DETERMINACIN DE

ESCHERICHIA COLI EN
COLIFORMES
TERMOTOLERANTES
1. INTRODUCCIN
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
-

Comprobar que la escherichia coli es el mximo representante de los

coliformes termotolerantes por medio de pruebas bioqumicas.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

-

Interpretar la morfologa colonial de los cultivos primarios

Realizar la prueba de indol
Realizar la prueba de reaccin rojo de metilo
Realizar la prueba de reaccin de Voges Proskauer
Realizar la prueba de citrato
Realizar la prueba de ureasa
Realizar la prueba de TSI ( agar hierro triple azcar )
Realizar la prueba de LIA ( agar lisina hierro )

3. MARCO TERICO
3.1. Grupo coliforme
Los coliformes son un grupo de bacterias que comparten caractersticas
bioqumicas en comn y son tiles como microorganismos indicadores de
sanidad de alimentos y agua.
Entre los coliformes ms importantes se encuentra la E.coli, enterobacter,
klebsiella y citrobacter.
Los coliformes se clasifican en totales y termotolerantes. Los coliformes
termotolerantes son un subgrupo de los coliformes totales.

3.1.1. Coliformes totales

Los coliformes totales incluyen una amplia variedad de bacilos aerobios y
anaerobios facultativos, gramnegativos y no esporulantes capaces de
proliferar en presencia de concentraciones relativamente altas de sales
biliares fermentando la lactosa y produciendo acido o aldehdo en 24 horas
a 35 37 C.
Los coliformes totales producen, para fermentar la lactosa, la enzima galactosidasa. Tradicionalmente, se consideraba que las bacterias
coliformes pertenecan a los gneros como Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter, pero el grupo es ms heterogneo e incluye otros
gneros como Serratia y Hafnia. El grupo de coliformes totales incluye
especies fecales y ambientales.

3.1.2. Coliformes termotolerantes

Los coliformes termotolerantes son miembros de los coliformes totales que
estn ms estrechamente relacionados con la contaminacin fecal. Los
coliformes termotolerantes generalmente no se multiplican en los ambientes
acuticos.
Los coliformes termotolerantes son bacilos gramnegativos y no
esporulantes, que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a
44.5 C dentro de las 24 horas.
El mximo representante de los coliformes termotolerantes es la
Escherichia coli.

3.1.2.1.

Escherichia coli

La Escherichia coli es el principal indicador bacteriano de contaminacin

fecal en el agua, estudios efectuados han demostrado que la Escherichia
coli esta presentes en las heces humanas y de los animales de sangre
caliente.
La Escherichia coli es un bacilo gramnegativo, no esporulante, tiene
flagelos peritricos que le da movilidad, mide alrededor de 0.5 de ancho
por 3 de largo, son catalasas positivas, oxidasas negativas, reducen
nitratos a nitritos, adems producen vitamina B y K y son capaces de
fermentar glucosa y lactosa

3.2. Morfologa colonial

La interpretacin de los cultivos primarios despus de 24 48 horas de la
incubacin requiere de la observacin o anlisis de la morfologa colonial.
La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias
habitualmente se lleva a cabo por medio de la inspeccin visual del
crecimiento en la superficie de las placas de agar.
La interpretacin de los cultivos primarios se lleva a cabo sosteniendo la
placa en la mano y observando la superficie del agar en busca de
crecimiento bacteriano.
Durante el examen las placas deben inclinarse en diversas direcciones, con
una iluminacin directa brillante, de modo que la luz se refleje desde varios
ngulos.
La morfologa de las colonias es una de las caractersticas bsicas de las
bacterias y es indispensable para la identificacin preliminar.
El tamao de las colonias bacterianas es asumiendo condiciones de cultivo
favorables bastante uniforme de toda una especie.
La forma de la colonia viene determinada por su borde y su espesor. El
borde puede ser liso o irregular y aserrado.
La consistencia y textura de la masa celular tambin son rasgos distintivos
de la morfologa de las colonias. Pueden tener una consistencia desde seca
y frgil a grasienta y cremosa, o viscosa y pegajosa.
La superficie de la colonia puede ser uniforme, lisa y brillante, rugosa y
granular, o estriada y dentada.
Adems las superficies de las colonias pueden o no presentar
pigmentacin.

Lectura de morfologa colonial

Tamao: dimetro en mm.
Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide.
Elevacin: plana, sobre elevada, convexa, pulvonada, umbonada,
umbilicada.
Margen (borde): entero, ondulante, lobulado, lacerado, filamentoso,
rizado.
Color: blanco, amarillo, negro, naranja, etc.
Superficie: brillante, opaca, erizada, rugosa.
Transmisin de luz: opaca, translucida, transparente.
Consistencia: cremosa, seca, mucoide (viscosa), membranosa).

3.3. Pruebas bioqumicas

3.3.1. Identificaciones
metablicas

basadas

en

caractersticas

Fundamento: La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la

actividad bioqumica o metablica de bacterias (por medio de la cual puede
hacerse una identificacin final de especie), se lleva a cabo mediante el
subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales,
cuyos resultados pueden interpretarse despus de uno o dos das de
incubacin.

3.3.1.1.

Prueba de indol

FUNDAMENTO: El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por

ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e
indolactico.
Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el
nombre de triptofanasas, lo que implica el sistema completo de enzimas
vinculadas con la produccin del indol. El principal intermediario en la
degradacin del triptfano es el cido indolprvico.
La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y
energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio
del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y
una gran produccin de energa. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar
nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra para la
reaccin anablica.
La prueba de indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo
cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de pdimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs).
La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos
capaces de fermentar los hidratos de carbono.
La elevada acidez producida por la fermentacin de la glucosa puede
impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima.
El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la
glucosa la inhibe.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Caldo de triptfano
Reactivo de Kovacs
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en el caldo de triptfano por un
tiempo de 24 48 horas, a una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin agregar 5 gotas del reactivo de Kovacs y
agitar suavemente para su inmediata interpretacin.
RESULTADOS:
Positivo.- formacin del anillo de color rojo rosado.
Negativo: no se produce color, si se produce color naranja en el anillo indica
la formacin de escatol.

3.3.1.2.

Prueba de reaccin rojo de metilo

Fundamento: Comprobar la capacidad de un organismo de producir y

mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la
glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba
cualitativa de la produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias
que principalmente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos a
menudo producen suficiente cido para mantener un pH menor de 4.4.
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH
para determinar la concentracin de iones hidrgeno presentes cuando un
organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos
estables manteniendo una alta concentracin de iones hidrgeno hasta
alcanzar cierta concentracin y entonces cesa toda actividad.
Los organismos RM negativo tambin producen cidos pero tienen una
menor concentracin de iones hidrgeno porque hay una reversin hacia la
neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en
carbonatos.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Medio de Clark y Lubs
Indicador rojo de metilo
METODO:

Se procede a la siembra del cultivo en el medio de Clark y Lubs por

un tiempo de 24 48 horas, a una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo y
agitar suavemente para su inmediata interpretacin.
RESULTADOS:
Positivo.- color rojo en la superficie del medio.
Negativo: color amarillo o naranjado en la superficie del medio.

3.3.1.3.

Prueba de reaccin de Voges Proskauer

Fundamento: Determina la capacidad de algunos organismos de producir

un producto final neutro, la acetona a partir de la fermentacin de glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como producto final
neutro derivado del metabolismo de la glucosa. sta es metabolizada en
cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido
pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona
(precursor de la produccin de 2,3- butanediol) que es uno de los ciclos
para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La formacin de
acetona y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido
pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo pequeas
cantidades de cidos mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del
medio de rojo de metilo, lo bastante como para producir un cambio de color.
Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP
positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa.
El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el catalizador alfanaftol porque ste acta como intensificador del color, lo que aumenta la
sensibilidad de la reaccin sin prdida de su especificidad. El segundo
reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP contribuye a la
absorcin de CO2. No debe excederse de un volumen exacto. El KOH
reaccionar con la peptona dando un color rosado salmn y con el
agregado posterior de alfa naftol no habr alteracin del color.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Medio de Clark y Lubs
Alfa naftol al 5% (intensificador del color)
Hidrxido de potasio 40% (agente oxidante)
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en el medio de Clark y Lubs por
un tiempo de 24 48 horas, a una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin agregar 6 gotas del alfa naftol al 5%.
Luego aadir 2 gotas de hidrxido de sodio 40%
Agitar suavemente y luego dejar reposar por 15 min antes de su
interpretacin.
RESULTADOS:
Positivo.- color rojo rosado en la superficie del medio.
Negativo: color amarillo o cobrizo en la superficie del medio.

3.3.1.4.

Prueba de citrato

Fundamento: Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato

como nica fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento,
provocando alcalinidad.
El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y
fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.
Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de
acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El
desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimtico sin la
intervencin de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o citrato
desmolasa.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Citrato de Simmons
Indicador azul de bromotimol.
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en el citrato de Simmons en pico
de flauta y se lo inocula en estra, por un tiempo de 24 48 horas, a una
temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin interpretar.
RESULTADOS:
Positivo.- crecimiento y el medio de color azul intenso en el pico de flauta.
Negativo: no existe crecimiento y el medio de color verde.

3.3.1.5.

Prueba de ureasa

Fundamento: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea

formando dos molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa
produciendo un cambio de color rojo en el medio.
La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos molculas
de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada
con la descomposicin de los compuestos orgnicos.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Agar urea de Christense
Indicador rojo de fenol
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en el agar urea de Christense en
pico de flauta y se lo inocula en estra, por un tiempo de 18 24 horas, a
una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin interpretar.
RESULTADOS:
Positivo.- Rojo rosado intenso en el pico de flauta.
Negativo: amarillo

3.3.1.6.

Prueba de TSI

Fundamento: Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato

de carbono especfico incorporado en un medio de crecimiento bsico, con
produccin o no de gases, junto con la determinacin de posible cido
sulfhdrico.
El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentacin de
los hidratos de carbono y la produccin de cido sulfhdrico. Las bacterias
pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser
metabolizados, caractersticas que son utilizadas para la diferenciacin de
stas, principalmente para las Enterobacterias.
Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y glucosa 0.1%,
lo cual permite la observacin de la fermentacin de uno o de ambos
carbohidratos por parte de las bacterias, adems de la produccin de gas y
de cido sulfhdrico.
La fermentacin es un proceso que se lleva a cabo en condiciones
aerbicas (pico de flauta) y anaerbicamente (capa inferior). En el pico de
flauta la glucosa (monosacrido) es catabolizada inicialmente por medio del
ciclo anaerbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios
como por los anaerobios para dar cido pirvico, y posteriormente ste ser
degradado a travs del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O y energa.

Por otra parte la lactosa (disacrido) ser primero degradada a sus

monosacridos correspondientes (glucosa y galactosa).

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una

concentracin 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los
fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azcar, ya que
las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes como constituyentes de
las bacterias, y stas pueden obtener mayor energa por utilizacin del
azcar ms simple.
Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar
en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilizacin de la glucosa se realiza en
forma aerobia sobre la estra, donde el oxgeno presente acta como
aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en
condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de
glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzar a
metabolizar el piruvato a travs del ciclo aerbico de Krebs (sobre la estra),
formando productos finales cidos. El cido en el medio hace virar el
amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de
incubacin, la zona de la estra y el fondo del tubo inoculado con un
fermentador de glucosa tendrn un color amarillo. Si el microorganismo no
fermenta la glucosa, el fondo permanecer rojo (indicando que no hay
variacin del pH) o se alcalinizar (lo que puede visualizarse por un color
rojo algo ms intenso que del medio original), demostrando que la bacteria
no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.
Despus de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria
con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzar a degradarlas.
Como el medio contiene 10 veces ms lactosa que glucosa, las bacterias
encontrarn sustrato suficiente para continuar la formacin de productos
finales cidos. Luego 18 24 horas de incubacin todo el medio TSI
permanecer de color amarillo. Esta reaccin se denomina cido sobre
cido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La
produccin de gas provocar la ruptura de la columna de agar o la
empujar hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa
que produce gas dar una reaccin A/A ms gas.
Si el organismo en estudio no es capaz de usar la lactosa del medio, debe
producir energa en forma menos eficiente al utilizar las protenas y
aminocidos del medio como fuentes nutritivas.
El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada
donde el oxgeno es abundante. Los productos de la degradacin de la

peptona (como el amoniaco) son alcalinos y provocan el viraje del indicador

rojo de fenol a su color rojo original. Un TSI inoculado con una bacteria que
no fermenta la lactosa al cabo de 18-24 horas de incubacin presentar la
zona inclinada roja y el fondo del agar permanecer amarillo debido al
metabolismo anaerobio de la glucosa durante la primera etapa. Esta
reaccin se denomina alcalina sobre cido (K/A).
Las bacterias que fermentan la glucosa tambin pueden formar productos
alcalinos a partir de la utilizacin de la peptona, sobre la zona inclinada.
Estas reacciones sern K/K.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Agar hierro triple azcar
Indicador rojo de fenol
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en el agar hierro triple azcar en
pico de flauta y se lo inocula en estra y por picadura, por un tiempo de 18
24 horas, a una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin interpretar.
RESULTADOS:
A = cido
K = Alcalino
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de glucosa.
Amarillo en capa profunda: cido; degradacin anaerbica de la glucosa.
Amarillo en pico: cido
Amarillo en capa profunda: cido
Rojo en pico de flauta: alcalino
Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.
Produccin de H2S: precipitado negro
Produccin de gases: Produccin de burbujas, descomposicin del
medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento
del medio del fondo, dejando un espacio libre.

3.3.1.7.

Prueba de LIA

Fundamento: Mide la capacidad enzimtica de un organismo para

descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar una amina, con
la consiguiente alcalinidad.

La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que

poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los
aminocidos en su grupo carboxilo dando una amina o una di amina y
anhdrido carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce
anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es irreversible, no
oxidativo y requiere una coenzima comn, el fosfato de piridoxal.
El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar cadaverina y CO2
por accin de la enzima especfica lisina descarboxilasa.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Base de descarboxilasa de Moller.
Indicador purpura de bromocresol.
METODO:
Se procede a la siembra del cultivo en la base de descarboxilasa de
Moller en pico de flauta y se lo inocula en estra y por picadura, por un
tiempo de 18 24 horas, a una temperatura de 35 37 C.
Luego de la incubacin interpretar.
RESULTADOS:
A = cido
K = Alcalino
N = Neutra
R = Rojo (desaminacin oxidativa)
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
K/K = azul de Prusia / azul de Prusia
Desaminacin oxidativa / descarboxilacin
K/A = azul de Prusia / lila
No desaminacin
Produccin de H2S = Ennegrecimiento del medio
Produccin de gas = Burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las
paredes del tubo.

4. METODOLOGA
5. RESULTADOS
6. CONCLUSIONES
7. RECOMENDACIONES
8. BIBLIOGRAFA