En los europeos b2 unin agonistas adrenrgicos como el clenbuterol y el salbutamol se

prohibi su uso como promotores del crecimiento. aunque clenbuterol y salbutamol ambos
acumulan en el hgado, las diferencias en la tasa de acumulacin se pueden ver entre las
especies animales debido a las diferentes distribuciones de los receptores adrenrgicos b2. El
objetivo de este estudio fue comparar la acumulacin de los dos en el tejido heptico de dos
cepas de ratn diferentes. el estudio incluy 200 8 semanas de edad BALB / cy C57 / BL / 6
ratones. un grupo de ratones BALB / c 40 y un grupo de C57 / BL / 6 40 ratones fueron tratados
con 2,5 mg / kg de masa corporal clenbuterol per os durante 28 das. los dos grupos de
animales restantes fueron tratados con salbutamol de la misma manera. los animales se
sacrificaron entonces al azar en das 1,15 y 30 tratamientos posteriores. a pesar de la misma
dosis de tratamiento, los resultados revelaron clenbuterol a persistir en el tejido heptico ms
de salbutamol. en el da 30 despus del tratamiento, la concentracin de residuos de
clenbuterol en C57 / BL / 6 y BALB / c ratones tejido heptico fueron 0,23 + 0,02 y 0,21 + 0,03
ng / g, respectivamente, mientras que no se detectaron residuos de salbutamol. al comparar la
acumulacin de ambos compuestos entre las dos cepas de ratn, se hace evidente que no
diferencia significativa P> 0,05 en la tasa de acumulacin se puede encontrar.
introduccin
clenbuterol y el salbutamol pertenecen a los agonistas adrenrgicos b2 utilizados como
broncodilatadores y tocolticos, tanto en medicina veterinaria y humana. sin embargo, cuando
se usa en dosis de 5-10 pliegues ms alta que teraputica, estos compuestos pueden provocar
un efecto anablico que se manifiesta en un aumento de la disminucin de la masa muscular y
tejido adiposo de los animales tratados. en el pasado, el clenbuterol fue mal utilizada como
factor de crecimiento durante el engorde de los animales productores de alimentos. debido a
sus efectos txicos, este abuso clenbuterol condujo a un nmero de intoxicaciones agudas de
los seres humanos que haban consumido la carne y especialmente el hgado procedentes de
los animales tratados (2-5). por lo tanto, el uso de clenbuterol y otros agonistas b para fines de
promocin del crecimiento fue prohibida en Europa bajo la Directiva del Consejo 96/22 / CE (6).
el programa anual de seguimiento de estas sustancias se define en la Directiva del Consejo
96/22 / CE. una de las posibles y comnmente implementadas las matrices para el abuso de la
vigilancia b agonistas es el hgado, con investigaciones que muestran una alta acumulacin de
b agonistsin este tejido (7-10). Aunque los agonistas b acumulan por unanimidad en el tejido
heptico, las diferencias en este acculation se pueden ver entre las especies animales debido a
la diferente distribucin de los receptores B2 (11) agonistas b2 pueden dividirse en dos grupos
qumicos: sustancias clenbuterol como con restos anilinic y salbutamol sustancias -como con
fenlica, cateclico o restos resorcinlicas (12).
teniendo en cuenta la diferencia en las propiedades qumicas del clenbuterol y salbutamol en
el tejido heptico de dos cepas de ratn diferentes despus de un tratamiento subcrnica con
la dosis de 2,5 mg / kg BM que es igual a NOAEL de clenbuterol (nivel sin efecto adverso
observado)
Materiales y mtodos
productos qumicos y aparatos

clorhidrato de clenbuterol y el salbutamol se utilizaron para la preparacin de la solucin de los

animales haban sido tratados con. d6 clenbuterol y el salbutamol d6, utilizado como patrones
internos, vinieron de RIVM (Bilthoven, Pases Bajos). columnas de extraccin en fase slida
(CSDAU 506 500mg, 6 ml) se utilizan para la limpieza vinieron de UCT Interchim (Montluon,
Francia). todos los dems qumico utilizado con el anlisis fueron de un grado analtico. la
separacin se llev a cabo usando el sistema de HPLC Perkin Elmer 200 (Waltham, EE.UU.) en
el que se mont un C18-columna que tiene las dimensiones de 50 * 2,1 mm y el tamao de
partcula de 3 micrometros. espectrometra de masas se realiz utilizando un API 3000 Triple
analizador de masas cuadrupolar
animales y procedimiento de muestreo
el estudio incluy a 8 semanas de edad blanco BALB / c (n = 100) y C57 / BL / 6 (n = 100)
ratones machos negros con una masa corporal promedio de 25 g. obtaines de una colonia de
reproduccin del instituto Boskovic ms brusca. estas dos cepas fueron seleccionados debido a
su color de pelo diferente, ya que dentro de este marco de investigacin de las tasas de
acumulacin de cabello tanto el clenbuterol y salbutamolwere estudiaron tambin. Durante el
experimento, los animales fueron alojados por jaula para. la parte inferior de la jaula estaba
cubierto de serrn. los ratones fueron alimentados en una comida estndar de laboratorio.
todos los animales tenan acceso libre a comida y agua. los animales se mantuvieron en
condiciones standart destacados por un 12 hlight / oscuridad ciclos, la temperatura de 22C y
55% de humedad alterna. todos los experimentos se realizaron de acuerdo a la gua ILAR para
el cuidado
y el uso de animales de laboratorio, la directiva del consejo y la proteccin de los animales
croata actan los animales (n = 160) fueron divididos al azar en cuatro grupos
un grupo de ratones negro (n = 40) y un grupo de ratones blanco (n = 40) fueron tratados con
2,5 mg / kg de masa corporal clenbuterol per os diariamente (a travs de una sonda) durante
28 das. los dos grupos de animales restantes se trataron de la misma manera, pero con
salbutamol cuarenta animales, es decir, 20 20 blanco y negro, se dejaron sin tratar y sirvi
como control. en tratamiento post das 1,15 y 30 los animales fueron introducidos por primera
vez en la anestesia y luego sacrificados en Grous de 40, mientras que sus tejidos del hgado se
almacenaron a - 20 C en espera de aanalisis
preparacin de muestras y limpieza
muestras de hgado enteros, 1,5 g de pesaje se pesaron en recipientes de plstico y se trataron
con 50 microlitros. del patrn interno en la concentracin de 100 ng / ml, as como con 7,5ml
de metanol y 10 ml de 0,2 M tampn de acetato con un pH de 5,2. despus de la
homogeneizacin, las muestras se centrifugaron durante 15 min a 4C utilizando una fuerza de
2.000 g *
los supernatansts se evaporaron hasta un tercio de su volumen de partida bajo una corriente
de nitrgeno a 45C. despus de la evaporacin, se aadieron 60microlitros de glucoronidasa /
sulfatasa y las muestras se incubaron a 42C durante la noche. Despus de la incubacin, el pH
se ajust a 6 y las muestras se centrifugaron a 2000 * g durante 10 min. los sobrenadantes
obtenidos se cargaron en columnas SPE previamente activado utilizando metanol, agua y tamp
n de fosfato 0,1 M que tiene un pH 6. Las columnas se lavaron a continuacin con 1 M de

cido actico y metanol, wile la elucin se llev a cabo utilizando una mezcla de acetato de etilo
y amonaco en la relacin 97/3. Los eluyentes se evaporaron hasta sequedad, y los residuos se
disolvieron en 200microlitros de cido actico 0,1%.

tndem cbromatography- condiciones de espectrometra de masas lquidas

Separacin por HPLC se realiz en columnas C18 uptisphere a una velocidad de flujo de 0,2 ml /
min y a la temperatura ambiente. la fase mvil consista en el constituyente A (metanol) y el
constituyente B (cido actico al 0,1% en agua). Se emple un protocolo de elucin en
gradiente, de la siguiente manera: 0-3min 1-A, 13 min 50-A, 15 min 100-A, 20 min 100 -A, 26
min 1-A y 1 min 35% -A. el volumen de inyeccin fue de 10 microlitros. Se realiz anlisis de
MS-MS usando ionizacin por electro pulverizacin en el modo de ion positivo. con el anlisis
cuantitativo, el enfoque mltiple de monitoreo de reaccin se ejerce mediante el producto m
s abundante ion molecular transicin in molecular protonado para el clenbuterol, salbutamol
y sus respectivas normas internas. con fines cualitativos, la segunda transicin se control para
confirmar la identidad y clenbuterol's salbutamol's. la temperatura de la fuente de tensin y
capilar se fij en 400C y en 5500V, respectivamente. las condiciones de EM fueron
optimizados mediante la regulacin de los parmetros especficos de analitos, incluyendo la
desagrupacin potencial, potencial, potencial de entrada, energa de colisin y el potencial de
salida celda de colisin de enfoque.
la presin del gas de gas de nebulizacin y de cortina (nitrgeno) se fij en 9 y 12 psi,
respectivamente, mientras que la del gas de colisin (nitrgeno) se fij en 7 psi. parmetros de
trabajo se otimized mediante la infusin de 1 microgramo / ml. de clenbuterol, salbutamol y
solucin de patrn interno en metanol-actico 0,1%, 50:50 (v, v), el seguimiento de ese modo
dos iones de fragmentos para el clenbuterol y el salbutamol, y un nico ion fragmento para
ambos estndares internos. MS parmetros optimizados y los fragmentos de iones se
presentan en la tabla 1
proceso de validacin
la validacin se llev a cabo de acuerdo con la decisin de la comisin. dentro del marco del
proceso de validacin, lmite de decisin, capacidad de deteccin, precisin, recuperacin,
repetibilidad, se estudiaron reproducibilidad y linealidad en-casa. el lmite de decisin se
determin por analzing 20 muestras representativas de hgado en blanco, mientras que la
capacidad de deteccin se determin mediante el anlisis de 20 muestras de hgado
fortificados en el nivel de 0,3 ng / g. la linealidad y el efecto de la matriz evaluada por medio de
los coeficientes de correlacin obtenidos a partir de las curvas de calibracin tanto para el
disolvente y la matriz. la linealidad de la respuesta de LC-MS-MS se comprob mediante an
lisis repetidos de clenbuterol y la solucin patrn de salbutamol en los niveles de concentraci
n de 3,125, 6,25, 12,5 y 25,0 ng / ml que contienen una cantidad fija de d6 d6 clenbuterol y
salbutamol (25 ng / ml ). anlisis de regresin lineal se realiz en virtud de de trazado de la
relacin entre el rea del patrn del analito en el rea de estndar interno frente a la
concentracin de analito. la linealidad se evalu tambin en virtud de analizar muestras de h
gado en blanco (10 g) enriquecidos en los niveles 0,125

0.250, 0.375, 0.500 y 0.625ng / g, en el que el 12,5, 25,0, 37,5, 50 y 62,5 microlitos. de la soluci
n estndar que contiene 100 ng / ml de clenbuterol y el salbutamol, y 50 microlitros de soluci
n de patrn interno de d6 d6 clenbuterol y salbutamol a 100 ng / ml se aadi. la recuperaci
n y la precisin se determinaron mediante el anlisis de 20 muestras de hgado en blanco
fortificados en 20 rplicas a 0,30 ng / g para ambos analitos. la supresin de iones que surgen
sobre la base de componentes de la matriz se vio compensada por el mtodo de dilucin isot
pica
anlisis estadstico
diferencias en las concentraciones de analitos visto en diferente con das de abstinencia, as
como las diferencias entre las dos cepas de ratn, se ensayaron para determinar su significaci
n estadstica mediante ANOVA. Se realiz un anlisis estadstico utilizando el Statistica ver.
software 6.1
Resultados y discusin
resultados de la validacin
dentro del marco del proceso de validacin, no se encontraron interferencias, ya sea con el
clenbuterol o identificacin salbutamol debido a un mtodo de adquisicin MRM altamente
especfico y el uso de patrones internos deuterados apropiadas. Las figuras 1 y 2 muestran un t
pico cromatograma de HPLC-MS / MS-MRM de un blanco BALB / c y C57BL / 6 muestra de h
gado de ratn.