchazos realizados en el mismo vial.
Un ejemplo de los factores de preconcentracin obtenidos puede verse en la
tabla 12-2 y su representacin grfica en la figura 12-7. En el segundo
pinchazo pueden observarse prdidas de entre el 8 y 69%, y en el tercero entre
60 y 92%. Incluso en alguno de los casos la prdida de la seal fue total (para
el acetato de 3-metil-1-butilo). Este parmetro fue optimizado, incluyndolo
en el diseo realizado posteriormente para aclarar esta influencia en la
utilizacin de un solo vial o ms.
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
N inyeccin
1
0.5910.040
2.410.12
5.230.15
4.660.23
2.760.30
4.420.03
1.820.03
2.830.19
3.810.26
7.180.60
3.240.11
17.70.8
0.5000.062
2.110.20
4.760.23
2.660.26
2.520.32
3.270.05
0.8350.042
1.970.21
2.530.28
5.630.71
1.280.18
5.420.79
nd
0.5160.210
0.6310.220
1.320.28
0.5570.363
1.220.11
0.7170.060
0.7910.231
0.6230.311
0.3820.721
0.6340.222
1.320.82
x Tabla 12-2: Factores de preconcentracin para tres inyecciones sucesivas diferentes

en el mismo vial en SPME
T. CEDRN FERNNDEZ
216
_________________________________________________________________________
20
A3M 1B
Factor de Preconcentracin
3M1B
HE
1P
1H
10
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
Inyeccin
x Figura 12-7: Representacin grfica de los factores de preconcentracin para tres

inyecciones sucesivas diferentes en el mismo vial en SPME
x Para la clase de fibra a utilizar, el estudio se hizo con cuatro de ellas: roja
(polidimetilsiloxano, 100 Pm), naranja (carbowax-divinilbenceno, 65 Pm)
blanca (poliacrilato, 85 Pm) y verde (polidimetilsiloxano, 7 Pm). Esta
preseleccin se hizo atendiendo a las caractersticas tanto de polaridad de los
analitos como de volatilidad y tamaos o pesos moleculares de stos.
Una vez realizados unos estudios previos con las cuatro fibras, observamos
que las que mejor respondan a los compuestos en estudio eran las fibras roja y
naranja, por ello, la optimizacin fue realizada usando ambas.

217
__________________________________________________________________
La bibliografa recomienda la roja, sin embargo los ensayos previos que

realizamos nos mostraron que para nuestros compuestos y condiciones, los
mejores resultados los obtenamos con la fibra naranja como puede verse en
las figuras 12-8 y 12-9 donde a la misma concentracin los picos de la
mayora de los compuestos son muchos ms altos, lo que nos demuestra que la
retencin en la fase estacionaria de la fibra naranja ha sido mayor.
mVolts
15.0
A3M1B
12.5
10.0
7.5
3M1B
1H
1P
5.0
L
HE
2.5
3O
SD
AFE
T
2FE
AO
0.0
-0.9
10
15
20
25
30
Minutos
x Figura 12-8: Cromatograma. Fibra roja, SPME
T. CEDRN FERNNDEZ
218
_________________________________________________________________________
mVolts
1H
15.0
L
12.5
10.0
7.5
3M 1B
HE
A3M 1B
1P
5.0
30
2FE
SD
AFE
2.5
AO
0.0
5
10
15
20
25
30
Minutos
x
Figura 12-9: Cromatograma. Fibra naranja, SPME

Una vez realizados los estudios preliminares, el siguiente paso fue la
optimizacin de los parmetros que afectan a la extraccin y separacin de
compuestos mediante SPME. Las variables optimizadas fueron:
x tiempo de adsorcin
x tiempo de desorcin
x split
x agitacin o no de la muestra
x tipo de fibra
x adicin, o no, y tipo de sales
x utilizacin de un vial y pinchar tres veces usar tres viales diferentes
en las rplicas

219
__________________________________________________________________
Para la optimizacin de las variables consideradas relevantes, se comenz

haciendo un diseo de Plackett-Burman (PB) que nos ayudase a ver que variables
eran ms o menos significativas y como influan en el sistema. En este diseo, se
consideran dos niveles para cada factor, +1 (valor ms alto de la variable) y 1
(valor ms bajo) cuyos valores se indican en la tabla 12-3. Estos valores fueron
elegidos segn los resultados de los estudios preliminares. Para las sales, se ha
considerado como valor mximo 1 g por cada 100 mL, dndole el valor de -1
cuando no se aade la sal.
VARIABLES
Tiempo de adsorcin (min)
Tiempo de desorcin (min)
Relacin de split
Agitacin
Tipo de fibra
Nmero deviales
NaCl
Na2SO4
K2SO4
(NH4 )2SO4
NaH2PO4
Niveles +1
10
5
15
SI
ROJA
3
SI
SI
SI
SI
SI
-1
5
2
5
NO
NARANJA
1
NO
NO
NO
NO
NO
x Tabla 12-3: Valores de las variables en el diseo Plackett-Burman en SPME
Los experimentos se hicieron por triplicado, las variables fueron 11 (4n-1

donde n=3), el nmero de experimentos son 4n, y como se hace por triplicado los
experimentos son 36.
Se utiliz Statgraphics para la realizacin de la matriz experimental que
aparece en la tabla 12-4, haciendo tres rplicas y aleatorizando todos los
experimentos. La variable respuesta fue el rea del pico cromatogrfico de cada
compuesto.
T. CEDRN FERNNDEZ
220
_________________________________________________________________________
EXPERIMENTOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
x
VARIABLES
x1
x2
x3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
x4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
x5
x6
x7
x8
x9
x10
x11
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Tabla 12-4: Matriz experimental con el diseo de Plackett-Burman en SPME:

x1 = tiempo de adsorcin , x2 = tiempo de desorcin, x3 = relacin de split, x4= agitacin,
x5 =tipo de fibra, x6 = NaCl, x7 = Na2SO4, x8 = nmero de viales/ muestra, x9 = K2SO4,
x10 = (NH4 )2SO4, x11= NaH2PO4

221
__________________________________________________________________
Los resultados obtenidos del diseo de PB se muestran en la tabla 12-5, en la

que, adems de la significacin de las variables, se muestran los pesos de cada una
de ellas, donde para cada compuesto los nmeros indican la importancia que tiene
las distintas variables, siendo el 1 el de mayor peso hasta 11 que es el de menor, ya
sea con valor positivo o negativo.
A3M1B 3M1B EH
Tiempo de
adsorcin
Tiempo de
desorcin
Relacin de
split
Agitacin
S
-8
S
+4
S
-10
NS
Tipo de fibra
S
-1
S
-5
S
-9
S
-6
S
-2
S
+7
S
+3
Nmero de
viales
NaCl
Na2SO4
K2SO4
(NH4 )2SO4
NaH2PO4
x
S
+2
S
-5
S
+3
S
+6
S
-1
S
+4
S
+8
S
-11
S
-9
S
+10
S
-7
S
-9
S
-8
S
-6
S
+2
S
+1
S
+3
S
-5
S
-10
NS
S
-7
S
-4
1P
1H
S
-7
S
+3
S
-9
NS
S
+2
S
-4
S
+3
S
+6
S
-1
S
+5
S
+8
S
-11
S
-9
S
+10
S
-7
S
-1
S
-6
NS
S
-8
S
-2
S
+5
S
+4
SD
FEA
2FE
S
+2
S
-10
S
+3
S
+6
S
-1
S
+4
S
+9
S
+8
S
+5
S
+11
S
+7
S
+2
S
-5
S
+3
S
+6
S
-1
S
+4
S
+8
S
-10
NS
S
+2
NS
S
+3
S
+4
S
-1
S
+7
S
+6
S
+8
NS
S
+2
S
-4
S
+3
S
+5
S
-1
S
+6
S
+7
NS
S
+2
S
-6
S
+3
S
+4
S
-1
S
+5
S
+8
NS
S
+2
S
-4
S
+3
S
+6
S
-1
S
+5
S
+8
NS
NS
NS
S
+5
NS
S
+8
NS
S
+9
S
-7
S
+9
S
+7
AO
S
+2
S
-5
S
+3
S
+6
S
-1
S
+4
S
+8
S
-11
S
S
-9
-9
S
S
+10 +10
NS
S
+7
Tabla 12-5: Pesos de las variables en el diseo de Plackett-Burman en SPME
Con los resultados obtenidos se hizo una representacin de cada variable

frente a los pesos con la finalidad de facilitar la observacin de las variables ms
relevantes (figura 12-10).
T. CEDRN FERNNDEZ
222
_________________________________________________________________________
Peso
x
10
11
Figura 12-10: Resultados Plackett-Burman: 1= tipo de fibra, 2= tiempo adsorcin,

3= relacin de split, 4= nmero de viales, 5= agitacin, 6= tiempo de desorcin,
7= NaCl, 8=(NH4) 2SO4, 9= K2SO4, 10= Na2SO4, 11= NaH2PO4
A la vista de los resultados, observamos que las variables ms influyentes

son la fibra y el tiempo de adsorcin, le siguen en importancia la relacin de split y
la utilizacin de un vial distinto para rplicas de la misma muestra en vez de
pinchar varias veces un mismo vial. Tambin se consideran relevantes la agitacin
de la muestra y el tiempo de desorcin. Con respecto a la utilizacin de sales
parece interesante utilizar NaCl y (NH4)2SO4, ya que son las que ms peso tienen y
con carcter positivo, el Na2SO4 y NaH2PO4 no se usan aunque el resultado fue
positivo ya que son las dos variables con pesos ms bajos. Por ltimo, el K2SO4
muestra un peso negativo, lo que implica que es mejor al nivel ms bajo, o sea, no
utilizarla (ver tabla 12-3).

223
__________________________________________________________________
En la siguiente tabla se indican las condiciones cromatogrficas y las variables

optimizadas que se han utilizado en los estudios por SPME.
PARMETROS
CONDICIONES
Tipo de fibra
Tiempo de adsorcin
N de Viales/ muestra
Tiempo de desorcin
NaCl
(NH4 )2SO4
Volumen de muestra/ vial
Tipo de extraccin
Carbowax-divinilbenceno o naranja
10 min con agitacin
3
2 min
1% (m/v)
1% (m/v)
0.80 mL
HS-SPME
Temperatura del detector

Columna
Gas portador
Gas auxiliar
Caudal de aire
Caudal de hidrgeno
Relacin de split
220 C
HP Innowax
220 C
Helio (30 mL min-1)
400 mL min-1
30 mL min-1
0.15:1
4 C min-1
60 C
170 C
4 min
12 min
x
Tabla 12-6: Condiciones ptimas en SPME

Se procedi a hacer las rectas de calibrado con esta metodologa de trabajo
para cada uno de los compuestos a analizar. Para ello se prepararon diferentes
disoluciones de vino sinttico de los compuestos ms el p.i. a concentraciones entre
0.100 y 750 mg L-1 y se sometieron al mismo proceso de extraccin en las
condiciones optimizadas en HS-SPME. En la tabla 12-7 se muestran los valores de
pendiente, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin.
como sr (%) (desviacin estndar relativa porcentual) se realizaron tres
extracciones de una disolucin en las condiciones optimizadas y se inyectaron por
triplicado en el cromatgrafo de gases, los resultados se muestran en la tabla 12-7.
T. CEDRN FERNNDEZ
224
_________________________________________________________________________
COMPUESTOS
Pendiente
(mL Pg -1 )
1
2
o.o.
L.D.
(intervalo de
(Pg mL-1)
confianza de 95%)
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
0.4870.023
0.5830.018
1.900.18
0.4060.029
0.5030.016
0.9620.056
0.6030.014
0.8020.042
0.8580.045
0.2790.020
0.9780.101
0.6830.015
0.02800.0011
0.02800.0016
0.4180.019
0.05300.0035
0.02000.0012
0.1260.064
0.01900.0014
0.06700.0029
0.1210.040
0.08800.0232
0.2830.025
0.02100.0013
0.00300
0.00260
0.00800
0.00370
0.00320
0.00160
0.00250
0.00190
0.00180
0.00540
0.00150
0.00220
L.C.
(Pg mL-1)
4
sr
(%)
0.00990
0.00858
0.0264
0.0122
0.0105
0.00528
0.00825
0.00627
0.00594
0.0178
0.00495
0.00726
5.1
5.7
4.8
1.8
4.1
1.1
4.4
5.3
5.1
2.4
3.5
3.1
Tabla 12-7: Caractersticas analticas HS-SPME

1

3
4

Una vez optimizado el procedimiento de SPME se aplic a muestras de vino
de la DOCa Rioja. Se utilizaron cinco muestras de diferentes vinos tintos jvenes a
los que se les aadi el patrn interno antes de la extraccin. Se analizaron por
triplicado siguiendo el procedimiento optimizado. La cuantificacin se realiz por
interpolacin en las rectas de calibrado. En esta parte del trabajo se trabaja con un
pequeo grupo de muestras diferentes de vino, pero este estudio ser ampliado
posteriormente en la segunda parte de esta memoria ya que fue el mtodo
seleccionado para la aplicacin quimiomtrica.
Interpolando los valores de rea de pico obtenidos, a partir de los
correspondientes cromatogramas, en las rectas de calibrado, se obtuvieron los
resultados de la tabla 12-8.

225
__________________________________________________________________
Comp.

muestra 1
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
L
SD
T
AFE
G
2FE
AO
x
12.50.3
48.20.3
2.700.10
0.02020.0006
2.770.10
nd
0.3010.010
nd
3.700.12
nd
4.100.19
0.3000.002
muestra 2
10.50.2
46.20.4
2.400.32
0.01830.0002
2.650.09
nd
0.2810.078
nd
2.800.09
nd
3.900.20
0.2920.003
muestra 3
muestra 4
13.20.1
39.60.6
1.900.25
0.01040.0032
3.170.14
nd
0.3020.054
nd
3.600.13
nd
4.000.15
0.3010.006
12.70.1
48.90.1
2.300.16
0.01910.0058
2.970.11
nd
0.3100.021
nd
3.500.11
nd
4.300.25
0.2010.004
muestra 5
10.6 0.4
37.2 0.4
2.80 0.18
0.0232 0.0004
2.87 0.22
nd
0.292 0.063
nd
3.50 0.07
nd
3.70 0.29
0.202 0.010
Tabla 12-8: Cuantificacin en vino real mediante SPME. Rectas de calibrado

(nd: no detectado)
Finalmente en la figura 12-11 se muestra el cromatograma obtenido por

SPME para vino sinttico, utilizando las condiciones ptimas.
mVolts
L (18.136)
10.0
A3M1B (5.710)
7.5
HE (8.598)
AFE (25.503)
5.0
T (22.304)
2.5
3M1B (7.827)
1P (9.044)
1H (12.159)
3O (13.432)
SD (21.806)
G (26.330)
2FE (27.957)
AO (31.690)
0.0
5
10
15
20
25
30
35
Minutos
x Figura 12-11: Cromatograma. Vino sinttico, SPME
CAPTULO 13
Estudio comparativo de los distintos
mtodos de extraccin empleados
ESTUDIO COMPARATIVO
229
__________________________________________________________________
13.- ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS DISTINTOS

MTODOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS
Una vez expuestos todos los mtodos de extraccin empleados a lo largo de

la memoria, parece adecuado llevar a cabo un estudio comparativo de los mismos.
Tal y como aparece reflejado en la bibliografa168, cada una de las tcnicas presenta
ventajas e inconvenientes, e incluso en ocasiones es necesario combinar diferentes
mtodos para la completa extraccin de los compuestos voltiles del vino. A la
hora de seleccionar uno u otro procedimiento, habr que tener en cuenta el tipo de
muestra, el tipo de analito y sobre todo, el material disponible.
Para poder comparar la eficacia de la extraccin se ha calculado, en cada
caso, el factor de preconcentracin. Este parmetro es el que se ha utilizado a lo
largo del captulo de SPME, y viene dado por c2/c1, donde c2 es la concentracin de
analito en el extracto y c1 la concentracin inicial en el vino sinttico.
El estudio comparativo de las distintas metodologas se va a hacer en
funcin de los valores de factores de preconcentracin y en funcin tambin de
ventajas e inconvenientes operacionales (coste, rapidez, comodidad, limpieza, etc.).
En cuanto a reproducibilidad, todas las tcnicas muestran valores de
desviacin estndar relativa porcentual similares, por lo que no destaca una sobre
el resto.
En la tabla 13-1 se muestran los factores de preconcentracin en las distintas
tcnicas empleadas. En algunos casos no hay datos porque no todos los compuestos
se han utilizado en todos los mtodos de extraccin estudiados.
168
Ortega M., et al, Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)

Zhou, Y. et al, J. Agric. Food Chem., 44-3, 818-822, (1996)
Leahy M.M. et al, Analysis of volatiles, (1984)
T. CEDRN FERNNDEZ
230
_________________________________________________________________________
COMPUESTOS
A3M1B
3M1B
HE
1P
1H
OE
L
AB
DE
SD
T
AFE
G
AH
2FE
AO
AD
ELLd
ELLc
ELLus
Microextr.
SPE
SPME
1.4
2.0
1.3
1.8
1.4
2.1
1.8
2.1
2.1
1.3
2.1
2.5
1.5
2.2
2.1
2.6
2.3
1.8
1.2
2.0
2.0
2.1
0.96
1.4
0.51
1.1
0.97
1.0
1.1
0.70
2.0
1.0
1.2
0.81
0.23
0.59
3.8
2.7
3.5
3.0
3.9
2.1
3.1
3.1
3.4
2.2
3.1
2.7
1.4
1.8
1.3
1.7
1.6
1.7
1.5
1.7
1.5
1.6
1.5
0.59
2.4
5.2
4.7
2.8
4.4
1.8
2.8
3.8
7.2
3.2
18
-
x Tabla 13-1: Factores de preconcentracin de las diferentes tcnicas estudiadas
Como se puede observar, en general, los valores ms altos de preconcentracin se dan en el caso de microextraccin con sales y en SPME. En el primer caso
parece lgico que los valores sean elevados ya que se emplea un bajo volumen de
disolvente orgnico.
As, si se tuviese que hacer la seleccin de una de las tcnicas, basndonos
nica y exclusivamente en estos valores de preconcentracin, habra que elegir
microextraccin con sales o SPME, en funcin de los analitos concretos a
determinar.
Como ya se ha comentado, vamos a hacer tambin una comparacin en
funcin de ventajas e inconvenientes operacionales, que en muchos casos van a ser
cuestiones decisivas. As, en la tabla 13-2 aparecen reflejados aspectos como
rapidez, comodidad, coste, consumo de disolventes, etc.
Como se puede apreciar, el nmero de ventajas es mayor en SPME, y por
otro lado, es la extraccin lquido-lquido en continuo la que presenta mayor
nmero de inconvenientes.
ESTUDIO COMPARATIVO
231
__________________________________________________________________
MTODO
VENTAJAS
INCONVENIENTES
ELLd
x
x
x
Posible prdida de voltiles

Largo y tedioso
x
x
x
x
Material especfico
Elevado consumo dtes. org.
Largo y tedioso
Material convencional
ELLc
ELL us
x
x
x

Largo y tedioso
MICROEX. por
desmezcla
x
x
Escaso consumo
disolventes orgnicos
x
x

Largo y tedioso
SPE
x
x
Rapidez
Posibilidad de
automatizacin
Poca manipulacin de
muestra
x
x
Material especfico
Rapidez
Comodidad
Automatizacin
Sin manipulacin de
muestra
Sin disolventes
orgnicos
No contaminacin
medioambiental
x
x
Material especfico
Elevada inversin inicial
x
SPME (HS)
x
x
x
x
x
x
x
Tabla 13-2: Ventajas e inconvenientes de los mtodos de extraccin utilizados
T. CEDRN FERNNDEZ
232
_________________________________________________________________________
Un aspecto muy importante a tener en cuenta hoy en da es el consumo de

disolventes orgnicos, ya que su uso conlleva problemas medioambientales y
problemas de gestin de residuos. En este sentido, la tcnica ms adecuada es la
SPME, ya que evita por completo la utilizacin de disolventes.
Por otro lado, otro punto a valorar es la comodidad en la realizacin del
anlisis y es indiscutible que la SPME es la mejor en este sentido.
Una vez vistos los factores de preconcentracin y las ventajas e
inconvenientes de las distintas tcnicas, el procedimiento seleccionado como
ptimo es la microextraccin en fase slida (SPME).
PARTE II- APLICACIN QUIMIOMTRICA
Una vez optimizados diferentes procedimientos de extraccin para

compuestos voltiles desde muestras de vino y se seleccion el ms adecuado
desde nuestro punto de vista, se pas al anlisis de muestras de vino para proceder
a su clasificacin mediante diversas tcnicas quimiomtricas.
No se trata de reconstruir el aroma de un vino, sino de que a partir de
ciertas variables podamos construir un modelo que lo caracterice. La
caracterizacin de alimentos va dirigida a proteger al consumidor y ayudar a la
administracin para evitar todo tipo de fraudes comerciales. As se intenta
tipificar vinos, basndonos en distintos compuestos que participan en sus
caractersticas organolpticas.
De todos es sabido que la instrumentacin analtica moderna proporciona
gran cantidad de datos en poco tiempo, pero obtener datos no es sinnimo de
poseer informacin, debemos interpretarlos y colocarlos en el contexto adecuado
para convertirlos en informacin til, y es la quimiometra la disciplina que tiene
esta finalidad.
En esta parte de la memoria se utilizan distintas tcnicas de clasificacin:
Anlisis de Componentes Principales (ACP), Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
y Anlisis Cluster (AC).
CAPTULO 14
Introduccin
INTRODUCCIN APLICACIN QUIMIOMTRICA

239
__________________________________________________________________
14.- INTRODUCCIN
El trmino quimiometra fue introducido en 1972 por el sueco Svante Wold
y el americano Bruce R. Kowalski. El desarrollo de la quimiometra fue tardo
como consecuencia de la lenta evolucin de la instrumentacin cientfica. En la
primera mitad del siglo XX era costoso y difcil obtener, tratar y almacenar datos
qumico-analticos. Se dispona de pocos datos, y su examen directo permita al
analista extraer toda la informacin significativa. Pero esta situacin comenz a
cambiar hacia 1960, debido al fuerte impulso que experiment el desarrollo de
nueva instrumentacin.
En la dcada 1960-1970 se comenzaba a tratar datos con algoritmos
matemticos, pero eran procesos lentos y complicados.
Haca 1975 aparecieron las calculadoras electrnicas, lo que supuso un gran
avance en el tratamiento de los datos. El impulso de la quimiometra como
disciplina independiente fue debido a la popularizacin del microordenador y su
incorporacin a los instrumentos cientficos, a mediados de la dcada 1980-1990.
Muchas tcnicas quimiomtricas se encuentran incorporadas al software de la
instrumentacin analtica.
Como ya sabemos, la instrumentacin analtica moderna permite obtener en
un tiempo muy corto mucha informacin dando lugar a tablas de datos en funcin
de dos o ms variables (seales multivariantes).
A travs de la quimiometra se pueden evaluar e interpretar esos datos. Se
pueden utilizar para realizar pruebas de significacin o para clasificarlos.
Si queremos clasificarlos, al conjunto de medidas que se utilizan para
caracterizar una muestra se denomina pauta.
Dentro de las tcnicas de reconocimiento de pautas existen los siguientes
modelos:
A) No supervisados, se utilizan para decir si un conjunto de pautas
(variables) se pueden dividir en grupos, aqu no se espera ningn
conocimiento a priori de las clases o grupos. Dentro de las tcnicas no
supervisadas est el anlisis cluster.
B) Mtodos supervisados, en ellos se conocen las clases en que puede caer
una muestra, y el objetivo es clasificar una muestra de clase desconocida
T. CEDRN FERNNDEZ
240
__________________________________________________________________
por su pauta. Dentro de estos mtodos estn el anlisis discriminante

[lineal (LDA) y cuadrtico (QDA)], mtodo del K del vecino ms
prximo (KNN), SIMCA o las redes neuronales artificiales (ANN).
Actualmente, la quimiometra se utiliza diariamente en el mbito del
laboratorio, tanto en investigacin como en el control analtico de calidad. Adems,
es evidente que los conocimientos de estadstica son de aplicacin comn en un
amplio campo de disciplinas, abarcando numerosas actividades cientficas y
humanas en general.
A continuacin se comentan la distintas tcnicas quimiomtricas que van a
utilizarse en esta parte de la memoria:
-
Anlisis de Componentes Principales (ACP)
Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
Anlisis Cluster
Anlisis de Componentes Principales (ACP)

El Anlisis de Componentes Principales es una tcnica multivariante
encuadrada dentro del grupo de tcnicas de simplificacin o reduccin de la
dimensin. Este anlisis permite transformar un grupo inicial de variables
correlacionadas en otro de variables ortogonales denominadas Componentes
Principales (CP), de modo que se reduce el nmero de datos cuando est presente
la correlacin. Es obvio afirmar que no es una tcnica til cuando las variables no
estn correlacionadas.
La idea que se encuentra detrs del ACP es encontrar componentes
principales que sean combinaciones lineales de las variables originales que
describe cada muestra. Las componentes principales se eligen de modo que la
primera componente principal recoge la mayor parte de la variacin que hay en el
conjunto de datos, la segunda recoge la siguiente mayor parte de la variacin y as
sucesivamente. Por consiguiente, cuando hay correlacin significativa el nmero
de CP tiles ser mucho menor que el nmero de variables originales.
Las primeras CP recogen la mayor parte de la variacin en el conjunto de
datos. Como resultado, los datos se pueden representar en dos dimensiones en lugar
de en las totales de origen.

241
__________________________________________________________________
En trminos matemticos las CP son los autovectores o vectores propios de

la matriz de correlacin y la tcnica para encontrar estos autovectores se llama
anlisis propio. A cada componente principal (es decir, a cada autovector) le
corresponde un autovalor que proporciona la cantidad de varianza en el conjunto de
datos que se encuentra explicada por esa componente principal169.
Anlisis Lineal Discriminante (ALD)
El Anlisis Lineal Discriminante es una tcnica multivariante que trata de
clasificar a individuos en grupos previamente determinados. Los objetivos
concretos que pretenden cubrirse con este anlisis son dos, el primero de ellos es
determinar a partir de la informacin inicial sobre una serie de individuos, de los
cuales se conoce el grupo o poblacin al que pertenecen, si los individuos estn
suficientemente definidos en funcin de las variables que se han medido. El
segundo es clasificar a individuos, distintos de los manejados en la informacin
inicial, en uno de los grupos existentes.
El Anlisis Discriminante tiene su origen en un famoso trabajo de Fisher en
1936 sobre la clasificacin de especies de flores de gnero Iris, utilizando como
variables de clasificacin la anchura y la longitud de spalos y ptalos.
El punto de partida del ALD es encontrar una funcin lineal discriminante
(FLD) que sea combinacin lineal de las variables originales. Las medidas
originales para cada objeto se combinan en este nico valor, de modo que los datos
se han reducido a una sola dimensin. Los coeficientes de los trminos se eligen de
modo que la FLD refleje la diferencia entre los grupos tanto como sea posible: los
objetos en el mismo grupo tendrn valores similares y los objetos en grupos
diferentes tendrn los valores muy diferentes. En consecuencia la FLD proporciona
un medio de discriminacin entre los distintos grupos170.
Anlisis Cluster
El anlisis cluster se define como un conjunto de tcnicas multivariantes
utilizadas para clasificar o agrupar objetos en grupos homogneos llamados
conglomerados (cluster) de acuerdo a algn criterio de seleccin predeterminado.
Los objetos dentro de cada conglomerado son similares entre s y diferentes a los
objetos de otros conglomerados. Como el conglomerado agrupa objetos similares,
se necesitan medidas de similitud o semejanza entre los que van a ser agrupados;
cuando las variables son mtricas se utilizan medidas de distancia.
169
Vandeginste B.G. et al, Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, (1998)

Wold S. et al, Mathematics and Statistics in Chemistry, (1984)
170
T. CEDRN FERNNDEZ
242
__________________________________________________________________
Para la formacin de conglomerados se pueden utilizar:

a)
Mtodos no jerrquicos, en los cuales primero se especifica el

nmero de conglomerados y despus se asignan los objetos a ellos.
b)
Mtodos jerrquicos, que se caracterizan por el desarrollo de una

jerarqua. Partiendo de tantos grupos iniciales como individuos se
estudian, se trata de conseguir agrupaciones sucesivas entre ellos de
forma que los resultados obtenidos en un paso previo siempre
necesitan encajarse dentro de los resultados del paso siguiente. La
representacin grfica se denomina dendograma.
El criterio de unin es el que determinar la forma de los grupos171. Para

desarrollar los conglomerados existen diferentes algoritmos:
1)
Enlace simple o de distancias mnimas: los puntos que forman grupo

quedan representados por uno de ellos, que ser el que presente la
menor distancia con respecto a cualquier otro punto que no pertenezca
al grupo, tambin se llama mtodo del vecino ms prximo.
2) Enlace completo o de distancias mximas: considera como distancia

entre dos grupos la que existe entre los individuos ms alejados de cada
grupo, tambin se denomina mtodo del vecino ms alejado.
3) Mtodo del centroide: considera la distancia entre dos grupos la que
existe entre los centros de gravedad de cada uno de ellos, definidas stas
como las medias aritmticas de las variables de los individuos de cada
cluster.
El dendograma se construye de la siguiente manera:
1.- En la parte inferior del grfico se disponen los n elementos iniciales.
2.- Las uniones entre elementos se indican por tres lneas rectas. Dos
dirigidas a los elementos que se unen y que son perpendiculares al eje de los
elementos, y una paralela a este eje, que se sita al nivel en que se unen.
3.- El proceso se repite hasta que todos los elementos estn conectados por
lneas rectas.
171
Forina M. et al, Chemometrics for Analytical Chemistry, (1992)

Forina M. et al, Anal. Chim. Acta, 454, 13-19, (2002)

243
__________________________________________________________________
Si cortamos el dendograma a un nivel de distancia dado, obtenemos una

clasificacin del nmero de grupos existentes a ese nivel y los elementos que lo
forman.
Una vez comentadas las diferentes tcnicas quimiomtricas utilizadas,
exponemos algunas de sus aplicaciones.
La bibliografa encontrada sobre anlisis clasificatorios es muy amplia, en
diferentes campos como aceite172, agua173, leche174, bebidas destiladas175,
vinagre176, indicadores marinos177, etc.
Respecto al vino, los estudios van dirigidos tanto a la clasificacin de vinos
de distintas denominaciones de origen178, como a clasificaciones por el tipo de
tratamiento179, variedad180, etc. en funcin de compuestos no voltiles181,
voltiles182, parmetros del color183, u otros.
172
Jelen H. et al, Agric. Food Chem, 48, 2360-2367, (2000)

Dron J. et al, J. Chromatogr. A, 963, 259-264, (2002)
Gonzlez C. et al, J. Chromatogr. A, 896, 373- 379, (2000)
174
Massili R. T. et al, J. Agric. Food Chem., 48, 3470-3475, (2000)
175
Fitzgerald G., J. Chromatogr. A, 896, 351-359, (2000)
Ortiz M. C. et al, Analyst, 118, 801-805, (1993)
176
Castro R. et al, J. Chromatogr. A, 953, 7-15, (2002)
177
Gndara S. et al, Cienc. Tecnol. Aliment., 2, 244-247, (2000)
178
Prez S. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 187-190, (2002)
Cliff M. et al, Am. J. Enol. Viticult., 53, 46-53, (2002)
Rebolo S. et al, Anal. Chim. Acta, 417, 211-220, (2000)
179
Guitart A. et al, Am. J. Enol, Viticult., 49, 4, 389-396, (1998)
180
Rebolo S. et al, Anal. Chim. Acta, 417, 211-220, (2000)
Gadarrama A. et al, Anal. Chim. Acta, 411, 193-200, (2000)
Pozo M.A., et al J. Chromatogr. A, 922, 267-275, (2001)
De La Calle D. et al, Vitis, 37, 181-188, (1998)
Aragn P. et al, Am. J. Enol. Viticult., 49, 211-219, (1998)
181
Fras S. et al, Talanta, 59, 335-344, (2003)
Rodrguez M.A. et al, Food Chem., 78, 523-532, (2002)
Barbaste M. et al, Anal. Chim. Acta, 472, 161-174, (2002)
Hernndez P. et al, J. Agr. Food Chem., 50, 2891-2899, (2002)
Ortega M. et al, Quim. Anal., 18, 127-131, (1999)
182
Daz C. et al, Food Chem., 80, 1-6, (2003)
Marengo E. et al, J. Chromatogr. A, 943, 1, 123-137, (2002)
Falqu E. et al, J. Agr. Food Chem., 50, 538-543, (2002)
Daz E.M. et al, Anal. Chim. Acta, 458, 139-145, (2002)
Petka J. et al, J. Sci. Food Agr., 81,.1533-1539, (2001)
183
Melndez M.E. et al, Anal. Chim. Acta, 446, 159-169, (2001)
173
T. CEDRN FERNNDEZ
244
__________________________________________________________________
Algo muy novedoso respecto al anlisis quimiomtrico en el campo de la

enologa es la nariz electrnica.
Como se ha comentado es algo muy actual con lo que se est trabajando
mucho en el campo del vino. Se le denominada nariz u olfato electrnico184.
Estos instrumentos estn diseados para generar un elevado nmero de seales
selectivas frente a compuestos voltiles. Constan de un sistema de introduccin de
la muestra (que es una bomba aspiradora de gases o un inyector en espacio de
cabeza), un analizador y un sistema informtico capaz de tratar y convertir en
informacin til las seales originadas en el analizador. La deteccin de los olores
se realiza mediante sensores de diferentes tipos, o bien mediante un espectrmetro
de masas. En concreto, la idea bsica de este sistema consiste en proporcionar
medidas sensoriales automticas de calidad sobre los aromas, sin necesidad de
utilizar un panel de expertos catadores.
Los sensores constan de un material activo (xido metlico, un polmero,
etc.), cuyas propiedades elctricas o mecnicas cambian transitoriamente en
presencia de ciertos compuestos voltiles. Los lmites de deteccin obtenidos son
similares a los obtenidos con el olfato humano, frente a los mismos compuestos.
Cuando la nariz electrnica incorpora un espectrmetro de masas, se obtiene
una respuesta ms compleja, con gran cantidad de picos que corresponden a
fragmentos moleculares y que se distinguen por su relacin carga/masa.
La ventaja que tiene este sistema frente a un panel de expertos es que la
evaluacin siempre es objetiva, puesto que no est sujeta a la variabilidad humana
y la fatiga que afecta al olfato humano. El experto humano necesita de un descanso
despus de evaluar un nmero corto de muestras, sin embargo la nariz electrnica
puede evaluar un elevado nmero de muestra sin perder prestaciones.
Otra ventaja del sistema es que es rpido y puede adecuarse para el trabajo
en campo. La rapidez en la monitorizacin de los datos casi en tiempo real supone
ahorros considerables tanto de tiempo como de dinero.
Sin embargo, la utilizacin de la nariz electrnica en anlisis cuantitativos es
ms problemtica. Los sensores experimentan problemas de deriva de la lnea base
y prdida de sensibilidad con el uso, sobre todo en presencia de elevadas
cantidades de agua, etanol y cido actico. Otro problema es su limitada vida, que
obliga a sustituirlos al cabo de cierto tiempo de uso. En comparacin con el uso de
sensores, el espectrmetro de masas ofrece prestaciones superiores, siempre a
184
Ramis Ramos G. et al, Quimiometra, (2001)

245
__________________________________________________________________
cambio de un mayor coste econmico. Un espectrmetro de masas discrimina las

seales de agua, etanol o cido actico, separndolas fcilmente de las respuestas
del resto de molculas, presentando menos problemas de deriva y prdida de
sensibilidad, resultando as una respuesta ms rpida y cuantitativa.
Por encima de lo ya mencionado, la mayor limitacin de este sistema es la
falta de estndares especficos de los olores que se quieren cuantificar. El problema
es debido a la complejidad de la combinacin de los compuestos voltiles, algunos
de los cuales no pueden aislarse por su inestabilidad. En ciertos casos, lo que se
hace es utilizar mezclas de compuestos puros que imitan el olor de la muestras
reales. Otra solucin es utilizar un panel de expertos catadores para definir los
estndares a partir de muestras reales. Los resultados, en general, son buenos,
desde el punto de vista clasificatorio, pero es peor la estimacin cuantitativa de la
intensidad del olor, la cual est sujeta a una incertidumbre considerable.
La principal aplicacin de la nariz electrnica es el control de calidad en la
industria agroalimentaria.
Una vez descritas algunas tcnicas quimiomtricas y sus aplicaciones,
pasamos a comentar en los captulos siguientes, los objetivos de esta segunda parte
del trabajo y el desarrollo experimental de la misma.
Nos proponemos estudiar, haciendo uso de una estadstica sencilla, la
posibilidad de relacionar determinados vinos entre s, con caractersticas similares,
referidas siempre a su contenido en compuestos voltiles. No se trata nicamente
de reconstruir el aroma del vino a travs de su composicin, sino de valorar ciertas
partes de ste, que nos permitan, a partir de los datos de los que disponemos,
obtenidos en el anlisis cromatogrfico, construir un modelo a seguir185.
Como ya se coment en el captulo 13, la tcnica seleccionada para la
determinacin del contenido en compuestos voltiles fue SME:
El primero de los casos estudiado se refiere a la caracterizacin de vinos
tintos, rosados, claretes y mezclas de tintos y blancos (prohibidas). En todos los
185
Massart D.L. et al, Chemometrics & textbook, (1988)

Box G.E.P. et al, Estadstica para investigadores. Introduccin al diseo de
experimentos, anlisis de datos y construccin de modelos, (1993)
Miller J.N. et al, Estadstica y Quimiometra para Quimica Analtica, (2002)
Manly F.J., Multivariate Statistical Methods, (1997)
Daz C. et al, Food Chem., 81, 447-452, (2003)
Bueno J.E. et al, J. Food Sci, 68, 158-163, (2003)
T. CEDRN FERNNDEZ
246
__________________________________________________________________
casos las muestras proceden de la DOCa Rioja, en concreto son 20 muestras de

vino jven del ao 2002.
De acuerdo con las normativas legales186, los vinos rosados son aquellos
que proceden de uvas rojas, o de la mezcla de rojas y blancas, cuyos zumos se han
fermentado sin orujos. Sus propiedades sensoriales estn entre las de los vinos
tintos y los vinos blancos. Los claretes son aqullos que se hacen con uvas rojas o
blancas o de sus mostos fermentados con los hollejos. En la legislacin de la CE,
no se admite el clarete como vino europeo, solamente se permite exportar el vino
rosado, mientras que los claretes nicamente pueden consumirse en Espaa, debido
a su baja difusin y hbito de consumo. Es por ello prctico construir un modelo
quimiomtrico que sea lo suficientemente sensible y especfico para evitar fraudes.
Existen estudios de tipificacin de vinos rosados y de mezclas fraudulentas con
diferentes variables, pero referidos al color, tonalidad y claridad, como
caractersticas discriminantes en los vinos.
Otra seccin de la Regulacin Europea187, prohbe hacer vinos rosados con la
mezcla de vinos tintos y vinos blancos.
El segundo caso estudiado en este trabajo se refiere a un grupo de vinos de
diferentes denominaciones de origen. La construccin de un modelo puede permitir
aceptar un vino de DOCa Rioja o bien descalificarlo como tal. Se comienza con un
pequeo nmero de muestras (18 vinos), y posteriormente se amplia el estudio a un
total de 244 muestras de cinco denominaciones de origen:
- Denominacin de Origen Calificada Rioja (R): 60 muestras.
- Denominacin de Origen Navarra (N): 54 muestras.
- Denominacin de Origen Valdepeas (V): 52 muestras.
- Denominacin de Origen Cariena (C): 36 muestras.
- Denominacin de Origen La Mancha (M): 42 muestras.
186
Estatuto de la Via y de los Alcoholes, Decreto 835/1972 de 23 de Marzo. Reglamento

de la Ley 25/1970
187
Reglamento (CE) 1128/96, DOCE, L 150/13, (1996)
CAPTULO 15
Objetivos
OBJETIVOS APLICACIN QUIMIOMTRICA

249
__________________________________________________________________
15.-OBJETIVOS
Los objetivos marcados para esta parte de la memoria son :
x Puesta al da de la bibliografa sobre el tema.
x Bsqueda de tcnicas estadsticas adecuadas para clasificar muestras de
diferentes vinos, en funcin de su contenido en compuestos voltiles.
x Evaluacin de las diferentes tcnicas quimiomtricas.
x Caracterizacin de vinos tintos, rosados, claretes y mezclas de vinos
tintos y blancos en la DOCa Rioja.
x Caracterizacin de vinos de diferentes denominaciones de origen
(Rioja, Navarra, Valdepeas, La Mancha y Cariena).
CAPTULO 16
Procedimiento experimental
- Estudio con vinos de distinto tipo

- Anlisis en componentes principales
- Anlisis lineal discriminante
- Anlisis cluster
- Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin
de origen
- Anlisis cluster
- Estudio ampliado con vinos de distinta denominacin
de origen
- Anlisis cluster
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL APLICACIN QUIMIOMTRICA

253
__________________________________________________________________
16.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

Como ya se ha comentado, el mtodo seleccionado para determinar los
compuestos voltiles en vino fue la microextraccin en fase slida (captulo 12). A
modo de recordatorio, el procedimiento empleado se expone de nuevo a
continuacin.
A 10.0 mL de vino sinttico o real se aadi 0.1 g de NaCl y 0.1 g de (NH4)2SO4,
para favorecer el paso de los voltiles a la fase gas. Se tomaron tres alcuotas de
0.80 mL que se colocaron en tres viales capsulados, para realizar una sola
inyeccin en cada vial. Como en casos anteriores, se emple 3-octanol como
patrn interno. El proceso de adsorcin se hizo en espacio de cabeza y con
agitacin durante 10 minutos, pasados los cuales la fibra (Carbowaxdivinilbenceno o fibra color naranja) se somete al proceso de desorcin de 2
minutos en el cromatgrafo de gases.
Las variables analizadas fueron 11: 3-metil-1-butanol (3M1B), 1-hexanol
(1H), 2-feniletanol (2FE), acetato de-3-metil-1-butilo (A3M1B), cido decanoico
(AD), cido hexanoico (AH), cido octanico (AO), geraniol (G), hexanoato de
etilo (HE), octanoato de etilo (OE), succinato de dietilo (SD).
Una vez obtenidos los cromatogramas, los resultados fueron tratados con los
paquetes estadsticos STATGRAPHICS188 y SPSS189.
16.1.- Estudio con vinos de distinto tipo

Inicialmente se realiz un estudio preliminar con un nmero reducido de
muestras de vino (vino tinto, rosado, clarete y mezclas en diferentes proporciones
de vino tinto y blanco preparadas por nosotros en el laboratorio), para ver si a partir
de tcnicas quimiomtricas se podan diferenciar bien los distintos tipos, dado que
como ya se ha comentado pueden existir fraudes, sobre todo con vinos rosados y
claretes. Este estudio se realiz con 20 muestras de vino de la DOCa Rioja
pertenecientes a los cuatro tipos anteriormente indicadas [3 claretes (c), 4 rosados
(r), 6 mezclas (m) (proporcin 1 tinto/10 blanco) y 7 tintos (t)]. A partir de los
cromatogramas se obtuvieron las reas de cada compuesto para cada uno de los
vinos. Los datos obtenidos se indican en la tabla 16-1.
188
Fernndez M.A. et al, Estadstica asistida por ordenador. Statgraphics plus 4.1,
(2000)
189
Prez C., Tcnicas Estadsticas con SPSS, (2001)
T. CEDRN FERNNDEZ
254
__________________________________________________________________
VINO
A1B3M
3M1B
HE
1H
c-1
572953
143147
785428
227619
225935
57426
c-1
646736
6111224
959622
228453
1753943
87534
c-1
277425
3172835
1211845
206043
3296835
60025
r-2
1010154
5007143
1341236
223241
3437024
91014
r-2
1467013
4554323
9773121
223264 1150554
r-2
1110034
4008645
1390467
143065
3719355
28717
r-2
270789
4877356
1403334
223062
32930122
89815
m-3
339754
4272565
413276
206424
399876
13209
m-3
279232
4100567
427477
186746
476034
84923
m-3
242843
4518854
410765
140465
283876
81854
m-3
264962
4671965
384464
187756
355176
10358
m-3
306454
4137761
381912
212365
628070
84223
m-3
365954
39855132 559365
208524
8720101
54119
t-4
188845
4726976
442887
230123
524490
16798
t-4
133278
4028432
366045
196956
662065
11347
t-4
376354
5122065
348134
98213
272034
145023
t-4
196943
5370654
349945
20419
442739
161456
t-4
123067
48281121 403048
223867
512476
147323
t-4
179934
4282855
457065
238365
385876
100466
t-4
280365
4345676
636734
74127
1972772
16428
x
OE
Tabla 16-1: Valores de las reas de los distintos tipos de vino (c, r, m, t)
SD
3562936

255
__________________________________________________________________
VINO
AH
2FEA
OA
AD
c-1
98965
46878
440843
194155
54499
c-1
101644
80868
511611
256856
99677
c-1
77166
120443
245155
348279
120367
r-2
--
119857
298078
382580
120389
r-2
53167
90769
223589
287699
94922
r-2
62477
130898
191443
353077
75612
r-2
50232
114244
294832
302253
98821
m-3
45024
87156
413345
2307101
--
m-3
35232
67576
234832
180723
--
m-3
--
36345
252134
137221
--
m-3
--
44355
281445
376722
--
m-3
--
37146
220567
113455
--
m-3
--
62276
179356
168554
--
t-4
62732
61554
383624
134032
--
t-4
--
52757
295676
123935
--
t-4
32234
50667
394847
87744
--
t-4
29412
23045
490236
69056
--
t-4
54032
46346
318726
107546
--
t-4
142067
81235
289417
117035
--
t-4
--
73416
27349
133768
--
x
Tabla 16-1: Continuacin. (-- : no detectado)
T. CEDRN FERNNDEZ
256
__________________________________________________________________
A los datos obtenidos se les realiz un test ANOVA (nivel de significancia D

= 0.05) y mediante el test de la diferencia mnima significativa (DMS), donde los
valores de las medias se ordenan de mayor a menor, se estudi qu tipos de vino
eran diferentes entre s y en funcin de qu variables. (Los datos de este estudio se
encuentran en el apndice G).
A partir de estos datos se deduce que las variables significativas son: acetato
de 3 metil-1-butilo (A3M1B), hexanoato de etilo (HE), octanoato de etilo (OE),
succinato de dietilo (SD), cido hexanoico (AH), geraniol (G), cido octanoico
(AO) y cido decanoico (AD).
Si analizamos los resultados que se obtienen en la tabla de comparaciones
mltiples (apndice G), podemos ver qu variables son significativas para cada
grupo de vinos comparndolos con el resto de grupos. Los resultados obtenidos se
Vino
c
Variables
r
A3M1B HE
A3M1B HE
OE
HE
OE
A3M1B HE
OE
A3M1B HE
OE
t
r
m
x
2FE
AH
SD
2FE
AD
AO
AD
AO
AD
SD
AO
AD
SD
AO
Tabla 16-2: Variables significativas en los distintos grupos de vinos
Como vemos, por ejemplo, entre los vinos claretes (c) y rosados (r) hay tres
variables que los hacen significativamente diferentes: acetato de 3 metil-1-butilo
(A3M1B), hexanoato de etilo (HE) y 2-feniletanol (2FE) o entre las mezclas (m) y
los vinos tintos (t) nicamente se diferencian en dos variables, succinato de dietilo
(SD) y cido octanoico (AO).

257
__________________________________________________________________
De todas las variables estudiadas, nicamente el 3 metil-1-butanol (3M1B) y

el 1-hexanol (1H) no aparecen en la tabla de comparaciones mltiples, es decir, no
influyen para que entre los grupos de vinos exista diferencia significativa.
El objetivo de este estudio era clasificar una serie de muestras de vino, las
cuales pertenecan a cuatro tipos o clases diferentes, as en los apartados siguientes
se van a exponer diferentes tcnicas quimiomtricas que se han utilizado para
realizar el estudio.
16.1.1.- Anlisis en componentes principales

En primer lugar se comprob si se poda realizar la clasificacin
representando las muestras en componentes principales. De este modo, con el fin
de reducir la dimensionalidad del problema y ver cuantas direcciones eran tiles se
realiz el anlisis de las componentes principales (ACP). Para ver el nmero de
componentes realizamos el grfico de sedimentacin (fig. 16-1).
Autovalor
0
1
10
11
Nmero de componentes
x
Figura 16-1: Grfico de sedimentacin
A partir de l vemos que con tres componentes (cada brusca) sera

suficiente. Si utilizamos el criterio de la varianza explicada y varianza acumulada
vemos que con estas tres componentes principales se explica o modela el 78.2% de
varianza (tabla 16-3)
T. CEDRN FERNNDEZ
258
__________________________________________________________________
x
Componentes
Autovalor
% varianza
explicada
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
5.20
2.31
1.09
0.905
0.506
0.401
0.297
0.128
9.23E-02
6.60E-02
9.06E-03
47.3
21.0
9.89
8.22
4.60
3.64
2.70
1.16
0.840
0.601
8.24E-02
% varianza
acumulada
47.3
68.3
78.6
86.4
90.9
94.6
97.3
98.5
99.3
99.9
100.0
Tabla 16-3: Autovalores, varianza explicada y acumulada para las 11 componentes
En la tabla tabla 16-4 se indica la matriz de componentes, la cual da los

coeficientes de correlacin de cada una de las variables originales con las
componentes principales para ver con cual est ms correlacionada.
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
1
0.689
-0.106
0.963
7.79E-03
0.895
-0.693
0.244
0.884
-0.296
0.856
0.918
Componentes
2
0.208
0.881
8.28E-02
0.577
2.18E-02
0.182
0.574
-0.107
0.845
-5.19E-02
0.242
Tabla 16-4: Matriz de componentes
3
-0.328
6.90E-02
0.162
-0.688
0.301
0.465
-6.76E-03
0.184
0.347
-3.44E-02
0.116

259
__________________________________________________________________
Como podemos ver a partir de los datos obtenidos en la tabla 16-4, en la

componente 1 las variables que ms peso tienen son HE (0.963), AD (0.918), OE
(0.895), G (0.884) y AO (0.856) y esta componente explica el 47.3% de varianza.
En la segunda componente las variables que ms peso tienen son 3M1B (0.881) y
2FE (0.845) y esta componente explica el 21.0% de varianza y en la componente 3,
la variable que ms peso tiene, pero con correlacin negativa es 1H (-0.688)
seguida de SD (0.465).
Una vez que se han visto qu variables estn mas correlacionadas con las
componentes principales se calcularon los loadings (coeficientes de las
combinaciones lineales sobre las variables antiguas que definen las variables
nuevas) (tabla 16-5) para as poder calcular a partir de ellos los scores, es decir
las nuevas coordenadas de los objetos en las componentes principales.
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
1
0.133
-0.020
0.185
0.001
0.172
-0.133
0.047
0.170
-0.057
0.165
0.177
Componentes
2
0.090
0.381
0.036
0.250
0.009
0.079
0.249
-0.046
0.366
-0.022
0.105
3
-0.302
0.063
0.149
-0.633
0.276
0.427
-0.006
0.169
0.319
-0.032
0.107
Tabla 16-5: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales

sobre las variables antiguas que definen las variables nuevas
Obtenidos los coeficientes de las componentes principales se pas a

representar los scores de cada objeto en las nuevas componentes. As, si se
representa la componente 1 frente a la componente 2 se obtiene la figura 16-2.
T. CEDRN FERNNDEZ
260
__________________________________________________________________
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
TIPO
Componente 2
0,0
t
-,5
r
-1,0
m
c
-1,5
-1,5
-1,0
-,5
0,0
,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Componente 1
x
Figura 16-2: Grfico de puntuacin sobre las dos primeras componentes
Para explicar la posicin de los objetos en los grficos, llamamos a los

cuadrantes que forman los ejes en 0,0 como: 1, 2, 3 y 4 en el sentido inverso a las
agujas del reloj, comenzando por el 1, que es el de la parte superior derecha. As,
en la figura 16-2 podemos observar, en general, una buena distribucin de los
objetos segn el tipo de vino. Los vinos claretes se sitan en el cuadrante 1 (parte
superior positiva de la componente 2 en la que las variables que ms peso tenan
eran 3M1B y 2FE). Parte de los vinos tintos en el cuadrante 2 (parte izquierda de la
componente 1), y con ellos un vino de la clase mezcla; en la componente 1 las
variables con ms peso eran HE, AD, OE, G y AO. Los vinos rosados, en el
cuadrante 1 (parte derecha de la componente 1 y prximos a ella). Los
pertenecientes a la clase mezcla junto con dos tintos en el cuadrante 3 y en el
cuadrante 4 aparecen una muestra de rosado y otra de clarete.
La representacin de los scores en las coordenadas de la componente 1 y
de la componente 3 di la figura 16-3. En ella no se observa una clara distribucin
de las cuatro tipos o clases, ms bien una dispersin de puntos en el plano, aunque
hay una ligera tendencia a separarse las mezclas y tintos en los cuadrantes 2 y 3
(parte izquierda de la componente 1) de los rosados y claretes en los cuadrantes 1 y
4 (parte derecha de la componente1).

261
__________________________________________________________________
Componente 3
TIPO
t
-1
r
m
c
-2
-1,5
-1,0
-,5
0,0
,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Componente 1
x
Figura 16-3: Grfico de puntuacin, componente 1 frente a componente 3
Finalmente, la representacin de la componente 3 frente a la 2 tampoco dio

buenos resultados, ya que como se observa en la figura 16-4, nicamente se
separaron ligeramente los vinos que correspondan a mezclas y los claretes; entre
los otros tipos no se observa separacin.
T. CEDRN FERNNDEZ
262
__________________________________________________________________
Componente 3
TIPO
t
-1
r
m
c
-2
-1,5
-1,0
-,5
0,0
,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Componente 2
x
Figura 16-4: Grfico de puntuacin, componente 2 frente a componente 3
16.1.2.- Anlisis lineal discriminante

Otro de los mtodos empleados para caracterizar las muestras de vino en las
cuatro clases es un mtodo de reconocimiento de pautas supervisado o clasificado,
el Anlisis Lineal Discriminante. Inicialmente se realiz introduciendo todas las
variables juntas. (Las tablas de datos obtenidas se muestran en el Apndice G).
En la tabla 16-6 se indican los autovalores y la correlacin cannica de las
funciones cannicas discriminantes. El autovalor de una funcin se puede entender
como la parte de variabilidad total de la nube de puntos proyectada sobre el
conjunto de todas las funciones atribuible a la funcin. Si su valor es grande, la
funcin discriminar mucho. Las correlaciones cannicas miden las desviaciones
de las puntuaciones discriminantes entre grupos respecto a las desviaciones totales
sin distinguir grupos. As, si su valor es grande (prximo a 1) la dispersin ser
debida a las diferencias entre grupos y por tanto, la funcin discriminar mucho.

263
__________________________________________________________________
Funcin Autovalor
1
2
3
x
76.7
7.53
2.80
% Varianza
explicada
88.1
8.70
3.20
% Varianza
acumulada
88.1
96.8
100.0
Correlacin
cannica
0.994
0.940
0.859
Tabla 16-6: Autovalores y correlacin cannica de las funciones discriminantes
En la tabla vemos que de las tres funciones que se obtienen, los autovalores
van en orden decreciente 76.668 >>> 7.527 > 2.803. La primera funcin explicara
un 88.1% de varianza y las otras dos el 8.7% y el 3.2%, respectivamente. As, la
primera funcin es la que va a dar prcticamente la clasificacin.
En la tabla 16-7 se indican los coeficientes de las funciones cannicas
discriminantes con sus variables tipificadas.
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
1
0.737
0.612
0.345
-0.289
1.056
-0.758
0.918
-0.873
0.390
0.022
1.330
Funcin
2
-0.316
-0.183
-2.461
-0.690
2.256
0.091
1.359
-0.626
0.308
-0.167
1.106
3
0.616
0.081
0.543
0.056
0.239
1.414
0.576
-0.167
-0.905
-0.674
-0.117
Tabla 16-7: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes

cannicas
Podemos apreciar qu variables influyen ms en cada funcin discriminante.

Por ejemplo, AD contribuye ms a la discriminacin en la primera funcin (1.330
> 1.106 > -0.117), mientras que AH (1.359 > 0.918 > 0.576) y OE (2.256 > 1.056 >
0.239) lo hacen en la segunda o SD (1.414) en la tercera.
T. CEDRN FERNNDEZ
264
__________________________________________________________________
Otra aportacin que nos da el programa son las tablas de las funciones de los
centroides (tabla 16-8), las cuales nos dan una idea de cmo las funciones
discriminan grupos. As, si las medias de los dos grupos en cada funcin son muy
parecidas la funcin no discrimina grupos, por ejemplo, referente a la funcin 1 la
media entre los vinos de los grupos c y r es muy parecida, luego esta funcin tendr
bajo poder discriminatorio entre estos grupos, lo mismo ocurre para los vinos m y t.
Vino
c
r
m
t
x
1
10.856
10.534
-5.783
-5.715
Funcin
2
4.269
-3.274
-1.410
1.250
3
-1.269
0.960
-1.808
1.545
Tabla 16-8: Funciones en los centroides de los grupos
El mapa territorial (apndice G) representa las fronteras utilizadas para la

clasificacin entre los grupos para las dos primeras funciones discriminantes.
En la figura 16-5 se representa una clasificacin de todos los objetos
estudiados utilizando las dos primeras funciones discriminantes. Vemos que entre
los vinos tintos y los rosados hay una separacin muy buena y que entre los
claretes y las mezclas aunque la separacin tambin se ve, no est tan marcada.
An as, puede observarse que quedan perfectamente clasificados los cuatro
tipos de vinos en los cuatro cuadrantes que forman los ejes en (0,0).

265
__________________________________________________________________
6
tipo
categora
Funcin 2
t
-2
r
m
c
-4
-10
10
20
Funcin 1
x
Figura 16-5: Grfico de dispersin de los objetos sobre el plano de

las dos primeras funciones discriminantes
Para ver si exista o no diferencia en cuanto a la forma de realizar el ALD lo

volvimos a repetir pero en el modo de estimacin por etapas, el cual va incluyendo
las variables independientes dentro de la funcin discriminante de una en una. En
concreto, se utiliz como mtodo de inclusin de variables el de Lambda. Los
resultados obtenidos se indican en el apndice G.
Con este tratamiento nicamente se introdujeron tres variables (SD, 2FE y
AD) obteniendo tres funciones discriminantes. En la tabla 16-9 se muestran los
coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes.
SD
2FE
AD
x
1
-1.197
0.958
1.136
Funcin
2
0.935
-0.134
0.308
3
-0.472
1.187
-0.161
Tabla 16-9: Coeficientes estandarizados de las funciones

discriminantes cannicas por etapas
T. CEDRN FERNNDEZ
266
__________________________________________________________________
Los autovalores obtenidos para cada funcin se indican en la tabla 16-10.
Funcin Autovalor
1
2
3
x
28.654
0.661
0.494
% Varianza
explicada
96.1
2.2
1.7
% Varianza
acumulada
96.1
98.3
100.0
Correlacin
cannica
0.983
0.631
0.575
Tabla 16-10: Autovalores de cada funcin
La primera funcin discriminante explicara un 96.1% de varianza frente a

un 2.2% de la segunda funcin y de un 1.7% de la tercera. Los valores de
correlacin cannica tambin indican que la primera funcin discrimina ms que
las otras dos (0.983 > 0.631 > 0.575).
En la representacin grfica (figura 16-6) de la funcin 1 frente a la funcin
2 vemos que los objetos no quedan bien definidos en las diferentes clases o tipos,
los vinos tintos y mezclas, quedan mezclados as como vinos rosados y claretes.

267
__________________________________________________________________
funciones discriminantes cannicas

2
4
2
1
tipo
VINO
3
-1
Centroides de grupo
Funcin 2
t
m
-2
r
c
-3
-8
-6
-4
-2
10
Funcin 1
x
Figura 16-6: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 2
En la representacin de la funcin 1 frente a la funcin 3 (figura 16-7)

tampoco quedan bien clasificados los vinos de distinto tipo, los vinos claretes y
mezclas no quedan bien separados, un vino mezcla aparece en el grupo de tintos, y
los rosados y claretes s que quedan bien separados, pero un vino clarete aparece en
el grupo de rosados.
T. CEDRN FERNNDEZ
268
__________________________________________________________________
3
tipo
VINO
Funcin 3
t
-1
m
r
c
-2
-8
-6
-4
-2
10
Funcin 1
x
Figura 16-7: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 3
16.1.3.- Anlisis cluster

Para completar las tcnicas de clasificacin realizamos un anlisis cluster. La
informacin de este anlisis es solo complementaria.
Tanto el anlisis clster como el anlisis discriminante sirven para clasificar
individuos en categoras. La diferencia principal entre ellos est en que en el
anlisis discriminante se conoce a priori el grupo de pertenencia, mientras que el
anlisis clster sirve para ir formando grupos homogneos de conglomerados.
La representacin grfica, a modo de rbol invertido, se denomina
dendograma.
Se realiz este primer anlisis cluster con todas las variables utilizando como
medida de distancia la distancia eucldea al cuadrado. Los resultados obtenidos se
indican en el apndice G. La representacin grfica se muestra en la figura 16-8.

269
__________________________________________________________________
Dendograma
Distancias Cluster
Tipo
Num
0
5
10
15
20
25
+---------+---------+---------+---------+--------+
m
12
t
15
m
9
m
8
t
19

m
13

t
14

t
18

m
10
m
11
t
16
8

t
17

t
20

r
5
c
1
8
c
2
r
4
8
r
7
r
6
c
3
x
Figura 16-8: Anlisis cluster para los distintos tipos de vinos
A partir del dendograma observamos que a una distancia de 10 obtenemos

tres conglomerados, uno con todos los vinos tintos, mezclas y un vino rosado, otro
conglomerado con dos vinos claretes y un tercer conglomerado con tres vinos
rosados y un vino clarete. A una distancia de 7 obtenemos 5 conglomerados,
similares a los obtenidos en el caso anterior, pero a esta distancia el vino rosado del
conglomerado 1 y el vino clarete del conglomerado 3 estaran en grupos
diferentes.Mediante esta tcnica de clasificacin y utilizando todas las variables no
se han separado los diferentes tipos de vino.
Con ALD quedan perfectamente clasificados (figura 16-5), sin embargo
mediante ACP la clasificacin no es tan clara, ya que por ejemplo uno de los vinos
de la clase rosado tiene ms similitud con los claretes que con los de su clase. Lo
T. CEDRN FERNNDEZ
270
__________________________________________________________________
mismo ocurre con un vino de la clase clarete, que se asemeja ms a los rosados que
a los claretes.
16.2.- Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin de

origen
Se realiz otro estudio preliminar con muestras de vino tinto de diferentes
Denominaciones de Origen. El nmero de muestras utilizadas fueron 18 [3 de
Navarra (N), 7 de Rioja (R), 4 de La Mancha (M) y 4 de Valdepeas (V)], las
variables en estudio fueron las mismas que en el caso anterior mas el acetato de 2feniletilo (AFE). La metodologa de trabajo utilizada tambin fue la misma que en
el apartado anterior y la preparacin de las muestras se realiz como se expuso en
el apartado 12-2. A partir de los cromatogramas obtenidos, las reas de cada
compuesto para cada uno de los vinos se indican en la tabla 16-11.
VINO
N1
N2
N3
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
M1
M2
M3
M4
V1
V2
V3
V4
x
A1B3M
388952
373648
395982
453950
642523
444419
732945
691152
242532
239122
621352
774850
509752
836835
948159
563968
813454
972055
3M1B
7177351
5725753
6127050
5823255
6543163
6816555
8845685
5939574
7729845
9265755
6266863
6481763
3848085
6477558
7803977
6824758
4233195
5738485
HE
483974
390858
368669
556868
677785
554358
495186
622058
616246
586354
429756
397663
188263
474574
374285
214764
809325
452385
1H
190886
198584
183252
213163
263385
253487
308875
107158
275386
302296
185484
180385
137685
162955
160558
142357
92550
137074
OE
902174
761958
604558
919656
988441
902951
638052
1512956
672684
451674
1089572
810671
530770
1057751
830785
640984
2048552
1112841
SD
44624
75915
77552
85774
56174
90511
96374
49378
143785
219185
118174
148958
297685
172182
92651
92486
51288
79574
Tabla 16-11: Valores de las reas de los picos cromatogrficos de los vinos de

271
__________________________________________________________________
VINO
N1
N2
N3
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
M1
M2
M3
M4
V1
V2
V3
V4
x
AFE
---------21416
----22812
-41425
--
AH
46825
7273
32122
80142
37340
92823
46258
31380
70612
105812
-38522
--55252
39412
108325
52111
G
41910
43225
-31652
46657
36852
33925
40445
114023
148078
----50578
32552
122412
51858
2FE
314525
303735
472033
262882
266562
316252
600458
220232
1173825
2494025
554035
364141
254025
252932
714220
467925
265128
325336
AO
84621
78152
40834
62452
92135
63324
50250
86048
254774
307552
175765
167325
111525
115536
113422
92151
295912
121218
AD
25550
-------58021
104812
----52832
97242
--
Tabla 16-11: Continuacin. (--: no detectado)
A los datos obtenidos se les realiz un test ANOVA (nivel de significancia D

= 0.05), y como en el estudio anterior, mediante el test de la diferencia mnima
significativa (DMS) estudiamos las diferencias entre los distintos vinos y las
variables en estudio y los resultados se muestran en el apndice H.
A partir de los datos de la tabla ANOVA vemos que las variables
significativas son: acetato de 3 metil-1-butilo (A3M1B), 1-hexanol (1H), succinato
de dietilo (SD), cido hexanoico (AH), geraniol (G), y cido decanoico (AD).
Si analizamos los resultados que se obtienen en la tabla de comparaciones
mltiples (apndice H), podemos ver qu variables son significativas para cada
grupo de vinos comparndolos con el resto de grupos. Los resultados obtenidos se
T. CEDRN FERNNDEZ
272
__________________________________________________________________
Vino
N
Variables
R
M
A1B3M
A1B3M
M
x
HE
M
V
SD
A1B3M
1H
SD
1H
SD
AH
AH
Tabla 16-12: Variables significativas en los distintos grupos de vinos
Podemos ver que entre los vinos de Navarra y Rioja no hay ninguna variable
que los haga significativamente diferentes; entre Navarra y La Mancha el acetato
de 3 metil-1-butilo (A1B3M) y el succinato de dietilo (SD); entre Navarra y
Valdepeas el acetato de 3 metil-1-butilo (A1B3M); entre vinos de Rioja y de La
Mancha se diferencian por el hexanoato de etilo (HE), 1-hexanol (1H), succinato
de dietilo (SD), cido hexanoico (AH) y geraniol (G); entre los de Rioja y
Valdepeas las variables significativas fueron el acetato de 3 metil-1-butilo
(A3M1B), el 1-hexanol (1H) y el succinato de dietilo (SD); y entre La Mancha y
Valdepeas las variables que se muestran con diferencia significativa son el cido
hexanoico (AH) y el geraniol (G).
Como nuestro estudio tena como objetivo clasificar una serie de muestras de
vino, las cuales pertenecan a cuatro tipos diferentes que eran las cuatro
Denominaciones de Origen, en los apartados siguientes se van a exponer las
tcnicas quimiomtricas que se han utilizado.

Comenzamos, igual que en el caso anterior, realizando la clasificacin de las
muestras por componentes principales (ACP). Para ver el nmero de componentes
principales realizamos el grfico de sedimentacin (figura 16-9).

273
__________________________________________________________________
Grfico de sedimentacin
6
Autovalor
0
1
10
11
12
Nmero de componente
x Figura 16-9: Grfico de sedimentacin

A partir de l vemos que con tres componentes (cada brusca) sera
suficiente. Si utilizamos el criterio de la varianza explicada y la varianza
acumulada observamos que con estos tres componentes se explica el 81.2% de
varianza (tabla 16-13).
x
Componentes
Autovalor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4.911
3.204
1.630
0.871
0.598
0.329
0.184
0.103
8.52E-02
5.55E-02
2.46E-02
4.57E-03
% Varianza
explicada
40.929
26.701
13.585
7.256
4.980
2.741
1.530
0.861
0.710
0.463
0.206
3.81E-02
% Varianza
acumulada
40.929
67.630
81.215
88.470
93.451
96.192
97.722
98.583
99.293
99.756
99.962
100.000
Tabla 16-13: Autovalores, varianza explicada y acumulada para los 12 componentes
T. CEDRN FERNNDEZ
274
__________________________________________________________________
En la tabla siguiente (tabla 16-14) se indica la matriz de componentes, la

cual da los coeficientes de correlacin de cada una de las variables originales con
las componentes principales para ver con cual est ms correlacionada.
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
1
-0.286
0.418
0.617
0.364
0.120
5.21E-02
0.715
0.773
0.951
0.765
0.805
0.937
Componentes
2
0.605
-0.618
0.432
-0.732
0.949
-0.487
0.500
0.111
7.85E-02
-0.540
0.140
0.135
3
0.130
-0.345
-0.465
-0.431
-0.111
0.784
0.264
-0.334
-5.16E-02
0.192
0.434
0.236
Tabla 16-14: Matriz de componentes
Como podemos ver a partir de los datos obtenidos en esta tabla, en la

componente 1 las dos variables que ms peso tienen son G (0.951) y AD (0.937),
seguidas por AO (0.805), AH (0.773), 2FE (0.765) y AFE (0.715) todas con
correlacin positiva, explicando esta componente el 40.9% de varianza. La segunda
componente explica el 26.7% de varianza, siendo la variable de ms peso el OE
(0.949) seguida de 1H pero con correlacin negativa (-0.732), y la tercera
componente explica el 13.6% y la variable con ms peso es el SD (0.784).
Una vez que se han visto qu variables estn ms correlacionadas con las
componentes principales se calcularon los loadings (tabla 16-15), con la
finalidad de obtener a partir de ellos los scores, es decir las coordenadas de los
objetos en las componentes principales.

275
__________________________________________________________________
1
-0.058
0.085
0.126
0.074
0.024
0.011
0.146
0.157
0.194
0.156
0.164
0.191
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Componentes
2
0.189
-0.193
0.135
-0.228
0.296
-0.152
0.156
0.035
0.025
-0.168
0.044
0.042
3
0.080
-0.212
-0.285
-0.264
-0.068
0.481
0.162
-0.205
-0.032
0.118
0.266
0.145
Tabla 16-15: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales

sobre las variables antiguas que definen las variables nuevas
Obtenidos los coeficientes de las componentes principales se pas a

representar cada objeto en las nuevas componentes. As, si se representa la
componente 1 frente a la componente 2 se obtiene la figura 16-10.
4
Componente 2
DO
0
V
M
-1
R
N
-2
-2
-1
Componente 1
x
Figura 16-10: Grfico de dispersin sobre las dos primeras componentes
T. CEDRN FERNNDEZ
276
__________________________________________________________________
En ella podemos observar, en general, una distribucin bastante aleatoria de

los objetos.
La representacin de la componente 1 frente a la componente 3 se muestra
en la figura 16-11.
3
Componente 3
DO
V
-1
M
R
-2
N
-2
-1
Componente 1
x
Figura 16-11: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 3
En esta figura se observa una distribucin ms homognea de los objetos en

funcin de las diferentes denominaciones de origen. Los vinos de Valdepeas y La
Mancha se encuentran ubicados en los cuadrantes 1 y 2 (parte superior positiva de
la componente 1), todos los de La Mancha se sitan en el cuadrante 2 (margen
izquierda de la componente 3). Sin embargo, los vinos de Navarra aparecen en el
cuadrante 3 y los de Rioja mayoritariamente en el 3 tambin, exceptuando dos
vinos que aparecen en el 1 y 4.
Por ltimo, la representacin de la componente 3 frente a la 2 dio los
siguiente resultados (figura 16-12).

277
__________________________________________________________________
3
Componente 3
DO
V
-1
M
R
-2
N
-2
-1
Componente 2
x
Figura 16-12: Grfico de dispersin sobre las componentes 2 y 3
Tampoco en este ltimo grfico de dispersin observamos una clara

separacin de las diferentes muestras por su pertenencia a las distintas
denominaciones de origen.

Para caracterizar las muestras de vino en las cuatro DO se ha utilizado un
mtodo de reconocimiento de pautas supervisado, el Anlisis Discriminante.
Inicialmente se realiz introduciendo todas las variables juntas. (Las tablas de datos
obtenidas se muestran en el Apndice H).
funciones cannicas discriminantes.
Funcin Autovalor
1
2
3
x
81.42
17.09
1.881
% Varianza
explicada
81.1
17.0
1.9
% Varianza
acumulada
81.1
98.1
100
Correlacin
cannica
0.994
0.972
0.808
T. CEDRN FERNNDEZ
278
__________________________________________________________________
Se puede observar que de las tres funciones que se obtienen, los autovalores
van en orden decreciente 81.428 >>> 17.098 > 1.881. Los valores de las
correlacin cannica son 0.994, 0.972, 0.808. La primera funcin explicara un
81.1% de varianza y las otras dos el 17.0% y el 1.9% respectivamente. As, la
primera funcin es la que va a dar prcticamente la clasificacin.
Funcin
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
1
0.105
2.466
-0.339
0.595
3.155
4.328
0.552
-0.004
-6.407
-2.382
7.442
-2.285
2
-1.891
1.782
4.116
-0.466
-0.306
2.202
0.935
-0.165
-0.658
0.200
-0.913
-3.427
3
0.148
1.828
1.169
-0.954
-0.834
1.247
2.300
0.036
2.466
-0.936
0.854
-5.357
Tabla 16-17: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes

cannicas

Por ejemplo, AO (7.442), G (-6.407), SD (4.328), OE (3.155) y 3M1B (2.466),
contribuyen ms a la discriminacin en la primera funcin, EH (4.116) en la
segunda o AD (-5.357) en la tercera.
La tabla de las funciones de los centroides (tabla 16-18) nos da una idea de
cmo las funciones discriminan grupos. Referente a la funcin 1, la media entre los
vinos de Rioja y Valdepeas es muy parecida, luego esta funcin tendr bajo poder
discriminatorio entre estos grupos.

279
__________________________________________________________________
DO
N
R
M
V
x
1
-6.757
-3.711
14.720
-3.157
Funcin
2
-0.262
3.540
0.153
-6.151
3
-2.500
0.776
-0.336
0.853
En el apndice H se muestra el mapa territorial, igual que se hizo para el

estudio de las variedades.
estudiados utilizando los valores de las dos primeras funciones discriminantes.

6
2
2
3
DO
-2
Centroides de grupo
V
Funcin 2
-4
M
4
-6
-8
-10
10
20
Funcin 1
x
Figura 16-13: Grfico de dispersin sobre las dos primeras funciones
Vemos que entre todos los grupos se muestra una buena separacin, los
vinos de las cuatro denominaciones de origen han quedado perfectamente
clasificados y dentro de su denominacin.
T. CEDRN FERNNDEZ
280
__________________________________________________________________
Para ver si exista o no diferencia en cuanto a la forma de realizar el Anlisis

Discriminante lo volvimos a repetir pero en el modo de estimacin por etapas.
Tambin se utiliz como mtodo de inclusin de variables el de Lambda. Los
resultados obtenidos se indican en el apndice H.
Con este tratamiento nicamente se introdujeron cinco variables (A1B3M,
HE, SD, G y AO) obteniendo tres funciones discriminantes. En la tabla 16-19 se
muestran los coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes.
Funcin
1
0.718
0.538
1.638
-5.264
4.654
A1B3M
HE
SD
G
AO
x
2
1.321
-2.081
-1.107
1.284
0.952
3
0.595
0.962
1.007
0.719
-0.903
Tabla 16-19: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas
Los autovalores obtenidos para cada funcin se indican en la tabla 16-20.
Funcin Autovalor
1
2
3
x
32.151
5.336
0.823
% Varianza
explicada
83.9
13.9
2.1
% Varianza
acumulada
83.9
97.9
100.0
Correlacin
cannica
0.985
0.918
0.672
Tabla 16-20: Autovalores para cada funcin
La primera funcin discriminante explicara un 83.9 % de varianza frente a

un 13.9 % de la segunda funcin y de un 2.1 % de la tercera. Los valores de
correlacin cannica tambin indican que la primera funcin discrimina ms que
las otras dos (0.985 > 0.918 > 0.672).
En la representacin grfica de la funcin 1 frente a la funcin 2 (figura 1614) vemos que los objetos de las denominaciones La Mancha y Valdepeas quedan
bien definidos, pero los vinos de Navarra no se diferencian mucho de los de Rioja.

281
__________________________________________________________________

6
DO
0
Centroides de grupo
Funcin 2
-2
R
-4
N
-6
-4
-2
10
12
Funcin 1
x
Figura 16-14: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 2 mediante

estimacin por etapas

Igual que hicimos en el estudio preliminar de las diferentes tipos de vino
realizamos un anlisis cluster. La informacin de este anlisis es slo
complementaria.
Se realiz este primer anlisis cluster con todas las variables utilizando como
medida de distancia la distancia eucldea al cuadrado. Los resultados obtenidos se
indican en el apndice H.
T. CEDRN FERNNDEZ
282
__________________________________________________________________
Dendograma
Distancia Cluster
CASO 0
5
10
15
20
25
Num
+--------+--------+--------+--------+--------+
N2
R4
N3
R8
V18
M12
M14
R5
M11
N1
R6
V16
R9 8
V15
R7
M13 8
V17
R10
x
Figura 16-15: Anlisis cluster para los vinos de diferentes DO
A partir del dendograma obtenido (figura 16-15), observamos que no se

pueden clasificar mediante esta tcnica los vinos pertenecientes a las distintas
denominaciones.
La conclusin de este estudio es que el ALD es la tcnica que mejor clasifica
los vinos en funcin de su denominacin de origen.

283
__________________________________________________________________
16.3.- Estudio ampliado con vinos de distinta Denominacin

Una vez que se ha realizado a pequea escala el estudio de clasificacin, se
aplicaron las distintas tcnicas quimiomtricas a muestras de vino de diferentes
denominaciones de origen. El estudio se realiz con 244 vinos tintos jvenes del
ao 2002 de las cuales:
- Denominacin de Origen Calificada Rioja (R): 60 muestras.
- Denominacin de Origen Navarra (N): 54 muestras.
- Denominacin de Origen Valdepeas (V): 52 muestras.
- Denominacin de Origen Cariena (C): 36 muestras.
- Denominacin de Origen La Mancha (M): 42 muestras.
Todas las muestras de vino fueron proporcionadas por los Consejos
Reguladores de las distintas denominaciones de origen.
La preparacin de las muestras se realiz siguiendo el procedimiento
operativo indicado en el apartado 12.2, y las variables utilizadas fueron las mismas
que en el anterior estudio preliminar. A partir de los cromatogramas obtenidos se
calcularon, en este caso, las concentraciones de cada compuesto para cada uno de
los vinos. Los datos obtenidos se muestran en el apndice I. A los datos obtenidos
se les realiz un test ANOVA (nivel de significancia D = 0.05), estudiando qu
variables eran significativas. Los datos de este estudio se encuentran en el apndice
K y los resultados de la significacin se muestran en la tabla 16-21, donde si D es
mayor o igual a 0.05 = no significativa.
Compuesto
A1B3M
AD
AFE
AH
AO
3M1B
HE
2FE
G
1H
OE
SD
x
D
0.0000
0.0101
0.0009
0.0000
0.0000
0.0000
0.4311
0.0000
0.0000
0.1152
0.0000
0.0015
Tabla 16-21: ANOVA para el estudio ampliado
S
S
S
S
S
S
NS
S
S
NS
S
S
T. CEDRN FERNNDEZ
284
__________________________________________________________________
A partir de los datos obtenidos en la tabla ANOVA vemos que las nicas
variables no significativas son: hexanoato de etilo (HE) y 1-hexanol (1H).
En los apartados siguientes se exponen las
quimiomtricas que se han utilizado para realizar el estudio.
diferentes
tcnicas

Igual que en los estudios preliminares, en primer lugar se comprob si se
poda realizar la clasificacin representando las muestras en componentes
principales.
Para ver el nmero de componentes principales realizamos el grfico de
sedimentacin (figura 16-16).
Scree Plot
Autovalor
Eigenvalue
4
3
2
1
0
0
10
12
Nmero de componente
Component
x
Figura16-16: Grfico de sedimentacin en el estudio ampliado de las distintas

denominaciones de origen

285
__________________________________________________________________
A partir de l vemos que con cuatro componentes sera suficiente. Si

utilizamos el criterio de la varianza explicada y varianza acumulada vemos que con
estos cuatro componentes se explica el 64.2% de la varianza (tabla 16-22).
Componentes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
x
Autovalor
3.874
1.608
1.223
1.001
.978
.814
.691
.535
.407
.346
.304
.220
% Varianza explicada % Varianza acumulada

32.283
32.283
13.403
45.686
10.195
55.881
8.338
64.220
8.146
72.366
6.785
79.150
5.756
84.906
4.460
89.365
3.389
92.755
2.885
95.640
2.531
98.171
1.829
100.000
Tabla 16-22: Autovalores, varianza explicada y acumulada para los 12 componentes
En la tabla 16-23 se indican los loadings (coeficientes de las combinaciones

lineales sobre las variables antiguas que definen las nuevas variables).
Componentes
1
0.0694663
A1B3M
-0.326316
AD
-0.112227
AFE
-0.335237
AH
-0.370179
AO
-0.320562
3M1B
0.0349917
HE
-0.396314
2FE
-0.424828
G
-0.23935
1H
-0.0019359
OE
-0.357576
SD
x
2
0.426387
-0.117957
-0.135376
-0.226464
-0.0254068
0.185106
0.0647383
0.172303
-0.103806
0.48214
0.644933
-0.0818844
3
0.629457
0.111901
-0.0699666
-0.0158012
0.391565
-0.378092
0.24436
-0.0706584
0.0991163
-0.395132
0.0440923
0.239246
Tabla 16-23: Loadings para las cuatro componentes
4
0.135234
0.0767178
0.426103
-0.141693
0.17715
0.0235906
0.849923
0.0900722
-0.048771
0.0687662
-0.0315797
0.0604962
T. CEDRN FERNNDEZ
286
__________________________________________________________________
Por ejemplo, la primera componente principal (1z) tiene la ecuacin:

1z = 0.0694663 x A1B3M - 0.326316 x AD - 0.112227 x AFE - 0.335237 x
AH - 0.370179 x AO - 0.320562 x 3M1B + 0.0349917 x HE - 0.396314 x 2FE 0.424828 x G - 0.23935 x H - 0.0019359 x OE - 0.357576 x SD
Una vez obtenidas las ecuaciones de las componentes principales, se
calcularon las coordenadas de los objetos (scores) en los nuevos ejes. La
representacin grfica se indica en las siguientes figuras: componente 1 vs
componente 2 (figura 16-17), componente 1 vs componente 3 (figura 16-18),
componente 3 vs componente 2 (figura 16-19) y componente 1 vs componente 4
(figura 16-20).
12
10
DO
4
Componente 2
V
R
N
0
M
-2
C
-2
Componente 1
x
Figura 16-17: Grficos de dispersin sobre las dos primeras componentes

287
__________________________________________________________________
6
DO
Componente 3
V
R
-2
N
M
-4
C
-2
Componente 1
x
Figura 16-18: Grficos de dispersin sobre las componentes 1 y 3

12
10
DO
4
Componente 2
V
2
R
N
0
M
-2
C
-4
-2
Componente 3
x
T. CEDRN FERNNDEZ
288
__________________________________________________________________
14
12
10
8
DO
V
Componente 4
R
2
N
0
M
C
-2
-2
Componente 1
x
Como conclusin de este apartado, tal y como queda de manifiesto en las

figuras, el ACP no es una buena tcnica de clasificacin para nuestras muestras de
vino.

Para caracterizar las muestras de vino en sus denominaciones de origen, se
ha utilizado un mtodo de reconocimiento de pautas supervisado, el Anlisis Lineal
Discriminante. Se realiz introduciendo todas las variables juntas.
funciones cannicas discriminantes.
x
Funcin
Autovalor
1
2
3
4
510.533
7.52161
0.628765
0.137463
% Varianza
explicada
98.40
1.45
0.12
0.03
Correlacin
cannica
0.99902
0.93950
0.62132
0.34764

289
__________________________________________________________________
Los valores de las cuatro funciones son: 510.533 >>> 7.52161 > 0.628765 >
0.137463, y los valores de correlacin cannica: 0.999, 0.939, 0.621 y 0.347. La
primera funcin explicara un 98.40% de varianza y las otras tres el 1.45%, el
0.12% y el 0.03% respectivamente. Por ello, la primera funcin es la que va a dar
prcticamente la clasificacin.
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
AFE
x
1
0.0228957
-0.000602946
-0.0182749
0.0238198
-0.0277775
0.0282813
0.0074332
0.00270119
-0.0405269
0.0767745
-0.0274639
-0.0114309
Funcin
2
1.03164
-0.0642547
0.118485
0.189484
-0.0868544
-0.0566158
-0.140001
-0.340079
-0.212268
0.524072
0.0214097
-0.0680954
3
0.144211
0.245036
0.0603428
-0.0957527
0.0528214
-0.572134
0.367521
1.52644
-0.155148
-1.54085
0.134676
-0.116618
4
0.029133
0.941424
0.0218776
-0.311898
0.100461
-0.0380175
0.00532522
0.523893
-0.538026
0.186588
0.0588957
0.415355
Tabla 16-25: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas

Por ejemplo, para la primera funcin las variables que ms contribuyen a la
discriminacin son el AO y 2FE (ste con valor negativo) seguidos por A1B3M,
1H, OE, SD y AD que contribuyen de modo similar; en la segunda funcin es, sin
embargo, el A1B3M el que tiene un valor ms alto; en la tercera funcin los
valores mayores los tienen G y AO, y en la cuarta 3M1B.
La tabla 16-26 nos muestra las funciones de los centroides, las cuales nos
dan una idea de cmo las funciones discriminan grupos. Por ejemplo, en lo
referente a la funcin 2, las medias entre los vinos de Cariena, Rioja y Navarra no
son muy diferentes (1.98, 1.57 y 2.34 respectivamente), por lo tanto, esta funcin
tendr poco poder discriminante entre estas denominaciones. Lo mismo ocurre con
la funcin 4 para los vinos de Navarra y Rioja (0.26 y 0.21 respectivamente).
T. CEDRN FERNNDEZ
290
__________________________________________________________________
Funcin
1
0.827071
32.3725
-30.5147
16.5394
-14.6368
Vino
C
M
N
R
V
x
2
-1.98559
0.983006
-2.39053
-1.57055
4.68479
3
-0.0462615
-1.19426
-0.527858
1.07684
0.322508
4
-0.843649
0.140109
0.260627
0.218540
-0.0497086

estudiados utilizando los valores de las dos primeras funciones discriminantes.
Observamos que la separacin es muy buena entre los diferentes grupos
formndose grupos muy definidos excepto en el caso de los vinos de la DO La
Mancha donde los puntos aparecen mas dispersos, pero bien diferenciados de los
dems.
Funciones discriminantes cannicas
Plot of Discriminant Functions

DO
vinos
C
M
N
R
V
centroides
Centroids
Funcin
2
Function
12
8
4
0
-4
-31
-11
Function
Funcin
1
x
29
49
Figura 16-21: Representacin de las dos primeras funciones discriminantes

291
__________________________________________________________________

Para completar las tcnicas de clasificacin realizamos un anlisis cluster.
Los resultados obtenidos se dan en el apndice I. No se muestra el dendograma ya
que al ser el nmero de muestras tan grande, no se aprecia bien la representacin,
an as no se apreciaba una clara separacin entre los vinos de las distintas
denominaciones de origen.
Como conclusin al estudio de clasificacin de vinos, podemos decir, que su
contenido en determinados compuestos voltiles es una variable que permite
diferenciarlos segn su denominacin de origen empleando para ello Anlisis
Lineal Discriminante.
CAPTULO 17
Conclusiones
CONCLUSIONES
295
_________________________________________________________________________
17.- CONCLUSIONES
Las conclusiones generales de esta memoria pueden resumirse en los
siguientes puntos:
1) Para la extraccin de compuestos voltiles en muestras de vino se pueden
utilizar la extraccin lquido-lquido (continuo, discontinuo y ultrasonidos), la
extraccin en fase slida, la microextraccin por desmezcla y la microextraccin en
fase slida.
2) Las concentraciones obtenidas para los compuestos estudiados, en
muestras de vino, estn de acuerdo con los valores que se encuentran en la
bibliografa.
3) Despus de hacer un estudio comparativo de las tcnicas de extraccin
empleadas, se selecciona la microextraccin en fase slida (SPME) por aspectos
como eficacia, rapidez, nulo consumo de disolventes orgnicos y comodidad.
4) Realizado el estudio quimiomtrico de los distintos tipos de vino (tinto,
clarete, rosado y mezclas) es posible diferenciarlos en base a su contenido en los
compuestos voltiles objeto de estudio.
6) Mediante tcnicas quimiomtricas de clasificacin y de reconocimiento de
pautas es posible caracterizar vinos de distintas denominaciones de origen segn su
contenido en determinados compuestos voltiles.
BIBLIOGRAFA Y APNDICES
Bibliografa
En este apartado bibliogrfico, las citas de las notas al pie de todo el
trabajo estn ampliadas, poniendo en cada uno de los artculos el nombre de todos
los autores y el ttulo. La ltima revisin bibliogrfica se ha hecho en Enero de
2004 en SciFinder.
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Apndices
Apndice A.- Constantes cromatogrficas
COMPUESTOS
Ka
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
D-Terpineol
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.6430.023
0.5070.011
0.6850.012
1.380.05
1.430.03
1.600.02
1.770.01
0.4980.020
1.670.01
0.6560.009
1.310.02
1.360.03
0.3560.011
1.610.01
0.7550.012
0.5840.018
1.290.02
x
Kh
0.6550.019
0.4760.010
0.7000.013
1.300.03
1.350.03
1.580.02
1.750.01
0.4080.021
1.810.02
0.6660.018
1.380.01
1.360.01
0.2460.010
1.650.01
0.4160.021
0.2850.011
0.4160.012
Constantes cromatogrficas en rea (Ka) y en altura (Kh) con diclorometano (DM).
T. CEDRN FERNNDEZ
332
__________________________________________________________________
COMPUESTOS
DM/HX
(2/1)
IO
HX
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
D-Terpineol
Acetato de 2 -feniletilo
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.4120.009
1.050.02
0.8610.016
1.010.02
0.9720.016
0.8740.012
0.8790.013
0.3120.008
1.530.01
0.5840.011
1.220.02
1.050.01
1.140.02
1.010.02
1.040.02
0.8960.015
0.8520.014
1.180.00
0.6920.015
1.190.01
1.130.02
0.8720.010
0.9730.014
0.9130.017
0.3740.008
1.610.02
0.4320.013
1.070.02
1.400.01
0.6200.013
0.9360.022
0.8610.014
0.1810.006
0.7600.011
1.030.02
0.5030.016
0.8550.007
0.9770.013
1.210.01
0.9850.015
0.8500.008
0.4130.009
1.600.02
0.08430.0061
0.9610.014
0.9330.013
0.3430.008
0.7700.014
0.7510.013
0.2530.010
0.2210.007
x
Constantes cromatogrficas (Ka) en diclorometano/hexano (DM/HX), isooctano (IO) y

hexano (HX)
COMPUESTOS
EP
MIBC
P/DM
(3/2)
3-Metil-1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
Acido butanoico
Decanoato de etilo
D-Terpineol
Acetato de 2 -feniletilo
cido hexanoico
Geraniol
2-Feniletanol
cido octanoico
cido decanoico
0.5130.011
0.7310.091
0.7630.015
0.9310.017
1.130.02
0.8610.017
0.8530.011
0.6960.008
1.340.01
0.1350.009
0.7340.021
0.9600.017
0.5700.018
0.8520.036
0.2430.011
0.5100.007
0.6330.012
0.4310.016
0.2130.014
0.5180.007
0.7120.018
0.9760.019
1.250.00
0.9310.042
0.7140.021
1.730.02
0.1030.025
1.130.01
0.9430.017
0.4530.022
0.7630.035
0.4250.011
0.3130.019
0.8610.008
0.6590.017
0.6230.021
0.1710.008
0.4130.025
1.220.03
0.8750.018
0.8410.022
0.5310.018
1.020.01
0.5170.015
0.9710.022
1.270.02
0.4620.016
0.6950.030
0.6230.025
0.6830.016
1.070.03
0.7510.014
0.7200.009
0.3540.004
0.5140.010
1.010.01
0.6910.011
0.5760.012
0.1290.007
1.130.01
0.6020.013
1.110.02
0.9920.011
0.5310.012
0.7970.019
0.3810.006
0.4430.009
0.6610.011
x
Constantes cromatogrficas (Ka) en pentano (P), ter de petrleo (EP),

metilisobutilcetona (MIBC) y pentano/diclorometano (P/DM)
APNDICES
333
__________________________________________________________________
Apndice B.- Tiempos de retencin

COMPUESTOS
TIEMPOS DE RETENCIN (min)

ELL
3 Metil 1-butanol
Hexanoato de etilo
1-Pentanol
1-Hexanol
Octanoato de etilo
Linalol
cido butanoico
Decanoato de etilo
D-Terpineol
Geraniol
cido hexanoico
2-Fenil etanol
cido octanoico
cido decanoico
x
5.7
7.8
8.6
12.1
14.7
21.7
25.4
26.1
27.9
31.6
38.7
MicroExtr.
sales
5.8
7.5
8.3
9.1
11.2
13.4
18.1
18.2
22.4
24.0
26.1
31.2
SPE
5.7
7.7
8.6
12.1
14.6
21.7
25.4
26.4
27.9
31.6
38.7
SPME
5.7
7.7
8.6
9.0
12.1
18.0
21.8
22.2
25.5
26.4
27.9
31.6
-
Tiempos de retencin (min) en los distintos procedimientos de extraccin utilizados

ELL: Extraccin lquido-lquido
MicroExtr. sales: microextraccin con sales
SPE: Extraccin en fase slida
SPME: microextraccin en fase slida
APNDICES
335
__________________________________________________________________
Apndice C.- Representaciones CG-Masas
A3M1B
3M1B
T. CEDRN FERNNDEZ
336
__________________________________________________________________
HE
1P
APNDICES
337
__________________________________________________________________
1H
OE
T. CEDRN FERNNDEZ
338
__________________________________________________________________
DE
APNDICES
339
__________________________________________________________________
SD
T. CEDRN FERNNDEZ
340
__________________________________________________________________
AFE
APNDICES
341
__________________________________________________________________
AH
2FE
T. CEDRN FERNNDEZ
342
__________________________________________________________________
AO
AD
APNDICES
343
__________________________________________________________________
Apndice D.- Rectas de calibrado en diclorometano
x Acetato de 3-metil-1-butilo
C/Cp
S/Sp
6
1.00E
0.0160
0.0380
0.120
0.240
0.550
1.02
2.94
3.98
5.23
S/Sp
0.416
1.25
2.50
5.20
10.4
26.0
52.0
175
233
292
-3
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,02677
0,00426
B
0,01736
2,59953E-4
-----------------------------------------------------------R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,9991 0,08624
10
<0.0001
------------------------------------------------------------
0
0
50
100
150
200
C/Cp
C/Cp= concentracin compuesto/ concentracin patrn interno (en Pg/mL)

S/Sp= seal del compuesto en rea / seal de patrn interno en rea
250
300
T. CEDRN FERNNDEZ
344
__________________________________________________________________
x 3 Metil-1 Butanol
C/Cp
S/Sp
25
5.00E
0.300
1.30
2.56
5.00
6.10
9.50
10.8
13.1
15.2
16.5
22.5
20
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
-1,44075
0,32848
B
0,03085
8,32996E-4
-----------------------------------------------------------R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99637
0,64618
12
<0.0001
------------------------------------------------------------
15
S/Sp
19.0
38.0
76.0
152
228
266
380
418
456
532
570
760
-3
10
100
200
300
400
500
600
700
800
C/Cp
x Hexanoato de etilo
C/Cp
S/Sp
3,0
1.00E-3
0.0260
0.0290
0.0340
0.0640
0.156
0.300
0.84
2.10
2.60
2,5
2,0
S/Sp
0.540
0.714
1.071
2.00
3.00
10.4
25.9
60.6
174
217
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,02382
0,00385
B
0,01197
1,53282E-4
-----------------------------------------------------------R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99934
0,03666
10
<0.0001
1,5
1,0
0,5
0,0
0
50
100
C/Cp
150
200
250
APNDICES
345
__________________________________________________________________
x 1-Pentanol
C/Cp
S/Sp
0.197
0.328
0.525
0.656
6.12
21.6
56.7
102
0.0180
0.0198
0.0238
0.0271
0.136
0.446
1.15
1.86
2,0
Parameter
Value
Error
-----------------------------A
0,02656
0,00679
B
0,0184
3,99531E-4
------------------------------R
SD
N
P
---------------------------------0,99859
0,03935
8
<0.0001
S/Sp
1,5
1,0
0,5
0,0
20
40
60
80
100
120
C/Cp
x 1-Hexanol
C/Cp
S/Sp
7
0.0600
0.0750
0.153
0.390
0.838
0.903
0.935
1.20
2.20
4.10
6.24
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,07004
0,00902
B
0,02558
3,12067E-4
-----------------------------------------------------------R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99933
0,07521
11
<0.0001
------------------------------------------------------------
S/Sp
0.520
1.04
5.19
17.2
25.9
29.4
31.1
43.3
86.5
156
242
3
2
1
0
0
50
100
150
C/Cp
200
250
T. CEDRN FERNNDEZ
346
__________________________________________________________________
x Octanoato de etilo
C/Cp
S/Sp
0.790
1.18
1.97
2.76
4.93
9.87
19.7
39.5
98.6
148
197
0.0230
0.0200
0.0480
0.0920
0.147
0.249
0.574
1.01
2.30
3.70
4.73
S/Sp
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,02276
0,00257
B
0,02411
2,77685E-4
-----------------------------------------------------------R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,9994 0,0606 11
<0.0001
0
0
50
100
150
200
C/Cp
x Linalol
C/Cp
S/Sp
0.347
0.695
1.11
5.39
7.67
10.7
50.3
73.2
0.0600
0.320
0.0900
0.270
0.360
0.492
2.06
2.98
Parameter
Value
Error
-------------------------------------A
0,09732
0,00873
B
0,03918
0,00122
-------------------------------------
3,0
2,5
R
SD
N
P
-----------------------------------0 99
0 0886
8
0 000
S/Sp
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-10
10
20
30
40
C/Cp
50
60
70
80
APNDICES
347
__________________________________________________________________
x cido butanoico
C/Cp
S/Sp
2,5
0.0450
0.117
0.143
0.149
0.450
1.25
2.41
2,0
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99943
0,03269
7
<0.0001
1,5
S/Sp
7.00
10.5
11.2
12.6
28.0
70.0
140
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
-0,0608 0,00641
B
0,01787
2,70674E-4
------------------------------------------------------------
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
35
40
C/Cp
x Decanoato de etilo
C/Cp
S/Sp
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
7,86374E-4
0,00003
B
0,05248
7,29016E-4
------------------------------------------------------------
2,0
0.0120
0.0140
0.0260
0.0740
0.100
0.500
1.90
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99952
0,02361
7
<0.0001
------------------------------------------------------------
1,5
S/Sp
0.0910
0.181
0.543
1.09
2.72
9.06
36.3
1,0
0,5
0,0
-5
10
15
C/Cp
20
25
30
T. CEDRN FERNNDEZ
348
__________________________________________________________________
x Succinato de dietilo
C/Cp
S/Sp
14
12
0.240
0.0620
0.133
0.436
1.70
4.10
6.00
9.65
12.8
10
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99859
0,26679
9
<0.0001
------------------------------------------------------------
S/Sp
0.111
0.222
0.444
0.888
22.2
77.7
110
166
222
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,11961
0,01661
B
0,05632
0,00113
------------------------------------------------------------
6
4
2
0
0
50
100
150
200
C/Cp
x - Terpineol
3,0
0.212
0.425
0.678
1.27
9.76
49.7
71.2
98.8
2,5
Parameter
Value
Error
---------------------------------------A
0,02171
0,00312
B
0,02414
6,6844E-5
----------------------------------------
2,0
R
SD
N
P
---------------------------------------0,99998
0,0069
8
<0.
S/Sp
0.0261
0.0307
0.0370
0.0501
0.256
1.24
1.74
2.40
1,5
S/Sp
C/Cp
1,0
0,5
0,0
-0,5
-20
20
40
60
C/Cp
80
100
120
250
APNDICES
349
__________________________________________________________________
x Acetato de 2-feniletilo
C/Cp
S/Sp
Parameter
Value
Error
-------------------------A
0,14123
0,0195
B
0,29329
0,0081
-----------------------------
35
33.7
28.5
19.6
12.8
3.39
1.88
0.545
30
R
SD
N
P
-------------------------------0,9981
0,9018
7
<0.0001
25
20
S/Sp
110
101
67.5
42.6
11.4
6.30
0.298
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
C/Cp
x cido hexanoico
C/Cp
S/Sp
2,5
0.00900
0.055
0.0800
1.10
1.50
2.24
2,0
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99965
0,02734
6
<0.0001
1,5
S/Sp
3.50
4.38
8.76
87.5
122
175
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
-0,02543
0,00584
B
0,01276
1,67652E-4
------------------------------------------------------------
1,0
0,5
0,0
-20
20
40
60
80
C/Cp
100
120
140
160
180
T. CEDRN FERNNDEZ
350
__________________________________________________________________
x Geraniol
C/Cp
S/Sp
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
0,08668
0,00518
B
0,56013
3,99503E-4
------------------------------------------------------------
60
0.230
0.266
0.507
0.747
0.930
50
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,9991 0,03628
7
<0.0001
------------------------------------------------------------
40
S/Sp
0.231
0.289
0.874
1.16
1.45
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
C/Cp
x
2-Feniletanol
C/Cp
S/Sp
2,5
5.00E-3
0.0660
0.178
0.203
0.290
0.370
0.600
1.12
2.32
2,0
Param eter
Value
Error
-----------------------------------------------------------A
-0,10786
0,01592
0,01157
1,89692E-4
------------------------------------------------------------
1,5
R
SD
------------------------------------------------------------
S/Sp
4.45
13.4
26.8
31.2
35.7
40.1
62.4
107
208
0,99906
1,0
0,0341 9
<0.0001
------------------------------------------------------------
0,5
0,0
50
100
C/Cp
150
200
APNDICES
351
__________________________________________________________________
x cido octanoico
C/Cp
3,5
S/Sp
Parameter
3,0
3.30E
4.00E-2
4.60E-2
0.0830
0.230
0.500
1.35
1.96
3.06
Error
-0,22858
0,02479
0,02107
3,5842E-4
------------------------------------------------------------
2,0
SD
-----------------------------------------------------------0,99899
S/Sp
11.5
12.3
13.8
15.3
22.9
30.7
76.6
107
153
2,5
-2
Value
------------------------------------------------------------
0,05215
<0.0001
------------------------------------------------------------
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C/Cp
x cido decanoico
C/Cp
S/Sp
Parameter
Value Error
-----------------------------------------------------------A
-0,4207
0,04415
B
0,02418
3,12446E-4
------------------------------------------------------------
1.00E-2
0.460
1.30
1.97
4.47
5.62
R
SD
N
P
-----------------------------------------------------------0,99967
0,06518
6
<0.0001
------------------------------------------------------------
S/Sp
20.0
36.4
66.8
101
202
250
0
0
50
100
150
C/Cp
200
250
APNDICES
353
__________________________________________________________________
Apndice E.- Rango de concentraciones en vino real y

frmulas de los compuestos voltiles
En este apndice se presentan las frmulas y concentraciones de los
compuestos voltiles que se utilizan a lo largo del trabajo en vinos tinto y blanco.
x Acetato de 3-metil -1-butilo
0-23 ppm (T)
x 3-Metil- 1-butanol
6-490 ppm
x Hexanoato de etilo
tr-3.4 ppm (T)
x 1-Pentanol
0.008-5.1 ppm
x 1-Hexanol
0.3-12 ppm
x Octanoato de etilo
0.2-3.8 ppm (T)
0.005-2.3(B)
x Linalol
libres 100Pg/kg uva
ligados 390
x cido butanoico
0.4-4.8ppm (T)
0.04-1.1(B)
x Decanoato de etilo
tr-0.3ppm (T)
0-2.1(B)
x Succinato de dietilo
1,.5-7.9 ppm
x -Terpineol
libres 5Pg/kg uva
ligados 40
x Acetato de 2-feniletilo
0.02-8ppm (T)
0-18.5(B)
x cido hexanico (Caprico)
0.7-2.6 ppm (T)
0.02-5.7(B)
x Geraniol
libres 5Pg/kg uva
ligados 330
x 2-Feniletanol
4-197 ppm
x cido octanoico ( Caprlico)
0.7-3.7 ppm (T)
x cido decanoico (Cprico)
0-1,.6 ppm (T)
0.03-0.5(B)
0.003-1.3(B)
0.07-20.9(B)
0-4.5(B)
x Rango de concentraciones encontrado en la bibliografa sobre muestras de vino real

(T: tinto, B: blanco). En caso de no especificarse engloban ambos tipos.
T. CEDRN FERNNDEZ
354
__________________________________________________________________
(C7H14O2)
A3M1B
(C8H14O4)
SD
O
O
O
O
O
3-Metil-1-butanol
(C5H12O)
3M1B
D-Terpineol
(C10H20O)
OH
OH
Hexanoato de etilo
(C8H16O2)
HE
Acetato de 2-feniletanol
(C10H12O2) AFE
O
O
1-Pentanol
(C5H12O) 1P
OH
cido hexanoico
1-Hexanol
(C6H14O)
(C6H12O2) AH
O
1H
OH
OH
Octanoato de etilo
(C10H20O2)
2-Feniletanol
OE
(C8H10O)
2FE
OH
O
O
Linalol
Geraniol
(C10H18O) L
(C10H18O)
OH
OH
cido butanoico
(C4H8O2)
cido octanoico
AB
(C8H16O2)
AO
O
OH
OH
Decanoato de etilo
(C12H24O2)
cido decanoico
DE
O
(C10H20O2)
AD
O
x Frmulas desarrolladas de los compuestos voltiles
OH
APNDICES
355
__________________________________________________________________
Apndice F.- Programas BASIC utilizados
El primero utilizado es un programa en el que se mide a una nica longitud,

donde el nmero de datos que pueden almacenarse son 319. Este programa,
denominado Programa 1, se utilizar cuando queramos realizar medidas en las que
no sea nenesario trabajar en condiciones de mxima sensibilidad.
10 LAMBDA 190
20 Y-SCALE 0 TO .5
30 PLOTTER 1
40 MEASURE 3,6,0,600
50 FOR I=1 TO 301
60 IF NMEAS<I THEN 6
70 NEXT I
80 END
*La longitud de onda de medida se fija en la lnea 10 (en nuestro caso a 190 nm)
*En la lnea 40 se determina cuanto tiempo va a durar el registro (600 segundos), el
tiempo del ciclo (6 segundos), el tiempo de integracin (3 segundos) y el tiempo de
retardo (0 segundos)
*En la lnea 50 muestra el nmero de datos que se recogen. Como se mide durante
600 segundos, se hace una medida cada 6 segundos, el nmero de medidas de
absorbancia es de 300.
T. CEDRN FERNNDEZ
356
__________________________________________________________________
En este programa denominado Programa 2, seleccionamos la longitud de

onda de medida en funcin de las caractersticas del compuesto que est siendo
eluido.
10 ERASE STANDARD
20 ABSORBANCE
30 LAMBDA 200
40 PLOTTER 1
50 Y-SCALE 0 TO .1
60 MEASURE .5, .5, 0, 102
70 FOR I=1 TO 205
80 IF NMEAS < I THEN 80
90 NEXT I
100 STOP MEASURE
110 TO STANDARD 1
120 ABSORBANCE
130 LAMBDA 198
140 PLOTTER 1
150 Y-SCALE 0 TO .1
160 MEASURE .5, .5, 0, 42
170 FOR I=1 TO 85
190 NEXT I
200 STOP MEASURE
210 TO STANDARD 2
220 ABSORBANCE
230 LAMBDA 202
240 PLOTTER 1
250 Y-SCALE 0 TO .1
260 MEASURE .5, .5, 0, 42
270 FOR I=1 TO 85
290 NEXT I
300 STOP MEASURE
310 TO STANDARD 3
320 ABSORBANCE
330 LAMBDA 200
340 PLOTTER 1
350 Y-SCALE 0 TO .1
360 MEASURE .5, .5, 0, 54
730 LAMBDA 200

740 PLOTTER 1
750 Y-SCALE 0 TO .1
760 MEASURE .5, .5, 0, 120
770 FOR I=1 TO 241
790 NEXT I
800 STOP MEASURE
810 TO STANDARD 8
820 END
830 GCLEAR
840 SCALE 0, 600, -.01, 5
850 XAXIS 0, 100
860 YAXIS 0, .1
870 PEN 1
880 RECALL STANDARD 1
890 FOR I=1 TO 205
900 X= .5*1
910 Y=VALUE(X)
920 PLOT X,Y
930 NEXT I
950 FOR I=1 TO 85
960 X= .5*1
970 Y=VALUE(X)
980 X=X+102
990 PLOT X,Y
1000 NEXT I
1020 FOR I=1 TO 85
1030 X= .5*1
1040 Y=VALUE(X)
1050 X=X+144
1060 PLOT X,Y
1070 NEXT I
APNDICES
357
__________________________________________________________________
370 FOR I=1 TO 109

390 NEXT I
400 STOP MEASURE
410 TO STANDARD 4
420 ABSORBANCE
430 LAMBDA 204
440 PLOTTER 1
450 Y-SCALE 0 TO .1
460 MEASURE .5, .5, 0, 42
470 FOR I=1 TO 85
490 NEXT I
500 STOP MEASURE
510 TO STANDARD 5
520 ABSORBANCE
530 LAMBDA 196
540 PLOTTER 1
550 Y-SCALE 0 TO .1
560 MEASURE .5, .5, 0, 90
570 FOR I=1 TO 181
590 NEXT I
600 STOP MEASURE
610 TO STANDARD 6
620 ABSORBANCE
630 LAMBDA 196
640 PLOTTER 1
650 Y-SCALE 0 TO .1
660 MEASURE .5, .5, 0, 108
670 FOR I=1 TO 217
690 NEXT I
700 STOP MEASURE
710 TO STANDARD 7
720 ABSORBANCE
1090 FOR I=1 TO 109

1100 X= .5*1
1110 Y=VALUE(X)
1120 X=X+186
1130 PLOT X,Y
1140 NEXT I
1160 FOR I=1 TO 85
1170 X= .5*1
1180 Y=VALUE(X)
1190 X=X+240
1200 PLOT X,Y
1210 NEXT I
1230 FOR I=1 TO 181
1240 X= .5*1
1250 Y=VALUE(X)
1260 X=X+282
1270 PLOT X,Y
1280 NEXT I
1300 FOR I=1 TO 217
1310 X= .5*1
1320 Y=VALUE(X)
1330 X=X+372
1340 PLOT X,Y
1350 NEXT I
1370 FOR I=1 TO 241
1380 X= .5*1
1390 Y=VALUE(X)
1400 X=X+480
1410 PLOT X,Y
1420 NEXT I
1430 PENUP
1440END
T. CEDRN FERNNDEZ
358
__________________________________________________________________
*Las primeras lneas (de la 30 a la 110) son similares al programa 1. Se mide a una
longitud de onda de 200 nm durante un tiempo de 102 segundos, realizando
medidas cada 0.5 segundos. Una vez realizada la medida se almacena la
informacin en una de las memorias (denominadas standard). Estas lneas se
repiten las veces que sea necesario (hasta lmite de memoria) y cada registro se
guarda en un standard distinto.
*Una vez que se ha terminado de medir, el programa termina en la lnea 820.
*Entre las lneas 830 y 870 se fijan las escalas del registro que va a ser presentado
en la pantalla y, a partir de la lnea 880 el programa pinta en orden correlativo cada
standard, dibujando as el cromatograma.
*El programa permite tambin corregir un aspecto formal: en cada estndar la
escala de tiempos empieza en cero, por lo que habr que hacer una correccin para
que asigne a cada dato su tiempo real. Esto se hace en dos etapas: la lnea 900 (y
similares en cada grupo) multiplica el nmero del dato (I) por el tiempo con que se
recoge cada dato (0.5 s) y la lnea 980 suma a cada estndar el tiempo de
cromatograma ya transcurrido.
APNDICES
359
__________________________________________________________________
Apndice G.- Resultados quimiomtricos.

Distinto tipo de vino
En este apndice se muestran los resultados obtenidos de la aplicacin de las
distintas tcnicas quimiomtricas en el estudio de muestras de vino de distinto tipo:
tinto (1), clarete (2), rosado (3) y mezclas (4).
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
2FE
AO
x
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
155414026,488
91131361,262
246545387,750
152585185,919
815322378,631
967907564,550
252801490,938
29800271,262
282601762,200
128638,093
4491868,857
4620506,950
2082172274,583
724138915,167
2806311189,750
2023214,938
1047120,262
3070335,200
1267947,336
1917872,464
3185819,800
1083008,205
778180,345
1861188,550
6108570,943
11546463,607
17655034,550
13785941,783
6638771,417
20424713,200
Anova. (sig. ! 0.05 = no significativa)
gl
Media
cuadrtica
3 51804675,496
16 5695710,079
19
3 50861728,640
16 50957648,664
19
3 84267163,646
16 1862516,954
19
3
42879,364
16
280741,804
19
3 694057424,861
16 45258682,198
19
3
674404,979
16
65445,016
19
3
422649,112
16
119867,029
19
3
361002,735
16
48636,272
19
3 2036190,314
16
721653,975
19
3 4595313,928
16
414923,214
19
Sig.
9,095
,001
,998
,419
45,244
,000
,153
,926
15,335
,000
10,305
,001
3,526
,039
7,423
,002
2,822
,072
11,075
,000
T. CEDRN FERNNDEZ
360
__________________________________________________________________
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
AD
x
Media
cuadrtica
1366689,778
20449,417
Sig.
66,833
,000
Anova. Continuacin.
Variable
3MBA
3M1B
x
Suma de gl
cuadrados
4100069,333 3
327190,667 16
4427260,000 19
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
-4654,50
1977,17
2755,71
4654,50
6631,67
7410,21
-1977,17
-6631,67
778,55
-2755,71
-7410,21
-778,55
5305,42
8612,17
4703,10
-5305,42
3306,75
-602,32
-8612,17
-3306,75
-3909,07
-4703,10
602,32
3909,07
Error
1822,77
1687,56
1646,89
1822,77
1540,52
1495,86
1687,56
1540,52
1327,76
1646,89
1495,86
1327,76
5452,09
5047,66
4926,01
5452,09
4607,86
4474,27
5047,66
4607,86
3971,47
4926,01
4474,27
3971,47
Intervalo 95%
Sig.
Lmite
inferior
,021
-8518,60
,259
-1600,30
,114
-735,53
,021
790,40
,001
3365,90
,000
4239,13
,259
-5554,63
,001
-9897,43
,566
-2036,19
,114
-6246,96
,000
-10581,30
,566
-3593,28
,345
-6252,50
,107
-2088,38
,354
-5739,57
,345
-16863,33
,483
-6461,47
,895
-10087,35
,107
-19312,72
,483
-13074,97
,340
-12328,22
,354
-15145,76
,895
-8882,70
,340
-4510,08
Lmite
superior
-790,40
5554,63
6246,96
8518,60
9897,43
10581,30
1600,30
-3365,90
3593,28
735,53
-4239,13
2036,19
16863,33
19312,72
15145,76
6252,50
13074,97
8882,70
2088,38
6461,47
4510,08
5739,57
10087,35
12328,22
Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).

(sig. ! 0.05 = no significativa)
APNDICES
361
__________________________________________________________________
Variable
HE
1H
OE
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
-2924,50
5561,17
5565,29
2924,50
8485,67
8489,79
-5561,17
-8485,67
4,12
-5565,29
-8489,79
-4,12
-157,67
-30,00
65,48
157,67
127,67
223,14
30,00
-127,67
95,48
-65,48
-223,14
-95,48
-4632,83
19342,17
17806,67
4632,83
23975,00
22439,50
-19342,17
-23975,00
-1535,50
-17806,67
-22439,50
1535,50
Error
1042,34
965,02
941,76
1042,34
880,94
855,40
965,02
880,94
759,27
941,76
855,40
759,27
404,68
374,66
365,63
404,68
342,02
332,10
374,66
342,02
294,78
365,63
332,10
294,78
5138,18
4757,03
4642,39
5138,18
4342,56
4216,66
4757,03
4342,56
3742,81
4642,39
4216,66
3742,81
Intervalo 95%
Sig.
Lmite
inferior
,013
-5134,16
,000
3515,42
,000
3568,84
,013
714,84
,000
6618,17
,000
6676,43
,000
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,000
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,996
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,000
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,000
-10303,15
,996
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,702
-1015,55
,937
-824,25
,860
-709,63
,702
-700,22
,714
-597,38
,511
-480,88
,937
-764,25
,714
-852,71
,750
-529,43
,860
-840,58
,511
-927,17
,750
-720,39
,381
-15525,29
,001
9257,71
,001
7965,25
,381
-6259,62
,000
14769,19
,000
13500,59
,001
-29426,62
,000
-33180,81
,687
-9469,91
,001
-27648,09
,000
-31378,41
,687
-6398,91
Lmite
superior
-714,84
7606,91
7561,73
5134,16
10353,17
10303,15
-3515,42
-6618,17
1613,70
-3568,84
-6676,43
1605,46
700,22
764,25
840,58
1015,55
852,71
927,17
824,25
597,38
720,39
709,63
480,88
529,43
6259,62
29426,62
27648,09
15525,29
33180,81
31378,41
-9257,71
-14769,19
6398,91
-7965,25
-13500,59
9469,91

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
362
__________________________________________________________________
Variable
1H
OE
SD
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
-157,67
-30,00
65,48
157,67
127,67
223,14
30,00
-127,67
95,48
-65,48
-223,14
-95,48
-4632,83
19342,17
17806,67
4632,83
23975,00
22439,50
-19342,17
-23975,00
-1535,50
-17806,67
-22439,50
1535,50
2,00
-217,83
-740,71
-2,00
-219,83
-742,71
217,83
219,83
-522,88
740,71
742,71
522,88
Error
404,68
374,66
365,63
404,68
342,02
332,10
374,66
342,02
294,78
365,63
332,10
294,78
5138,18
4757,03
4642,39
5138,18
4342,56
4216,66
4757,03
4342,56
3742,81
4642,39
4216,66
3742,81
195,39
180,89
176,53
195,39
165,13
160,35
180,89
165,13
142,33
176,53
160,35
142,33
Intervalo 95%
Sig.
Lmite
inferior
,702
-1015,55
,937
-824,25
,860
-709,63
,702
-700,22
,714
-597,38
,511
-480,88
,937
-764,25
,714
-852,71
,750
-529,43
,860
-840,58
,511
-927,17
,750
-720,39
,381
-15525,29
,001
9257,71
,001
7965,25
,381
-6259,62
,000
14769,19
,000
13500,59
,001
-29426,62
,000
-33180,81
,687
-9469,91
,001
-27648,09
,000
-31378,41
,687
-6398,91
,992
-412,20
,246
-601,31
,001
-1114,95
,992
-416,20
,202
-569,90
,000
-1082,63
,246
-165,64
,202
-130,23
,002
-824,60
,001
366,48
,000
402,80
,002
221,16
Lmite
superior
700,22
764,25
840,58
1015,55
852,71
927,17
824,25
597,38
720,39
709,63
480,88
529,43
6259,62
29426,62
27648,09
15525,29
33180,81
31378,41
-9257,71
-14769,19
6398,91
-7965,25
-13500,59
9469,91
416,20
165,64
-366,48
412,20
130,23
-402,80
601,31
569,90
-221,16
1114,95
1082,63
824,60

Continuacin
APNDICES
363
__________________________________________________________________
Variable
1
AH
2FE
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
511,08
791,67
467,76
-511,08
280,58
-43,32
-791,67
-280,58
-323,90
-467,76
43,32
323,90
-312,08
269,17
271,38
312,08
581,25
583,46
-269,17
-581,25
2,21
-271,38
-583,46
-2,21
1472,42
1356,00
497,81
-1472,42
-116,42
-974,61
-1356,00
116,42
-858,19
-497,81
974,61
858,19
Error
264,43
244,81
238,91
264,43
223,48
217,00
244,81
223,48
192,62
238,91
217,00
192,62
168,44
155,94
152,18
168,44
142,36
138,23
155,94
142,36
122,70
152,18
138,23
122,70
648,82
600,69
586,21
648,82
548,35
532,45
600,69
548,35
472,62
586,21
532,45
472,62
Intervalo 95%
Sig.
Lmite
Lmite
inferior superior
,071
-49,48 1071,65
,005
272,69 1310,65
,068
-38,71
974,24
,071
-1071,65
49,48
,227
-193,18
754,35
,844
-503,35
416,71
,005
-1310,65 -272,69
,227
-754,35
193,18
,112
-732,24
84,43
,068
-974,24
38,71
,844
-416,71
503,35
,112
-84,43
732,24
,082
-669,15
44,99
,104
-61,42
599,75
,094
-51,24
594,00
,082
-44,99
669,15
,001
279,47
883,03
,001
290,43
876,50
,104
-599,75
61,42
,001
-883,03 -279,47
,986
-257,89
262,32
,094
-594,00
51,24
,001
-876,50 -290,43
,986
-262,32
257,89
,037
96,98 2847,85
,038
82,60 2629,40
,408
-744,90 1740,52
,037
-2847,85
-96,98
,835
-1278,87 1046,04
,086
-2103,36
154,14
,038
-2629,40
-82,60
,835
-1046,04 1278,87
,088
-1860,10
143,72
,408
-1740,52
744,90
,086
-154,14 2103,36
,088
-143,72 1860,10

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
364
__________________________________________________________________
Variable
AO
AD
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
-649,58
651,67
1559,67
649,58
1301,25
2209,25
-651,67
-1301,25
908,00
-1559,67
-2209,25
-908,00
-59,33
914,67
914,67
59,33
974,00
974,00
-914,67
-974,00
,00
-914,67
-974,00
,00
Error
491,97
455,48
444,50
491,97
415,79
403,74
455,48
415,79
358,37
444,50
403,74
358,37
109,22
101,12
98,68
109,22
92,31
89,63
101,12
92,31
79,56
98,68
89,63
79,56
Intervalo 95%
Sig.
Lmite
Lmite
inferior superior
,205
-1692,52
393,36
,172
-313,91 1617,24
,003
617,36 2501,97
,205
-393,36 1692,52
,006
419,81 2182,69
,000
1353,36 3065,14
,172
-1617,24
313,91
,006
-2182,69 -419,81
,022
148,29 1667,71
,003
-2501,97 -617,36
,000
-3065,14 -1353,36
,022
-1667,71 -148,29
,594
-290,87
172,20
,000
700,31 1129,03
,000
705,47 1123,86
,594
-172,20
290,87
,000
778,32 1169,68
,000
783,99 1164,01
,000
-1129,03 -700,31
,000
-1169,68 -778,32
1,000
-168,66
168,66
,000
-1123,86 -705,47
,000
-1164,01 -783,99
1,000
-168,66
168,66

Continuacin
APNDICES
365
__________________________________________________________________
ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
Extraccin
.626
.792
.961
.807
.893
.729
.389
.826
.923
.736
.915
Comunalidades. Mtodo de extraccin
Componentes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
x
Inicial
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
Autovalor
5.198
2.311
1.088
.905
.506
.401
.297
.128
9.238E-02
6.606E-02
9.060E-03
% Varianza explicada % Varianza acumulada

47.258
47.258
21.005
68.263
9.889
78.152
8.224
86.376
4.602
90.978
3.643
94.621
2.697
97.317
1.160
98.477
.840
99.317
.601
99.918
8.236E-02
100.000
Autovalores.Varianza explicada, varianza acumulada
T. CEDRN FERNNDEZ
366
__________________________________________________________________
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
Componente
1
.689
-.106
.963
7.787E-03
.895
-.693
.244
.884
-.296
.856
.918
Componente
1
.133
-.020
.185
.001
.172
-.133
.047
.170
-.057
.165
.177
2
.090
.381
.036
.250
.009
.079
.249
-.046
.366
-.022
.105
3
-.302
.063
.149
-.633
.276
.427
-.006
.169
.319
-.032
.107
Matriz de coeficientes para el clculo de las puntuaciones en las componentes

(loadings)
Componente
1
2
3
x
3
-.328
6.901E-02
.162
-.688
.301
.465
-6,755E-03
.184
.347
-3,443E-02
.116
Matriz de componentes
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
2
.208
.881
8.276E-02
.577
2.179E-02
.182
.574
-.107
.845
-5,193E-02
.242
1
1.000
.000
.000
2
.000
1.000
.000
Matriz de covarianza de las puntuaciones de las componentes
3
.000
.000
1.000
APNDICES
367
__________________________________________________________________
ANLISIS LINEAL DISCRIMINANTE

Mtodo I: variables juntas
Casos no
ponderados
Vlidos
Excluidos
N Porcentaje
Cdigo de grupo de perdido o fuera de rango

Perdida al menos una variable discriminante
Perdidos o fuera de rango ambos, el cdigo de
grupo y al menos una de las variables
discriminantes.
Total
Total
x
x
100.0
.0
.0
.0
0
20
.0
100.0
Resumen del procesamiento para el anlisis de casos
VINO
1
20
0
0
0
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
Estadsticos del grupo
N vlido (segn lista)

No ponderados
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Ponderados
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
T. CEDRN FERNNDEZ
368
__________________________________________________________________
VINO
3
Total
x
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
Estadsticos del grupo. Continuacin
Ponderados
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
7.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
APNDICES
369
__________________________________________________________________
Resumen de las funciones cannicas discriminantes

Funcin
Autovalor
1
2
3
76.668
7.527
2.803
x
Lambda de
Wilks
.000
.031
.263
Chi-cuadrado
gl
Sig.
90.062
40.008
15.362
33
20
9
.000
.005
.081
1
.737
.612
.345
-.289
1.056
-.758
.918
-.873
.390
.022
1.330
Funcin
2
-.316
-.183
-2.461
-.690
2.256
.091
1.359
-.626
.308
-.167
1.106
3
.616
.081
.543
.056
.239
1.414
.576
-.167
-.905
-.674
-.117
Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas
AD
HE
OE
2FE
x
Correlacin
cannica
.994
.940
.859
Lambda de Wilks
3MBA
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
x
% Varianza
acumulada
88.1
96.8
100.0
Autovalores. Varianza explicada, varianza acumulada y correlacin cannica
Contraste de
las funciones
1 a la 3
2 a la 3
3
x
% Varianza
explicada
88.1
8.7
3.2
1
.404
.322
.191
.005
Funcin
2
-.060
-.243
-.065
.258
3
.040
.185
.116
.096
Matriz de estructura. Correlaciones intra-grupo combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes cannicas tipificadas Variables
ordenadas por el tamao de la correlacin con la funcin
T. CEDRN FERNNDEZ
370
__________________________________________________________________
Funcin
1
.128
.058
.123
.030
.013
-.119
.142
A3M1B
AH
G
3M1B
1H
SD
AO
x
3
.089
.101
.120
.069
-.018
.492
-.253
Matriz de estructura. Continuacin
VINO
1
2
3
4
x
2
-.238
.223
-.158
.118
-.045
.151
-.215
Funcin
1
10.856
10.534
-5.783
-5.715
2
4.269
-3.274
-1.410
1.250
3
-1.269
.960
-1.808
1.545
Funciones en los centroides de los grupos
Estadsticos de clasificacin
Previas
VINO
1
2
3
4
Total
x
.250
.250
.250
.250
1.000
Ponderados
3.000
4.000
6.000
7.000
20.000
Probabilidades previas para los grupos
Procesados
Excluidos
Cdigo de grupo perdido o fuera de rango

Usados en los
resultados
x
Casos utilizados
en el anlisis
No ponderados
3
4
6
7
20
Resumen del proceso de clasificacin
20
0
0
20
APNDICES
371
__________________________________________________________________
Mapa territorial
(Asumiendo que todas las funciones excepto las dos primeras son = 0)
Discriminante cannico
Funcin 2
-12.0
-8.0
-4.0
.0
4.0
8.0
12.0
12.0
41
41
41
41
41
41
8.0
41
41
41
41
41
41
4.0
41
41
41
41
*
41
411111111111111111111111
.0 4444444444444444444444444
422222222222222222222222
33333333333333333333333334444444444442
*
3333333333332
32
32
32
*
-4.0
32
32
32
32
32
32
-8.0
32
32
32
32
32
32
-12.0
32
-12.0
-8.0
-4.0
.0
4.0
8.0
12.0
Funcin de discriminante cannico 1

Smbolos usados en el mapa territorial
Smbolo Grupo Etiqueta
------ ----- -------------------1
1
2
2
3
3
4
4
*
Indica un centroide de grupo
x
Mapa territorial

Mtodo II: variables por pasos
Casos no
ponderados
Porcentaje
T. CEDRN FERNNDEZ
372
__________________________________________________________________
Vlidos
Excluidos

discriminantes.
Total
Total
x
100.0
.0
.0
.0
0
20
.0
100.0
VINO
1
x
20
0
0
0
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Ponderados
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
3.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000
4.000

No ponderados
6
6
6
Ponderados
6.000
6.000
6.000
VINO
3
A3M1B
3M1B
HE
APNDICES
373
__________________________________________________________________
x
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
20
20
20
20
20
20
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
6.000
7.000
7.000
7.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
20.000
Introducidas Lambda de
Wilks
Estadstico
Paso
.074
1
AD
.032
2
SD
.014
3
2FE
x Variables introducidas/eliminadas
gl1
gl2
gl3
1
2
3
3
3
3
16.000
16.000
16.000
F exacta
Estadstico
66.833
22.802
Introducidas
Paso
1
2
3
x
AD
SD
2FE
gl1
gl2
Sig.
3 16.000 .000
6 30.000 .000
F
aproximada
Estadstico gl1
18.440
gl2
Sig.
34.223
.000
Variables introducidas/eliminadas. Continuacin
Paso
1
2
AD
AD
SD
Tolerancia
1.000
.911
.911
F que eliminar
66.833
47.722
6.425
Lambda de Wilks
.341
.074
T. CEDRN FERNNDEZ
374
__________________________________________________________________
.709
.395
.426
AD
SD
2FE
51.218
11.656
6.444
.163
.048
.032
x Variables en el anlisis
Paso
0
x
Tolerancia
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AH
G
2FE
AO
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AH
G
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
.949
.850
.809
.979
.973
.911
.934
.806
.983
.849
.949
.536
.787
.972
.964
.906
.773
Tolerancia F que introducir

mn.
1.000
9.095
1.000
.998
1.000
45.244
1.000
.153
1.000
15.335
1.000
10.305
1.000
3.526
1.000
7.423
1.000
2.822
1.000
11.075
1.000
66.833
.949
3.453
.850
1.872
.809
2.947
.979
.226
.973
.652
.911
6.425
.934
3.057
.806
1.197
.983
2.777
.849
2.835
.867
2.844
.536
4.460
.717
2.663
.887
.229
.880
.597
.874
3.086
.705
1.339
Lambda de
Wilks
.370
.842
.105
.972
.258
.341
.602
.418
.654
.325
.074
.044
.054
.046
.071
.065
.032
.046
.060
.048
.047
.020
.017
.021
.031
.029
.019
.025
Variables no incluidas en el anlisis
Paso
2
Tolerancia
2FE
AO
.426
.842
Tolerancia F que introducir

mn.
.395
6.444
.799
2.125
Lambda de
Wilks
.014
.022
APNDICES
375
__________________________________________________________________
x
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
AH
G
AO
.924
.305
.654
.753
.776
.837
.726
.809
.390
.243
.355
.330
.343
.355
.394
.378
.008
.010
.009
.011
.010
.010
.013
.010
Variables no incluidas en el anlisis. Continuacin
Nmero Lambda
de
variables
Paso
1
2
3
Paso
1
2
3
x
2.833
1.692
2.348
.863
1.309
1.769
.197
1.842
1
2
3
gl1
3
6
.074
.032
.014
gl1
1
2
3
gl2
16.000
30.000
Sig.
2.872E-09
6.195E-10
gl2
gl3
F exacta
Estadstico
66.833
22.802
3
16
3
16
3
16
F aproximada
Estadstico
gl1
gl2
18.440
34.223
Lambda de Wilks

Funcin
Autovalor
1
2
3
28.654
.661
.494
x
% Varianza
explicada
96.1
2.2
1.7
% Varianza
acumulada
96.1
98.3
100.0
Correlacin
cannica
.983
.631
.575
Autovalores.Varianza explicada, varianza acumulada, correlacin cannica
Contraste de las Lambda de

funciones
Wilks
.014
1 a la 3
.403
2 a la 3
.669
3
Chi-cuadrado
gl
Sig.
66.632
14.093
6.226
9
4
1
.000
.007
.013
T. CEDRN FERNNDEZ
376
__________________________________________________________________
x
Lambda de Wilks
SD
2FE
AD
x
1
.652
-.214
.102
.070
.003
-.192
.122
.163
-.124
.229
-.053
Funcin
2
.604
.936
.320
-.310
.454
.168
.176
-.062
.061
.142
-.139
3
-.458
.278
-.280
.249
.891
.794
-.547
.466
-.453
-.448
.233

discriminantes y las funciones discriminantes cannicas tipificadas. Variables
ordenadas por el tamao de la correlacin con la funcin.
VINO
1
2
3
4
x
3
-.472
1.187
-.161
AD
SD
AO
AH
2FE
3M1B
HE
1H
OE
G
A3M1B
x
1
-1.197
.958
1.136
Funcin
2
.935
-.134
.308
1
7.131
5.951
-2.680
-4.160
Funcin
2
-6,915E-02
.283
-1.027
.748
3
1.166
-.954
-.102
.133
Funciones en los centroides de los grupos. Funciones discriminantes cannicas no

tipificadas evaluadas en las medias de los grupos
Previas
VINO
Casos utilizados en el anlisis

No ponderados
Ponderados
APNDICES
377
__________________________________________________________________
1
2
3
4
Total
x
.250
.250
.250
.250
1.000
3
4
6
7
20
3.000
4.000
6.000
7.000
20.000
Procesados
Excluidos

Usados en los resultados
x Resumen del proceso de clasificacin
Mapa territorial
Funcin 2
-12,0
-8,0
-4,0
,0
4,0
8,0
12,0
12,0
42
21
42
21
42
21
20
0
0
20
T. CEDRN FERNNDEZ
378
__________________________________________________________________
42
21
42
21
42
21
8,0
42
21
42
21
42
21
42
21
42
21
42
21
4,0
42
21
442
21
44332
21
4433 32
21
4433
32
21
*
4433
32
21
,0
4433
32
* 2*
4433
32
21
4433 *
32
21
4433
32
21
4433
32
21
4433
32
21
-4,0
4433
32
21
4433
32
21
4433
32
21
4433
32
21
4433
32
21
4433
32
21
-8,0 33
32 21
32 21
32 21
3221
321
321
-12,0
31
-12,0
-8,0
-4,0
,0
4,0
8,0
12,0

------ ----- -------------------1
1
2
2
3
3
4
4
*
x
Mapa territorial
ANLISIS CLUSTER
Anlisis de conglomerados
Casos
Vlidos
Perdidos
N
Porcentaje
N
Porcentaje
100.0
0
.0
20
Total
N
20
Porcentaje
100.0
APNDICES
379
__________________________________________________________________
x
Resumen del procesamiento de los casos. Distancia eucldea al cuadrado usada.

Vinculacin promedio (Inter-grupos)

Etapa Congl. 1 Congl. 2
12
15
1
14
18
2
9
12
3
8
19
4
10
11
5
8
9
6
10
14
7
16
17
8
8
13
9
1
2
10
8
10
11
4
7
12
8
16
13
4
6
14
8
20
15
5
8
16
3
4
17
1
5
18
1
3
19
x
Historial de conglomeracin
Coeficientes Congl. 1
2622993.000
0
4610092.000
0
4767459.500
0
8891830.000
0
10760352,000
0
13192893,000
4
14982228,000
5
17174552,000
0
24700314,000
6
30528672,000
0
44318564,000
9
59762628,000
0
103997872,000
11
139149328,000
12
205499888,000
13
247393136,000
0
284490944,000
0
539024832,000
10
964305536,000
18
Congl.2
0
0
1
0
0
3
2
0
0
0
7
0
8
0
0
15
14
16
17
APNDICES
381
__________________________________________________________________
Apndice H.- Resultados quimiomtricos.

Distinta denominacin de origen.
(estudio preliminar)
En este apartado se muestran los resultados obtenidos de la aplicacin de las
distintas tcnicas quimiomtricas en el estudio preliminar de muestras de vino de
distintas denominaciones de origen: Rioja (R, 1), Navarra (N, 2), La mancha (M,
3), y Valdepeas (V, 4).
Suma de cuadrados
44768448,730
42147126,381
86915575,111
694328486,226
2437974188,274
3132302674,500
14019279,726
26606464,274
40625744,000
3694425,266
3270205,845
6964631,111
33410894,905
211486483,595
244897378,500
3179414,143
4111106,357
7290520,500
68875,730
159592,714
228468,444
913279,361
968466,417
1881745,778
1305897,683
1905116,095
3211013,778
61056367,393
438024688,607
499081056,000
A3M1B Inter-grupos
Intra-grupos
Total
3M1B Inter-grupos
Intra-grupos
Total
HE Inter-grupos
Intra-grupos
Total
1H Inter-grupos
Intra-grupos
Total
OE Inter-grupos
Intra-grupos
Total
SD Inter-grupos
Intra-grupos
Total
AFE Inter-grupos
Intra-grupos
Total
AH Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
G
Intra-grupos
Total
2FE Inter-grupos
Intra-grupos
Total
x Anova. (sig. ! 0.05 = no significativa)
gl Media cuadrtica F
3
14922816,243 4,957
14
3010509,027
17
3
231442828,742 1,329
14
174141013,448
17
3
4673093,242 2,459
14
1900461,734
17
3
1231475,089 5,272
14
233586,132
17
3
11136964,968 ,737
14
15106177,400
17
3
1059804,714 3,609
14
293650,454
17
3
22958,577
2,014
14
11399,480
17
3
304426,454
4,401
14
69176,173
17
3
435299,228
3,199
14
136079,721
17
3
20352122,464 ,650
14
31287477,758
17
Sig.
,015
,305
,106
,012
,547
,040
,158
,022
,050
,596
T. CEDRN FERNNDEZ
382
__________________________________________________________________
AO
AD
x
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
gl Media cuadrtica F Sig.

3
493787,918
,713 ,561
14
692964,895
17
3
108995,077
,867 ,481
14
125749,694
17
Anova. Continuacin
Variable
A1B3M
3M1B
x
Suma de cuadrados
1481363,754
9701508,524
11182872,278
326985,230
1760495,714
2087480,944
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
Error
de medias
-1062,0952 1197,3202
-2995,1667 1325,1907
-4382,1667 1325,1907
1062,0952 1197,3202
-1933,0714 1087,5201
-3320,0714 1087,5201
2995,1667 1325,1907
1933,0714 1087,5201
-1387,0000 1226,8881
4382,1667 1325,1907
3320,0714 1087,5201
1387,0000 1226,8881
-9371,5238 9106,2776
5748,3333 10078,8024
1933,0833 10078,8024
9371,5238 9106,2776
15119,8571 8271,1874
11304,6071 8271,1874
-5748,3333 10078,8024
-15119,8571 8271,1874
-3815,2500 9331,1578
-1933,0833 10078,8024
-11304,6071 8271,1874
3815,2500 9331,1578
Sig.
,390
,040
,005
,390
,097
,009
,040
,097
,277
,005
,009
,277
,321
,577
,851
,321
,089
,193
,577
,089
,689
,851
,193
,689
Intervalo
95%
Lmite
Lmite
inferior
superior
-3630,0917 1505,9012
-5837,4179 -152,9154
-7224,4179 -1539,9154
-1505,9012 3630,0917
-4265,5701 399,4272
-5652,5701 -987,5728
152,9154 5837,4179
-399,4272 4265,5701
-4018,4134 1244,4134
1539,9154 7224,4179
987,5728 5652,5701
-1244,4134 4018,4134
-28902,5468 10159,4992
-15868,5479 27365,2146
-19683,7979 23549,9646
-10159,4992 28902,5468
-2620,0755 32859,7898
-6435,3255 29044,5398
-27365,2146 15868,5479
-32859,7898 2620,0755
-23828,5931 16198,0931
-23549,9646 19683,7979
-29044,5398 6435,3255
-16198,0931 23828,5931

APNDICES
383
__________________________________________________________________
Variable
HE
1H
OE
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
Diferencia
de medias
-1724,8095
419,3333
-481,9167
1724,8095
2144,1429
1242,8929
-419,3333
-2144,1429
-901,2500
481,9167
-1242,8929
901,2500
-553,3810
242,8333
577,5833
553,3810
796,2143
1130,9643
-242,8333
-796,2143
334,7500
-577,5833
-1130,9643
-334,7500
-1132,6190
-1159,5833
-4020,0833
1132,6190
-26,9643
-2887,4643
1159,5833
26,9643
-2860,5000
4020,0833
2887,4643
2860,5000
Error
Sig.
951,3053
1052,9020
1052,9020
951,3053
864,0660
864,0660
1052,9020
864,0660
974,7979
1052,9020
864,0660
974,7979
333,5139
369,1322
369,1322
333,5139
302,9290
302,9290
369,1322
302,9290
341,7500
369,1322
302,9290
341,7500
2682,0548
2968,4907
2968,4907
2682,0548
2436,0972
2436,0972
2968,4907
2436,0972
2748,2883
2968,4907
2436,0972
2748,2883
,091
,696
,654
,091
,026
,172
,696
,026
,371
,654
,172
,371
,119
,521
,140
,119
,020
,002
,521
,020
,344
,140
,002
,344
,679
,702
,197
,679
,991
,256
,702
,991
,316
,197
,256
,316
Lmite
Lmite
inferior
superior
-3765,1565 315,5374
-1838,9169 2677,5836
-2740,1669 1776,3336
-315,5374 3765,1565
290,9057 3997,3800
-610,3443 3096,1300
-2677,5836 1838,9169
-3997,3800 -290,9057
-2991,9835 1189,4835
-1776,3336 2740,1669
-3096,1300 610,3443
-1189,4835 2991,9835
-1268,6970 161,9351
-548,8765 1034,5431
-214,1265 1369,2931
-161,9351 1268,6970
146,4962 1445,9324
481,2462 1780,6824
-1034,5431 548,8765
-1445,9324 -146,4962
-398,2309 1067,7309
-1369,2931 214,1265
-1780,6824 -481,2462
-1067,7309 398,2309
-6885,0544 4619,8163
-7526,3626 5207,1959
-10386,8626 2346,6959
-4619,8163 6885,0544
-5251,8732 5197,9446
-8112,3732 2337,4446
-5207,1959 7526,3626
-5197,9446 5251,8732
-8754,9922 3033,9922
-2346,6959 10386,8626
-2337,4446 8112,3732
-3033,9922 8754,9922

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
384
__________________________________________________________________
Variable
depend.
SD
AFE
2FE
x
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
Diferencia
de medias
-398,1429
-1181,7500
-129,2500
398,1429
-783,6071
268,8929
1181,7500
783,6071
1052,5000
129,2500
-268,8929
-1052,5000
-30,5714
,0000
-160,5000
30,5714
30,5714
-129,9286
541,2500
-361,0476
283,6667
-359,3333
361,0476
644,7143
1,7143
-283,6667
-644,7143
-643,0000
359,3333
-1,7143
643,0000
-3985,8571
71,5000
-797,2500
3985,8571
4057,3571
3188,6071
Error
373,9432
413,8793
413,8793
373,9432
339,6508
339,6508
413,8793
339,6508
383,1778
413,8793
339,6508
383,1778
73,6772
81,5457
81,5457
73,6772
66,9206
66,9206
185,9787
254,5582
281,7443
281,7443
254,5582
231,2139
231,2139
281,7443
231,2139
260,8445
281,7443
231,2139
260,8445
3859,8962
4272,1223
4272,1223
3859,8962
3505,9249
3505,9249
Sig.
Lmite
Lmite
inferior
superior
,305 -1200,1713 403,8856
,013 -2069,4329 -294,0671
,759 -1016,9329 758,4329
,305 -403,8856 1200,1713
,037 -1512,0857 -55,1286
,442 -459,5857 997,3714
,013 294,0671 2069,4329
,037 55,1286 1512,0857
,016 230,6654 1874,3346
,759 -758,4329 1016,9329
,442 -997,3714 459,5857
,016 -1874,3346 -230,6654
,684 -188,5932 127,4504
1,000 -174,8981 174,8981
,069 -335,3981 14,3981
,684 -127,4504 188,5932
,655 -112,9590 174,1018
,073 -273,4590 13,6018
,011 142,3653 940,1347
,178 -907,0206 184,9254
,331 -320,6147 887,9480
,223 -963,6147 244,9480
,178 -184,9254 907,0206
,015 148,8097 1140,6189
,994 -494,1903 497,6189
,331 -887,9480 320,6147
,015 -1140,6189 -148,8097
,027 -1202,4558 -83,5442
,223 -244,9480 963,6147
,994 -497,6189 494,1903
,027 83,5442 1202,4558
,319 -12264,5112 4292,7969
,987 -9091,2910 9234,2910
,855 -9960,0410 8365,5410
,319 -4292,7969 12264,5112
,267 -3462,1038 11576,8181
,378 -4330,8538 10708,0681

Continuacin
APNDICES
385
__________________________________________________________________
Diferencia
de medias
Variable
depend.
2FE
AO
AD
x
1
2
4
1
2
3
2
3
4,
1
3
4
1
2
4
1
2
3
2
3
4
1
3
4
1
2
4
1
2
3
-71,5000
-4057,3571
-868,7500
797,2500
-3188,6071
868,7500
-630,5238
-746,6667
-878,1667
630,5238
-116,1429
-247,6429
746,6667
116,1429
-131,5000
878,1667
247,6429
131,5000
-147,5714
85,0000
-290,0000
147,5714
232,5714
-142,4286
-85,0000
-232,5714
-375,0000
290,0000
142,4286
375,0000
Error
4272,1223
3505,9249
3955,2167
4272,1223
3505,9249
3955,2167
574,4417
635,7905
635,7905
574,4417
521,7626
521,7626
635,7905
521,7626
588,6276
635,7905
521,7626
588,6276
244,7056
270,8394
270,8394
244,7056
222,2649
222,2649
270,8394
222,2649
250,7486
270,8394
222,2649
250,7486
Sig.
,987
,267
,829
,855
,378
,829
,291
,260
,189
,291
,827
,642
,260
,827
,826
,189
,642
,826
,556
,758
,302
,556
,313
,532
,758
,313
,157
,302
,532
,157
Intervalo
95%
Lmite
inferior
-9234,2910
-11576,8181
-9351,8461
-8365,5410
-10708,0681
-7614,3461
-1862,5788
-2110,3016
-2241,8016
-601,5311
-1235,2123
-1366,7123
-616,9683
-1002,9266
-1393,9806
-485,4683
-871,4266
-1130,9806
-672,4126
-495,8928
-870,8928
-377,2698
-244,1393
-619,1393
-665,8928
-709,2821
-912,8022
-290,8928
-334,2821
-162,8022
Lmite
superior
9091,2910
3462,1038
7614,3461
9960,0410
4330,8538
9351,8461
601,5311
616,9683
485,4683
1862,5788
1002,9266
871,4266
2110,3016
1235,2123
1130,9806
2241,8016
1366,7123
1393,9806
377,2698
665,8928
290,8928
672,4126
709,2821
334,2821
495,8928
244,1393
162,8022
870,8928
619,1393
912,8022

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
386
__________________________________________________________________
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Inicial
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
Extraccin
,465
,675
,783
,854
,927
,855
,831
,722
,914
,914
,855
,951
Comunalidades. Mtodo de extraccin
Componente Autovalor % Varianza explicada % Varianza acumulada

4,911
40,929
40,929
1
3,204
26,701
67,630
2
1,630
13,585
81,215
3
,871
7,256
88,470
4
,598
4,980
93,451
5
,329
2,741
96,192
6
,184
1,530
97,722
7
,103
,861
98,583
8
8,523E-02
,710
99,293
9
5,553E-02
,463
99,756
10
2,469E-02
,206
99,962
11
4,577E-03
3,814E-02
100,000
12
x
Autovaloes.Varianza explicada, varianza acumulada
APNDICES
387
__________________________________________________________________
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
3
,130
-,345
-,465
-,431
-,111
,784
,264
-,334
-5,165E-02
,192
,434
,236
Componente
1
-,058
,085
,126
,074
,024
,011
,146
,157
,194
,156
,164
,191
2
,189
-,193
,135
-,228
,296
-,152
,156
,035
,025
-,168
,044
,042
3
,080
-,212
-,285
-,264
-,068
,481
,162
-,205
-,032
,118
,266
,145
Matriz de coeficientes para el clculo de las puntuaciones en las componentes.

(loadings)
Componente
1
2
3
x
2
,605
-,618
,432
-,732
,949
-,487
,500
,111
7,858E-02
-,540
,140
,135
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Componente
1
-,286
,418
,617
,364
,120
5,218E-02
,715
,773
,951
,765
,805
,937
1
1,000
,000
,000
2
,000
1,000
,000
3
,000
,000
1,000
T. CEDRN FERNNDEZ
388
__________________________________________________________________

Mtodo I: variables juntas
Casos no
ponderados
Vlidos
Excluidos

discriminantes.
Total
x
Porcentaje
18
0
0
0
100,0
,0
,0
,0
18
100,0
DO
N
x
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
Ponderados
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
APNDICES
389
__________________________________________________________________
DO
M
Total
x
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
Ponderados
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
T. CEDRN FERNNDEZ
390
__________________________________________________________________

Funcin
Autovalor
1
2
3
81,428
17,098
1,881
x
Lambda de
Wilks
,000
,019
,347
Chi-cuadrado
gl
Sig.
75,292
35,584
9,522
36
22
10
,000
,034
,483
Funcin
2
-1,891
1,782
4,116
-,466
-,306
2,202
,935
-,165
-,658
,200
-,913
-3,427
1
,105
2,466
-,339
,595
3,155
4,328
,552
-,004
-6,407
-2,382
7,442
-2,285
3
,148
1,828
1,169
-,954
-,834
1,247
2,300
,036
2,466
-,936
,854
-5,357
SD
1H
G
A3M1B
HE
AH
x
Correlacin
cannica
,994
,972
,808
Lambda de Wilks
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
% Varianza
acumulada
81,1
98,1
100,0
Autovalores. Varianza explicada. Varianza acumulada. Correlacin cannica
Contraste de
las funciones
1 a la 3
2 a la 3
3
x
% Varianza
explicada
81,1
17,0
1,9
Funcin :
,093
-,039
-,073
,047
-,048
-,100
2
,057
,240
-,001
-,192
,093
,006
3
,071
,107
,367
,366
,319
,268

discriminantes y las funciones cannicas tipificadas. Variables ordenadas por el
tamao de la correlacin con la funcin
APNDICES
391
__________________________________________________________________
SD
1H
G
A3M1B
HE
AH
x
2
,057
,240
-,001
-,192
,093
,006
3
,071
,107
,367
,366
,319
,268
Matriz de estructura. Continuacin
DO
N
R
M
V
x
Funcin :
,093
-,039
-,073
,047
-,048
-,100
Funcin :
-6,757
-3,711
14,720
-3,157
2
-,262
3,540
,153
-6,151
3
-2,500
,776
-,336
,853
Previas
DO
1
2
3
4
Total
x
,250
,250
,250
,250
1,000
Casos utilizados en el anlisis

No ponderados
3
7
4
4
18
Ponderados
3,000
7,000
4,000
4,000
18,000
T. CEDRN FERNNDEZ
392
__________________________________________________________________
Mapa territorial
Funcin 2
-15,0
-10,0
-5,0
,0
5,0
10,0
15,0
15,0
23
23
23
23
23
23
10,0
23
2
23
122
23
1122
23
1122
23
1122
23
5,0
1122
23
1122
23
1122
*
23
11222
23
11122
23
1122
23
,0
*
1122
23
11222222222222222223
1114444444444444443
111444
43
11444
43
11144
43
-5,0
111444
43
11444
*
43
11144
43
111444
43
111444
43
1444
43
-10,0 4
43
43
43
43
43
43
-15,0
43
-15,0
-10,0
-5,0
,0
5,0
10,0
15,0

------ ----- -------------------1
1
2
2
3
3
4
4
*
x
Mapa territorial

Mtodo II: variables por pasos
Casos no
ponderados
Porcentaje
APNDICES
393
__________________________________________________________________
Vlidos
Excluidos

discriminantes.
Total
Total
x
18
0
0
0
100,0
,0
,0
,0
0
18
,0
100,0
DO
1,00
2,00
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
No ponderados
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
Ponderados
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
7,000
No ponderados
4
4
Ponderados
4,000
4,000
x Estadsticos del grupo

DO
3,00
A1B3M
3M1B
T. CEDRN FERNNDEZ
394
__________________________________________________________________
4,00
Total
x
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A1B3M
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
4,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
18,000
Introducidas Eliminadas Lambda de

Wilks
Estadstico gl1
Paso
1
1H
,470
gl2
gl3
14,000
F exacta
Estadstico
5,272
APNDICES
395
__________________________________________________________________
2
3
4
5
6
7
x
1H
AO
HE
gl1
3
6
gl2
14,000
26,000
2
3
4
3
4
5
3
3
3
3
3
3
14,000
14,000
14,000
14,000
14,000
14,000
4,423
Sig.
,012
,003
F aproximada
Estadstico
gl1
gl2
Sig.
5,004
5,106
5,667
11,490
14,235
9
12
9
12
15
29,355
29,395
29,355
29,395
28,007
,000
,000
,000
,000
,000
Variables introducidas/eliminadas. Continuacin
Paso
1
2
3
x
,245
,104
,051
,086
,010
,003
Variables introducidas/eliminadas
Paso
1
2
3
4
5
6
7
x
SD
A3M1B
G
Tolerancia
1,000
,909
,909
,908
,600
,632
,900
,577
,581
,736
,602
,581
,742
1H
1H
SD
1H
SD
A3M1B
1H
SD
A3M1B
G
SD
A3M1B
G
F que
eliminar
5,272
5,644
3,974
2,932
7,334
5,418
2,558
7,010
5,461
3,844
7,191
8,562
4,364
Lambda de Wilks
,564
,470
,180
,295
,245
,086
,148
,126
,104
,241
,271
,180
Variables en el anlisis
Paso
6
Tolerancia
SD
A3M1B
,375
,448
F que
eliminar
7,393
9,801
Lambda de Wilks
,030
,037
T. CEDRN FERNNDEZ
396
__________________________________________________________________
x
G
AO
SD
A3M1B
G
AO
HE
44,959
27,798
11,354
11,654
44,035
23,489
9,489
,133
,086
,012
,012
,037
,021
,010
Variables en el anlisis. Continuacin
Paso
0
x
,038
,040
,189
,365
,033
,040
,170
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
Tolerancia Tolerancia
F que
Lambda de Wilks
mn.
introducir
1,000
1,000
4,957
,485
1,000
1,000
1,329
,778
1,000
1,000
2,459
,655
1,000
1,000
5,272
,470
1,000
1,000
,737
,864
1,000
1,000
3,609
,564
1,000
1,000
2,014
,699
1,000
1,000
4,401
,515
1,000
1,000
3,199
,593
1,000
1,000
,650
,878
1,000
1,000
,713
,868
1,000
1,000
,867
,843
,958
,958
2,570
,295
,490
,490
,845
,393
,955
,955
2,278
,308
,587
,587
1,357
,358
,909
,909
3,974
,245
1,000
1,000
1,596
,343
,956
,956
3,695
,253
,953
,953
2,758
,287
,722
,722
,412
,429
,965
,965
,831
,394
,955
,955
,976
,383
Variables no incluidas en el anlisis
Paso
2
A1B3M
3M1B
HE
F que
Lambda de Wilks
mn.
introducir
,632
,600
5,418
,104
,485
,451
,686
,209
,794
,756
1,823
,168
APNDICES
397
__________________________________________________________________
x
OE
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
3M1B
HE
OE
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
3M1B
HE
OE
AFE
AH
2FE
AO
AD
3M1B
HE
1H
OE
AFE
AH
2FE
AO
AD
,362
,873
,879
,763
,466
,837
,769
,443
,527
,362
,584
,581
,577
,439
,538
,570
,443
,135
,105
,334
,488
,274
,038
,140
,572
,158
,577
,310
,345
,488
,368
,038
,140
2,181
1,699
2,894
3,749
1,667
,655
1,721
,437
1,651
1,657
1,466
2,830
3,844
1,675
1,337
1,754
,226
11,706
8,880
,377
,218
,239
22,940
1,235
,668
11,375
2,558
2,149
1,012
,241
,097
27,798
1,788
,159
,172
,142
,126
,173
,210
,171
,093
,072
,072
,074
,059
,051
,071
,076
,070
,048
,011
,014
,046
,048
,047
,006
,037
,073
,021
,051
,054
,068
,081
,084
,010
,058
Paso
6
,362
,960
,925
,800
,466
,889
,808
,473
,794
,362
,960
,851
,736
,439
,757
,773
,469
,146
,105
,436
,564
,274
,040
,147
,953
,170
,900
,369
,447
,572
,368
,040
,147
3M1B
HE
F que Lambda de Wilks
mn. introducir
,944
,038
,442
,009
,170
,033
9,489
,003
T. CEDRN FERNNDEZ
398
__________________________________________________________________
x
,900
,360
,436
,569
,295
,132
,507
,772
,179
,358
,544
,176
,126
1H
OE
AFE
AH
2FE
AD
3M1B
1H
OE
AFE
AH
2FE
AD
1,864
,723
,677
,052
,931
1,023
3,261
1,849
2,141
1,348
,183
3,041
,984
,006
,008
,008
,010
,008
,008
,001
,002
,002
,002
,002
,001
,002
Nmero Lambda
de
variables
Paso
1
2
3
4
5
6
7
Paso
1
2
3
4
5
6
7
x
,038
,035
,038
,036
,032
,036
,030
,032
,033
,032
,032
,028
,032
1
2
3
4
3
4
5
gl1
3
6
,470
,245
,104
,051
,086
,010
,003
gl2
14,000
26,000
gl1
1
2
3
4
3
4
5
Sig.
gl2
gl3
3
14
3
14
3
14
3
14
3
14
3
14
3
14
F
gl1
Estadstico
F exacta
Estadstico
5,272
4,423
gl2
Sig.
29,355
29,395
29,355
29,395
28,007
4,037E-04
1,519E-04
1,508E-04
4,621E-08
2,551E-09
1,212E-02
3,288E-03
5,004
5,106
5,667
11,490
14,235
9
12
9
12
15
Lambda de Wilks

Funcin Autovalor
1
32,151
% Varianza
explicada
83,9
% Varianza
acumulada
83,9
Correlacin
cannica
,985
APNDICES
399
__________________________________________________________________
5,336
,823
2
3
x
13,9
2,1
gl
Sig.
74,346
30,583
7,504
15
8
3
,000
,000
,057
Funcin 1
,718
,538
1,638
-5,264
4,654
2
1,321
-2,081
-1,107
1,284
,952
3
,595
,962
1,007
,719
-,903
3M1B
A1B3M
2FE
1H
AFE
HE
AD
G
AO
OE
AH
SD
x
Chi-cuadrado
Lambda de Wilks
A1B3M
HE
SD
G
AO
x
,918
,672
Autovalores. Varianza explicada. Varianza acumulada. Correlacin cannica
Contraste de Lambda de
las funciones
Wilks
,003
1 a la 3
,087
2 a la 3
,549
3
x
97,9
100,0
1
-,035
,082
,164
-,038
,080
-,086
,032
-,120
,026
-,148
-,124
,143
Funcin
2
,636
,375
,318
,290
-,054
-,096
,042
,079
,082
-,179
-,135
-,112
3
-,110
,341
,132
-,035
,582
,537
,485
,478
,340
,325
,295
,243

discriminantes y las funciones discriminantes cannicas tipificadas Variables
DO
1
2
Funcin
1
-3,611
-2,923
2
-,858
-1,489
3
-1,659
,667
T. CEDRN FERNNDEZ
400
__________________________________________________________________
9,259
-1,437
3
4
x
-,493
3,742
-9,070E-02
,167
Previas
DO
1
2
3
4
Total
x
,250
,250
,250
,250
1,000
Casos utilizados en
el anlisis
No ponderados
3
7
4
4
18
Ponderados
3,000
7,000
4,000
4,000
18,000
Procesados
Excluidos

Usados en los
resultados
x
18
0
0
18
Resumen del proceso de clasificacin
Mapa Territorial
Funcin 2
-12,0
-8,0
-4,0
,0
4,0
8,0
12,0
APNDICES
401
__________________________________________________________________
12,0
43
43
43
43
43
43
8,0
43
43
43
4
43
1444
43
1114444
43
4,0
1111444
43
1114444
43
1111444
43
1114444
43
11114444
43
1122444444
43
,0
122 22222244444443
11*
22222243
*
122 *
23
112
23
1122
23
122
23
-4,0
112
23
122
23
112
23
122
23
112
23
122
23
-8,0 112
23
122
23
12
23
2
23
23
23
-12,0
23
-12,0
-8,0
-4,0
,0
4,0
8,0
12,0

------ ----- -------------------1
1
2
2
3
3
4
4
*
x
Mapa territorial
ANLISIS CLUSTER
Casos
Vlidos
N
18
Perdidos
Porcentaje
N
Porcentaje
100.0
0
.0
Total
N
18
Porcentaje
100.0
T. CEDRN FERNNDEZ
402
__________________________________________________________________
x
Resumen del procesamiento de los casos. Distancia eucldea al cuadrado usada.


Etapa Congl. 1 Congl. 2
Coeficientes
1
2
4
7079745,000
2
12
14
8820559,000
3
5
12
14008842,000
4
1
6
14748810,000
5
5
11
21011556,000
6
2
3
24956736,000
7
1
16
28112616,000
8
8
18
32287782,000
9
1
5
49595020,000
10
2
8
65368340,000
11
9
15
83872616,000
12
1
2
97615608,000
13
7
9
155576592,000
14
13
17
306476384,000
15
1
7
429574080,000
16
1
13
890403136,000
17
1
10
1477515136,000
x
Congl.1
0
0
0
0
3
1
4
0
7
6
0
9
0
0
12
15
16
Congl.2
0
0
2
0
0
0
0
0
5
8
0
10
11
0
13
14
0
APNDICES
403
__________________________________________________________________
Apndice I.- Resultados quimiomtricos.

Distinta denominacin de origen.
(estudio ampliado)
En este apndice se muestran los resultados obtenidos de la aplicacin de las
distintas tcnicas quimiomtricas en el estudio de muestras de vino de distintas
denominaciones de origen : Navarra (N, 1), Valdepeas (V, 2), Cariena (C, 3),
Rioja (R, 4), La Mancha (M, 5).
Vino A1B3M 3M1B
N1
8.32 223.904
N2
8.239 176.958
N3
8.146 193.312
N4
8.14 158.898
N5
6.076 231.376
N6
6.802 227.888
N7
8.274 353.073
N8
5.42 256.179
N9
8.446 222.973
N10
8.031 212.758
N11
4.648 356.771
N12
8.206 249.75
N13
5.068 342.471
N14
6.657 350.947
N15
8.285 440.135
N16
3.934 409.382
N17
8.307 173.365
N18
8.768 320.91
N19
6.184 346.032
N20
8.369 441.015
N21
8.347 261.43
N22
8.091 370.22
N23
8.406 383.994
N24
8.101 376.719
N25
4.492 536.272
N26
6.548 563.762
N27
6.482 596.254
N28
8.896 575.097
N29
9.723 536.773
x
HE
8.864
6.386
5.885
4.375
5.934
5.328
5.055
4.233
9.012
6.25
3.834
5.888
9.738
0.801
5.954
7.066
3.606
7.892
7.145
4.614
4.532
10.215
8.333
11.574
7.923
3.665
5.455
8.698
8.749
1H
2.023
2.01
1.799
1.659
1.626
2.826
2.057
1.908
3.602
2.379
2.783
2.804
4.172
4.886
2.906
2.692
2.126
2.892
1.983
1.739
2.853
4.584
2.13
3.247
3.13
3.357
2.532
3.494
3.747
OE
7.25
5.458
4.281
2.882
5.307
3.369
3.848
4.258
5.207
3.177
4.148
4.913
6.065
2.361
5.877
4.698
3.515
5.756
5.703
4.001
3.236
7.179
5.899
9.972
7.122
3.11
4.847
5.979
5.911
SD
1.139
1.691
1.571
2.216
2.06
3.62
1.326
1.867
7.398
3.856
6.678
3.692
3.145
5.425
3.872
3.335
0
5.74
1.219
3.219
2.299
9.05
2.733
6.602
3.434
1.527
2.413
1.424
1.61
Cuantificacin en las muestras de vino. Concentraciones en Pg mL-1
T. CEDRN FERNNDEZ
404
__________________________________________________________________
Vino A1B3M 3M1B

N30
6.355 602.365
N31
6.501 215.047
N32
6.977 223.38
N33
4.519 241.319
N34
4.549 265.632
N35
4.396 212.012
N36
4.538 260.92
N37
6.812 137.864
N38
8.425 140.069
N39
6.56 172.126
N40
6.703 111.46
N41
6.053 116.283
N42
6.52 286.35
N43
6.127 220.029
N44
6.184 248.061
N45
6.185 130.406
N46
6.833 275.5
N47
6.634 142.475
N48
6.527 177.078
N49
6.409 171.828
N50
6.075 238.69
N51
6.766 192.875
N52
6.405 241.748
N53
6.14 190.997
N54
6.033 215.748
V55
57.318 274.47
V56
56.62 244.252
V57
55.936 160.68
V58
57.926 207.758
V59
52.992 174.173
V60
58.313 212.578
V61
58.371 192.517
V62
51.435 182.931
V63
57.737 186.403
V64
55.877 223.218
V65
54.54 251.671
V66
50.04 142.714
V67
71.091 347.429
V68
50.354 349.439
x
HE
7.797
6.255
8.257
10.547
7.479
10.174
8.245
5.061
6.463
9.273
2.217
5.11
7.41
6.082
8.342
5.999
7.02
7.264
6.615
7.918
8.657
9.865
4.762
6.729
7.781
8.953
6.016
22.408
11.51
5.988
9.032
6.836
5.226
5.304
11.753
9.965
12.171
21.931
11.905
1H
2.687
1.673
2.634
3.342
2.743
2.383
2.344
2.295
1.829
2.148
1.47
1.513
1.816
1.854
1.476
1.616
1.996
1.706
1.254
2.207
1.962
2.034
1.946
2.315
1.919
1.852
1.598
1.253
1.775
1.878
1.739
1.725
1.936
3.628
2.376
2.379
2.137
2.416
2.732
OE
5.745
6.501
7.205
9.668
5.861
9.858
7.094
3.717
4.133
8.323
3.452
3.66
3.548
4.689
6.997
4.751
13.076
7.137
5.399
6.339
9.212
8.903
3.471
4.322
5.556
9.156
7.365
24.166
12.459
9.009
9.666
8.789
7.859
6.657
11.173
9.772
15.717
25.607
13.367
Cuantificacin en las muestras de vino. Continuacin
SD
0
3.656
2.313
1.562
2.462
4.384
4.041
0
2.812
3.913
2.404
2.438
4.34
1.834
3.219
1.175
1.937
1.706
1.331
1.84
1.82
0
1.09
2.863
2.731
2.176
2.457
1.366
2.558
1.547
2.603
3.167
1.668
3.883
0.855
2.101
4.561
6.816
2.701
APNDICES
405
__________________________________________________________________
Vino A1B3M 3M1B

V69
67.824 422.121
V70
61.615 724.403
V71
108.71 320.136
V72
56.134 244.714
V73
52.888 225.061
V74
57.183 271.006
V75
52.176 262.754
V76
54.984 305.999
V77
57.606 276.571
V78
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V79
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V80
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V81
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V82
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V83
43.35 150.882
V84
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V85
53.651 0
V86
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V87
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V88
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V89
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V90
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V91
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V92
59.652 0
V93
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V94
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V95
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V96
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V97
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V98
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V99
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V100 52.664 136.407
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V106 53.939 126.584
C107 17.295 169.85
HE
1H
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0
0
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0
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0
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OE
34.891
22.874
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12.977
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19.218
24.537
7.441
21.637
5.601
8.435
x Cuantificacin en las muestras de vino. Continuacin
SD
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0
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0
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0
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0
2.19
2.586
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3.198
1.89
3.728
3.198
2.342
3.304
0.973
1.25
T. CEDRN FERNNDEZ
406
__________________________________________________________________
Vino A1B3M 3M1B

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R143 28.71 248.982
R144 23.248 227.321
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HE
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9.145
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1H
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1.691
1.968
2.011
1.958
2.019
1.857
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2.072
1.908
1.913
2.021
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1.823
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1.957
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3.027
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3.431
OE
5.375
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5.434
5.357
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4.387
5.31
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9.396
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5.828
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9.237
7.372
10.464
13.991
13.609
SD
1.456
2.617
0
1.475
2.512
1.516
1.117
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1.94
1.979
1.97
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2.49
1.811
2.024
1.579
2.519
1.844
1.702
3.081
1.886
2.462
2.561
2.612
5.29
3.209
2.269
2.141
2.385
1.709
2.5
APNDICES
407
__________________________________________________________________
Vino A1B3M 3M1B

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R148 27.067 266.507
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R157 24.419 157.102
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R180 32.459 154.667
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R183 27.817 202.031
R184 24.811 197.985
R185 22.866 141.198
HE
1H
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7.532 1.593
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OE
8.595
23.755
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7.512
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6.045
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10.736
SD
3.12
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1.84
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1.497
2.472
2.89
3.359
2.149
1.172
T. CEDRN FERNNDEZ
408
__________________________________________________________________
Vino A1B3M
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R189 25.267
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R192 21.65
R193 26.252
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R195 26.835
R196 25.57
R197 25.571
R198 23.058
R199 28.165
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3M1B
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HE
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OE
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SD
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1.978
0.72
APNDICES
409
__________________________________________________________________
Vino A1B3M
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414
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R185
R186
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R188
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416
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239
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239
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4
238
242
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,000
,609
,180
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,010
APNDICES
417
__________________________________________________________________
D
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T. CEDRN FERNNDEZ
418
__________________________________________________________________
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medias
tpico
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267,28330
277,39408

Continuacin
APNDICES
419
__________________________________________________________________
Variable
HE
1H
OE
4
x
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420
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421
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x Tabla de comparaciones mltiples por Diferencia Mnima Significativa (DMS).

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
422
__________________________________________________________________
Variable
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Continuacin
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423
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inferior superior
-,73675
,77229
,23233
1,91630
-,43796
1,03360
-2,51847 -,90715
-1,89213 -,22097
-1,91630 -,23233
-1,59519 4,22E-02
-3,66916 -1,90509
-1,00849
,44839
-1,03360
,43796
-4,220E-02 1,59519
-2,79192 -1,22933
,93161
2,52954
,90715
2,51847
1,90509
3,66916
1,22933
2,79192
4,1253E-02 ,36563
7,8905E-02 ,43813
5,0088E-02 ,36451
,10482
,44831
-,36563 -4,12E-02
-,12591
,23607
-,15492
,16264
-,10006
,24631
-,43813 -7,89E-02
-,23607
,12591
-,22776
,12532
-,17155
,20765
-,36451 -5,00E-02
-,16264
,15492
-,12532
,22776
-9,9261E-02 ,23780
-,44831
-,10482
-,24631
,10006
-,20765
,17155
-,23780 9,926E-02

Continuacin
T. CEDRN FERNNDEZ
424
__________________________________________________________________
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Extraccin
,814
,629
,807
,792
,672
,580
,266
,538
,731
,670
,751
,456
Comunalidades Mtodo de extraccin
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Inicial
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
Componente
1
-,035
,163
-,018
,122
,001
,182
,057
,170
,216
,201
,188
,166
2
,336
,146
,051
,380
,509
-,065
-,107
-,179
-,082
,136
-,020
-,093
3
,569
-,342
,221
-,357
,040
,216
-,063
-,014
,090
-,064
,354
,101
4
-,135
,024
,850
,069
-,032
,060
,426
-,142
-,049
,090
-,177
,077
Matriz de coeficientes para el clculo de las puntuaciones en las componentes

(loadings)
APNDICES
425
__________________________________________________________________
Componente Autovalor % Varianza explicada

3,874
32,283
1
1,608
13,403
2
1,223
10,195
3
1,001
8,338
4
,978
8,146
5
,814
6,785
6
,691
5,756
7
,535
4,460
8
,407
3,389
9
,346
2,885
10
,304
2,531
11
,220
1,829
12
x
Autovalor. Varianza explicada. Varianza acumulada
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
% Varianza acumulada
32,283
45,686
55,881
64,220
72,366
79,150
84,906
89,365
92,755
95,640
98,171
100,000
Componente
1
-,137
,631
-6,887E-02
,471
3,810E-03
,704
,221
,660
,836
,780
,729
,642
2
,541
,235
8,210E-02
,611
,818
-,104
-,172
-,287
-,132
,219
-3,222E-02
-,150
3
,696
-,418
,270
-,437
4,877E-02
,265
-7,739E-02
-1,748E-02
,110
-7,815E-02
,433
,124
4
-,135
2,360E-02
,850
6,879E-02
-3,159E-02
6,051E-02
,426
-,142
-4,879E-02
9,010E-02
-,177
7,674E-02
T. CEDRN FERNNDEZ
426
__________________________________________________________________
A3M1B
AD
AFE
AH
AO
3M1B
HE
2FE
G
1H
OE
SD
x
Componentes
1
0,0694663
-0,326316
-0,112227
-0,335237
-0,370179
-0,320562
0,0349917
-0,396314
-0,424828
-0,23935
-0,0019359
-0,357576
3
0,629457
0,111901
-0,0699666
-0,0158012
0,391565
-0,378092
0,24436
-0,0706584
0,0991163
-0,395132
0,0440923
0,239246
4
0,135234
0,0767178
0,426103
-0,141693
0,17715
0,0235906
0,849923
0,0900722
-0,048771
0,0687662
-0,0315797
0,0604962
Componente
1
2
3
4
x
2
0,426387
-0,117957
-0,135376
-0,226464
-0,0254068
0,185106
0,0647383
0,172303
-0,103806
0,48214
0,644933
-0,0818844
1
1,000
,000
,000
,000
2
,000
1,000
,000
,000
3
,000
,000
1,000
,000
4
,000
,000
,000
1,000
APNDICES
427
__________________________________________________________________

Mtodo: variables juntas
Casos no
ponderados
Vlidos
Excluidos
discriminantes.
Total
Total
x
VINO
1,00
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
x Estadsticos del grupo
Ponderados
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
N Porcentaje
239
0
5
0
98,0
,0
2,0
,0
5
244
2,0
100,0
T. CEDRN FERNNDEZ
428
__________________________________________________________________
VINO
2
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
52
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
58
58
58
58
58
58
58
58
58
58
58
58
x Estadsticos del grupo. Continuacin
Ponderados
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
52,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
35,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
58,000
APNDICES
429
__________________________________________________________________
VINO
5
Total
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD

No ponderados
42
42
42
42
42
42
42
42
42
42
42
42
239
239
239
239
239
239
239
239
239
239
239
239
Ponderados
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
42,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
239,000
x Estadsticos del grupo. Continuacin

Funcin
Autovalor
1
2
3
4
8,821
1,518
,221
,061
x
% Varianza
explicada
83,1
14,3
2,1
,6
% Varianza
acumulada
83,1
97,3
99,4
100,0
Correlacin
cannica
,948
,776
,425
,240
Autovalores, Varianza explicada. Varianza acumulada. Correlacin cannoca
T. CEDRN FERNNDEZ
430
__________________________________________________________________
Contraste de funciones
1 a la 4
2 a la 4
3 a la 4
4
x
Funcin :1
,990
-,145
,090
,223
-,116
,013
-,098
-,190
-,527
-,240
,771
-,014
Sig.
,000
,000
,000
,135
2
,314
,480
,126
-,149
,104
-,472
,089
,366
1,394
-,008
-1,522
,167
3
,012
,704
,065
-,231
,124
,274
,518
-,069
-,271
,044
,394
,037
4
,000
-,454
,070
,178
,013
,290
,029
,137
-,553
1,055
-,571
-,024
A3M1B
OE
3M1B
2FE
AO
SD
AFE
G
AD
AH
1H
HE
x
gl
48
33
20
9
Lambda de Wilks
A3M1B
3M1B
HE
1H
OE
SD
AFE
AH
G
2FE
AO
AD
x
Lambda de Wilks Chi-cuadrado

,031
795,644
,307
271,355
,772
59,414
,942
13,647
Funcin
1
,887
,100
-,077
-,017
,072
-,018
-,049
-,079
-,056
-,097
-,027
,029
2
,372
,130
,227
,124
-,191
-,092
,012
,266
,082
,123
,080
,071
3
,082
,042
,723
,597
,559
,514
,501
,394
,316
,286
,213
,022
4
,150
,072
-,029
,466
-,399
,167
,100
-,337
-,052
-,192
,262
,107
Matriz de estructura Correlaciones intra-grupo combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes cannicas tipificadas. Variables
APNDICES
431
__________________________________________________________________
VINO
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
x
Funcin
1
-3,971
3,756
-1,870
-,777
2,899
2
,419
1,617
-,597
,104
-2,166
3
,594
7,800E-02
-,700
-,431
,347
4
3,334E-02
,103
,418
-,362
-1,724E-02
ANLISIS CLUSTER
Casos
Vlidos
N
239
x
Porcentaje
98,0
Perdidos
N
5
Porcentaje
2,0
Total
N
244
Porcentaje
100,0
Resumen del procesamiento de los casos Distancia eucldea al cuadrado usada.


Etapa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
x
Congl. 1
196
167
122
122
85
120
125
31
138
221
125
203
121
121
160
Congl. 2
197
168
123
124
96
126
123
54
139
228
127
233
122
130
166
coeficientes
1,000E-06
1,082E-02
,448
1,352
2,928
3,678
3,675
7,648
8,184
9,551
9,610
9,714
11,494
11,986
13,657
Congl. 1
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
13
0
Congl. 2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
T. CEDRN FERNNDEZ
432
__________________________________________________________________
Etapa
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
x
Congl. 1
170
108
159
156
155
131
38
102
178
204
108
107
160
116
214
209
12
153
165
190
85
187
167
2
153
114
169
40
108
112
1
188
55
34
109
2
107
145
203
Congl. 2
196
120
198
158
156
135
47
105
191
207
111
132
182
121
222
213
44
161
170
192
92
201
172
17
179
119
185
41
125
149
32
200
77
36
190
49
137
146
226
coeficientes
14,099
14,962
15,907
16,190
17,350
18,950
20,329
20,480
20,630
21,674
21,855
22,045
23,178
23,762
24,053
24,460
25,080
26,073
26,477
26,949
27,208
27,657
27,797
28,813
29,452
29,596
32,177
32,681
32,835
32,929
32,945
33,098
34,129
34,631
36,123
36,277
36,536
38,014
38,643
Historial de conglomeracin Continuacin
Congl. 1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
0
15
0
0
0
0
0
0
0
5
0
2
0
33
0
0
0
26
0
0
0
0
0
0
39
27
0
12
Congl. 2
1
7
0
0
19
0
0
0
0
0
0
0
0
14
0
0
0
0
16
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
0
0
0
0
0
35
0
0
0
0
APNDICES
433
__________________________________________________________________
Etapa
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
x
Congl. 1
64
171
218
155
165
31
112
162
211
3
116
55
152
209
25
2
8
210
203
107
153
219
210
4
203
159
62
208
58
171
6
7
93
193
59
174
8
31
33
Congl. 2
73
195
225
160
183
43
113
164
224
51
128
74
154
241
29
48
21
221
214
109
169
236
244
115
223
178
78
235
60
180
9
11
104
194
204
189
34
35
52
coeficientes
40,512
41,045
41,743
42,658
43,216
43,967
44,382
45,256
46,103
47,047
47,771
49,829
49,944
50,599
51,918
52,445
53,133
54,166
54,915
56,769
59,186
61,934
62,245
63,817
64,370
65,656
65,782
66,012
66,962
67,674
68,457
69,136
69,869
72,867
73,131
75,050
75,125
78,730
80,280
Historial de conglomeracin. Continuacin
Cong . 1
0
0
0
20
34
8
45
0
0
0
29
48
0
31
0
51
0
0
54
52
40
0
72
0
73
18
0
0
0
56
0
0
0
0
0
0
71
60
0
Congl. 2
0
0
0
28
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
30
50
42
0
0
0
0
24
0
0
0
0
0
0
0
0
25
0
49
0
0
T. CEDRN FERNNDEZ
434
__________________________________________________________________
Etapa
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
x
Congl. 1
165
22
56
162
138
171
15
217
1
12
80
131
155
107
83
89
108
229
231
107
209
152
3
131
211
208
59
38
165
114
83
210
153
210
Congl. 2
202
24
65
163
159
181
20
219
5
33
216
144
171
176
205
90
116
239
232
193
218
167
134
188
237
215
62
45
187
177
206
227
155
217
coeficientes
81,475
87,975
89,027
89,333
90,037
92,102
92,543
93,284
93,878
95,259
99,887
99,990
102,924
104,323
104,724
107,018
108,190
108,198
113,807
115,501
119,645
122,431
122,884
124,208
125,531
125,737
127,664
128,245
131,313
133,555
135,906
136,328
137,387
138,309
Congl. 1
59
0
0
62
9
84
0
0
46
32
0
21
58
74
0
0
44
0
0
107
68
67
64
105
63
82
89
22
94
41
108
77
75
125
Congl. 2
0
0
0
0
80
0
0
76
0
93
0
0
99
0
0
0
65
0
0
88
57
38
0
47
0
0
81
0
37
0
0
0
106
101
APNDICES
435
__________________________________________________________________
Etapa
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
x
Congl. 1
7
10
112
145
76
83
2
136
211
107
40
75
95
38
94
106
112
208
56
3
26
75
1
114
12
42
231
58
210
98
59
95
208
2
66
107
141
8
Congl. 2
19
31
138
148
79
203
39
175
234
152
118
81
242
108
102
209
174
220
72
53
28
238
10
162
50
140
240
64
229
103
210
106
212
4
94
173
143
46
coeficientes
138,449
143,479
151,149
151,882
152,278
152,723
153,558
155,101
162,061
166,831
167,343
175,992
176,322
177,710
177,716
178,484
184,667
187,374
192,137
193,896
211,075
211,443
213,555
218,372
221,471
235,504
238,909
243,957
248,705
251,797
261,119
263,737
266,721
272,070
284,428
284,469
305,265
312,918
Cong.1
86
0
61
53
0
124
70
0
118
113
43
0
0
121
0
0
130
119
96
116
0
139
102
123
103
0
112
83
127
0
120
140
145
134
0
137
0
91
Congl. 2
0
92
98
0
0
79
0
0
0
115
0
0
0
110
23
114
90
0
0
0
0
0
129
97
0
0
0
55
111
0
156
143
0
78
142
0
0
0
T. CEDRN FERNNDEZ
436
__________________________________________________________________
Etapa
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
x
Congl. 1
131
1
18
56
66
38
3
59
83
7
208
23
8
2
66
61
38
12
40
1
3
58
98
18
55
42
8
57
67
22
8
59
57
97
7
58
26
2
15
Congl. 2
186
6
142
75
211
114
112
231
93
13
230
147
136
107
83
208
153
141
117
131
165
80
99
151
56
199
145
66
68
23
12
89
95
101
18
61
27
3
16
coeficientes
322,879
331,669
342,087
342,337
347,413
357,773
363,525
364,221
370,474
371,727
380,634
401,183
409,976
439,309
442,449
454,613
458,172
464,043
477,462
500,854
504,667
557,794
565,183
596,820
601,495
644,023
649,400
690,716
715,954
735,172
741,852
761,982
794,741
803,094
818,736
825,683
830,267
910,932
1021,802
Congl. 1
117
150
0
146
162
141
147
158
133
128
160
0
165
161
170
0
171
152
138
167
172
155
157
168
66
153
178
0
0
95
192
173
193
0
175
187
148
179
100
Congl. 2
0
85
0
149
136
151
144
154
87
0
0
0
135
163
174
176
126
164
0
166
122
104
0
0
169
0
131
180
0
177
183
109
159
0
189
181
0
186
0
APNDICES
437
__________________________________________________________________
Etapa
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
x
Congl. 1
82
59
8
38
8
2
85
7
7
1
25
97
2
38
67
15
1
2
67
2
15
7
2
88
1
7
1
25
86
1
1
1
1
1
Congl. 2
84
63
150
57
42
59
110
14
22
8
26
98
58
40
76
82
55
38
71
97
69
67
243
91
2
15
88
70
87
85
7
86
25
100
coeficientes
1061,981
1123,253
1130,949
1172,764
1322,487
1356,718
1547,614
1695,449
1853,544
1905,165
1984,754
2015,787
2137,896
2151,865
2265,172
2305,924
2682,922
3040,644
3576,656
4673,364
5573,840
5710,597
7391,234
7550,040
9327,520
9852,014
11988,398
31305,543
36433,391
36566,426
41673,660
77638,047
164442,656
110006320,0
00
Congl. 1
0
197
196
182
207
203
36
200
212
185
69
199
210
208
194
204
214
217
219
222
220
213
224
0
221
226
229
215
0
231
234
235
236
237
Congl. 2
0
0
0
198
191
206
0
0
195
209
202
188
201
184
132
205
190
218
0
216
0
223
0
0
227
225
228
0
0
211
230
233
232
0
T. CEDRN FERNNDEZ
438
__________________________________________________________________
Apndice J.- Tablas y figuras
TABLAS
INTRODUCCIN
x
Tabla 1.1: Componentes del vino de sabor cido ..........................................18
x
Tabla 1.2: Componentes del vino de sabor salado.........................................19
x
Tabla 1.3: Descripcin aromtica del vino, umbrales olfatorios y

contribucin al aroma del vino .......................................................................28
x Tabla 3-1: Caractersticas de los compuestos utilizados................................59
ENSAYOS PREVIOS Y OPTIMIZACIN
x Tabla 4-1: Compuestos seleccionados...........................................................68
x Tabla 4-2: Condiciones cromatogrficas iniciales para la optimizacin .......76
x Tabla 4-3: Programas de temperatura con una rampa....................................79
x Tabla 4-4: Programas de temperatura con dos rampas ..................................79
x Tabla 4-5: Eleccin de volumen de muestra a utilizar...................................81
x Tabla 4-6: Condiciones ptimas de trabajo ...................................................82
x Tabla 4-7: Concentraciones de las disoluciones empleadas para las rectas
de calibrado
...........................................................................85
x Tabla 4-8: Caractersticas analticas en DM de los compuestos voltiles .....86
ELLd
x Tabla 6-1: Condiciones iniciales para la optimizacin en ELLd .................101
APNDICES
439
__________________________________________________________________
x Tabla 6-2: Rendimientos (%) con distintos disolventes en ELLd .............. 102
x Tabla 6-3: Rendimientos (%) con distintos volmenes de muestra en
ELLd
......................................................................... 104
x Tabla 6-4: Condiciones ptimas en ELLd .................................................. 106
x Tabla 6-5: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLd) ............. 106
x Tabla 6-6: Caractersticas analticas ELLd ................................................. 107
x Tabla 6-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLd.
Rectas de calibrado
......................................................................... 108
x Tabla 6-8: Cuantificacin en vino real mediante ELLd.
Patrn interno
......................................................................... 109
x Tabla 6-9: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLd)..... 110
ELLc
x Tabla 7-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes
en (ELLc)
......................................................................... 115
x Tabla 7-2: Rendimientos de extraccin (%) a diferentes tiempos
en (ELLc)
......................................................................... 117
x Tabla 7-3: Condiciones ptimas en (ELLc) ................................................ 119
x Tabla 7-4: Rendimientos en las condiciones ptimas ................................. 119
x Tabla 7-5: Caractersticas analticas en ELLc............................................. 120
x Tabla 7-6: Cuantificacin en vino real mediante ELLc.
Rectas de calibrado
......................................................................... 121
x Tabla 7-7: Cuantificacin en vino real mediante ELLc.
Patrn interno
......................................................................... 121
x Tabla 7-8: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin (ELLc)..... 122
T. CEDRN FERNNDEZ
440
__________________________________________________________________
ELLus
x Tabla 8-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes
en ELLus
.........................................................................130
x Tabla 8-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintas sales en ELLus .133
x Tabla 8-3: Variables y niveles considerados para el diseo factorial ..........134
x Tabla 8-4: Matriz experimental del 23+2 ....................................................135
x Tabla 8-5: Valor de los coeficientes de ajuste en el diseo 23 + 2 ...............135
x Tabla 8-6: Resultados de significacin y direccin de los parmetros
obtenidos en el diseo factorial ....................................................................136
x Tabla 8-7: Condiciones ptimas en ELLus..................................................137
x Tabla 8-8: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (ELLus).............138
x Tabla 8-9: Caractersticas analticas ELLus.................................................138
x Tabla 8-10: Cuantificacin en vino real mediante ELLus.
Rectas de calibrado
.........................................................................139
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA Y DETECTOR FID
x Tabla 9-1: Condiciones iniciales de trabajo ................................................146
x Tabla 9-2: Rendimientos de extraccin (%) con distintos disolventes en
microextraccin por desmezcla y detector FID ............................................147
x Tabla 9-3: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de
diclorometano en microextraccin por desmezcla y detector FID ..............149
x Tabla 9-4: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos con las sales
estudiadas en microextraccin por desmezcla y detector FID .....................151
x Tabla 9-5: Rendimientos de extraccin (%) segn el tiempo de agitacin
empleado en microextraccin por desmezcla y detector FID .......................153
APNDICES
441
__________________________________________________________________
x Tabla 9-6: Condiciones ptimas de trabajo en microextraccin por

desmezcla
......................................................................... 155
x Tabla 9-7: Rendimientos en las condiciones ptimas en microextraccin
por desmezcla
......................................................................... 155
x Tabla 9-8: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla.... 156
x Tabla 9-9: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por
desmezcla. Rectas de calibrado.................................................................... 157
x Tabla 9-10: Cuantificacin en el vino real mediante microextraccin por
desmezcla. Patrn interno ......................................................................... 158
x Tabla 9-11: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin
(microextraccin por desmezcla) ................................................................. 159
x Tabla 9-12: Rendimientos de extraccin (%) obtenidos por adicin
estndar en muestras de vino ....................................................................... 160
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA Y DETECTOR EAM-UV-Vis
x Tabla 10-1: Condiciones de trabajo en microextraccin por desmezcla
en CG-EAM UV-Vis
......................................................................... 168
x Tabla 10-2: Factores y niveles considerados en el diseo de
Plackett-Burman
......................................................................... 172
x Tabla 10-3: Matriz experimental con el diseo de Plackett- Burman......... 173
x Tabla 10-4: Resultados obtenidos en el diseo de Plackett- Burman ......... 174
x Tabla 10-5: Matriz experimental y resultados del diseo 22+2................... 176
x Tabla 10-6 Valor de los coeficientes de ajuste en el diseo 22 + 2 en
CG-EAM UV-Vis
......................................................................... 177
x Tabla 10-7: Condiciones ptimas para la microextraccin por desmezcla
en CG-EAM UV-Vis
......................................................................... 177
T. CEDRN FERNNDEZ
442
__________________________________________________________________
x Tabla 10-8: Concentraciones de las disoluciones para el estudio de

calibracin en CG-EAM UV-Vis .................................................................179
x Tabla 10-9: Caractersticas analticas en microextraccin por desmezcla
en CG-EAM UV-Vis
.........................................................................179
x Tabla 10-10: Rendimientos de extraccin (%) en microextraccin por
desmezcla en CG-EAM UV-Vis...................................................................180
SPE
x Tabla 11-1: Rendimientos de extraccin (%) con distintos volmenes de
muestra en SPE
.........................................................................189
x Tabla 11-2: Condiciones ptimas en SPE....................................................192
x Tabla 11-3: Rendimientos (%) en las condiciones ptimas (SPE)...............192
x Tabla 11-4: Caracteristicas analticas en SPE..............................................193
x Tabla 11-5: Cuantificacin en vino real mediante en SPE.
Rectas de calibrado
.........................................................................194
x Tabla 11-6: Cuantificacin en vino real mediante en SPE.
Patrn interno
.........................................................................195
x Tabla 11-7: Comparativa con ambos mtodos de cuantificacin ................196
x Tabla 11-8: Efecto de la matriz en los rendimientos de extraccin (SPE) ..197
SPME
x Tabla 12-1: Factores de preconcentracin con SPME en inyeccin directa y
espacio de cabeza
.........................................................................214
x Tabla 12-2: Factores de preconcentracin para tres inyecciones sucesivas
diferentes en el mismo vial en SPME .........................................................215
x Tabla 12-3: Valores de las variables en el diseo Placket-Burman
en SPME
.........................................................................219
APNDICES
443
__________________________________________________________________
x Tabla 12-4: Matriz experimental con el diseo de Plackett-Burman

en SPME
......................................................................... 220
x Tabla 12-5: Pesos de las variables en el diseo de Plackett-Burman
en SPME
......................................................................... 221
x Tabla 12-6: Condiciones ptimas en SPME .............................................. 223
x Tabla 12-7: Caracterstica analticas HS-SPME ......................................... 224
x Tabla 12-8: Cuantificacin en vino real mediante SPME.
Rectas de calibrado
......................................................................... 225
ESTUDIO COMPARATIVO
x Tabla 13-1: Factores de preconcentracin de las diferentes tcnicas
estudiadas
......................................................................... 230
x Tabla 13-2: Ventajas e inconvenientes de los mtodos de extraccin
utilizados
......................................................................... 231
ESTUDIO QUIMIOMTRICO
Con vinos de distinta tipo

x Tabla 16-1: Valores de las reas de los distintos tipos vinos de vino
(c, r, m, t)
......................................................................... 254
x Tabla 16-2: Variables significativas en los distintos grupos de vinos ........ 256
x Tabla 16- 3: Autovalores, varianza explicada y acumulada para las 11
componentes
......................................................................... 258
x Tabla 16-4: Matriz de componentes............................................................ 258
x Tabla 16-5: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales sobre
las variables antiguas que definen las variables nuevas............................... 259
x Tabla 16-6: Autovalores y correlacin cannica de las funciones
discriminantes
......................................................................... 263
T. CEDRN FERNNDEZ
444
__________________________________________________________________
x Tabla 16-7: Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes

cannicas
........................................................................263
x Tabla 16-8: Funciones en los centroides de los grupos ...............................264
cannicas por etapas
.........................................................................265
x Tabla 16-10: Autovalores de cada funcin ..................................................266
Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin de origen

x Tabla 16-11: Valores de las reas de los picos cromatogrficos de los
vinos de distintas denominaciones de origen................................................270
x Tabla 16-12: Variables significativas en los distintos grupos de vinos .......272
x Tabla 16-13: Autovalores, varianza explicada y acumulada para las 12
componentes
.........................................................................273
x Tabla 16-14: Matriz de componentes ..........................................................274
x Tabla 16-15: Loadings o coeficientes de las combinaciones lineales sobre
las variables antiguas que definen las variables nuevas................................275
discriminantes
.........................................................................277
cannicas
.........................................................................278
x Tabla 16-18: Funciones en los centroides de los grupos .............................279
cannicas
.......................................................................280
x Tabla 16-20: Autovalores para cada funcin ...............................................280
Estudio ampliado con vinos de distinta denominacin de origen

x Tabla 16-21: ANOVA para el estudio ampliado .........................................283
APNDICES
445
__________________________________________________________________
x Tabla 16-22: Autovalores, varianza explicada y acumulada para las 12

componentes
......................................................................... 285
x Tabla 16-23: Loadings para las cuatro componentes.................................. 285
discriminantes
......................................................................... 288
cannicas
......................................................................... 289
x Tabla 16-26: Funciones en los centroides de los grupos............................. 290
T. CEDRN FERNNDEZ
446
__________________________________________________________________
FIGURAS
INTRODUCCIN
x
Figura 1-1: Mapa de las Denominaciones de Origen en Espaa ...................12
x
Figura 1-2: Mapa de las subzonas en la DOCa Rioja....................................16
x Figura 3-1: Cromatgrafo de gases HP 5890 ................................................52
x Figura 3-2: Cromatgrafo de gases Varian CP-3800 ....................................52
x Figura 3-3: Cromatgrafo de gases con detector Masas HP GDC Plus ........53
x Figura 3-4: Cromatgrafo de gases con detector masas HP 5989B ..............53
x Figura 3-5: Cromatgrafo de gasesEspectrofotmetro de absorcin molecular
UV-Visible
...........................................................................54
ENSAYOS PREVIOS Y OPTIMIZACIN
x Figura 4-1a: Cromatograma obtenido por CG-MS para muestras de vino....65
x Figura 4-1b: Cromatograma obtenido por CG-MS. Ampliacin por zonas ..66
x Figura 4-2: Cromatograma obtenido para el vino sinttico por CG-Masas ...71
x Figura 4-3: Cromatograma obtenido por CG-FID para el patrn interno......72
x Figura 4-4: Programa de temperatura sencillo...............................................78
x Figura 4-5: Programa de temperatura mltiple.............................................78
x Figura 4-6: Cromatograma de vino sinttico en las condiciones ptimas ....82
PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS
x Figura 5-1: Procedimientos de extraccin empleados ...................................93
APNDICES
447
__________________________________________________________________
ELLd
x Figura 6-1: Esquema de trabajo en ELLd ..................................................... 99
con los distintos disolventes en ELLd.......................................................... 103
con distintos volmenes de muestra en ELLd.............................................. 105
x Figura 6-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLd...................................... 110
ELLc
x Figura 7-1: Extractores en continuo para disolventes menos (a) y ms (b)
densos que la muestra
......................................................................... 114
con los distintos disolventes en ELLc.......................................................... 116
a diferentes tiempos en ELLc....................................................................... 118
x Figura 7-4: Cromatograma. Vino sinttico, ELLc ...................................... 123
ELLus
x Figura 8-1 : Representacin grfica de los rendimientos de extraccin (%)
con distintos disolventes en ELLus.............................................................. 131
con distintas sales en ELLus ........................................................................ 133
x Figura 8-3 : Cromatograma. Vino sinttico, ELLus ................................... 140
con distintos disolventes en microextraccin por desmezcla y detector
FID
......................................................................... 148
T. CEDRN FERNNDEZ
448
__________________________________________________________________

con distintos volmenes de diclorometano en microextraccin por
desmezcla y detector FID .........................................................................149
obtenidos con las sales estudiadas en microextraccin por desmezcla y
detector FID
.........................................................................152
segn el tiempo de agitacin empleado en microextraccin por desmezcla y
detector FID
.........................................................................154
x Figura 9-5: Cromatograma. Vino tinto, microextraccin por desmezcla ....161
MICROEXTRACCIN POR DESMEZCLA CON DETECTOR EAM-UVVis
x Figura 10-1: Espectros de absorcin molecular en fase gas de los
compuestos
.........................................................................171
x Figura 10-2: Cromatograma. Voltiles en ter de petrleo, microextraccin
por desmezcla en CG-EAM UV-Vis ............................................................178
SPE
x Figura 11-1: Estructura qumica del relleno del cartucho (ODS)................184
x Figura 11-2: Fase slida (a) y elucin selectiva en SPE y smbolos (b)......185
x Figura 11-3: Pasos en SPE .........................................................................186
x Figura 11-4: Cartuchos comerciales para SPE ............................................187
con distintos volmenes de muestra en SPE.................................................190
x Figura 11-6: Representacin grfica del volumen de elucin utilizado
en SPE (3+2+2)
.........................................................................194
x Figura 11-7: Cromatograma. Vino sinttico, SPE .......................................198
APNDICES
449
__________________________________________________________________
SPME
x Figura 12-1: Equilibrio de la fibra en tres fases de la fibra en muestras
lquidas
......................................................................... 202
x Figura 12-2: Fibra con soporte para SPME ................................................ 205
x Figura 12-3: Fibra ensamblada al cromatgrafo con el sistema de
agitacin
......................................................................... 205
x
Figura 12-4: Fibras comerciales y propiedades ......................................... 206
x Figura 12-5: Proceso de adsorcin y desorcin en la fibra ......................... 207

x Figura 12-6: SPME en (a) espacio de cabeza (b) inyeccin directa ........... 208
x Figura 12-7: Representacin grfica de los factores de preconcentracin
para tres inyecciones sucesivas diferentes en el mismo vial en SPME....... 216
x Figura 12-8: Cromatograma. Fibra roja, SPME ......................................... 217
x Figura 12-9: Cromatograma. Fibra naranja, SPME .................................... 218
x Figura 12-10: Resultados Plakett-Burman.................................................. 222
x Figura 12-11: Cromatograma. Vino sinttico, SPME................................. 225
ESTUDIO QUIMIOMTRICO
Con vinos de distinto tipo

x Figura 16-1: Grfico de sedimentacin ...................................................... 257..
x Figura 16-2: Grfico de puntuacin sobre las dos primeras componentes . 260
x Figura 16- 3: Grfico de puntuacin componente 1 frente a componente 3261
x Figura 16-4: Grfico de puntuacin componente 2 frente a componente 3 262
x Figura 16-5: Grfico de dispersin de los objetos sobre el plano de las dos
primeras funciones discriminantes............................................................... 265
T. CEDRN FERNNDEZ
450
__________________________________________________________________
x Figura 16-6: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 2 ......267

x Figura 16-7: Representacin de funciones discriminantes: 1 frente a 3 ......268
x Figura 16-8: Anlisis cluster para los distintos tipos de vino ......................269
Estudio preliminar con vinos de distinta denominacin de origen

x Figura 16-9: Grfico de sedimentacin .......................................................273
x Figura 16-10: Grfico de dispersin sobre las dos primeras componentes .275
x Figura 16-11: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 3..............276
x Figura 16-12: Grfico de dispersin sobre las componentes 2 y 3..............277
x Figura 16-13: Grfico de dispersin sobre las dos primeras funciones.......276
x Figura 16-14: Grfico de dispersin sobre las componentes 1 y 2 mediante
estimacin por etapas
.........................................................................281
x Figura 16-15: Anlisis cluster para los vinos de diferentes DO ..................282
Estudio ampliado con vinos de distinta denominacin de origen

x Figura 16-16: Grfico de sedimentacin en el estudio ampliado de las
distintas denominaciones de origen ..............................................................284
x Figura 16-17: Grficos de dispersin sobre las dos primeras componentes 286
x Figura 16-18: Grficos de dispersin sobre las componentes 1 y 3 ............287
x Figura 16-21: Representacin de las dos primeras funciones
discriminantes
.........................................................................290

Componetes Vino

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TESIS DOCTORAL

Estudio analtico de compuestos

M Trinidad Cedrn Fernndez

Estudio analtico de compuestos

M Trinidad Cedrn Fernndez

Edita: Universidad de La Rioja

ESTUDIO ANALTICO DE COMPUESTOS VOLTILES

Memoria presentada en la Universidad de La Rioja

Este trabajo se ha subvencionado parcialmente con los

Un experto es aqul que ya ha

En la primera parte de este trabajo se han descrito tanto las tcnicas

"Quiero fer una prosa en romn paladino,

A Julio, Lucas y Laura

Soy de las que piensan que la ciencia tiene una

Captulo 4: Ensayos previos y optimizacin del mtodo

Captulo 5: Procedimientos de extraccin empleados

Captulo 7: Extraccin lquido-lquido en continuo

7.1.- Introduccin ........................................................................113

Captulo 8: Extraccin lquido-lquido con ultrasonidos

Captulo 9: Microextraccin por desmezcla

Captulo 10: Microextraccin por desmezcla

Captulo 11: Extraccin en fase slida (SPE)

Captulo 12: Microextraccin en fase slida (SPME)

Captulo 13: Estudio comparativo de los distintos

Parte II.- APLICACIN QUIMIOMTRICA

Captulo 17: Conclusiones

Apndice G.- Resultados quimiomtricos.

PARTE I: MTODOS DE EXTRACCIN Y

Las operaciones previas a la introduccin de la muestra en el sistema

- Tcnicas de aislamiento o separacin

Abordamos el tema desde distintos puntos de vista: queremos profundizar en

1.1.- Historia del vino1

Barea Surez E., Historia del Vino I y II, (2003)

Figura 1-1: Mapa de las Denominaciones de Origen en Espaa.

Cona de Barber (Tarragona)

Ribeira Sacra (Orense, Lugo)

La Denominacin de Origen Calificada Rioja (DOCa Rioja)

x Figura 1-2: Mapa de las subzonas en la DOCa Rioja

1.2.- Componentes del vino2

1.2.1.- Componentes de sabor azucarado

Badui Dergal S., Qumica de los alimentos, Mxico, (1999)

1.2.2.- Componentes de sabor cido

Tabla 1-1: Componentes del vino de sabor cido

En el vino se encuentran adems otros cidos en pequeas cantidades, tales

1.2.3.- Componentes de sabor salado

x Tabla 1-2: Componentes del vino de sabor salado

En el vino tambin se encuentran trazas de otros componentes minerales

1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente

D) Taninos condensados: se localizan en las pepitas, en el hollejo de la uva y

1.2.5.- Otros componentes

1.3.- El aroma del vino

Mallouchos A. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 3060-3066, (2003)

Es difcil determinar la influencia sensorial de compuestos individuales, ya

Chatonnet, P. et al, J. Int. Sci. Vigne Vin, 26, 253-269, (1992)

algunos steres como el acetato de etilo, succinato de dietilo, etc. y se aportan

Cutzach I. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 2217-2224, (1997)

Oliva J. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 2830-2836, (1999)

1.4.- Compuestos responsables del aroma del vino

Moio L. et al, Vignevini, 29, 115-123, (2002)

(Cx es la concentracin del compuesto x en el alimento; Ax es la concentracin

Etivant P.X., Volatile compounds in foods and beverages, (1991)

Manzana verde, herbceo

Disolvente, frutal, qumico

Fruta sinttica, manzana