Estructura de Macromolculas. Dpto. de Qumica Fsica. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada.

2.- INTERACCIONES ELECTROSTTICAS (Continuacin).

Fuentes de cargas elctricas en protenas (continuacin). Ionizacin de los grupos
amino y carboxilo terminal en oligopptidos.
Los oligopeptidos formados con aminocidos sin cadenas laterales ionizables son
como el caso anterior cidos diprticos, donde solamente los grupos amino y carboxilo
terminal son susceptibles de ionizacin porque los restantes aminocidos han utilizado
estos grupos para la formacin de enlaces peptdicos; as las polialaninas solo tiene
ionizables los grupos amino y carboxilo terminales, como se muestra para el caso del
hexapptido de Ala en la figura i.e.4.

Figura i.e.4. Hexapptido de Ala en la forma completamente protonada que

predomina a un pH muy cido.
No obstante los pKs de los mencionados grupos en oligopptidos con diferentes
tamaos, difieren de los valores caractersticos que presentan en el aminocido libre y
muestran correlacin con el tamao de la cadena. Analizando los valores de pKs para la
serie de oligoalaninas en la figura i.e.5 podemos apreciar que el pK1 correspondiente a la
ionizacin del grupo carboxilo terminal, aumenta con el tamao del oligopptido. Esto
implica que la Ala sencilla es mas cida que el dipptido Ala-Ala, este a su vez mas cido
que el tripptido Ala-Ala-Ala, siendo el tetrapptido Ala-Ala-Ala-Ala el menos cido de la
serie; dicho de otra forma la facilidad con que se libera el protn del grupo carboxilo
disminuye con el tamao del oligopptido. Por otro lado el pK2 correspondiente a la
ionizacin del grupo amino terminal disminuye con el tamao del oligopptido, hacindose
menos bsico conforme avanzamos en la serie, as el protn del grupo amino terminal se
libera con mayor facilidad en el tetrapptido.
Este comportamiento puede explicarse cualitativamente en trminos de la
interaccin electrosttica entre las cargas netas de los grupos amino (+) y carboxilo (-)
terminal acoplada a la ionizacin. Esta interaccin consiste en una fuerza atractiva que se
debilita a medida que se alejan estos grupos terminales. La situacin mas favorable la
representa la forma dipolar de la Ala simple, en la que las cargas estn mas prximas y
como consecuencia le corresponde el pK1 menor y el pK2 mayor; es decir el protn del
grupo carboxilo se libera fcilmente porque la ionizacin est acoplada a la aparicin de la
interaccin favorable entre las dos cargas, y el protn del grupo amino se libera con mayor
dificultad porque la prdida de este protn hace desaparecer la interaccin favorable entre
cargas.

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Cuantitativamente y desde un punto de vista termodinmico la interaccin puede

estimarse en trminos del Gint usando la ecuacin Gint = 2303RT ( pK a* pK a ) ; as por
ejemplo para el proceso: ALA ALA + H + a T = 25 C, el pK a* = 235 y para el pK a
sin interaccin podemos tomar como aproximadamente vlido el valor correspondiente al
tetrapeptido, en el cual las cargas estn lo suficientemente alejadas como para que la
interaccin sea despreciable, es decir pK a = 342 :

kcal
kcal
Gint = 2303 198 103

29815(K ) (235 342) = 15

mol
mol K
Es decir, hay una disminucin de la energa libre debida a la interaccin que aumenta el
carcter cido del grupo carboxilico. Esta disminucin de la energa libre ser menor
cuanto ms alejados estn los grupos amino y carboxilo.

Figura i.e.5: Ionizacin de los grupos amino y carboxilo terminal en oligopptidos.

Fuentes de cargas elctricas en protenas (continuacin). Ionizacin de las cadenas

laterales.
Cuando en un aminocido o en un oligopptido la/s cadena/s lateral/es presentan
grupos ionizables los procesos de ionizacin se complican y no siempre es posible resolver
la asignacin de pKs a grupos especficos. A continuacin vamos a estudiar algunos casos
sencillos que ilustran esta complejidad..

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Caso de la Lisina: La titulacin de la lisina presenta tres pKs: pK1 = 218, pK2 =
8.95 y pK3 = 1053 que corresponden al equilibrio de ionizacin representado en la
figura i.e.6. Adjudicar correctamente los valores de los pks a las ionizaciones
concretas no es un problema trivial, y para su solucin se requiere informacin
adicional a la que nos proporciona la valoracin del aminocido.

Figura i.e.6: Ionizacin de la Lisina.

En principio podemos adjudicar el ms bajo de los pKs a la ionizacin del grupo
-COOH, por analoga con la alanina, y porque en general este grupo es el ms
cido en todos los aminocidos. Comparando este pK1 = 218 con el
correspondiente a la Ala, pK1 = 235, podemos observar un pequeo
desplazamiento del pK hacia un valor menor. Esto se puede interpretar en trminos
de una contribucin extra del grupo amino protonado de la cadena lateral a la
interaccin electrosttica. Lo que ya no es tan obvio es la adjudicacin del pK2 y
pK3 a la ionizacin del grupo -NH3 y -NH3, respectivamente. Para saber que
grupo amino se desprotona antes podemos recurrir a la comparacin con pK
conocidos de compuestos modelo. As, se sabe que, en general, las aquil-aminas
primarias tienen un pK mas elevado que las metil-aminas sustituidas en el carbono
alfa; por ejemplo, la n-butilamina se disocia con un pKa = 1059.:
CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 NH 3+ CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 + H +
Si adems tenemos en cuenta que un -NH3 no perturbado por las interacciones
electrostticas, como hemos visto para el caso del tetrapptido Ala-Ala-Ala-Ala,
presenta un pKa 8, ya tenemos suficientes datos para adjudicar el pK2 = 895 a la
ionizacin del grupo -NH3 y el pK3 = 1053 al -NH3.
Finalmente comparando el pK2 de la Lys y la Ala, 895 y 969, respectivamente,
podemos observar que este pK en la Lys es menor que en la Ala; es como si la
interaccin del grupo -NH3 con el grupo -COO- fuera menor en la Lys que en la
Ala. Podemos interpretar este hecho con la presencia del -NH3 que representa una
carga + compensando en parte el campo elctrico producido por la carga negativa
del grupo carboxilo.

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Ionizacin de las cadenas laterales en pequeos pptidos.

Analizamos a continuacin el caso sencillo del dipptido Ala-Lys:

Figura i.e.7: Dipptido Ala-Lys.

La valoracin de este dipptido da como resultado los siguientes pKs:
pK1 = 322,

pK2 = 762 y pK3 = 1070

La asignacin del pK1 es inmediata pues corresponde a la ionizacin del grupo

-COOH, que es el mas cido. Este pK presenta un valor muy parecido al
correspondiente en el dipptido Ala-Ala estudiado anteriormente (pK1 = 312).
La asignacin de los otros dos pKs no es tan inmediata; existen las dos posibilidades
representadas en la figura i.e.8.
Debemos optar por la primera asignacin sobre la base a los siguientes
argumentos:
Por las mismas consideraciones hechas en el caso de la Lys, el pK2 = 762 debe
corresponder a la ionizacin del grupo -NH3 del resto de Ala. Este pK es algo menor
que el correspondiente en el dipptido Ala-Ala, 83; esta disminucin del carcter
bsico del grupo amino se debe a que, adems del alejamiento del grupo -COO- (igual
que en en Ala-Ala), el grupo -NH3 se valora en presencia del grupo -NH3 cuya
interaccin electrosttica atractiva sobre el grupo -COO- podramos decir compite con
la interaccin entre los grupos terminales.
Por otra parte el pK3, ligeramente mayor que el correspondiente a la Lys libre
(1053), lo que significa mayor dificultad para desprotonar el grupo -NH3 en Ala-Lys
porque al alejarse el grupo -NH3 la interaccin del grupo -NH3 con el grupo -COOest menos afectada por la repulsin de los dos grupos aminos; no obstante dada la
longitud de la cadena lateral este efecto es pequeo.
La segunda asignacin implicara un cambio de pK del grupo -NH3 desde 83
en Ala-Ala hasta 107 en +Ala-Lys- no estando cargada la cadena lateral de Lys,
cambio que no podemos explicar.

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Figura i.e.8 : Ionizacin del dipptido Ala-Lys.

Otro caso donde es posible asignar los pKs de forma sencilla sera el del
tetrapptido Ala-Lys-Ala-Ala. La titulacin de este oligopptido resulta en los
siguientes valores de pKs:
pK1 = 358, pK2 = 801 y pK3 = 1058.
Por comparacin con el oligopptido (Ala)4 los dos primeros pKs se asignan a
los grupos -COO- y -NH3 . El tercero se asigna al grupo -NH3 del resto de Lys, que
presenta un valor muy prximo al del aminocido libre.
Incluso en oligopptidos no siempre es posible resolver la asignacin de pKs,
especialmente cuando estn presentes mas de una cadena lateral ionizable; as por
ejemplo el tripptido Lys-Lys-Lys presenta los pKs:
pK1 = 306, pK2 = 734, pK3 = 980, pK4 = 1054 y pK5 =1132
La asignacin completa de pKs de este caso no es un problema trivial. Intentalo!.

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Fuentes de cargas elctricas en protenas (continuacin). Cargas parciales en

protenas.
El concepto de carga parcial.
El concepto de carga neta que adquiere un tomo cuando pierde o gana
electrones de valencia es bsico y familiar para los estudiantes de esta asignatura, pero
el concepto de carga parcial, una abstraccin conveniente especialmente para los
clculos biocomputacionales, no resulta tan conocido.
Una molcula es un conjunto de ncleos y electrones formando una estructura
dinmica que, en un promedio temporal, se caracteriza por unas posiciones relativas de
los ncleos y una distribucin espacio-temporal de sus electrones acorde con las
funciones de onda de los orbitales atmicos y moleculares. La densidad de carga
electrnica no siempre se distribuye simtricamente alrededor de los ncleos; en
funcin del mayor o menor carcter electronegativo o electropositivo de los tomos los
orbitales moleculares se polarizan y un tomo ve una cierta carga elctrica en un
tomo vecino que depende de esta distribucin asimtrica de carga. El concepto de
carga parcial es un intento de representar esta realidad: Se asigna una carga parcial a
cada tomo que puede ser positiva o negativa y fraccionaria, es decir, puede valer una
fraccin de carga elemental, por ejemplo +042 e. Se acepta que estas cargas
interaccionan como las cargas netas obedeciendo la ley de Coulomb.
El valor de las cargas se determina mediante clculos qumico-cunticos que no
abordamos en esta asignatura pero que en todo caso dependen del campo de fuerza de la
mecnica molecular utilizada. En la siguiente tabla se muestran los valores
correspondiente al grupo peptdico calculados con el campo de fuerzas AMBER
(Weiner et al.,1984. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic
acids and proteins. J Am Chem Soc106:765-784.
TABLA I.E.2
Cargas parciales de los tomos del grupo peptdico calculadas con el campo de
fuerzas AMBER
tomo
N
HN
C
O
C
H

Carga parcial
- 052
+ 025
+ 006
- 053
+ 050
+ 002

En la figura i.e.9 se muestra un ejemplo de puente salino en el que se especifican

las cargas parciales. Las cargas formales o netas 1 y +1 de los restos cido glutmico y
la arginina, respectivamente, de este ejemplo aparecen distribuidas entre los diferentes
tomos de cada resto.

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Figura i.e.9 : Puente salino entre el resto Glu21 y el resto Arg154 de Quimotripsina
y cargas parciales calculadas con el campo de fuerzas AMBER

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Fuentes de cargas elctricas en protenas (continuacin). Titulaciones de protenas:

En la titulacin de cualquier protena real hay un amplio conjunto de grupos
ionizables, desde muy cidos a muy bsicos. En primera aproximacin podemos
agruparlos en clases, los grupos carboxilicos, los imidazoles, las lisinas, etc. As
podramos intentar describir la curva completa de titulacin por la ecuacin
aproximada:

[ ]
r=
1 + k [H ]
n1k1 H +

+ 1

[ ]
+
1 + k [H ]
n2 k2 H +

+ 1

(Apartado 15.3.3 del tema 15, pginas 621-628, del libro Principles of Physical
Biochemistry, K. E. Van Holde, W. Curtis Jonson y P.Shing Ho.)
donde, r representa el nmero medio de protones disociados desde una macromolcula
completamente protonada; ni el nmero total de protones disociables de la clase de
grupos ionizables i, considerada cada una como un conjunto de ni sitios independientes
de unin de protones (sin interacciones mutuas); ki las constantes de disociacin cidas
microscpicas de la clase de grupos ionizables i.
Las curvas de titulacin de protenas tienen el aspecto mostrado en la figura
i.e.10, donde la ionizacin de diferentes clases de grupos se solapan por lo que no se
pueden obtener pKs con un anlisis simple. Los ajustes de las curvas con ecuaciones
como la anterior no son muy fiables por dos razones, por unl ado, el modelo en si es
demasiado simple, no tiene en cuenta aspectos importantes de un sistema realmente
complejo, por otro lado el nmero de parmetros del ajuste es tan grande que la
dependencia mutua de estos valores introduce una gran incertidumbre. El pKa de un
determinado grupo no solo es un valor intrnseco caracterstico sino que tambin
depende del entorno y de las interacciones con otros grupos. Para una clase de grupo
ionizable dado, por ejemplo grupos carboxilicos, el entorno puede ser muy diferente,
desde regiones muy hidrofbicas en el interior de la protena hasta un medio hidroflico
en la superficie de la protena. Por otro lado un determinado grupo (carboxilo, por
ejemplo), dependiendo de su posicin en la estructura plegada de una protena, puede
estar interaccionando fuertemente con otro grupo (Lys, por ejemplo), o no experimentar
una interaccin intramolecular significativa. Todo ello da lugar a que cada grupo
ionizable muestre un intervalo relativamente amplio de valores de pKa
No obstante un hecho que se puede generalizar para cualquier protena globular
compacta es que a pH muy bsicos la macromolcula estar negativamente cargada;
conforme disminuye el pH nos acercamos al punto de carga neta nula, punto
isoelctrico. Si seguimos disminuyendo el pH la macromolcula se carga positivamente,
y conforme aumenta su carga positiva se hace mas difcil protonar grupos; es una
especie de cooperatividad negativa, cuantos mas protones se unen a la protena tanto
mas difcil se hace la unin de nuevos protones.

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Figura i.e.10: Titulacin de ribonucleasa a 25C. (Figura del tema 15, pgina 626,
del libro Principles of Physical Biochemistry, K. E. Van Holde, W. Curtis Jonson y
P.Shing Ho.)

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