Sie sind auf Seite 1von 36

FLUOROMETRIA Y SUS APLICACIONES EN FOTOQUMICA Y

FITOPATOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRINCIPIOS


ACTIVOS Y EL CICLO DE VIDA DE INSECTOS, HONGOS Y
ALGAS A NIVEL FOLIAR, TALLO Y RAZ.

IBQ.

GRUPO A.

ALUMNA:
DANIELA FERNANDA MARTINEZ JARAMILLO.

PROFESOR:
EDUARDO ANDRADE ESQUIVEL.

11/11/14

ANLISIS FITOQUMICO PRELIMINAR DE HOJAS, TALLOS Y SEMILLAS DE


CUPAT (STRYCHNOS SCHULTESIANA KRUKOFF)
Preliminary phytochemical analysis of Cupat (Strychnos schultesiana
krukoff) stems and seeds

Palabras clave: Strychnos, anlisis fitoqumico preliminar,


alcaloides.

Lyndon Carvajal Rojas


Yoshie Hata Uribe
Noralba Sierra Martnez
Diana Rueda Nio

Keywords: Strychnos, preliminary phytochemical study,


alkaloids.

RESUMEN
Con el fin de ahondar en el conocimiento de la flora
colombiana, particularmente aquella presente en
la regin de los llanos orientales, se eligi la especie Strychnos schultesiana Krukoff para profundizar en su composicin qumica y as establecer una
potencial utilidad medicinal o industrial. Para ello
se realiz un anlisis fitoqumico preliminar de tres
de sus rganos tallos, hojas y semillas, en el que
se evalu la presencia de los principales grupos de
metabolitos secundarios asociados con actividad
biolgica, a saber: alcaloides, flavonoides, taninos,
saponinas, derivados antracnicos, esteroides y/o
triterpenoides, cumarinas, glicsidos cardiotnicos y lactonas terpnicas. Se detect la presencia
de alcaloides en gran concentracin, lo cual era
de esperarse al tratarse de una especie del gnero
Strychnos, ampliamente conocida por su contenido
de alcaloides. Es notable tambin la presencia de
flavonoides en los tres rganos. Estos compuestos
son ampliamente conocidos por sus propiedades
antioxidantes, tiles en la prevencin de mltiples
enfermedades asociadas a los procesos oxidativos.
Los resultados de este trabajo son realmente ti-







ABSTRACT
In order to improve the knowledge of Colombian
flora, particularly that belonging to the llanos
orientales region, Strychnos schultesiana Krukoff
was chosen for a chemical composition indepth
study to establish a potential utility in medicinal
or industrial fields. For this analysis, a preliminary
phytochemical study of three organs of the plant
steams, seeds and leafs was made; the purpose
was to find the main secondary metabolites associated with biological activities: alkaloids, flavonoids, tannins, saponins, antracenic derivates, steroids, coumarins, cardiotonic glycosides and terpenic lactones. The main compounds were alkaloids.
This fact was expected, as this species belongs to

Ingeniera Forestal, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas.
Correspondencia: lcarvajal@udistrital.edu.co.
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. yahatau@unal.edu.co
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. nsierram@unal.edu.co
Grupo Bsqueda de Principios Bioactivos, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. dcruedan@unal.edu.co

Recepcin: 4 de julio de 2009 / Aprobacin: 1 de septiembre de 2009

FORESTAL 12.indd 161

les como primera aproximacin a la ampliacin


del conocimiento qumico y a la posible utilidad
de las especies presentes en esta zona de Colombia con caractersticas agronmicas ptimas para
el establecimiento de cultivos, que permitan una
utilizacin racional de los recursos naturales de
nuestro pas, como fuente de desarrollo regional y
nacional.

Revista Colombia Forestal Vol. 12: 161-170 / Diciembre 2009

161

5/18/10 4:53:04 PM

Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)

the genus Strhychnos, widely known because of its


high alkaloid content. In addition, the existence of
flavonoids in the studied organs of the plant is very
remarkable. These compounds are well known as
scavengers, useful in prevention of diseases related with oxidative processes. Finally, the results
of this work are very useful as a first approach to
the knowledge and utility of the vegetal species
found in this location. Furthermore, this plant has
big agronomical advantages related with the culture establishment, which improves the rational use
of natural resources in our country, as a means of
regional and national development.
INTRODUCCIN
El hombre utiliza las plantas con propsitos medicinales desde tiempos prehistricos y an hoy tienen
un papel clave en el mantenimiento de la salud de
la mayor parte de la poblacin mundial, pese a los
avances de la medicina moderna. Esto si se tienen
en cuenta las diversas formas en que se utilizan, que
van desde la preparacin de decocciones e infusiones en zonas rurales y pases pobres, pasando por
los productos fitoteraputicos, hasta la obtencin
de principios activos en pases desarrollados para
la elaboracin de medicamentos. Se estima que en
el mundo se utilizan cerca de 10000 especies vegetales con fines medicinales, la mayor parte en sistemas de medicina tradicional (who 1993, Calixto
2000, Caigueral 2002, Newman et al. 2003).
En los pases en vas de desarrollo, donde vive el
75% de la poblacin mundial, se consume menos
del 15% del mercado total de medicamentos. Las
plantas medicinales representan, por tanto, el nico recurso teraputico disponible para los sectores
ms desfavorecidos de esta poblacin. Por lo anterior, las autoridades de salud a nivel mundial han
aumentado considerablemente su atencin a dichos
medicamentos, ya que por un lado constituyen la
nica medicina disponible en los pases en vas de
desarrollo y, por otro, se han convertido en una popular alternativa en los pases desarrollados (Sharapin 2002).
Para determinar la composicin qumica de las
plantas medicinales y conocer sus constituyentes
biolgicamente activos pueden seguirse metodologas que van desde un anlisis fitoqumico prelimi-

162

FORESTAL 12.indd 162

nar hasta estudios qumicos sistemticos bioguiados. Puesto que este ltimo tipo de estudio requiere
una inversin considerable de tiempo y recursos,
lo ideal es iniciar con estudios fitoqumicos preliminares que permitan hacer una discriminacin
de las plantas a estudiar en trminos de su composicin qumica, con el fin de seleccionar nicamente aquellas ms interesantes para posteriores
estudios sistemticos. El objetivo de un estudio
fitoqumico preliminar es determinar la presencia o
ausencia de los principales grupos de metabolitos
en una especie vegetal, a saber: alcaloides, antraquinonas y naftoquinonas, esteroides y triterpenos,
flavonoides, taninos, saponinas, cumarinas, lactonas terpnicas y cardiotnicos. Dado que cada uno
de estos grupos de compuestos est relacionado
con actividades biolgicas especficas, partiendo
de los resultados obtenidos en el estudio fitoqumico preliminar es posible orientar investigaciones
posteriores para determinar la actividad biolgica
de las especies en cuestin y los principios activos
involucrados.
En el caso del presente anlisis fitoqumico preliminar se parti del extracto etanlico de tres rganos hojas, semillas y tallos de Strychnos schultesiana (Loganiaceae) (Missouri Botanical Garden
2008), en los cuales se evalu la presencia de los
principales grupos de metabolitos secundarios previamente mencionados, mediante pruebas de tubo
y/o cromatografa en capa delgada que se describen de manera detallada en el siguiente apartado.
Las especies del gnero Strychnos han sido utilizadas tradicionalmente por muchas comunidades
indgenas para la preparacin de venenos conocidos como curares. Strychnos schultesiana es una
especie trepadora que presenta un comportamiento
muy favorable para su manejo y propagacin en vivero, de igual manera comienza entre los 3 y 4 aos
de edad la produccin de frutos, muy abundantes
en el sitio de recoleccin y conocidos en la poblacin con los nombres de cupat, castaa espinosa o
solita. Al no conocerse mucho de su composicin
qumica, se plante la necesidad de realizacin de
un anlisis fitoqumico preliminar para ahondar en
su conocimiento qumico.
El cupat es una planta trepadora de hojas simples,
opuestas, sin estipula ni exudado. La corteza exter-

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

5/18/10 4:53:05 PM

Lyndon Carvajal Rojas / Yoshie Hata Uribe / Noralba Sierra Martnez / Diana Rueda Nio

na es de color caf y la viva, amarilla. Las ramas


tienen espinas opuestas con las cuales asciende.
Flores de color amarillo estn dispuestas en cimas
axilares. Los frutos son bayas grandes de color
amarillo y con numerosas semillas de color curuba
que presentan una fragancia muy agradable. En la
Figura 1 se pueden observar fotografas de los diferentes rganos de la especie.
La especie se distribuye en Per, Ecuador y Venezuela. En Colombia la encontramos en el Choc
biogeogrfico, Orinoqua, regin Andina y piedemonte llanero y es usada por los indgenas de las
regiones donde se encuentra para la preparacin de
A.

curares tiles para capturar las presas fcilmente;


para ello untan la punta del dardo o de la flecha
con la cual van a herir al animal. Aunque los frutos
poseen una pulpa carnosa de un sabor muy agradable, las semillas no se deben consumir ya que contienen estricnina. Con respecto a la propagacin,
se puede utilizar la semilla de manera exitosa y la
planta es de lento crecimiento en sus primeros estados de desarrollo, en los que requiere sombra. Por
su carcter ascendente tiende a trepar sobre rboles
hasta alcanzar las copas. Se han realizado ensayos
de propagacin vegetativa que presentan buenos
resultados en vivero. La especie presenta rebrotes.
B.

C.

D.

Figura 1. Fotografas de muestras de Strychnos schultesiana A. Hojas, B. Flores, C. Frutos, D. Semillas.

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

FORESTAL 12.indd 163

163

5/18/10 4:53:22 PM

Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)

METODOLOGA
El material vegetal de cupat fue recolectado en el
mes de junio del ao 2008, en la finca El Alcaravn, vereda Los Maracos, km 1 va al Ri Ariari,
Granada, Meta. Para realizar el anlisis fitoqumico
preliminar se utiliz la metodologa corrientemente utilizada en el Departamento de Farmacia para
tal propsito (Sanabria 1983), la cual se divide en
tres etapas: procesamiento del material vegetal,
obtencin del extracto etanlico y realizacin de
la prueba de identificacin de cada uno de los metabolitos.
Procesamiento del material vegetal: Hojas, tallos
y semillas de S. schultesiana fueron sometidos a un
proceso de secado en una estufa de aire circulante a
50 C por 48 horas, trabajando cada uno de los rganos de la planta por separado. Posteriormente, el
tamao de partcula se disminuy pasando el material seco por un molino de discos (hojas y tallos) o
un molino de cuchillas (semillas), segn el caso.
Obtencin del extracto etanlico: 100 g del material vegetal seco y molido de cada uno de lo rganos a estudiar fueron sometidos separadamente
a maceracin, en un baln de fondo plano por un
tiempo de 24 horas, utilizando como solvente de
extraccin etanol del 96% en cantidad suficiente
para cubrir el material vegetal. Posteriormente se
llev a reflujo por una hora, se dej enfriar a temperatura ambiente y se filtr y concentr para eliminar el solvente y proceder a realizar las pruebas
para cada uno de los metabolitos.
Alcaloides: La mayora de los alcaloides, con excepcin de los alcaloides de amonio cuaternario y
N-xidos de amina, son solubles en solventes orgnicos poco polares, como cloroformo y mezclas
de ste, pero pueden formar sales solubles en agua
en presencia de cidos minerales diluidos, como
el cido clorhdrico al 5% en agua. Esta propiedad
cido-base se aprovech para su purificacin a partir de extractos totales. Luego de este paso inicial
se realizaron pruebas de precipitacin en medio
cido, utilizando para ello sales de metales pesados como el ioduro de potasio (reactivo de Dragendorff), el ioduro de potasio y mercurio (reactivo de
Mayer) y la sal de Reineckato de amonio, entre

164

FORESTAL 12.indd 164

otros. En la Figura 2 se describe detalladamente el


procedimiento de purificacin de alcaloides en las
muestras evaluadas.
Nafto y antraquinonas: Para la deteccin de este
tipo de metabolitos secundarios se emple la reaccin de Borntrger-Kraus. Para ello, el extracto
etanlico seco fue extrado con una solucin etanlica en agua (1:7), a la cual se adicion perxido de
hidrgeno y cido sulfrico y se procedi a calentar; bajo estas drsticas condiciones, se hidrolizan
los enlaces glicosdicos y se oxidan las antronas y
los antranoles hasta antraquinonas, las cuales fueron extradas con tolueno y agitadas en presencia
de una solucin de hidrxido de sodio al 5% que
contiene hidrxido de amonio al 2%. En caso de
presencia de nafto o antraquinonas, al dejar separar
las fases la capa alcalina (inferior) toma una coloracin que va del rosado al rojo intenso, dependiendo de la concentracin de estos compuestos en
la muestra.
Esteroides y triterpenoides libres: Para su anlisis preliminar en plantas la prueba ms comnmente usada es la de Liebermann-Burchard. Para
realizar esta prueba, fue necesario hacer un procedimiento de separacin previo en el cual se obtuvo
un extracto en ter de petrleo a partir del extracto
etanlico seco. Este extracto etreo se extrajo de
nuevo con una mezcla de metanol - agua 9:1, se
recuper la capa superior y se someti a cromatografa en capa delgada, empleando gel de slice F254
como fase estacionaria y una fase mvil compuesta
por una mezcla hexano - acetato de etilo (95:5).
La cromatografa desarrollada se dej secar antes
de revelarla, se asperj con el reactivo de Liebermann-Burchard (solucin etanlica de anhdrido
actico en presencia de cido sulfrico) y se someti a calentamiento (110 C) durante 5 a 10 min. Se
considera resultado positivo si bajo estas condiciones aparecen manchas en cualquier tonalidad del
rojo, azules o verdes.
Flavonoides: Para su deteccin se emplea principalmente la reaccin de la cianidina, conocida tambin como reaccin de Shinoda. Para ello el extracto
etanlico seco se extrajo con una solucin etanlica en agua (1:7) y se filtr. Este filtrado, denomina-

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

5/18/10 4:53:23 PM

Lyndon Carvajal Rojas / Yoshie Hata Uribe / Noralba Sierra Martnez / Diana Rueda Nio

do A, se puso en un tubo de ensayo con 0.5 g de


magnesio en polvo. Seguidamente se adicion hcl
concentrado, gota a gota, hasta el desprendimiento
de hidrgeno. Si en estas condiciones se observa la
aparicin de coloracin rojiza, violeta o naranja, se
considera positivo para compuestos con el ncleo
de la -benzopirona (flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, isoflavonoides y xantonas).
Tambin existe otro tipo de flavonoides denominados leucoantocianidinas, las cuales por cambio
en el pH se tornan de incoloras a intensamente
coloreadas de rojo. Para detectar la presencia de
este tipo de compuestos en la muestra, el filtrado
A fue transferido a un tubo de ensayo, se adicion
cido clorhdrico concentrado y se someti a calentamiento en un bao mara hirviendo durante 10-15
min. La aparicin de coloracin rojiza bajo estas
condiciones indica la presencia de leucoantocianidinas.
Taninos: Estos polifenoles tienen la propiedad
de unirse a las protenas y precipitarlas. Por esta
razn, la prueba ms empleada para la deteccin
de este grupo de metabolitos secundarios emplea
el reactivo de gelatina-sal, el cual produce un precipitado blanco en presencia de taninos, luego de
haber extrado el extracto etanlico total con una
solucin acuosa de etanol (7:1). Estos precipitados
formados como consecuencia de la presencia de taninos deben ser solubles en urea 10 M y producir
coloraciones verdes, azules o negras tras la adicin
de cloruro frrico al 10% en agua.
Saponinas: Son glicsidos cuya aglicona consiste
en un ncleo esteroidal o triterpnico; esta caracterstica estructural les confiere un carcter anftero que les permite actuar como tensioactivos.
Aprovechando esta propiedad, las dos pruebas ms
empleadas en la deteccin de saponinas son la de
hemlisis y la de formacin de espuma, puesto que
al ser tensioactivas las saponinas inestabilizan la
membrana celular de los eritrocitos, induciendo su
ruptura.
Para realizar la prueba de hemlisis el extracto etanlico fue extrado con la solucin acuosa (7:1). En
caso de ausencia de taninos, se procedi a realizar
las pruebas; de lo contrario, con el fin de eliminarlos, se adicionaron aproximadamente 2 g de xido

de magnesio, evaporando a sequedad y extrayendo


luego con etanol al 96%. Una vez eliminados los
taninos, 1 ml de esta solucin se puso en un tubo de
ensayo en presencia de 5 ml de suspensin normalizada de glbulos rojos. Como patrn de hemlisis
positiva se emplearon 0.5 ml de una solucin de
digitonina (10 mg en 100 ml de etanol del 80%)
en presencia de 5 ml de suspensin normalizada
de glbulos rojos y como blanco se emplearon 5ml
de la misma suspensin con 1 ml de agua. La prueba de hemlisis es considerada positiva cuando en
10 min se presenta hemlisis en el patrn y en la
muestra, mientras que el blanco permanece sin hemolizar.
La prueba de formacin de espuma consiste en
agitar vigorosamente la solucin acuosa (7:1), obtenida del extracto etanlico total, en un tubo de
ensayo y observar la espuma formada. sta debe
ser estable por lo menos 30 minutos para poder establecer la presencia de saponinas.
Glicsidos cardiotnicos: Estos compuestos poseen caractersticas estructurales similares a las de
las saponinas, con una estructura compuesta por
un ncleo esteroidal glicosilado (2 desoxiazcares)
y una lactona insaturada de 5 o 6 miembros. Para
la deteccin de stos pueden emplearse pruebas
en tubo de ensayo especficas para cada una de
las partes que componen la molcula, o tcnicas
cromatogficas. El presente anlisis fitoqumico
preliminar emple cromatografa en capa delgada (ccd), sirvindose de dos placas cromatogrficas eludas en la misma fase mvil (cloroformo:
metanol: agua 82:17:1) con el fin de comparar los
valores de Rf de los compuestos revelados. Una de
ellas se revel con el reactivo de vainillina - cido
ortofosfrico (1% vainillina y 10% de cido en etanol), especfico para esteroides y triterpenos, con
el fin de detectar el ncleo esteroidal de los cardiotnicos. La otra placa se revel con la reaccin
de Raymond, la cual utiliza m-dinitrobenceno (2%
en etanol) y naoh al 20%; en estas condiciones, las
-lactonas - insaturadas producen coloraciones
violeta que desaparecen rpidamente. De esta manera, slo aquellas manchas que revelan en las dos
placas pueden considerarse cardiotnicos pues poseen el ncleo esteroidal adems de la lactona insaturada. Esto se evidencia claramente con un patrn
de digitoxina.
Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

FORESTAL 12.indd 165

165

5/18/10 4:53:24 PM

Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)

Practicar las 4
reacciones de
precipitacin

Figura 2. Anlisis preliminar de alcaloides.

Previo a la realizacin de la cromatografa es necesario eliminar las clorofilas del extracto, ya que
intervienen con el ensayo. Es necesario hacer lo
mismo en el caso del anlisis de cumarinas y lactonas sesquiterpnicas. Para ello el extracto etanlico
seco fue tratado con un volumen aproximadamente
igual de una solucin de acetato de plomo al 4%
que contena 0.5% de cido actico, con el fin de
precipitar las clorofilas presentes. Esta mezcla se
dej en reposo durante aproximadamente 15 min y
se filtr a presin atmosfrica. El filtrado as obtenido fue concentrado a 3/4 de su volumen en eva-

166

FORESTAL 12.indd 166

porador rotatorio, se dej enfriar y se extrajo en


un embudo de decantacin con 2 volmenes de 30
ml de cloroformo. Se combinaron las capas clorofrmicas, se adicion sulfato de sodio anhidro, se
filtr y se concentr a 3 ml aproximadamente, obteniendo as la solucin a ser utilizada en las pruebas cromatogrficas.
Cumarinas: Son compuestos derivados de la benzopirona. Dado que en su estructura presentan
un gran nmero de instauraciones, estos compuestos exhiben una fuerte fluorescencia azul o verde
al ser irradiados con luz ultravioleta, propiedad

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

5/18/10 4:53:31 PM

Lyndon Carvajal Rojas / Yoshie Hata Uribe / Noralba Sierra Martnez / Diana Rueda Nio

que se aprovecha para su deteccin. Adicionalmente, puesto que todas las cumarinas poseen en
su estructura una -lactona, pueden identificarse
mediante las reacciones propias para lactonas. Por
este motivo, con el fin de determinar la presencia
de cumarinas en la muestra, se desarroll una cromatografa en capa delgada empleando gel de slice
F254 como fase estacionaria y una mezcla cloroformo-cetona 9:1 como fase mvil. Una vez eluda la
placa, se observ a la luz uv (365 y 254 nm) antes
de revelarse con la reaccin del hidroxamato frrico, especfica para lactonas. Esta reaccin consiste
en asperjar la placa con una mezcla de volmenes
iguales de clorhidrato de hidroxilamina al 2% en
etanol y naoh 2N, calentar por 5-10 min a 100 C
y, al cabo de este tiempo, dejar enfriar y asperjar
con volmenes iguales de hcl 2N y FeCl3 al 1% en
etanol. Aquellos compuestos con fluorescencia al
ultravioleta que luego de la aplicacin del reactivo
revelador exhiben coloracin anaranjada al visible
son considerados cumarinas. Una placa cromatogrfica adicional puede asperjarse con koh al 5%,
el cual acenta fuertemente la fluorescencia de estos compuestos al ser expuestos a la luz uv.
Lactonas sesquiterpnicas: Estos compuestos,
como su nombre lo indica, son terpenos con un esqueleto de 15 tomos de carbono, que tienen adems en su estructura una lactona. Para identificar
estos compuestos se hicieron dos cromatografas
en capa delgada (fase estacionaria: gel de slice
F254) eludas con una fase mvil compuesta por
cloroformo y acetona (9:1). Una de las cromatografas fue revelada para terpenos, como se indic
en el caso de los glicsidos cardiotnicos, y la otra
se derivatiz para lactonas con el reactivo de hidroxamato frrico, como se indic en el caso de
las cumarinas. Ambas pruebas deben ser positivas
para poder concluir que la muestra presenta este
tipo de metabolitos secundarios.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se presentan los resultados obtenidos
luego de hacer el anlisis fitoqumico preliminar de
los tres rganos seleccionados de S. schultesiana.

DISCUSIN
En el presente anlisis fitoqumico preliminar de
hojas, tallos y semillas de la especie S. schultesiana se parti de extractos etanlicos puesto que este
solvente tiene la capacidad de extraer compuestos
de una amplia gama de polaridades, adems de ser
menos costoso y txico que otros solventes orgnicos. La metodologa seguida para este anlisis fue
la previamente estandarizada por Sanabria (1983),
y contempla la deteccin de los metabolitos secundarios generalmente relacionados con actividades
biolgicas.
A continuacin se presenta la discusin de los resultados consignados en la Tabla 1, en relacin a los
rganos de la especie S. schultesiana evaluados.
Con respecto a los alcaloides, fue el grupo de metabolitos secundarios ms abundante encontrado en
los tres rganos. Sin embargo, dado que la cantidad
de precipitado obtenido es proporcional a la concentracin de alcaloides en la muestra, puede inferirse que las hojas son el rgano de la planta donde
tiene lugar la mayor acumulacin de alcaloides,
aunque cabe aclarar que en tallos y semillas tambin se encuentran en concentracin apreciable.
Es conocido que las especies del gnero Strychnos
presentan una alta concentracin de alcaloides de
tipo indlico (estricnina, Yang & Yang 1993, Santos et al. 2006), los cuales son solubles principalmente en solventes de baja polaridad. Por este motivo, los extractos obtenidos con este tipo de solventes durante el proceso de purificacin (filtrados
A y B) presentaron una mayor concentracin de
alcaloides, tal como se muestra en la Tabla 1. Adems de alcaloides de tipo indlico, puede inferirse
la presencia de alcaloides de amonio cuaternario o
N-xidos de amina en las semillas y las hojas de
esta planta, puesto que se obtuvo resultado positivo
con el Reineckato de amonio, tanto en el extracto
inicial como en la fase ms polar del proceso de
purificacin, donde se encuentra concentrado este
tipo de alcaloides. Sin embargo, se deduce que
la concentracin de stos es muy baja, lo que se
evidencia en la reducida cantidad de precipitado
obtenido.

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

FORESTAL 12.indd 167

167

5/18/10 4:53:32 PM

Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
Tabla 1. Resultados de los anlisis fotoqumicos preliminares de hojas, tallos y semillas de Strychnos schultesiana.
rgano

Metabolito

Alcaloides

Hojas

Tallos

Semillas

Filtrado A

+++

++

Filtrado B

+++

++

Filtrado C

++

Filtrado D

++

Capa acuosa 3

Capa Cloroformo

Esteroides y/o triterpenoides libres

++

++

++

Flavonoides

++

++

++

Taninos

Saponinas

Glicsidos cardiotnicos

Cumarinas

Lactonas sesquiterpnicas

Nafto/Antraquinonas

+ Presencia escaza, ++ Presencia relativamente abundante, +++ Presencia abundante, - No detectado.

La cromatografa realizada para la deteccin de


esteroides y/o triterpenos permite determinar la
presencia de estos compuestos en las tres muestras
evaluadas, lo que se evidencia en la aparicin de
diversas manchas de tonalidades azulosas y rojizas. Las hojas presentan un mayor nmero de estos
compuestos en comparacin con semillas y tallos.
Segn lo observado, el lupeol no se encuentra presente en esta planta puesto que en ninguno de los
rganos evaluados se observan manchas con un valor de Rf similar al obtenido para este patrn.
El anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos
y semillas de S. schultesiana permiti comprobar
tambin la presencia de flavonoides en la especie,
ya que en los tres rganos evaluados se obtuvieron resultados positivos con la reaccin de Shinoda y con la del cido clorhdrico. Lo anterior
indica la presencia de flavonoides tipo flavona,
flavonol, flavanona, flavanonol, isoflavonoide y
leucoantocianidinas.
Por otra parte, puesto que slo las hojas de S. schultesiana ocasionaron precipitacin del reactivo gelatina - sal, puede concluirse que en este rgano se
concentran los taninos producidos por la planta, y

168

FORESTAL 12.indd 168

dado que el precipitado obtenido es soluble en urea


y produce coloracin verde tras la adicin de cloruro frrico, se infiere que estos taninos son del tipo
catquico o condensados. Sin embargo, la reducida
cantidad de precipitado obtenido indica una baja
concentracin de taninos en la muestra.
Respecto al anlisis de saponinas, slo el extracto
etanlico de las hojas de la especie evaluada produjo hemlisis comparable a la observada con el
patrn, mientras que con los extractos de tallos y
semillas los eritrocitos permanecieron intactos,
lo que se evidenci por la turbidez de la suspensin de glbulos rojos. De lo anterior se infiere
que de los tres rganos analizados, slo las hojas
contienen saponinas. Por otro lado, los resultados
de la prueba de espuma para semillas y tallos concuerdan con esta conclusin, puesto que al agitar
la muestra no se observ la formacin de espuma
abundante ni estable; sin embargo, a pesar de los
resultados obtenidos en la prueba de hemlisis para
el extracto de hojas, el ensayo de espuma arroj
resultados negativos, lo cual puede deberse a que,
como se expuso anteriormente, no todas las saponinas tienen la capacidad de producir espuma. Aun
con estos resultados a simple vista contradictorios

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

5/18/10 4:53:33 PM

Lyndon Carvajal Rojas / Yoshie Hata Uribe / Noralba Sierra Martnez / Diana Rueda Nio

para el extracto de hojas, puede inferirse la presencia de saponinas en l, pues la prueba ms concluyente para la determinacin de saponinas es la de
hemlisis.
En cuanto a la deteccin de glicsidos cardiotnicos, ninguno de los esteroides observados tras revelar una de las placas con vainillina present coloracin violeta similar a la del patrn en la placa
revelada con la reaccin de Raymond, por lo cual
puede deducirse que la especie S. schultesiana no
contiene glicsidos cardiotnicos en hojas, tallos
ni semillas. Por su parte, el patrn de digitoxina
produjo coloraciones violetas, al ser revelado tanto
con el reactivo de vainillina en cido o-fosfrico
como con el de Raymond, tal como se esperaba.
Para la deteccin de cumarinas se emplearon tres
fases mviles, de las cuales aquella constituida por
tolueno-ter etlico (1:1), saturada con cido actico al 10%, permiti una mejor separacin de los
componentes de cada extracto, encontrndose as
una mancha fluorescente bien definida en el extracto de tallos, otra en el extracto de semillas y
cuatro en el de hojas; sin embargo, al revelar con la
reaccin del hidroxamato frrico, ninguna de ellas
present coloracin caf similar a la del patrn,
descartando as la presencia de cumarinas en los
extractos.
Para confirmar lo anterior, se asperj una de las
placas desarrolladas en acetato de etilo, con koh al
5%, con lo cual no se intensific la fluorescencia de
las manchas observadas, que incluso desapareci,
confirmando que no se trata de cumarinas sino de
otros compuestos poliinsaturados que pueden fluorescer tambin al uv.
Por otro lado, si bien los compuestos fluorescentes
presentes en semillas y hojas de S. schultesiana no
se colorearon tras revelar la placa con la reaccin
del hidroxamato frrico, los extractos de tallos y
semillas presentaron manchas de color caf que no
fluorescan al uv, lo que indica la presencia de lactonas. Sin embargo, al revelar con el reactivo de
vainillina, slo las lactonas presentes en el extracto de semillas poseen una parte terpnica que se
observa de color violeta, mientras que la mancha

observada en el extracto de tallos no revel, por lo


que puede concluirse que aunque los tallos poseen
lactonas, no son de tipo terpnico.
Para esta especie no se encuentran reportes sobre
composicin qumica. Sin embargo, los resultados
obtenidos del presente anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de esta planta coinciden con los reportados para otras especies del
gnero Strychnos. Ejemplo de lo anterior son los
reportes de la presencia de alcaloides en las hojas
de S. pseudoquina y en semillas de S. nux-vomica
(Nicoletti & Colus 1984, Yang & Yang 1993, Santos et al. 2006), flavonoides en hojas de S. pseudoquina y S. spinosa (Nicoletti et al. 1984, Hoet et al.
2004, Santos et al. 2006) y esteroides y cidos grasos en races y tallos de S. nitida (Gu et al. 1997).
Adicionalmente, se reporta la presencia de otros
grupos de metabolitos no analizados en esta oportunidad, como lignanos en tallos de S. vanprukii
(Thongphasuk et al. 2004), glicsidos fenlicos,
iridoides en madera y corteza de S. axillaris (Itoh
y Colus 2008) y cidos orgnicos como el qunico
y el lognico y steres de los mismos en corteza y
madera de S. lucida (Itoh et al. 2008).
A pesar de no haber detectado cumarinas en el presente anlisis fitoqumico preliminar de S. schultesiana, se ha reportado la presencia de este tipo de
metabolitos secundarios en las races de S. cathayensis (Luo 2006). Sin embargo, este es un grupo
de compuestos cuya presencia no se haya ampliamente descrita en la literatura de otras plantas del
gnero Strychnos, por lo que puede tratarse de un
grupo poco difundido en estas especies y presente en estos rganos (races). Adems, cabe aclarar
que la presencia de un tipo de metabolito en una
planta no condiciona su presencia en otras especies
del mismo gnero.
Grupos de metabolitos secundarios como los glicsidos antracnicos, los cardiotnicos, saponinas
y taninos, los cuales no fueron detectados en el
presente estudio o slo fueron detectados en uno
de los rganos evaluados, no se encuentran reportados en la literatura consultada para otras especies
del gnero Strychnos.

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

FORESTAL 12.indd 169

169

5/18/10 4:53:34 PM

Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)

CONCLUSIONES
Los resultados del anlisis fitoqumico preliminar
efectuado sobre la muestra de hojas de S. schultesiana Krukoff evidencian la presencia de alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas, esteroides
y/o triterpenoides. Los tallos y las semillas de la
misma especie presentan alcaloides, flavonoides,
lactonas y esteroides. En estos rganos no se detect la presencia de saponinas ni taninos. Las semillas contienen lactonas terpnicas, mientras que
en los tallos se encuentran lactonas pero no de tipo
esteroidal. En ninguno de los rganos evaluados se
encontr la presencia de cumarinas ni glicsidos
cardiotnicos o antraquinnicos.
AGRADECIMIENTOS
A la Corporacin para el Desarrollo del rea del
Manejo Especializado la Macarena CORMACARENA, por la financiacin de este proyecto el
cual se desarroll en el marco del convenio 05 de
2001 suscrito con la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Calixto, J. B. 2000. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for
herbal medicines (phytotherapeutic agents).
Brazilian Journal of Medical and Biological
Research 33: 179-189.
Caigueral, S. 2002. La fitoterapia: una teraputica para el tercer milenio? Revista de Fitoterapia (2): 101-121.
Gu, Z., T. Li, P. Xiao, J. Chen & W. Lian. 1997.
Chemical constituents of Strychnos nitida G.
Don. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 22 (1): 4041.
Hoet, S., F. Opperdoes, R. Brun, V. Adjakidj &
J. Quetin-Leclercq. 2004. In vitro antitrypanosomal activity of ethnopharmacologically
selected Beninese plants. Journal of Ethnopharmacology 91 (1): 37-42.
Itoh, A., Y. Tanaka, N. Nagakura, T. Nishi &
T. Tanahashi. 2006. A quinic acid ester from
Strychnos lucida. J. Nat. Med 60: 146-148.

170

FORESTAL 12.indd 170

Luo, T. 2006. Studies on the chemical constituents and biological activities from the stem
of Pourthiaea lucida and the root of Strychnos cathayensis. Masters Thesis. Graduate Institute of Pharmaceutical Technology,
Tajen University. Taiwan. Disponible en:
http://192.192.215.232/ETD-db/ETD-search/
view_etd?URN=etd-0717107-162042
Missouri Botanical Garden. 2008. Disponible en:
http://www.tropicos.org/
Nicoletti, M., M. Goulart., R. de Lima, A.
Goulart, F. Delle Monache & G. Marini
Bettolo. 1984. Flavonoids and alkaloids from
Strychnos pseudoquina. J. Nat. Prod. 47 (6):
953-957.
Newman, D. J., G. M. Cragg & K. M. Snader.
2003. Natural products as sources of new drugs
over the period 1981 - 2002. Journal of Natural
Products 66: 1022-1037.
Sanabria, A. 1983. Anlisis fitoqumico preliminar. Metodologa y su aplicacin en la evaluacin de 40 plantas de la familia Compositeae.
Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia.
Bogot.
Santos, F., I. Colus, M. Silva, W. Villegas & E.
Varanda. 2006. Assessment of dna damage by
extracts and fractions of Strychnos pseudoquina, a Brazilian medicinal plant with antiulcerogenic activity. Food and Chemical Toxicology
4 (9): 1585-1589.
Sharapin, N. 2002. Materias primas vegetales
para la industria de productos fitofarmacuticos. Revista de Fitoterapia 1 (3): 23-28.
Thongphasuk, P., R. Suttisri, R. Bavovada & R.
Verpoorte. 2004. Antioxidant lignan glucosides from Strychnos vanprukii. Fitoterapia 75
(7-8): 623-628.
World Health Organization (WHO). 1993. Research guidelines for evaluating the safety and
efficacy of herbal medicines. Geneva. Pg. 57.
Yang, X. & Z. Yan. 1993. Studies on the chemical
constituents of alkaloids in seeds of Strychnos
nux-vomica L. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi
18 (12): 739-40, 763-764.

Revista Colombia Forestal Vol. 12 - Diciembre 2009

5/18/10 4:53:35 PM

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

Sistema de Informacin Cientfica

Eva Noem Obledo Vzquez, Norma Flores Verduzco, Jess Cervantes Martnez
Deteccin del Efecto de un Extracto Vegetal Antimicrobiano Sobre Plantas de Agave (Agave tequilana Weber
var. azul) Cultivadas in vitro Utilizando Fluorescencia Inducida por Laser (LIF)
Revista Mexicana de Fitopatologa, vol. 22, nm. 3, diciembre, 2004, pp. 328-332,
Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C.
Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=61222302

Revista Mexicana de Fitopatologa,


ISSN (Versin impresa): 0185-3309
mrlegarreta@prodigy.net.mx
Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C.
Mxico

Cmo citar?

Fascculo completo

Ms informacin del artculo

Pgina de la revista

www.redalyc.org
Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

328

/ Volumen 22, Nmero 3, 2004

Deteccin del Efecto de un Extracto Vegetal Antimicrobiano


Sobre Plantas de Agave (Agave tequilana Weber var. azul)
Cultivadas in vitro Utilizando Fluorescencia Inducida por Laser
(LIF)
Eva Noem Obledo-Vzquez, Norma Flores-Verduzco, y Jess Cervantes-Martnez,
Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco A.C.,
Av. Normalistas 800 S.H., Col. Colinas de la Normal, Guadalajara Jalisco, Mxico CP
44270. Correspondencia: nobledo@ciatej.net.mx
(Recibido: Mayo 19, 2004 Aceptado: Junio 30, 2004)
Obledo-Vzquez, E.N., Flores-Verduzco, N., y CervantesMartnez, J. 2004. Deteccin del efecto de un extracto vegetal
antimicrobiano sobre plantas de agave (Agave tequilana
Weber var. azul) cultivadas in vitro utilizando fluorescencia
inducida por laser (LIF). Revista Mexicana de Fitopatologa
22:328-332.
Resumen. El empleo de antimicrobianos de origen vegetal
es una alternativa para evitar o disminuir los efectos negativos
que los antibiticos han mostrado sobre el desarrollo y
crecimiento de especies vegetales in vitro. En este trabajo se
utiliz la fluorescencia inducida por laser como una
herramienta no invasiva y no destructiva para la deteccin
del efecto de la adicin de un extracto comercial de toronja
(citricidal) sobre plantas de Agave tequilana in vitro.
Mediante esta tcnica se detectaron en tiempo real los
cambios en la actividad fotosinttica de las plantas. Se
obtuvieron espectros y cocientes de intensidad de
fluorescencia F690/F740, los cuales proporcionaron de
manera conjunta informacin sobre el nivel de estrs. Los
resultados obtenidos indicaron que el extracto de toronja
aplicado por un perodo de 40 das no afecta
considerablemente la actividad fotosinttica de las plantas,
por lo que se le considera como un producto factible de
emplearse en el cultivo in vitro de Agave tequilana para
controlar contaminaciones microbianas.
Palabras clave adicionales: Extracto de toronja, Citrus
grandis.
Abstract. The use of antimicrobial compounds derived from
plants is an alternative to avoid o reduce the negative effects
that antibiotics have shown on development and growth of
plant species in vitro. In this work, the laser-induced
fluorescence was used as a non-invasive and non-destructive
tool to detect the effect of the addition of the commercial
grapefruit extract (citricidal ) on Agave tequilana plants
cultured in vitro. This technique was able to detect in real
time, the changes in plant photosynthetic activity. The

spectrum and the F690/F740 fluorescence ratio intensity were


obtained, which together provided information about the stress
levels. The results indicated that the grapefruit extract used
during 40 days, does not affect the photosynthetic activity of
plants; therefore, the extract is a feasible product to be used
for control of microbial contamination on Agave tequilana
in vitro culture.
Additional keywords: Grapefruit extract, Citrus grandis.
Uno de los requisitos indispensables de la micropropagacin
in vitro de especies vegetales es la asepsia de los cultivos.
An cuando en la naturaleza las plantas interaccionan de
manera constante con microorganismos, tanto benficos,
como neutros o perjudiciales, el cultivo in vitro requiere la
total ausencia de ellos debido a que el medio de cultivo, al
contener sales minerales, azcares, vitaminas, hormonas, y
agua, es adecuado para la reproduccin de microorganismos
los cuales presentan una mayor tasa de crecimiento que la de
las plantas, por lo que la planta puede ser totalmente invadida.
La contaminacin en los medios de cultivo in vitro puede
combatirse utilizando antibiticos; sin embargo, debido a la
susceptibilidad de las plantas, el rango de antibiticos que
puede utilizarse es reducido. Se emplean principalmente los
antiobiticos ampicilina, oxytetraciclina, cefotaxima,
augmentina, rifampicina, y oligomicina (George, 1993), los
cuales, sin embargo, deben evaluarse antes de aplicarse a un
protocolo de micropropagacin masiva, ya que se han
reportado diferentes respuestas de las especies vegetales a
la aplicacin de estos productos. La contaminacin puede
causar grandes prdidas y su control es usualmente el
problema ms frecuente y difcil de los laboratorios de
micropropagacin (George, 1993). Cualquier tipo de
infeccin puede alterar el crecimiento y desarrollo de la planta,
y aunque tericamente una contaminacin persistente puede
ser removida aadiendo uno o ms antibiticos, no es factible
utilizarlos de manera rutinaria debido principalmente al efecto
fitotxico que presentan. En Mxico, una de las especies de

Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/


agave de mayor importancia es el Agave tequilana Weber
var. azul con el cual se elabora la bebida alcohlica llamada
tequila, la cual en aos recientes sufri una escasez debido a
problemas fitosanitarios. Como respuesta a este problema se
obtuvieron por medio de tcnicas biotecnolgicas, genotipos
resistentes a sus principales microorganismos patgenos y se
propagaron masivamente in vitro por medio de proliferacin
de yemas axilares. Durante esta propagacin se presentaron
problemas de contaminacin bacteriana, los cuales no
pudieron ser controlados de manera efectiva con antibiticos
utilizados en cultivo de especies vegetales in vitro (CastilloCampohermoso, 2002) por lo que se buscaron otras
alternativas. Una de ellas fue el empleo de un extracto
comercial de toronja (Citrus grandis Osbeck) con conocida
actividad antimicrobiana (Orlikowski, 2001; 2002; Wojdyla,
2001). Por otro lado, en los ltimos aos, la fluorescencia
inducida por laser (LIF) ha sido aplicada como una eficiente
herramienta para el estudio de la fisiologa y fotosntesis
vegetal, as como para detectar daos en el aparato
fotosinttico (Lichtenthaler y Babani, 2000). El empleo de
LIF se basa en que la luz absorbida por los pigmentos
fotosintticos es utilizada para la fotosntesis o disipada como
calor o como fluorescencia. Bajo condiciones ptimas de
fotosntesis, la disipacin de la energa de la luz absorbida
va fluorescencia es baja, por lo tanto, la fluorescencia se
relaciona inversamente a la tasa de fotosntesis (Lichtenthaler,
1988). El cociente de intensidad de fluorescencia F690/F740
se ha utilizado para indicar diferentes tipos de estrs, tales
como deficiencia de nutrientes, estrs de agua, presencia de
herbicidas e infecciones por virus, bacterias, y hongos
(Apostol et al., 2003; Balachandran et al., 1997; CervantesMartnez et al., 2002; Chappelle et al., 1984; Lichtenthaler y
Rinderle, 1988a; Ldeker et al., 1996). El objetivo de este
trabajo fue evaluar el efecto de la adicin del extracto
comercial de toronja en plantas de Agave tequilana cultivadas
in vitro utilizando la tcnica LIF.
MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron plantas de Agave tequilana pertenecientes a la
coleccin de genotipos del Centro de Investigacin y
Asistencia en Tecnologa y Diseo del estado de Jalisco, A.C.,
Mxico, que se caracterizan por ser resistentes a cepas
patgenas de Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr. y de
Erwinia carotovora (Jones) Bergy. Las plantas se cultivaron
in vitro en un medio de cultivo basal MS (Murashige y Skoog,
1962) suplementado con vitaminas L2 (Phillips y Collins,
1979). Los reguladores de crecimiento utilizados fueron 0.025
mg/l de cido 2, 4-diclorofenoxiactico y 10 mg/l de
benciladenina (Robert et al., 1987). Despus de 30 das de
incubacin a 27C, con un fotoperodo de 16 h y una
irradiacin de 25 mol m-2 s-1 se utiliz el extracto de toronja
disponible comercialmente (Citricidal) para aplicar los
siguientes tratamientos (9 plantas por tratamiento): 1) plantas
testigo sin extracto, 2) plantas con 0.1% de extracto aplicado
como enjuague, 3) plantas con 0.1% de extracto incorporado

329

al medio de cultivo, 4) plantas con 1% de extracto aplicado


como enjuague, y 5) plantas con 1% de extracto incorporado
al medio de cultivo. El enjuague se realiz por medio de la
inmersin completa de la planta durante 10 segundos en una
solucin acuosa del extracto antes de resembrarse en medio
de cultivo fresco. La incorporacin del extracto al medio de
cultivo se realiz adicionndolo a su formulacin. Las plantas
permanecieron en incubacin por 40 das antes de las
mediciones. Al final del perodo de incubacin se evalu la
calidad, crecimiento longitudinal y espectros de fluorescencia
de las plantas. La calidad de las plantas se evalu mediante
una escala ordinal del 1 al 3, donde: 1 representa plantas con
clorosis, sin brotes y con tejido deshidratado; 2, plantas sin
clorosis, turgentes y sin brotes; y 3, plantas sin clorosis,
turgentes y con brotes. El crecimiento se determin midiendo
en cm la hoja ms alta.
Para obtener los espectros de fluorescencia se utiliz un lser
de He-Ne como fuente de excitacin emitiendo a 632.8 nm y
con una potencia de salida de 1 mW. Se irradi con el lser
un rea constante (10 mm dimetro) de la superficie de la
hoja. La fluorescencia emitida por la regin irradiada fue
colectada con una fibra ptica bifurcada con un ncleo de
dimetro de 200 m, la cual fue acoplada a un espectrmetro
porttil de 2,048 elementos de CCD (S2000, Ocean Optics,
Inc, Dunedin, FL, USA). La coleccin de datos as como su
procesamiento y anlisis, fueron hechos en tiempo real con
una computadora porttil y un software comercial OOI Base
(Ocean Optics, Inc, Dunedin, FL).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Despus de 40 das de incubacin, las plantas que
permanecieron en contacto con el extracto al 0.1% no
presentaron diferencias visuales comparadas con las plantas
testigo. Sin embargo, las que permanecieron en contacto con
la concentracin del 1% de extracto en el medio de cultivo,
presentaron diferencias muy evidentes en cuanto a su longitud
y en su calidad (Fig. 1 y Cuadro 1). Los espectros de
fluorescencia de las plantas cultivadas in vitro mostraron los
dos mximos caractersticos de las plantas superiores (Hall y
Rao, 1995); un mximo a 690 nm (fotosistema II) y el otro a
740 nm (fotosistema I) (Fig. 2). Las plantas con extracto tanto
en el enjuague como en el medio de cultivo mostraron un
mayor incremento de fluorescencia a 690 nm que a 740 nm
comparadas con las plantas testigo. Este incremento de
emisin de fluorescencia indica una declinacin de la funcin
fotosinttica ocasionada por el agente estresante, es decir por
el extracto de toronja. Resultados similares fueron reportados
por Lichtenthaler y Rinderle (1988a) al aplicar herbicida en
hojas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) y por Chapelle et al.
(1984) en plantas de maz (Zea mays L.) estresadas por una
deficiencia de potasio. Por el contrario, en el mximo de 740
nm, la concentracin menor tanto en el enjuague como en el
medio de cultivo present una ligera disminucin, la cual
puede ser debida a una menor reabsorcin de energa por
parte del fotosistema I, a diferencia de lo reportado por

332

/ Volumen 22, Nmero 3, 2004

19:529-585.
Ldeker, W., Dahn, H.G., and Gnther, K.P. 1996. Detection
of fungal infection of plants by laser-induced fluorescence:
an attempt to use remote sensing. Journal of Plant
Physiology 148:579-585.
Murashige, T., and Skoog, F. 1962. A revised medium for
rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum 15:473-497.
Orlikowski, L.B. 2001. Plant extracts in the control of
Phytophthora cryptogea. Meded Pijksuniv Gent Fak
Landbouwkd Toegep Biol Wet. 66:83-89.
Orlikowski, L.B. 2002. Growth and sporulation of some
pathogenic fungi in the presence of grapefruit extract.

Meded Pijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet.


67:315-320.
Phillips, G.C., and Collins, G.B. 1979. In vitro tissue culture
of selected legumes and plant regeneration from callus
cultures of red clover. Crop Science 19:59-64.
Robert, M.L., Herrera, J.L., Contreras, F., and Scorer, K.
1987. In vitro propagation of Agave fourcroydes Lem.
(henequen). Plant Cell Tissue and Organ Culture 8:37-48.
Wojdyla, A.T. 2001. Grapefruit extract activity in the control
of rose powdery mildew and black spot. Meded Pijksuniv
Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 66:167-177.

USO DE ESPECTROSCOPIA DE RMN Y MALDI-TOF MS


EN LA ELUCIDACION ESTRUCTURAL DE FLAVONOIDES
ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE LA PLANTA
MEDICINAL CHILENA Cheilanthes glauca (Cav.) Mett.
E. R. Pastene1*, T. Wilkomirsky1, G. Bocaz2a, J. Havel2, I. Peric3,
M. Vega1, M. Gonzlez1 y J. Alderete4
1

Fac. de Farmacia, Universidad de Concepcin, Casilla 237, Concepcin, Chile


Masaryk University, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Kotlrsk 2,
61137 Brno, Czech Republic
a
Bajo autorizacin del: Departamento de Laboratorios, Servicio Mdico Legal, Ministerio de
Justicia, Av. La Paz 1012, Santiago, Chile
3
Depto. de Qumica Analtica e Inorgnica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad de
Concepcin, Casilla 160-C, Concepcin, Chile
4
Depto. De Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad de Concepcin,
Casilla 160-C, Concepcin, Chile
2

RESUMEN
La especie nativa Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., es usada en medicina popular en el
tratamiento tpico de heridas y contusiones. Un estudio del extracto metanlico total
demostr la presencia de antioxidantes en la fraccin extrada con acetato de etilo. De
esta fraccin se aisl dos flavonoides conocidos, quercetina-3-O-ramnoglucsido y
canferol-3,7-O-diramnsido. Ambos compuestos son descritos por primera vez en esta
especie. La determinacin estructural se llev a cabo mediante comparacin con
sustancias patrn, hidrlisis qumica, espectros UV, RMN-1H y 13C, COSY 1H-1H, DEPT y
MALDI-TOF MS. Slo quercetina-3-O-ramnoglucsido (rutina), demostr tener
actividad decolorante inespecfica in vitro sobre el radical DPPH.
PALABRAS CLAVES: Cheilanthes glauca,
Flavonoides, Rutina, Canferol, Antioxidantes.

RMN-1H,

RMN-13C,

MALDI-TOF

MS,

SUMMARY
Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., is a native Chilean species used in popular medicine
for the topical treatment of wounds and contusions. A study on the total methanolic
extract showed the presence of antioxidants in the ethyl acetate fraction. From this
fraction, two known flavonol glycosides were isolated, quercetin-3-O-rhamnoglucoside
and kaempferol-3,7-O-dirhamnoside. Both substances are described for the first time
in this species. Structural elucidation was carried out by comparison with standard
substances, chemical hydrolysis, UV spectra, 1H- and 13C- NMR, COSY 1H-1H, DEPT and
MALDI-TOF MS. Only quercetin-3-O-rhamnoglucoside (rutin) showed unspecific in
vitro decolourizing activity upon DPPH radical.
KEY WORDS: Cheilanthes glauca, 1H-NMR,
Rutin, Kaempferol, Antioxidants.

13

C-NMR, MALDI-TOF MS, Flavonoids,

INTRODUCCION
Cheilanthes glauca (Cav.) Mett. (Adiantaceae), es una especie nativa chilena conocida
como "Doradilla". Este helecho crece desde la cordillera central al sur del pas. En
medicina popular se emplea en forma tpica para curar heridas y en uso interno por

sus posibles propiedades antiinflamatorias, diurticas y protectoras hepticas1). Los


representantes del genero Cheilanthes aparecen citados en la literatura como helechos
ornamentales sin aplicaciones mdicas reportadas. Las investigaciones fitoqumicas
llevadas a cabo en diferentes especies de Cheilanthes se han orientado a los
compuestos apolares como cheilarinosina; 3,7 di-O-metilcanferol; 3,7,4` tri-Ometilcanferol; 7-O-metilapigenina y D-glucsido de sitosterol2,3). La especie investigada
en este trabajo no posee antecedentes fitoqumicos previos ni tampoco estudios de su
actividad biolgica.
La bsqueda de sustancias con actividad antioxidante en el reino vegetal ha tomado
caminos diferentes. Por un lado interesa encontrar fuentes de antioxidantes naturales
para ser usados como aditivos alimentarios, que puedan reemplazar total o
parcialmente a los sintticos como el butilhidroxitolueno (BHT) y butilhidroxianisol
(BHA) 4, 5, 6). La comprobada toxicidad de stos ha llevado a que muchos pases de la
Unin Europea hayan decidido reemplazarlos por productos ms inocuos 7, 8, 9). Por otro
lado, est la bsqueda de especies vegetales cuyo alto contenido en antioxidantes
(fitocomplejo antioxidante) signifique un aporte en el tratamiento y prevencin de
patologas ligadas a la oxidacin de molculas biolgicas. Esto ltimo est avalado por
la gran cantidad de informacin generada por los estudios en el vino y diferentes
frutales ricos en antocianos10, 11, 12). El uso popular de Cheilanthes glauca como agente
antiinflamatorio y hepatoprotector hace pensar en la existencia de sustancias con
capacidad captadora de radicales dentro de su composicin. Como es ampliamente
conocido, estas especies estn involucradas en los mecanismos de dao celular
descritos para ambas patologas.
Tras la actividad biolgica de un extracto vegetal existe una serie de principios activos.
Por lo tanto, el empleo de tcnicas espectroscpicas que permitan elucidar la
estructura de estas sustancias, es fundamental para delinear futuros estudios en el
mbito farmacolgico-clnico y de sntesis de molculas ms activas.
En este trabajo se presenta un fraccionamiento de antioxidantes provenientes de la
especie nativa Cheilanthes glauca, empleando como criterio orientador la capacidad
captadora del radical libre estable DPPH. La determinacin de las estructuras se llev a
cabo empleando tcnicas de resonancia nuclear magntica (RMN) y espectrometra de
masas. "Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry"
(MALDI -TOF MS) es una tcnica originalmente ideada para el estudio del peso
molecular de macromolculas (polmeros sintticos, pptidos y protenas). En los
ltimos diez aos sta tcnica y la ionizacin por electrospray (ESI), han significado un
aporte importante en el campo de las ciencias qumicas y bioqumicas 13). ESI puede ser
fcilmente acoplada a sistemas de separacin por cromatografa liquida (LC) mientras
que MALDI permite analizar en forma directa muestras mixtas sin necesidad de
acuciosos procesos de purificacin. El sistema utiliza un lser UV que desorbe la
muestra, la cual es aplicada como cristales o co-cristales formados con una matriz
especfica. Durante el proceso de desorcin y expansin, el analito es ionizado. En
general, los iones moleculares son las especies predominantes. Esto ltimo hace ms
fcil la asignacin de las masas, incluso para mezclas que contengan varias
especies14,15).
En el estudio de productos naturales constituye una poderosa herramienta porque
permite la obtencin rpida de informacin sobre pesos moleculares con pequeas
cantidades de muestra. La aplicacin no slo se ha limitado al estudio de
macromolculas. Los trabajos de Hbner et. al. demuestran la potencialidad de MALDI

en la elucidacin estructural de glicosilflavonoides. Estos investigadores consideran que


el uso conjunto de MALDI con otros tipos de espectrometra de masa con mecanismos
diferentes de ionizacin (FAB-MS, D/CI-MS, etc) en paralelo con los experimentos de
RMN (COSY, NOESY, HETCOR, HMBC, etc), entregan informacin de gran valor para la
completa elucidacin estructural de flavonoides oligosacridos 16).
PARTE EXPERIMENTAL
Los espectros de RMN-1H y 13C fueron registrados en un espectrmetro Bruker modelo
AC 250-P. La muestras se disolvieron en metanol-d4 o DMSO-d6, usando TMS como
referencia interna. Se utilizaron los programas de RMN-1H, COSY 1H -1H, Correlacin XH, DEPT a 45 y 135. Los espectros de masas MALDI-TOF fueron obtenidos en un
espectrmetro Kratos Kompact MALDI III (Manchester, UK), equipado con un lser de
N2 VSL-337D-10-TTL de Laser Science Inc. (Franklin, MA, USA) y operado a una
longitud de onda de 337 nm con una duracin de pulso (tau) = 10 ns. La energa de
pulso fue de 250 m J, la potencia promedio a 10 Hz fue de 2,5 mW y la potencia de
pico 85 kW. La energa del lser estuvo en el rango de 0-180 unidades relativas. Para
cada muestra se promedi un total de 100 disparos del lser. El potencial del campo
de extraccin continua fue de 20kV. Las medidas fueron hechas en un vaco de 10 6
Pa. Las condiciones experimentales fueron controladas usando el software Kratos
Kompact V 2.0 en una unidad SPARC Classic Sun Microsystems, Inc, operado por el
software UNIX Solaris 2.3. Las muestras fueron aplicadas en una platina de acero
inoxidable y secadas con aire. Un primer grupo de fragmentos fue obtenido y analizado
usando la modalidad de "laser desorption ionization" (LDI), que no emplea matriz, sino
metanol saturado con la muestra (100 L). Posteriormente, las muestras fueron
analizadas usando diferentes matrices (MALDI). Las matrices empleadas fueron el
cido a -ciano-4-hidroxicinmico (a -CHC) y cido 3,5-dihidroxibenzoico (DHB) ambos
de la firma SIGMA-Aldrich Chemie GmBH (Steinheim, Alemania). El a -CHC y DHB se
disuelven en acetonitrilo con 0,5 % de citrato de amonio. Se prepar 100m L de
solucin saturada con a -CHC o DHB. Se mezcl 50m L de acetonitrilo + 50 m L de
citrato de amonio 0,5 % en solucin saturada de CHC o DHB + 0,5 mL de muestra.
Para el anlisis de las muestras sin la presencia de matriz (LDI) se deposit en la
platina de acero inoxidable una alcuota de 1,0 L de solucin diluida de los extractos
metanlicos. De igual forma, usando adicin de matrices (MALDI) se deposit en la
placa de muestras un volumen total de 1,5 L correspondiente a 1,0 L solucin de
matriz saturada ms 0,5 L de solucin diluida de los extractos. Las placas con las
muestras preparadas fueron usadas para el anlisis y se estudiaron los espectros de
masas tanto cuando la modalidad lineal (positivo, negativo) o de reflectron (positivo,
negativo) es aplicada en orden a enfocar las partculas en vuelo hacia el detector.
Los espectros de UV fueron registrados en un espectrofotmetro UV-Visible Shimadzu
1601 (Japn). Los reactivos sodio metlico, tricloruro de aluminio, acetato de sodio
anhidro y cido brico fueron todos de calidad analtica Merck (Darmstadt, Alemania).
El material vegetal fue recolectado en la localidad de Pea Negra a 80 km de Chilln, al
norte del estero Las Races, 600 m s.m. (36 58` S 71 48` W), entre los meses de
Enero y Febrero de 1999. La identificacin botnica fue hecha por el Prof. Max
Quezada. Un ejemplar fue depositado como testigo en el herbario de la Universidad de
Concepcin, donde qued conservado bajo el nmero CONC148497.
Extraccin y fraccionamiento: 500 g de hojas desecadas y pulverizadas (40 mesh)
fueron extrados a temperatura ambiente dos veces con metanol por 8 das. Los

extractos reunidos fueron filtrados y concentrados al vaco (T < 40 C). El residuo (42
g), fue secado en capa delgada hasta una humedad de 3 % aproximadamente. Una
parte del extracto seco (15 g) se disolvi en 200 mL agua caliente y dej reposar por
12 horas en el refrigerador. El precipitado amarillo formado fue separado por
centrifugacin y posteriormente lavado varias veces con agua fra y finalmente con
ter etlico. Se obtuvo 0.93 g de polvo amarillo verdoso (CG-A). El remanente acuoso
(CG-B), fue extrado 5 veces con diclorometano. El extracto de diclorometano (EDCL)
fue secado a presin reducida (0.462 g). Se continu la extraccin con acetato de etilo
(x 5). El extracto de acetato de etilo (EAE) fue secado a presin reducida con un
rendimiento de 1.12 g y el remanente acuoso (EACUO) fue liofilizado (10.22 g).
Purificacin de la fraccin CG-A: El precipitado fue disuelto en metanol y sometido
a sucesivas separaciones en columna de Sephadex LH-20 (2,5 x 40 cm), usando
metanol como fase mvil. Como resultado se obtuvo un slo compuesto mayoritario
(CG-1), el cual fue purificado por cromatografa en capa fina preparativa (PTLC) sobre
gel de slice 60 PF254 (20 x 20 cm, 2 mm de espesor), usando acetato de etilo/cido
frmico/agua (9+1+1 v/v) como fase mvil. Finalmente la sustancia fue limpiada en
columna de Sephadex LH-20 (1 x 30 cm), usando metanol/agua 80 % como fase
mvil. Se obtuvo por cristalizacin al vaco desde metanol-agua, 452 mg de la
sustancia CG-1.
Actividad captadora de radicales libres: Para determinar la actividad captadora de
radicales libres se emple la reduccin del radical coloreado DPPH (1,1-difenil-2picrilhidrazilo). La actividad se expresa como concentracin efectiva 50 (EC 50), que es
la concentracin de la muestra requerida para disminuir la absorbancia del radical en
un 50 % comparado con una solucin blanco. Se prepar soluciones de los extractos
EDCL, EAE y EACUO desde 0,1 hasta 800 m g/mL. En la determinacin, 750 m L de las
muestras se mezclaron con 1,5 mL de la solucin de DPPH. La mezcla se dej reposar
5 minutos para luego leer la absorbancia a 517 nm. Para la obtencin de los resultados
se aplic regresin lineal a los datos entre 1 y 90 %. Como control positivo se us
quercetina (EC 50 = 5,15 g/mL).
Purificacin de EAE: EAE se disolvi en metanol y mezcl con 1 g de quitina. La
mezcla se sec a presin reducida y aplic sobre una columna de quitina (2,5 x 45 cm)
acondicionada con cloroformo. La muestra se separ por cromatografa en columna de
presin media (MPLC), usando gradiente de CHCl 3-CH3OH (0-100 % con incrementos
de 5 %). Se obtuvo dos compuestos mayoritarios que fueron purificados siguiendo el
mismo protocolo usado para la fraccin CG-A. El anlisis por CCF analtica permiti
establecer que uno de los compuestos corresponda al mismo CG-1 aislado del
precipitado CG-A, mientras que el otro se denomin CG-2(550 mg). Este ltimo fue
cristalizado al vaco, desde metanol agua (1:1).
La pureza de CG-1 y CG-2 fue controlada por HPTLC bidimensional (5 x 5 cm), usando
placas tratadas previamente con K2HPO4 0,1 M, y con la fase mvil acetato de
etilo/cido frmico/agua (9+1+1 v/v). Los cromatogramas fueron analizados a la luz
UV de 254 nm y 366 nm. Para deteccin especfica de grupos orto hidroxilados se uso
el reactivo de fluorescencia difenilboriloxietilamina (SIGMA). Adicionalmente, se
confirm la pureza por electroforesis capilar de alta eficiencia (HPCE), usando un
equipo PrinCE 450 Capillary Electrophoresis System conectado a un detector Lambda
1010 UV-Vis (Bishoff, Leonberg, Alemania). El tampn empleado fue un sistema tpico
para cromatografa micelar electrocintica (MEKC), tetraborato sdico decahidrato 10
mM y sodio dodecilsulfato 30 mM.

Hidrlisis de CG-1 y CG-2: 10 mg de cada sustancia fueron hervidos a reflujo por 1


hora con CF3COOH 0,1N17). Los aglicones liberados fueron identificados mediante sus
espectros UV, utilizando reactivos de desplazamiento. Adicionalmente se compar con
patrones por CCF en gel de slice G 60, empleando como fase mvil
tolueno/cloroformo/acetona (8 + 5 + 7 v/v). Los azcares fueron identificados por CCF
en gel de slice G 60 pretratada con KH 2PO4 0,1 M, usando como fase mvil
acetonitrilo/agua (85 + 15 v/v), y multidesarrollo vertical (5 veces)18).
RESULTADOS
El extracto metanlico total de Ch. glauca fue particionado exhaustivamente con
solventes de polaridad creciente. Los extractos obtenidos fueron sometidos a
fraccionamiento empleando como criterio de potencia antioxidante, la determinacin
de la EC50 frente al radical DPPH. Las EC50 indicaron una mayor actividad antioxidante
inespecfica para EAE (EC50 = 52,21 g/ml) y EACUO (EC50 = 70,74 g/ml), mientras
que EDCL (EC50 = 1227 g/ml) mostr una actividad muy dbil.
El estudio fitoqumico de la fraccin ms activa, EAE, indic la presencia de
flavonoides. La estrategia de aislamiento dio como resultado dos compuestos
denominados CG-1 y CG-2. Al someter a CG-1 a hidrlisis cida se detect quercetina
y los azcares glucosa y ramnosa (1:1). Mediante el mismo procedimiento, de CG-2 se
obtuvo la genina canferol y ramnosa como nico azcar. El anlisis de los espectros de
UV confirm la estructura de las geninas producto de la hidrlisis (Tabla I). Los
espectros de UV para CG-1, obtenidos con los diferentes reactivos de desplazamiento,
indican un patrn de oxidacin de CG-1 acorde con un derivado de quercetina
sustituido en el C-3. Para CG-2, se observ desplazamientos concordantes con un
derivado de canferol sustituido en C-3 y C-7. Adicionalmente, las sustituciones fueron
estudiadas utilizando el revelador de CCF difenilboriloxietilamina. CG-1 y su genina
mostraron una fluorescencia anaranjada al UV, que es tpica de sistemas 3,4ortohidroxilados. CG-2 y su genina presentaron una fluorescencia amarillo-verdosa al UV,
tpica de un flavonoide con un solo hidroxilo en el anillo B ( 3 4). El alto Rf de la
sustancia CG-2 en diferentes sistemas cromatogrficos para glicsidos de flavonoides
confirm la presencia de ms de un azcar.

El espectro de RMN-1H de CG-1 en metanol-d4 mostr el singulete tpico de los


protones metlicos de la ramnosa a campo alto. Las seales de los protones libres en
C-2`, C-6`y C-5`, confirmaron la presencia de OH fenlicos en C-3`y C-4` (Tabla II).
El espectro de RMN-13C arroj 27 tomos de carbonos cuyas asignaciones estn
detalladas en la Tabla III. La relacin entre los protones fue estudiada en los
experimentos COSY 1H-1H, mientras que la relacin entre protn y carbono fue
corroborada mediante la Correlacin X-H (datos no presentados). El experimento DEPT
a 135 mostr un ncleo de carbono en fase negativa correspondiente al C-6 de la
funcin CH2OH de la glucosa.

El anlisis de CG-2 mostr un espectro de RMN-1H en metanol-d4 con dos seales de


protones metlicos correspondientes a dos molculas de ramnosa unidas en dos puntos
distintos del flavonoide. La sustitucin hidroxilica se confirm con las seales de los
protones en C-2, C-3, C-5 y C-6, patrn tpico de canferol con OH libre en C-4`
(Tabla II). El espectro de RMN-1H en DMSO-d6 mostr slo los singuletes anchos
correspondientes a OH fenlicos libres en C-5 y C-4. El espectro de RMN-13C arroj 27
tomos de carbono cuyas asignaciones estn detalladas en la Tabla III. La relacin
entre los protones fue estudiada en los experimentos COSY 1H-1H, mientras que la
relacin entre protn y carbono fue corroborada mediante la Correlacin X-H (datos no
presentados).

En el estudio de CG-1 y CG-2 por MALDI-TOF/MS, se ensay diferentes modalidades


de deteccin. Para iones negativos se emple Linear Negative y Reflectron Negative,
las cuales generaron espectros complejos y de difcil interpretacin. Los mejores
resultados se obtuvieron con las modalidades Linear Positive y Reflectron Positive,
donde los iones detectados fueron similares. El empleo de diferentes matrices, tanto
para CG-1 y CG-2, no dio mejores resultados que la aplicacin de la muestra sin
matriz. Los iones Na+ y K+ presentes en las muestras fueron suficientes para absorber
la energa del lser, produciendo ionizacin de los flavonoides sin descomposicin.
En la modalidad Linear Positive las partculas cargadas siguen una trayectoria recta
hacia el detector (linear fly path), con una mayor distribucin de la energa cintica y
menor resolucin de los picos. No obstante, este modo posibilita la deteccin de iones
metastables y especies neutras.
La resolucin del equipo es mejorada ostensiblemente con el Reflectron. En este
sistema, los iones extrados de la fuente son repelidos por un voltaje deflector (V 0).
Este ocasiona un desvo de las partculas de su trayectoria lineal, llevndolas hacia el
Reflectron. All son devueltas hacia un segundo detector mediante la aplicacin de un
segundo voltaje VR (VR > V0). Esto ocasiona que la distribucin en el tiempo de vuelo
(causada por la energa inicial cuando el ion es generado), para iones que poseen la
misma masa, sea eliminada. El fenmeno se conoce como "enfoque en el tiempo" y
permite que iones con m/z equivalentes sean detectados al mismo tiempo,
independientemente de la magnitud de su energa inicial. El aumento en la trayectoria
es directamente proporcional al tiempo de vuelo. Debido a lo anterior, se estrecha la
energa cintica de los iones a medida que estos entran al detector, aumentando la
resolucin del instrumento.
En la Fig.1 se presenta los espectros de masas para ambas sustancias en la modalidad
Reflectron Positive, sin uso de matriz. Las m/z observadas en la figura deben ser
divididas por el factor 1.04, debido a que es necesario corregir el efecto del Reflectron
sobre el tiempo de vuelo. De esta manera se obtienen los mismos resultados
de m/z que en la modalidad Linear Positive, donde la m/z de los fragmentos es leda
directamente.

FIG. 1. Espectro MALDI-TOF MS de glicosilflavonoides aislados de Ch. glauca. (a) CG-1, Reflectron
Positive, potencia del lser 180 r.p.u., sin matriz. (b) CG-2. Reflectron Positive, potencia del lser
180 r.p.u., sin matriz.

En la modalidad Linear Positive, CG-1 mostr un ion molecular con m/z 630.8
generado por adicin de protn, correspondiente a [CG-1. H2O + 2H]2+. La seal
observada a m/z 323.4 correspondi al fragmento generado por adicin de un catin,
[quercetina + Na]+. La seal correspondiente a quercetina sola se encontr
a m/z301.3. En la modalidad Reflectron Positive se resolvi una seal de menor
intensidad de m/z 340.48 (354.1/1.04), que correspondi a [quercetina + K]+. Una
pico de intensidad muy dbil se apreci en la modalidad Reflectron Positive,
correspondiente al fragmento [ramnosa-glucosa]+. La sustancia fue comparada con un
patrn de rutina (Merck, Darmstadt, Germany) para el cual se obtuvo los espectros
MALDI-TOF-MS, encontrndose total coincidencia (datos no presentados).
En la modalidad Linear Positive, CG-2 mostr un ion molecular a m/z 618,7
correspondiente a [CG-2. H2O + Na]+. Una seal a m/z 596.7 correspondi a [CG-2 +
H2O]+, con un pico muy dbil a m/z 454.8 debido al fragmento [canferol-ramnosa +
Na]+. Un fragmento a m/z 329.6 se asign a la genina [canferol + 2Na]2+. El
fragmento de relacin m/z 307.1 correspondi a [canferol + Na]+ mientras que el
de m/z 285.6 a la genina. Finalmente el fragmento de m/z 164.1 correspondi a la
masa de ramnosa. No hubo indicios de un fragmento correspondiente a di-ramnosa, lo
que confirm lo indicado por los espectros de UV y RMN en DMSO-d6, que se tratara
de una sustitucin con dos residuos de ramnosa en C-3 y C-7, quedando libres los
hidroxilos en C-5 y C-4.

DISCUSION
De la fraccin ms activa de Ch. glauca se aisl dos sustancias de estructura tipo
flavonol. Se confirma que CG-1 corresponde al flavonoide rutina, uno de los
compuestos fenlicos ms corrientes en vegetales superiores. No obstante, su
presencia en Ch. glauca se desconoca hasta ahora. CG-2 fue identificado como
canferitrin (canferol 3,7-O-diramnsido), sustancia aislada por primera vez
en Indigofera arrecta (Leguminoseae). El compuesto tambin ha sido descrito en otras
leguminosas como Lespedeza cyrtobotrya, Lathyrus odoratus y Lotus corniculatus. Se
ha reportado su presencia en representantes de otras familias no relacionadas
como Tilia platyphyllos (Tiliaceae), Celastrus (Celastraceae) y Tagetes (Compositae)19).
El uso concomitante de ambos tipos de espectroscopa permite obtener mayor
informacin estructural. La RMN ha sido empleada durante muchos aos como tcnica
clave en la determinacin de las estructuras de un sinnmero de sustancias de origen
natural. MALDI, aunque conocida hace mucho tiempo, ha evolucionado rpidamente en
la ltima dcada. Esta tiene la ventaja comparativa sobre otras tcnicas indirectas, que
para obtencin de pesos moleculares no necesita derivatizacin de los glucsidos
altamente polares. Ambas tcnicas tienen la limitante de no entregar informacin
relacionada con la configuracin absoluta de la fraccin azucarada. Para dichos
estudios se requiere, si la cantidad de sustancia lo permite, la obtencin del poder
rotatorio, derivados diastereomricos, o el empleo de mtodos de correlacin como
HPLC, GC o HPCE con fases mviles o estacionarias quirales.
El ensayo posterior de ambos compuestos puros sobre DPPH mostr una actividad
importante slo para rutina. Este hecho ha sido probado en numerosos trabajos
empleando diferentes modelos de oxidacin 20). Se debe tener presente que una parte
importante de la rutina fue removida previamente en el precipitado CG-A, por lo que la
actividad de la fraccin EAE habra sido aun mayor si hubiese contenido toda la rutina.
En este ensayo, canferol 3,7-diramnsido no mostr un efecto importante. Sin
embargo, es preciso considerar que la ingestin de estas sustancias necesariamente
involucra aspectos metablicos que pueden llevar a la generacin de las geninas libres
canferol y quercetina, adems de algunos metabolitos biodisponibles. Mientras las
geninas poseen un importante efecto antioxidante in vivo, sus metabolitos
(principalmente cidos fenlicos, cinmico, fenilactico, benzoico, fenilpropanoico y
floroglucinol), poseen una actividad antioxidante atenuada e inespecfica21). La
EC50 (5,15 m g/mL) del control positivo quercetina (uno de los metabolitos de rutina),
obtenida bajo nuestras condiciones, es la ms baja de todas las muestras ensayadas.
Por lo anterior, se concluye que esta planta debe sus efectos beneficiosos, a la
presencia mayoritaria de flavonoides. Es sabido que los antioxidantes de plantas se
comportan de diferente manera dependiendo de agente oxidante que se emplee en el
ensayo22). Debido a esto, actualmente se estn realizando estudios para demostrar la
actividad antioxidante frente a otros radicales como el OH y O2 cuya produccin in
vivo es importante en diferentes procesos como el envejecimiento y la injuria celular.
Asimismo, una parte de los esfuerzos est puesta en la determinacin de la capacidad
antioxidante en sistemas ms complejos y de mayor importancia biolgica como las
lipoproteinas de baja densidad LDL. A lo anterior hay que sumar la determinacin
cuantitativa de este tipo de sustancias de la planta, la cual es necesaria para estimar si
el uso popular representa una real contribucin en la prevencin de patologas ligadas
a radicales libres.

E. R. Pastene agradece a la Direccin de Investigacin de la Universidad de Concepcin


el apoyo econmico mediante el Proyecto DIUC 98074023-11. El autor hace un
especial reconocimiento a Silvia Fernndez (Universidad de Concepcin, Chile), por su
colaboracin en la obtencin de los espectros de RMN y al Dr. J. Havlis (Masaryk
University, Czech Republic), por su apoyo en las mediciones realizadas con el equipo
MALDI. El Dr. I. Peric agradece a la Deutsche Gesellschaft fr Technische
Zusammenarbeit (GZT) por el suministro del Aparato de electroforesis capilar.
REFERENCIAS
1. M. Montes, T. Wilkomirsky, Medicina Tradicional Chilena. Editorial Universidad de
Concepcin, Concepcin, Chile (1985).
[ Links ]
2. H. Khan, A. Zaman, G. L. Chetty, A. S. Gupta, S. Dev. Tetrahedron Letters.
4443(1971).
[ Links ]
3. R. Sunder, K. N. N. Ayengar, S. Rangaswami. Phytochemistry. 13(8), 16101611(1974).
[ Links ]
4. K. Imida, S. Fukushima, T.
Ito. Carcinogenesis, 4, 885-889 (1983).

Shivai, M.
[ Links ]

Ohtani,

5. A. L. Branen. J. Am. Oil Chem. Soc., 52, 59-63 (1975).

K.

Nakanishi,

N.

[ Links ]

6. N. Ito, S. Fukushima, A. Hasegawa, M. Shibata, T. Ogiso. J. Natl. Cancer Inst., 70,


343-347 (1983).
[ Links ]
7. H. C. Grice. Food Chem. Toxicol., 24, 1127-1130 (1986).
8. G-C.
(1998).

Yen, H-W.
[ Links ]

Chen,

P-D.

Duh. J.

Agric.

[ Links ]

Food

9. H. P. Wichi. Food Chem. Toxicol., 26, 717-723 (1998).

Chem., 46,

820-824

[ Links ]

10. S. Renaud, M. De Longeril., Lancet, 339, 1523-1526 (1992).

[ Links ]

11. E. N. Frankel, J. Kanner, J. B. Parks, J. E. Kinsella. Lancet, 341, 454-457


(1993).
[ Links ]
12. H.
(1997).

Wang, G.
[ Links ]

Cao,

13. R. J. Cotter, J.
(1983).
[ Links ]

R.

L.

Tablet. Int. J.

Prior. J.

Mass

Agric.

Food

Spectrom.

Ion

Chem., 45,

304-309

Phys., 53:

161-156

14. M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp. Int. J. Mass Spectrom. Ion


Proc., 78, 53 (1987).
[ Links ]
15. R.
(1989)

C.

Beavis,
[ Links ]

B.

T.

Chait. Rapid

Commun.

Mass

Spectrom., 3,

233

16. G. Hbner, V. Wray, A. Nahrstedt. Planta Med., 65: 636-642 (1999).

[ Links ]

17. T. J. Mabry, K. R. Markham, M. B. Thomas. The Systematic identification of


Flavonoids", Springer-Verlag, Berlin, 1970, p. 354.
[ Links ]
18. R. Ikan. "Natural Products: A Laboratory Guide", 2 Edit., Academic Press., Inc.,
1991, p. 91.
[ Links ]
19. J. B. Harborne, T. J. Mabry, H. Mabry. "The Flavonoids", Academic Press, New
York, 1975, p. 418.
[ Links ]
20. I. Merford, J. Heilmann, M. Weiss, P. Pietta, C. Gardana. Planta Med., 62 289-292
(1996).
[ Links ]
21. B. Limasset, T. Ojasoo, C. Le Doucen, J-C. Dor. Planta Med., 65, 23-29
(1999).
[ Links ]
22. R. Prior, G. Cao. J. AOAC International, 83(N4), 950-956 (2000)

[ Links ]

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3): 151 - 157, 2011

Artculo Cientfico

FLAVONOIDES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE


Calia secundiflora (Ort.) Yakovlev

FLAVONOIDS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF


Calia secundilfora (Ort.) Yakovlev

Rosario M. Barrn-Ynez1, M. del Rosario Garca-Mateos1,2 *, Marcos R. Soto-Hernndez3,


Teresa Colinas-Len1 y Georey Kite4

1
Instituto de Horticultura, Departamento de Fitotecnia, y 2Preparatoria Agrcola, Universidad Autnoma Chapingo. km 38.5 Carr. Mxico-Texcoco. 56230,
Chapingo, Edo. de Mxico. Tel. (01) 595 95 215 00 Ext. 5797. 3Programa de Botnica, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo. km 36.5. Carr. MxicoTexcoco. 56230, Montecillo, Texcoco, Edo. de Mxico. 4Royal Botanical Gardens Kew. Richmond, Surrey, TW9 3AB, UK.

*Autor para correspondencia (rosgar08@hotmail.com )

RESUMEN
La posible extincin de algunas especies no estudiadas como Calia
secundiflora (Ort.) Yakovlev significa la prdida del potencial que representa el conocimiento de sus metabolitos con propiedades medicinales y de inters agronmico. Los estudios fitoqumicos en C. secundiflora (Ortega) Yakovlev (Fabaceae) se han enfocado hacia los alcaloides, pero an se desconoce su perfil de flavonoides. Estos metabolitos
presentes en los vegetales se asocian con una capacidad antioxidante
natural, y que estudios epidemiolgicos han mostrado efectos benficos
para la salud humana. El objetivo de esta investigacin fue cuantificar
el contenido de compuestos fenlicos y flavonoides, as como identificar las estructuras de los flavonoides en hoja y evaluar el potencial
antioxidante de los extractos. La actividad antioxidante se evalu por
el mtodo de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) en muestras de una
zona del Estado de Hidalgo, Mxico. El anlisis por CL-EM permiti
identificar siete glicsidos en los flavonoles quercetina, isoramnetina
y kaenferol, no descritos previamente para esta especie. El contenido
de compuestos fenlicos totales (8.31 0.38 mg g-1 de MS) fue mayor al
de flavonoides (3.08 0.32 mg g-1 de MS). Estos resultados explican la
actividad antioxidante (CI50 = 88.54 0.15; 109.44 0.48 g mL-1) que
presentaron los extractos de hoja. La identificacin de estos flavonoides
puede contribuir a la quimiotaxonoma del gnero.
Palabras clave: Calia secundiflora, colorn, actividad antioxidante, flavonoides.

SUMMARY
The possible extinction of some non-studied species such as Calia
secundiflora might mean the loss of the knowledge about their metabolites with medicinal properties and agronomic interest. The phytochemical studies on C. secundiflora (Ort.) Yakovlev (Fabaceae) have
been focused on its content of alkaloids, but its profile of flavonoids
is still unknown. These plant metabolites have been associated to a
natural antioxidant capacity which are beneficial for human health
according to epidemiological studies. The objective of this research
was to quantify the contents of phenolic compounds and flavonoids,
as well as to identify the flavonoid structures in leaf and to evaluate
Recibido: 26 de Julio del 2010.
Aceptado: 14 de Marzo del 2011.

their antioxidant potential. The antioxidant activity was evaluated by


the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) method in samples taken
from Hidalgo State, Mxico. The analysis by HPLC-MS allowed to the
identify seven glycosides in the flavonols quercetin, isorhamnetin and
kaempferol, which have not described previously for this species. The
content of total phenolic compounds (8.31 0.38 mg g-1 of DM) was
higher than that of flavonoids (3.08 0.32 mg g-1 of DM). These results
explain the antioxidant activity (IC50 = 88.54 0.15; 109.44 0.48 g
mL-1) presented by the leaf extracts. The identification of these flavonoids may contribute to the chemotaxonomy of this genus.
Index words: Calia secundiflora, colorin, antioxidant activity, flavonoids,

INTRODUCCIN
El cambio climtico ha producido numerosos cambios
en la distribucin y abundancia de las especies vegetales.
Los escenarios futuros predicen el riesgo de extincin de
algunas plantas (Thomas et al., 2004). Esto significa una
prdida del potencial que representa el conocimiento de
sus metabolitos con propiedades medicinales y de inters
agronmico. Por ello existe la necesidad de realizar estudios fitoqumicos y evaluar la actividad biolgica de plantas para identificar los principios activos en beneficio del
hombre, sobre todo de las especies que no han sido estudiadas. Adems, el estudio fitoqumico puede contribuir al
conocimiento taxonmico de las especies, como es el caso
de Calia secundiflora (Ort.) Yakovlev.
C. secundiflora (Ortega) Yakovlev (Fabaceae) se encuentra distribuida en frica, Amrica y Asia (Hatfiled et al.,
1977; Shulthes y Hofmann, 1982). En Mxico se localiza
en los Estados de Sonora, Chihuahua, Coahuila, Nuevo
Len, San Luis Potos, Tamaulipas, Zacatecas, Quertaro e
Hidalgo (Rzedowski, 1978; Aguilar y Zolla, 1982), donde

FLAVONOIDES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE Calia secundiflora

se le conoce localmente como Patol, Pitol, Coca, Colorn,


Chocoln y Frijolillo. Sin embargo, es ms conocida como
Sophora secundiflora (Ortega) Lag. ex DC. y por sus efectos
alucingenos en rituales de grupos tnicos del suroeste de
los Estados Unidos (Murakoshi et al., 1986; Keller, 1975).
C. secundiflora se considera una planta txica por contener
alcaloides del tipo quinolizidnico (Zavala et al., 2006), lo
que ha restringido su uso medicinal (Hatfield et al., 1977;
Murakoshi et al., 1986).

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

MATERIALES Y MTODOS
Recolecta del material vegetal
El material vegetal (hojas) se recolect aleatoriamente de
diversos ejemplares adultos en etapa de floracin (abril de
2007), de una poblacin ubicada en el transecto El CardonalSantuario, Municipio El Cardonal, Estado de Hidalgo,
Mxico. Este sitio se ubica en laderas con exposicin al SSE
y SE con pendiente de 40, en las coordenadas 20 36 LN y
99 07 LO, a 2130 msnm. La muestra (hojas) del Estado de
Quertaro tambin se recolect aleatoriamente en diversos
ejemplares adultos en etapa de floracin (mayo 2007), en
una poblacin ubicada en el transecto Vizarrn del MonteSan Joaqun, municipio de Cadereyta; este sitio se ubica a
2070 msnm, en las coordenadas 20 41 LN y 99 49 LO,
en laderas con exposicin al SE y pendientes de 45. Se
prepararon dos ejemplares de herbario que fueron identificados por el Dr. Mario Sousa del Instituto de Biologa
de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico, con los
nmeros de registro 1155623 y 1155624. Las hojas de Calia
secundiflora se secaron a temperatura ambiente durante tres
semanas, y luego en una estufa a 45 C por 24 h; despus se
molieron en un molino Thomas-Wiley modelo 4 (PA.,
USA) con un tamiz del nmero 2.

Los alcaloides identificados en esta especie tambin se


han descrito en unas 65 especies de la familia Leguminosae, en particular en Sophora secundiflora, razn por la cual
a C. secundiflora se le clasific inicialmente como Sophora
secundiflora (Omiya et al., 1995). Los anlisis filogenticos
de algunos gneros (Styphnobium y Cladrastis), anteriormente representativos del gnero Sophora, han permitido
reclasificarlos mediante sus caracteres fitoqumicos (perfil
de flavonoides) y moleculares (secuencia de ADN) (Kite y
Pennington, 2003). En contraste, an existen casos no resueltos, como el de C. secundiflora, debido a que hay incongruencia en la secuencia de ADN (Kite y Pennington,
2003), y porque para su reubicacin taxonmica se requieren evidencias fitoqumicas de la presencia de alcaloides, fenlicos y flavonoides (Hatfield et al., 1977; Murakoshi et al.,
1986). Se justifica as el seguimiento de la posicin de este
taxn para contribuir a su relacin filogentica, con base en
el estudio fitoqumico de otros metabolitos y de la actividad
biolgica de la especie.

Preparacin del extracto


De cada muestra de campo se pes 1 g de hoja molida y
seca, que se disolvi en 25 mL de etanol a 95 %; despus de
24 h se ajust su volumen a 25 mL con etanol a 80 %, y se
centrifug la mezcla a 2000 rpm.

Los estudios publicados slo se han dirigido hacia la


investigacin de alcaloides en ambos gneros (Sophora y
Calia), pero se desconoce la presencia de flavonoides que
pudieran justificar los efectos benficos que puede aportar
la especie. Los compuestos de naturaleza fenlica presentes
en hortalizas y frutos contribuyen a dar una fuerte capacidad antioxidante (Prior et al., 1998); por su diversidad y
amplia distribucin constituyen el grupo ms importante
de metabolitos con actividad antioxidante natural. Hay
evidencias epidemiolgicas convincentes que muestran los
beneficios de los flavonoides en la salud y de su contribucin en retardar algunos procesos degenerativos (Robards
et al., 1999). Son compuestos con habilidad para atrapar
radicales libres, quelatar metales pesados y modular la actividad de ciertas enzimas, y adems se ha observado que
los flavonoides poseen propiedades anticancergenas, cardiotnicas, antitrombticas, vasculares, que disminuyen el
colesterol y contribuyen a la proteccin del hgado, entre
otras (Robards et al., 1999). Con base en lo anterior, el objetivo de esta investigacin fue identificar los flavonoides en
la hoja de esta especie y evaluar su potencial antioxidante,
para contribuir de manera indirecta a una validacin de la
especie por sus caractersticas fitoqumicas dentro del gnero Calia.

Cuantificacin de fenoles totales


El contenido de fenoles totales se cuantific con el mtodo propuesto por Waterman y Mole (1994). A 0.5 mL del
extracto etanlico se le adicion 10 mL de una solucin de
Na2CO3 a 10 % y se incub a 38 C por 15 min. Se tom 1
mL de esta mezcla, a la que se le adicion 3 mL de agua y
1 mL del reactivo de Foln-Ciocalteu: agua 1:1 v/v. La mezcla se dej reposar por 15 min en oscuridad. Finalmente se
tom lectura de la absorbancia a 660 nm en un espectrofotmetro Spectronic 20 (Florida, USA). La concentracin
se calcul a partir de una curva patrn (y = 0.0014x; R2 =
0.9979) elaborada con fenol. Cada anlisis se efectu por
triplicado. El contenido total de fenlicos en el extracto se
expres en mg de equivalentes de fenol por g de materia
seca (mg g-1 MS).
Cuantificacin de flavonoides totales
A una alcuota de 0.5 mL del sobrenadante del extracto

152

BARRN, GARCA, SOTO, COLINAS Y KITE

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

etanlico preparado anteriormente, se le agreg 1.5 mL de


etanol a 95 %, 0.1 mL de una solucin de AlCl3, 0.1 mL de
solucin 1 M de acetato de potasio y 2.8 mL de agua destilada; la mezcla se incub por 30 min. Su absorbancia se ley
en un espectrofotmetro Spectronic 20 a una longitud de
onda 415 nm. Para la cuantificacin de la concentracin se
hizo una curva patrn (y = 0.0122x-0.0067; R2 = 0.9653)
preparada con quercetina (Chang et al., 2002). Los resultados fueron expresados en mg equivalentes de quercetina
por g de materia seca (mg g-1 MS).

delo Finnigan MAT900 XLT (Hemmel Hempstead, U.K).


Se utiliz una columna Phenomenex Luna C18 (150 mm x
4.6 mm de d.i. y tamao de partcula de 5 m). Como fase
mvil se emple un gradiente de elucin para la mezcla metanol/agua/ACN + 1 % cido frmico: 0:90:10 (0); 40:50:10
(30); 40:50:10 (40); 90:0:10 (45); 90:0:10 (47); 0:90:10
(55), a una velocidad de flujo de 1 mL min-1 y un volumen
de inyeccin de 20 L del extracto metanlico. Para el detector del espectrmetro de masas se utiliz una trampa de
iones cuadrupolo (Finnigan LCQ, Hemmel Hempstead,
U.K) acoplado con una fuente inica APCI. La temperatura
de vaporizacin fue de 550 C, y la de calentamiento de la
columna capilar de 150 C. Se utiliz una corriente de nitrgeno y un flujo auxiliar del mismo gas a 80 y 10 unidades,
respectivamente. La identificacin de los flavonoides en las
fracciones estudiadas se llev a cabo por comparacin con
muestras autnticas y por cotejo con la biblioteca de espectros del equipo (Cuyckens y Claeys, 2004; Kite et al., 2007).

Extraccin de flavonoides
El material vegetal (1 kg) se someti a un proceso de
extracciones exhaustivas (3 x 48 h) con metanol (MeOH),
seguido de una decantacin del disolvente, el cual se concentr a sequedad mediante vaco en un rotaevaporador
Bcki R-210 (Slawil, Switzerland) a 45 C. Se usaron 5 g
del extracto metanlico para hacer su particin con diclorometano: agua (5 x 5 mL). La fase acuosa se fraccion
con butanol (5 x 5 mL) y la porcin butanlica se concentr
a sequedad mediante vaco. La deteccin de flavonoides se
efectu en los extractos metanlico y butanlico por cromatografa en capa fina en gel de slice 60 F254 (Merck), y
como eluyente se utiliz una mezcla de butanol: cido actico: agua (BAW) en una proporcin de 40:10:50 % (v/v). Las
placas cromatogrficas se revelaron por aspersin sucesiva
de los reactivos NP (cido 2-amino-etil ster difenilbrico
a 1 % en metanol, p/v) y PEG (polietilenglicol 4000 a 5 %
en metanol, p/v). Las placas se visualizaron a una longitud
de onda de 365 nm. Se observ una fluorescencia de color anaranjado, caracterstica de los flavonoides (Wagner y
Bladt, 1996).

Evaluacin de la actividad antioxidante


Este anlisis se hizo con el mtodo del radical libre DPPH
(2,2-difenil-1-picrilhidracilo) descrito por Liu et al. (2009),
y solamente en el extracto de hojas proveniente del Estado
de Hidalgo, porque las muestras del Estado de Quertaro presentaron una baja concentracin de metabolitos en
comparacin con las de Hidalgo. La capacidad antioxidante de las muestras fue observada a 516 nm por el cambio de
coloracin gradual del DPPH (prpura) a DPPH-reducido
(amarillo) (Soler-Rivas et al., 2000; Cotelle et al., 1996).
Se prepar una solucin metanlica de DPPH a una concentracin 0.1 mM. Los extractos (1 mL) metanlico, butanlico y las fracciones 1 y 2, se diluyeron con metanol para
obtener las concentraciones de 0.2, 0.15, 0.1, 0.05 mg mL-1.
A cada concentracin de los extractos y de las fracciones se
les adicion 3 mL de la solucin de DPPH (0.1 mM) y se
mezclaron separadamente. Las mezclas se dejaron a temperatura ambiente y oscuridad durante 30 min y despus se
les midi su absorbancia a 516 nm en un espectrofotmetro
Spectronic 20. Se determin el porcentaje de DPPH remanente mediante la frmula:

Fraccionamiento del extracto butanlico


Se aplicaron 700 mg del extracto butanlico a una placa
preparativa de gel de slice 60 (Merck) de 2 mm de grosor;
como eluyente se utiliz una mezcla de BAW en la proporcin 40:10:50 (% v/v). Las placas se visualizaron con luz UV
a 365 nm y se revelaron en un extremo con el reactivo NP
y PEG a 1 y 5 % en metanol, respectivamente, reactivos
especficos para la identificacin de flavonoides (Wagner y
Bladt, 1996). Posteriormente se rasparon los componentes
de la placa y se extrajeron del gel de slice con metanol. De
los componentes se obtuvieron dos fracciones (1 y 2) que se
concentraron a sequedad mediante vaco.

% DPPH =(Ablanco- Amuestra) x 100/Ablanco


En donde Ablanco es la absorbancia del testigo (DPPH
0.1mM); Amuestra es la absorbancia obtenida de cada muestra
despus de 30 min con DPPH 0.1 mM. La actividad antioxidante de las muestras se determin mediante el clculo de
la concentracin inhibitoria media (CI50), que es la concentracin requerida por la muestra para disminuir la absorbancia del DPPH a 50 %. La baja absorbancia de la mezcla
de reaccin indic alta actividad antioxidante.

Identificacin de flavonoides por CL-EM


La identificacin de flavonoides se efectu en un cromatgrafo de lquidos Waters modelo LC600 (Massachusetts, USA) en fase reversa, provisto con un detector de
arreglo diodos acoplado a un espectrmetro de masas mo-

Se construy una curva estndar de DPPH; para ello

153

FLAVONOIDES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE Calia secundiflora

se pes 3.93 mg del reactivo y se disolvi en 100 mL de


metanol para obtener una concentracin de 0.1 mM. De
esta solucin patrn se prepararon las diferentes concentraciones: 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.1 mM de DPPH.
La absorbancia se midi a 516 nm en un espectrofotmetro Spectronic 20; las lecturas se tomaron por triplicado y
como blanco se utiliz metanol.

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

contenido de compuestos fenlicos corresponde a flavonoides, y que el resto podra estar constituido de procianidinas
u otros cidos fenlicos, como sucede en otras especies vegetales segn describieron Cui et al. (2006).
Entre regiones no hubo diferencias significativas en el
contenido de flavonoides en las muestras de las dos zonas,
pero s la hubo (P 0.05) en la concentracin de fenlicos,
aunque el contenido de fenlicos tendi a ser superior en
las muestras provenientes de la regin ms perturbada (Hidalgo). Al respecto, en un estudio comparativo de hbitat
de C. secundiflora en los Estados de Hidalgo y Quertaro,
Garca-Mateos et al. (2007) observaron un mayor contenido de alcaloides en las muestras de Hidalgo que en las
de Quertaro, lo cual asociaron al grado de perturbacin y
hbitat de la especie.

Para determinar la cintica de reaccin de los extractos


y de las fracciones 1 y 2 con el DPPH remanente, se sigui
el mtodo modificado de Snchez-Moreno et al. (1999).
Se prepar separadamente una solucin de 1 mg mL -1 de
metanol de cada muestra, de la cual se tom 0.1 mL y se
le adicion 3.9 mL de la solucin de DPPH (5 mg/100 mL
de metanol). Posteriormente, se midieron las absorbancias del DPPH con intervalos de 30 s, desde el tiempo cero
(DPPHT=0) hasta concluir los 30 min (DPPHrem) en un espectrofotmetro Spectronic 20, a una longitud de onda
de 515 nm. Los datos obtenidos sirvieron para calcular el
DPPH remanente en el medio de reaccin. Cada lectura se
hizo por triplicado, y como blanco se uso metanol. La concentracin de DPPHrem se calcul con la ecuacin:

El contenido y perfil de metabolitos puede variar con las


condiciones climticas y geogrficas. En semillas de soya
(Glycine max L.) Caldwell et al. (2005) observaron un incremento en la concentracin de isoflavonas al aumentar la
temperatura, la concentracin de CO2 y el dficit hdrico.
Kirakosyan et al. (2004) tambin encontraron niveles elevados de compuestos fenlicos en hojas de Crataegus laevigata y C. monogyna cuando estuvieron en condiciones de
estrs por dficit de agua.

% DPPHrem=100 x DPPHrem/DPPHT=0
Anlisis estadstico

Identificacin de flavonoides por CL-EM

Se efectu un anlisis de varianza y la prueba de comparacin de medias (Tukey, 0.05) mediante el programa de
cmputo SAS Institute versin 8.0 (SAS Institute, 1999).

El anlisis por cromatografa de lquidos-espectrometra


de masas permiti identificar en el extracto metanlico, a
siete glicsidos de tres flavonoides: quercetina (Q), kaenferol (K) e isoramnetina (I); a otros compuestos no fue posible identificarlos. En el Cuadro 1 se muestran las caractersticas cromatogrficas y espectromtricas de los compuestos
detectados en el extracto metanlico, y en la Figura 1 se
presentan las estructuras de los glicsidos de los flavonoides identificados. Los tiempos de retencin y los valores de
los iones moleculares de los glicsidos coincidieron con los
existentes en la biblioteca de espectros del equipo y con los
descritos en la literatura (Kite et al., 2007).

RESULTADOS Y DISCUSIN
Cuantificacin de fenoles y flavonoides
De 1 kg de muestra seca se obtuvo un rendimiento de
10.23 % de extracto metanlico y 1.02 % de extracto butanlico. El fraccionamiento del extracto butanlico por cromatografa en capa fina preparativa permiti obtener 0.8
mg g-1 y 1.1 mg g-1 de materia seca en las fracciones 1 (Rf
= 0.26) y 2 (Rf = 0.40), respectivamente, ya que de acuerdo
con el anlisis preliminar por cromatografa en capa fina se
confirm cualitativamente la presencia de flavonoides.

Cuadro 1. Tiempo de retencin (tR), ion molecular (M+), azcares


localizados en las posiciones C-3 y C-7 de las agliconas de los
glicsidos identificados en el extracto metanlico de hojas de Calia
secundiflora provenientes del Estado de Hidalgo, Mxico

El contenido de fenlicos (8.31 0.38 mg g-1 de MS) fue


mayor al de flavonoides (3.08 0.32 mg g-1 de MS) en hojas
provenientes del Estado de Hidalgo. El contenido total de
compuestos fenlicos fue de 5.61 0.05 mg g-1 de MS y el
de flavonoides de 2.76 0.14 mg g-1 de MS, en hojas de C.
secundiflora provenientes del Estado de Quertaro.

Nm tR(min) [M+] Aglicona

C-3

C-7

1
8.53
918
i
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha2 12.71
901
q
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha3 14.75
885
k
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha4 17.80
755
q
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc-5 18.26
755
q
Rha(16)- GlcRha6 20.3
595
k
Rutinsido (Rha(16)- Glc-) -7 21.86
609
q
Rutina
-
I = isoramnetina; K = kaenferol; Q = quercetina. Rha = Ramnosa;
Glc = glucosa; Primer azcar unido al O-C3 de la aglicona que
corresponde al ltimo de cada fila.

No se encontraron estudios similares efectuados en especies de este gnero para poder realizar una comparacin.
Sin embargo, se infiere que una pequea proporcin del
154

BARRN, GARCA, SOTO, COLINAS Y KITE

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

R1
3

OH
4

R3 O

O
7

OR2

HO

Quercetina

3,3,4,5,7-pentahidroxiflavona

R1 = OH; R2 = R3 = H

Isoramnetina

3,4,5,7-tetrahidroxi-3-metoxi-flavona

R1 = OCH3; R2 = R3 = H

Kaenferol

3,4,5,7-tetrahidroxiflavona

R1 = R2 = R3 = H

Figura 1. Estructura de las agliconas en los glicsidos identificados en C. secundiflora.

Cuadro 2. Concentracin inhibitoria media (CI50) de DPPH


(2,2-difenil-1-picrilhidracilo) con los extractos y fracciones de
Calia secundiflora.

La presencia de di-, tri- y tetraglicsidos de estos flavonoles no se han descrito en la C. secundiflora, especie en la que
se ha sealado la presencia de otros flavonoides. Shirataki
et al. (1997) describieron tres isoflavonoides aislados de la
raz de C. secundiflora. Por su parte, Tanaka et al. (1998)
detectaron ocho nuevos isoflavonoides en la raz de S. secundiflora, S. arizonica y S. gypsophila.

CI50
(g mL-1)
Extracto metanlico
109.443 0.482 c
Extracto butanlico
88.543 0.151 d
Fraccin 1
568.630 1.152 a
Fraccin 2
168.903 1.277 b
CI50 fue determinada como la concentracin requerida de las
muestra para inhibir en 50 % al DPPH en 30 min. Datos con la
misma letra son estadsticamente iguales (Tukey, 0.05). Despus
de cada valor se presentan el error estndar (n = 3).
Extracto

Glicsidos de flavonoides similares a los detectados en


este trabajo en C. secundiflora fueron descritos recientemente en otras leguminosas y han servido como marcadores. Kite et al. (2007, 2009) describieron la presencia de
glicsidos de flavonoides en especies del gnero Styphnolobium y en la especie Cladrastis kentukea. Kite et al. (2007)
identificaron a los mismos glicsidos en la especie Styphnolobium japonicum, que en el presente estudio se muestran
en el Cuadro 1 como estructuras 3, 4, 6 y 7.

los extractos metanlico y butanlico tuvieron una cintica


ms rpida que las muestras restantes, y tambin dieron una
menor concentracin de DPPH remanente a los 30 min, en
congruencia con los resultados del Cuadro 2; estos dos extractos fueron los de mayor actividad antioxidante debido
al efecto sinrgico de los glicsidos en la mezcla.

Actividad antioxidante

La actividad antioxidante de los extractos metanlico y


butanlico de C. secundiflora se debe, en parte, a la presencia
de los siete glicsidos en quercetina, de isoramnetina y de
kaenferol. Se ha documentado ampliamente que la presencia
de estos metabolitos se asocia con la actividad antioxidante
de una amplia variedad de frutos y otras especies (Chang
et al., 2002; Harborne y Williams, 2000; Robards et al.,
1999). La actividad antioxidante de flavonoles y flavonas se
asocia con sus caractersticas estructurales. Las estructuras
que poseen grupos hidroxilos en las posiciones 3 y 4 del
anillo B y OH en C-3 e insaturacin del anillo C, permiten
estructuras mesomricas estables con capacidad eficiente
de captura de radicales libres, requisito para una mxima
capacidad antioxidante (Robards et al., 1999; Cotelle et al.,
1996; Bors et al., 1990). En este caso, la quercetina cumple
en mayor medida con estas caractersticas estructurales,

Se encontraron diferencias significativas (P 0.05) en la


concentracin inhibitoria media (CI50) entre los extractos
metanlico, butanlico y las fracciones 1 y 2 para reducir
a 50 % el DPPH (Cuadro 2). Los extractos butanlico y
metanlico presentaron mayor actividad antioxidante que
las fracciones aqu detectadas.
La cintica de reaccin mostr que la cantidad de DPPH
remanente disminuy por la actividad antirradical (actividad antioxidante) de los extractos y de las fracciones evaluadas (Figura 2). Snchez-Moreno (2002) clasific el desempeo antioxidante de varias sustancias de acuerdo con
la cintica de la reaccin, como: < 5 min, rpida; entre 5 y
30 min, intermedia; y > 30 min como lenta. Para este caso,

155

FLAVONOIDES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE Calia secundiflora

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

100

Extracto metanlico
Extracto butanlico
Fraccin 1
Fraccin 2

DPPH (%)

75

50

25

10

15
Tiempo (min)

20

25

30

Figura 2. Actividad antioxidante de los extractos y fracciones de C. secundiflora en relacin con la variacin de la concentracin de
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) remanente en funcin del tiempo.

aunque se ha descrito que algunos de sus derivados


glicosdicos presentan menor actividad antioxidante que la
aglicona por la unin del azcar al OH del C-3 (Robards
et al., 1999). La actividad antioxidante aqu encontrada se
explica por la estructura de los glicsidos detectados en los
extractos y en las fracciones.

186:343-355.
Caldwell C R, S Britz, R Mirecki (2005) Eect of temperature, elevated
carbon dioxide, and drought during seed development on the
isoflavone content of dwarf soybean [Glycine max (L.) Merrill]
grown in controlled environments. J. Agric. Food Chem. 53:11251129.
Chang C, M Yang, H Wen, J CHern (2002) Estimation of total flavonoids
content in propolis by two complementary colorimetric methods.
J. Food Drug Anal. 10:176-182.
Cotelle N, J Jery, J Wallet, E M Gaydou (1996) Antioxidant properties of
hidroxy-flavones. Free Radical Biol. Med. 20:35-43.
Cui N, K Nakamura, S Tian, H Kayahara, Y Tian (2006) Polyphenolic
content and physiological activities of Chinese hawthorn extracts.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:2948-2956.
Cuyckens F, M Claeys (2004) Mass spectrometry in the structural analysis
of flavonoids. J. Mass Spectrom. 39:1-15.
Garca-Mateos R, M Soto-Hernndez, F Zavala-Chvez, G Kite (2007)
Quinolizidine alkaloids in Calia secundiflora (Leguminosae).
Agrociencia 41:161-167.
Harborne J B, C Williams (2000) Review advances in flavonoid research
since 1992. Phytochemistry 55:481-504.
Hatfield G M, L J Valdes, W Keller, W Merril, V Jones (1977) An
investigation of Sophora secundiflora seeds (Mescalbeans). Lloydia
40:374-383.
Keller W J (1975) Alkaloids from Sophora secundiflora. Phytochemistry
14:2305-2306.
Kirakosyan A, P Kaufman, S Warber, S Zick, K Aaronson, S Bolling,
S Ch Chang (2004) Applied environmental stresses to enhance
the levels of polyphenolics in leaves of hawthorn plants. Physiol.
Plant.121:182-186.
Kite G C, Ch Stoneham, N Veitch (2007) Flavonol tetraglycosides and
other constituents from leaves of Styphnolobium japonicum
(Leguminosae) and related taxa. Phytochemistry 68:1407-1416.
Kite G, N C Veitch, M E Boalch, G P Lewis, C J Leon, M S J Simmonds
(2009) Flavonol tetraglycosides from fruits of Styphnolobium
japonicum (Leguminosae) and the authentication of fructus
Sophorae and flos Sophorae. Phytochemistry 70:785-794.

CONCLUSIONES
En las dos Estados muestreados, Hidalgo y Quertaro, el
contenido total de compuestos fenlicos en hojas de Calia
secundiflora fue mayor que el de flavonoides, aunque en las
muestras de Hidalgo tendieron a ser mayores, posiblemente
por ser una zona perturbada. Mediante el anlisis de CLEM se identificaron siete di-, tri- y tetra glicsidos descritos
por primera vez en esta especie. La presencia de glicsidos
en los flavonoles quercetina, isoramnetina y kaenferol, explican la actividad antioxidante encontrada en los extractos
y en las fracciones de flavonoides de hojas provenientes del
Estado de Hidalgo. Estos resultados pueden contribuir a la
quimiotaxonoma de C. secundiflora y al conocimiento fitoqumico de las especies mexicanas, y en la distribucin de
nuevos principios activos.
BIBLIOGRAFA
Aguilar C A, C Zolla (1982) Plantas Txicas de Mxico. Instituto
Mexicano del Seguro Social. Mxico, D. F. 271 p.
Bors W, W Heller, C Michel, S Manfred (1990) Flavonoids as antioxidants:
determination of radical-scavenging efficiencies. Meth. Enzymol.

156

BARRN, GARCA, SOTO, COLINAS Y KITE

Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (3), 2011

Shirataki Y, Y Sanae, Y Sugita, I Yokoe, M Komatsu, M Ohyama, T


Tanaka, M Iinuma (1997) Isoflavanones in roots of Sophora
secundiflora. Phytochemistry 44:715- 718.
Shulthes R E, A Hofmann (1982) Plantas de los Dioses: Origen y Uso de
los Alucingenos. Mxico. Fondo de Cultura Econmica. 192 p.
Soler-Rivas C, J C Espn, H J Wichers (2000) An easy and fast test to
compare total free radical scavenger capacity of foodstus.
Phytochem. Anal. 11:330-338.
Tanaka T, M Ohyama, M Iinuma, Y Shirataki, M Komatsu, Ch L Burandt
(1998) Isoflavonoids from Sophora secundiflora, S. Arizonica and
S. Gypsophila. Phytochemistry 48:1187 1193.
Thomas C D, A Cameron, R E Green, M Bakkenes, L J Beaumont, Y
C Collingham, B F N Erasmus, M Ferreira de Siqueira, A
Grainger, L Hannah, L Hughes, B Huntley, A S Van Jaarsveld,
G F Midgley, L M Miles, M A Ortega-Huerta, A T Peterson,
O L Phillips, S E Williams (2004) Extinction risk from climate
change. Nature 427:145-148.
Wagner H, S Bladt (1996) Plant Drug Analysis. A Thin Layer
Chromatography Atlas. Springer Verlag, Berlin. 384 p.
Waterman P G, S Mole (1994) Analysis of Phenolic Plant Metabolites.
Methods in Ecology. Blackwell Scientific Publications. Oxford,
UK. 238 p.
Zavala C F, R Garca M, M Soto H, G Kite (2006) Phytochemical
dierences between Calia secundiflora (Ort.) growing at two sities
in Mexico. Z. Naturforstch. 61:155-159.

Kite G, R Pennington (2003) Quinolizidine alkaloid status of


Styphnolobium and Cladrastis (Leguminosae). Biochem. Syst.
Ecol. 31:1409-1416.
Liu L, Y Laura, T Liang, X Ye Hong, X Zeng (2009) Determination of
polyphenolic content and antioxidant of kudingcha made from
Ilex kudingcha C. J. Tseng. Food Chem. 112:35-41.
Murakoshi I, H Kubo, M Ikram, M Israr, N Shafi, S Ohmiya, H Otomasu
(1986) (+)-11-oxocytisine, a lupin alkaloid from leaves of Sophora
secundiflora. Phytochemistry 25:2000-2002.
Prior R L, G Cao, A Martin, E Sofic, J Mcewen, C Obrien, N Lischner, M
Ehlenfeldt, W Kalt, G Krewer, C Mainland (1998) Antioxidant
capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content,
maturity, and variety of Vaccinium species. J. Agric. Food Chem.
46:2686-2693.
Robards K, D Prenzler, G Tucker, P Swatsitang, W Glover (1999)
Phenolic compounds and their role in oxidative processes in
fruits. Food Chem. 66:401-436.
Rzedowski J (1978) Vegetacin de Mxico. Ed. Limusa. Mxico, D. F. 432
p.
Snchez-Moreno C (2002) Methods used to evaluate the free radical
scavenging activity in foods and biological systems. Food Sci.
Technol. Internt. 8:121-137.
Snchez-Moreno C, J A Larrauri, F Saura-Calixto (1999) Free radical
scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines,
grape juices and related polyphenolic constituents. Food Res.
Internt. 32:407-412.

157

Das könnte Ihnen auch gefallen