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23/09/2014

Propuesta por Arne Teselius (1937).


Tcnica para visualizacin de protenas, diferencias de longitud de
fragmentos de aminocidos y cargas elctricas.

Estudios

Genetista
Diana Susana Martinez Corcino

con

cidos

nuclicos

(Brown

1998;

Farah

2000),

visualizacin de material gentico (ADN y ARN).


Arne Tiselus
Prmio Nobel de
Qumica em 1948

La electroforesis en gel separa las molculas (carga y

Los fragmentos de una molcula de

ADN se separan a travs de la

Las macromolculas cargadas migran a travs de gel,

electroforesis de acuerdo a las

tamiz para que retardan


el paso de molculas de
acuerdo con su tamao y
forma.

tamao)

siguientes caractersticas:
El tamao de la molcula o masa.

La magnitud de la carga neta de la


molcula
El tamao de los poros del gel La

Tcnica utilizada en biologa

forma o conformacin del ADN (ej.

molecular

ADN sper-enrollado vs. ADN


lineal).

23/09/2014

1. Preparacin del

2. Aplicacin

gel

Agarose / Poliacrilamida

de las muestras

3. Electroforesis
4. Tincin

y visualizacin de la muestra

Poliacrilamida

Alta resolucin
NO para fragmentos grandes
Difcil de armar
Tipos:
1. Denaturante: con la presencia de
urea, se separa y purifica cadenas
simples
2. No denaturante: separa y purifica
cadenas dobles sin la presencia de
urea

Agarosa
Baja resolucin (poros grandes)
SI fragmentos grandes
Fcil de armar
Si el % es muy bajo el gel es frgil
Buffer de corrida: TAE (acetato)
o TBE (borato)
Muestra: buffer (SDS, bMercaptoetanol o DTT, azul de
bromofenol, xilencianol)

23/09/2014

Buffer de corrida
Glicerol o ficol o sacarosa

Densidad a la muestra

Da la fuerza inica al medio de corrida


Al

la [ ] de iones,

la resolucin

Loading Buffer
Colorantes de corrida
(ubicar frente de corrida)

Composicin

TAE

Ms usado. No puede reciclarse mucho.

TBE

Mayor capacidad buffer

Azul de bromofenol
(corre como DNA 300 pb)
Xylene Cyanol
(corre como DNA 4000 pb)

Orange G
(corre como DNA 50 pb)

Tiempo
Depende del tamao de los fragmentos a separar
A

tiempo

resolucin

OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)

Temperatura
A

Temperatura

OJO! (Se puede fundir el gel)

pH

Hay que controlar el pH

Evitar modificaciones en la carga y


conformacin del DNA y las protenas

23/09/2014

TINCION Y VISUALIZACIN DE
LA MUESTRA

Revelado

.Corriendo en un gel con EtBr


BrEt

Visualizado luz UV: bandas de ADN.

- Se intercala cada 2,5 pb


- Fluoresce naranja a la luz UV
- Detecta hasta 10ng de DNA ds

(tumorignico)

Agentes
intercalantes
SyBR Gold

Fluoresce amarillo
Poca afinidad gel (bajo background)
Detecta hasta 20 pg DNA ds
Seguro (no tumorignico)
Caro

Contaminacin: control negativo presenta banda(s)


- Mejorar prcticas de laboratorio:
* P o co DNA

Se ve un barrido:

* utilizar material limpio y estril, libre de nucleasas

* DNA d egradado

* Ex ceso de DNA

* utilizar reactivos limpios, distribuidos en alcuotas

* La e nzima no funciona

* T e mperatura de alineacin
d e masiado b aja

* usar guantes limpios

* d NTPs o p rimers degradados


* Inhib idores de PCR e n la reaccin

* Inadecuada concentracin de MgCl2

* no tocar ADN mientras se prepara la mezcla de PCR


* trabajar en rea limpia
Control
negativo con
presencia de
bandas
( contaminacin)

SMEAR

23/09/2014

Gracias por su atencion

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