1024201792.química Biológica

Captulo III
Consideraciones tericas y prcticas

de Qumica Biolgica
Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica
PROTENAS
Funciones de las protenas. Niveles de organizacin en las protenas. Propiedades de
las protenas. Extraccin de protenas. Cuantificacin de protenas.
Los aminocidos son compuestos nitrogenados que tienen un papel

primordial en la formacin de los seres vivos, puesto que constituyen los
bloques fundamentales con los que se forman las protenas, en las cuales los
aminocidos se unen mediante enlaces peptdicos. Las protenas tienen un
peso molecular elevado y son especficas de la especie y del rgano.
Funciones de las protenas

La gran mayora de los procesos biolgicos depende de la presencia y/o
actividad de alguna protena. stas pueden presentar diferentes actividades
biolgicas tales como: enzimtica, hormonal, de transporte (hemoglobina),
inmunolgica o de defensa (anticuerpos), de receptor celular (a los cuales se
fijan molculas capaces de desencadenar una respuesta determinada),
contrctil (actina y miosina, responsables de la contraccin muscular), de
reserva (ovoalbmina del huevo, casena de la leche y gliadina del trigo),
estructural (el colgeno, que integra fibras altamente resistentes en tejidos de
sostn), entre otras. Por todo esto, su estudio representa un enorme inters
para mltiples disciplinas biolgicas como gentica, biologa molecular,
biologa celular, bioqumica, fisiologa, medicina humana, veterinaria,
agronoma, zootecnia, botnica y zoologa, entre muchas otras.
182
1. Niveles de organizacin en las protenas

Estructura primaria: Incluye a todos los enlaces covalentes entre los
aminocidos y se define por la secuencia de los aminocidos unidos por
enlaces peptdicos y la localizacin de los puentes disulfuro.
Estructura secundaria: ordenamiento espacial de la cadena de
aminocidos de la estructura primaria sin considerar las conformaciones de
sus cadenas laterales. Plegamiento bsico de la cadena debido a enlaces de
hidrgeno entre grupos -CO- y -NH- del enlace peptdico: hlices, lminas y
giros
Estructura terciaria: Describe el plegamiento tridimensional de un
polipptido, incluidas sus cadenas laterales. Las estructuras estabilizantes
entre las cadenas laterales de los aminocidos,
son: enlaces hidrgeno,
interaccin hidrofbica, electrosttica, puentes disulfuros, y enlaces ester

(entre aminocidos alejados).
Estructura cuaternaria: Asociacin de distintas subunidades, siendo
cada una un polipptido. Es el arreglo tridimensional de las subunidades que
forman las protenas. Esta estructura se estabiliza por puentes hidrgeno,
interaccin hidrofbica, electrosttica y puentes disulfuros.
Estructura
primaria
Residuos de
aminocidos
Estructura
secundaria
hlice
Estructura
terciaria
Cadena polipeptdica
Estructura
cuaternaria
Subunidades ensambladas
183
2. Propiedades de las protenas

2.1. Carga neta: Las protenas presentan propiedades cido-base. Los
grupos funcionales de las protenas se pueden ionizar dependiendo del
pH de la solucin donde se encuentren.
2.2. Solubilidad: A pH bajo o por encima del punto isoelctrico, la
protena tiene una carga neta positiva o negativa. Esto hace que sea
soluble. En el punto isoelctrico las protenas reaccionan unas con
otras formando agregados que tienden a precipitar. Segn la fuerza
inica cambia la solubilidad
2.3. Desnaturalizacin o prdida de la estructura o conformacin
nativa: Es un cambio parcial o total de la estructura nativa de la
protena (secundaria, terciaria y cuaternaria).
Ocurre con la ruptura de puentes de azufre y de las interacciones no
covalentes. Los factores que producen la desnaturalizacin de las
protenas pueden ser fsicos (temperatura) o qumicos (pHs extremos,
detergentes, compuestos que forman puentes de hidrgeno o que
participan en interacciones hidrofbicas)
3. Aislamiento, purificacin y caracterizacin de protenas

La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren de la
purificacin, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Los
primeros pasos para encarar el estudio de una protena involucran su
aislamiento o extraccin a partir de una fuente determinada (animal, vegetal,
fngica, bacteriana, etc.) y su purificacin, al menos parcial. Esto requiere
generalmente un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias
diferentes y la molcula que buscamos puede ser extremadamente inestable o
encontrarse a concentraciones muy bajas. Sin embargo, se dispone de
184
diferentes mtodos adecuados para cada caso particular y para cada etapa de
este proceso, tales como, lisis celular, destruccin mecnica o tcnicas de
congelacin-descongelacin, a fin de romper las clulas y extraer las
protenas.
3.1.
Mtodos de ruptura celular y extraccin de protenas

La extraccin de protenas es considerada a menudo slo como un paso
preliminar para una subsiguiente purificacin, pero de hecho constituye un

paso crucial para su estudio, ya que el procedimiento de extraccin determina
la naturaleza y la estabilidad de las protenas extradas, lo que a su vez
determina la calidad y la validez de los resultados.
En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenato,
que implica la destruccin de la clula y el pasaje de las protenas a solucin o
suspensin. Esto puede llevarse a cabo de diferentes maneras, entre las que se
puede citar:
A) Homogenizacin mecnica: Puede utilizarse un homogeneizador de
vidrio, mortero, licuadora, a veces, con la ayuda de abrasivos como almina,
arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25
M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en una solucin
tampn (buffer) adecuado para controlar el pH.
B) Homogeneizacin snica: El choque de ondas snicas o ultrasnicas
provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared
celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para
determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).
C) Desintegracin trmicas: El congelamiento y descongelamiento rpido y
repetido suele usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin
se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al
185
descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia

de agua pura y se libera su contenido.
D) Homogeneizacin por deshidratacin: Se basa en la precipitacin de
protenas por solventes orgnicos (etanol, acetona, etc.). En la preparacin
del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.
3.2 Mtodos de extraccin de protenas (tejidos vegetales)
Para la extraccin de protenas a partir de un homogenato de tejidos
vegetales se pueden citar tres procedimientos generales:
A) Extraccin con soluciones tampn: El uso de tampones de baja fuerza
inica nos permite recuperar las protenas citoplsmicas solubles y las de los
espacios intercelulares, mientras que con alta fuerza inica tambin extraemos
las protenas ligadas a la pared celular.
B) Extraccin con detergentes: La extraccin con dodecil sulfato de sodio
(SDS) permite la extraccin de protenas solubles y de las ligadas a la
membrana celular en condiciones desnaturalizantes.
C) Precipitacin directa: Consiste en precipitar directamente la protena total
del tejido, triturando ste en presencia de cido tricloroactico (ATC) fro al
10%. Esta ltima tcnica se utiliza para comparar patrones proteicos entre
varias muestras analizadas por 2DPAGE (electroforesis bidimensional en
geles de poliacrilamida). Sin embargo, la presencia de ATC desnaturaliza
irreversiblemente las protenas, por lo que no puede ser utilizado cuando se
efectan estudios de actividad enzimtica o de otro tipo.
Para evitar la desnaturalizacin es necesario operar a bajas temperaturas
y a veces es conveniente la adicin de inhibidores de enzimas proteolticas
(proteasas) al buffer de extraccin. Algunos agentes estabilizadores como el
dimetilsulfxido (DMSO) al 10%, o glicerol al 25% protegen las protenas
contra la accin proteoltica. La adicin de agentes reductores como el
ditiotreitol (DTT) 5 mM, L-cisteina 8 mM, o mercaptoetanol 3mM,
186
protege las protenas de la oxidacin, pero se debe tener cuidado porque estos
agentes, en algunos casos pueden activar a las proteasas.
3.3 Mtodos de purificacin y caracterizacin
Por otro lado, para separar o purificar una protena a partir de una
mezcla de protenas se aplican habitualmente mtodos cromatogrficos que
aprovechan diferentes propiedades de la molcula proteica, como su masa
molecular (en la cromatografa de filtracin por gel), su carga (en la
cromatografa de intercambio inico) o su afinidad por determinados grupos
qumicos (cromatografa de afinidad). El anlisis de la protena o protenas
aisladas, como la determinacin de su peso molecular o la existencia de
subunidades (estructura cuaternaria), pI (punto isoelctrico), se lleva a cabo
generalmente mediante tcnicas electroforticas en condiciones nativas o
desnaturalizantes e isoelectroenfoque. El anlisis de la estructura de una
protena se hace mediante RMN, dicrosmo cicular, espectrofluorimetra,
secuenciacin, etc. Si la protena es una enzima, se realiza el anlisis de su
actividad biolgica y estudio de su comportamiento cintico.
Tcnicas utilizadas en el estudio de protenas
Purificacin
Fraccionamiento
subcelular
por
centrifugacin
diferencial
Precipitacin
salina
Dilisis
Cromatografa de
filtracin por gel,
intercambio
inico,afinidad
Electroforesis en
geles
isoelectroenfoque
Cuantificacin
Espectrofotometra
Anlisis de
estructura
Espectrofluorimetra
Anlisis de
actividad
Actividad
enzimtica
Espectrofluorimetra
Dicroismo circular
ELISA
RMN
Anlisis
de
radioligandos
Complejos
Antgeno
Anticuerpo
MALDI-MS
Secuenciacin
de
aminocidos
Difraccin de RX
187
3.4 Cuantificacin de protenas

Por ltimo, muchas veces es indispensable un mtodo que permita
medir la actividad biolgica de la protena que intentamos aislar y purificar
(por ejemplo, una actividad enzimtica) y en todo momento se requiere de un
mtodo adecuado para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en
estudio. Los criterios importantes para la eleccin de un mtodo adecuado
para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en estudio son:
a) Especificidad
b) Bajo umbral de deteccin
c) Facilidad para ponerla en prctica
d) Rapidez
e) Costo accesible
f) Facilidad para integrarla a un protocolo de purificacin
Entre los mtodos ms usados citaremos tres:
Absorbancia a 280 nm
Aunque ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas
absorbe luz en la regin visible del espectro electromagntico, tres de ellos
(tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la regin
del UV cercano a los 280 nm. Dado que las protenas poseen restos de
aminocidos aromticos, las medidas de absorcin a 280 nm constituyen un
mtodo rpido para la determinacin del contenido de protena de una
solucin. Este mtodo es usado para determinar la localizacin de protenas en
una o ms fracciones procedentes de un proceso de separacin
cromatogrfica.
188
Protenas (mg/ml) = 1.55 A280 0.76 A260
Mtodo de Bradford - Fijacin no Covalente de Colorante

El colorante puede existir en diferentes formas inicas en una solucin
cida. La forma aninica (azul) del Coomassie Blue G250 (max=590 nm), se
fija a las protenas por interacciones electrostticas con los grupos catinicos.
El colorante interacciona en forma preferencial con los grupos funcionales de
arginina y lisina. El mismo colorante tiene una forma catinica roja (max=470
nm) y otra verde (mx=650 nm). El complejo es estable por una hora.
Mtodo de Lowry
Es un mtodo espectrofotomtrico de valoracin cuantitativa de
protenas. Se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de FolinCiocalteau, que consiste en una solucin de tungstato sdico y molibdato
sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. A una adecuada dilucin de
protenas se aade el Reactivo de Folin que forma un complejo coloreado con
ellas, siendo la intensidad de color resultante proporcional a la concentracin
de protenas, segn la ley de Lambert-Beer (A= .L.C).
Fundamento: La reaccin entre las protenas y los reactivos empleados
por este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas en los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos, formando complejos. Estos
complejos Cu2+-protena, de un color azul plido, provocan el desdoblamiento de
la estructura tridimensional de la protena, exponiendo hacia la superficie a los
residuos fenoles de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la
reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
189
2) Tambin en medio bsico, el cobre acta como catalizador de la

reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteau por parte de los grupos fenlicos de
los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico,
de color amarillo, que al ser reducido por los residuos fenlicos da lugar a un
complejo de color azul intenso que se lee en espectrofotmetro a una longitud de
onda () de 750 nanmetros (nm). La intensidad del color depende de la
cantidad de estos aminocidos aromticos presentes en las protenas y ser
proporcional a la concentracin de protenas en la solucin.
Reaccin entre la protena y los reactivos de Cu2+ y de Folin

Cada mtodo presenta sus ventajas y desventajas las cuales se resumen
en la tabla. La eleccin de uno u otro mtodo depender del objetivo final que
se pretende llegar en el estudio de protenas.
190
Grupos
Aromticos
(280 nm)
Unin Peptdica
(205 nm)
Ventajas
-Gran espectro de sensibilidad
-Mtodo no destructivo
-Protenas con y sin grupos
aromticos
-Mtodo no destructivo
Mtodo de
Lowry
(745-750 nm)
-10 veces ms sensible que UV

(5 a 100 g)
-Aconsejable
para
mezclas
complejas (tisulares)
Mtodo de
Bradford
(595 nm)
-5 veces ms sensible que el de

Lowry
-Pequeas
interferencias
se
compensan con el control
Desventajas
-Interfieren
cidos
nucleicos
y
otros
compuestos aromticos.
-Deteccin de otros
compuestos qumicos.
-Interfieren la mayora
de los tampn.
-Interferencia de varias
sustancias.
-Inestabilidad de los
reactivos
-Desviacin
de
la
linealidad
a
altas
concentraciones
-La sensibilidad
depende del contenido
de lisinas y argininas.
-El
complejo
deja
restos azules en las
cubetas.
191
Experimentacin
Protenas
Objetivos
Extraer, concentrar y purificar protenas de origen animal y vegetal.
Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas.
Determinar el punto isoelctrico de una protena.
Estudiar el efecto de solventes orgnicos sobre las protenas.
Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalizacin reversible e

irreversible de las protenas.
Emplear un mtodo colorimtrico para el anlisis cuantitativo de las

protenas presentes en una muestra desconocida.
A. Extraccin de protenas solubles de hojas de trtago (Ricinus

communis).
Tcnica: pesar aproximadamente 100 g de hojas de trtago. Lavar el
material vegetal con agua corriente y enjuagar con agua destilada. Cortar en
trozos pequeos con tijeras y homogeneizar en una procesadora con 100 ml de
buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 conteniendo 2-mercaptoetanol 1 mM
(buffer de extraccin) y rotular como Extracto Crudo (M0). Filtrar el
extracto crudo por doble gasa y centrifugar el lquido filtrado a una velocidad
de 2000 rpm durante 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y medir su
volumen. Rotular como Extracto Centrifugado (M1).
B. Tcnica de concentracin de extracto de protenas solubles

El extracto centrifugado se concentra mediante precipitacin con
sulfato de amonio slido hasta un 100 % de saturacin (para 100 ml de
solucin al 100 % se debe agregar 70,6 g de (NH4)2SO4). Se debe medir el
192
volumen del extracto que se va a concentrar y calcular la cantidad de sal

necesaria para alcanzar una saturacin del 100 %. Pesar el sulfato de amonio y
agregarlo lentamente y con agitacin para lograr una buena precipitacin de
las protenas. Posteriormente centrifugar a una velocidad de 2000 rpm durante
15 minutos. Descartar el lquido sobrenadante y resuspender el precipitado en
un pequeo volumen de buffer acetato de sodio 10 mM pH 5,5 con 2mercaptoetanol 1 mM (tampn de dilisis).
A fin de eliminar el (NH4)2SO4, que puede alterar irreversiblemente a
algunas protenas, se debe someter el extracto concentrado a un proceso de
dilisis. Para ello, se carga el extracto en una membrana de dilisis y se dializa
contra 500 ml del tampn de dilisis durante dos horas, renovando el lquido
de dilisis a los 60 minutos. Durante este proceso las molculas salinas de
menor tamao atraviesan los poros de la membrana por difusin simple y las
protenas, de mayor tamao, son retenidas. Rotular como Extracto
concentrado (M2).
Advertencia: el 2-mercaptoetanol es un producto combustible y

sumamente txico por ingestin, inhalacin o contacto con la piel. Irrita
ojos, piel y vas respiratorias.
C. Propiedad amortiguadora de las protenas: titulacin con cido.

Reactivos:
- Acido clorhdrico 0,01 N
- Solucin indicadora de Rojo de Metilo. Vira de rojo (pH 4,2) a amarillo (pH
6,3).
- Suero sanguneo.
- Suero desproteinizado : A una muestra de suero sanguneo se la somete a
calentamiento (100C durante 1 a 2 minutos). Posteriormente se filtra o
193
centrifuga 5 min a 2000 rpm. Se descarta el precipitado. El sobrenadante

constituye el suero desproteinizado
Procedimiento:
Titular una fraccin alcuota del suero y una del suero
desproteinizado, ambos diluidos 1/5 con agua destilada. La titulacin se
realiza en presencia de 10 gotas del indicador rojo de metilo que al mezclar
con el suero se torna de color amarillo,.agregando HCl 0,01 N hasta cambio
de color a rosado plido. Se mide el volumen de HCl gastados.
D. Solubilidad de la casena a diferentes pH

Reactivos:
- Acido actico 1 N.
- Solucin de casena en acetato de sodio 0,1 N.
Procedimiento:
-
Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de cido

actico 1 N y 6,8 ml de agua destilada, mezclar.
Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.
Tomar 5 ml de la solucin del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y

repetir la operacin hasta el ltimo tubo. Descartar los 5 ml finales.
Medir el pH a cada solucin (rango de pH esperado 3,5-5,9).
Agregar 1 ml de casena a cada tubo de la escala de pH y mezclar

inmediatamente por agitacin.
Observar la solubilidad de la casena a distintos pH a tiempo cero (T0) y a

los 30 minutos (T30) de contacto.
E. Precipitacin y desnaturalizacin de protenas.
194
Reactivos:
- Etanol de 95
- Acetona
- Hidrxido de sodio conc.
- HCl conc.
- Solucin de ovoalbmina: separar la clara de huevo, medir su volumen y
batir durante unos minutos, mezclar con cinco volmenes de agua destilada y
filtrar la mezcla a travs de doble gasa.
Procedimiento:
Precipitacin
de
ovoalbmina
con
solventes orgnicos:
agregar
volmenes iguales de alcohol y acetona a la solucin de ovoalbmina.
Coagulacin de ovoalbmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,

colocar en cada uno 2 ml de solucin de ovoalbmina y proceder a:
Tubo 1: calentar.
Tubo 2: agregar unas gotas de cido clorhdrico concentrado (HCl).
Tubo 3: agregar solucin concentrada de hidrxido de sodio (NaOH).
Tubo 4: usar como control.
Explicar el fenmeno observado.
F. Determinacin cuantitativa de protenas.

Mtodo de Lowry.
Reactivos:
1- NaOH 0,5 N
2- Reactivo 1: Se prepara en el momento de usar. Cada 10 ml de Na2CO3 2%
se agrega 0,1 ml de CuSO4.5 H2O 1% y 0,1 ml de Tartrato de Na y K 2,7 %.
3 Reactivo de Folin-Ciocalteau. Se emplea una dilucin .
195
El mtodo como en todo mtodo cuantitativo colorimtrico requiere de

la realizacin de una curva de calibracin, tambin llamada curva estndar,
para lo cual se emplea una solucin patrn de albmina srica bovina (BSA)
de 0,15 mg/ml.
Tcnica: Rotular 8 tubos y agregar la solucin estndar o las muestras y

los reactivos, segn el siguiente protocolo:
Tubo
BSA:
H2O
NaOH
R1*
Folin**
DO
0,15 mg/ml
(ml)
(ml)
(ml)
(ml)
750 nm
0,4
0,2
(ml)
1 (Blanco)
-------
0,20
2 (7,5 g)
0,05
0,15
3 (15 g)
0,10
0,10
4 (22,5 g)
0,15
0,05
5 (30 g)
0,20
-------
M0
M1
M2
* Mezclar y esperar 10 minutos antes de agregar el Reactivo de Folin
** Mezclar y leer exactamente a los 30 minutos la DO a 750 nm.
Curva de Calibracin: graficar en papel milimetrado los valores de
DO en funcin de los de g de BSA.
Valoracin de las muestras desconocidas: Para determinar la cantidad
de protenas presentes en las muestras problemas se debe interpolar sus valores a
partir de las DO determinadas. En base al contenido de protenas determinadas
por este mtodo y conociendo los volmenes y diluciones empleados para la
determinacin, se puede calcular la concentracin de protenas de las muestras
problema en mg/ml.
196
ENZIMAS
Definicin de enzimas. Nomenclatura y clasificacin. Actividad enzimtica.
Velocidad de reaccin. Cintica enzimtica.
Las reacciones qumicas de los sistemas biolgicos raramente ocurren

en ausencia de un catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y
son casi en su totalidad de naturaleza proteica, con la excepcin de un
pequeo grupo de molculas de RNA cataltico (ribozimas). Las funciones
vitales de cualquier clula seran imposibles de mantener si las reacciones que
ocurren en ellas fueran extremadamente lentas. Adems de incrementar la
velocidad de las reacciones, las enzimas exhiben una elevada especificidad y
en algunos casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos que
aumentan o disminuyen su actividad.
Las enzimas, como todos los catalizadores, son efectivas en pequeas
cantidades, no sufren modificaciones qumicas irreversibles durante la
catlisis ni afectan el equilibrio de las reacciones que catalizan. Aunque los
estadios inicial y final de una reaccin son los mismos con y sin un
catalizador, su presencia hace que se llegue al equilibrio mucho ms
rpidamente, es decir, slo modifican la velocidad de la reaccin.
Por otro lado, debido a su naturaleza proteica, las enzimas comparten
caractersticas con las protenas no enzimticas y difieren de los catalizadores
inorgnicos en que:
Son termolbiles y su actividad depende en la mayora de los casos del pH
del medio.
El reconocimiento de la enzima por su sustrato es altamente especfico.
Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran nmero de molculas
de sustrato por unidad de tiempo.
197
Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares, genticos y

alostricos.
Nomenclatura y clasificacin de las enzimas

Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al
nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cual ejerce su actividad
cataltica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea y la arginasa
cataliza la hidrlisis de la arginina. Otras enzimas han recibido su nombre en
funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3-fosfatodeshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin (oxidacin) del Gliceraldehdo3-fosfato a 3-fosfoglicerato. Incluso tienen nombres especficos que no dan
informacin alguna del sustrato que transforman o de la reaccin que
catalizan, como por ejemplo la tripsina (enzima proteoltica).
No obstante, existe una clasificacin sistemtica de las enzimas que
las divide en seis grandes grupos, cada uno de los cuales se subdivide a su
vez en clases:
1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin)
2: Transferasas (transfieren grupos funcionales)
3: Hidrolasas (reacciones de hidrlisis),
4: Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces)
5: Isomerasas (reacciones de isomerizacin)
6: Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP).
Actividad enzimtica
El estudio o investigacin de una actividad enzimtica involucra dos
aspectos: uno cualitativo y otro cuantitativo.
Anlisis cualitativo:
198
Consiste en poner de manifiesto la presencia de la enzima en estudio,

mediante la observacin de la transformacin del sustrato de la enzima en un
producto dado, mediante reacciones que involucren un cambio de color,
aparicin de gas, cambio de pH, variacin de viscosidad o de otro parmetro
fsico, etc.
Anlisis cuantitativo:
Consiste en determinar la cantidad de enzima presente en un sistema;
para ello se recurre a la medida de la velocidad de la reaccin catalizada por la
enzima que se ensaya. Esto es posible debido que, en condiciones adecuadas,
la velocidad de una reaccin enzimtica es directamente proporcional a la
cantidad de enzima presente.
Velocidad de reaccin:
Se entiende por velocidad de una reaccin qumica a la variacin de la
concentracin de reactivos o de productos en funcin del tiempo. As, la
velocidad de una reaccin enzimtica puede medirse como la velocidad de
utilizacin del sustrato o bien como la velocidad de formacin de uno de los
productos. De esta manera, se puede expresar la cantidad de enzima en
trminos de unidades enzimticas, entendindose por Unidad de Enzima a la
cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol de
sustrato por minuto bajo condiciones definidas de temperatura y pH .
Cuando la actividad de una enzima se relaciona con el contenido
proteico de la preparacin enzimtica, se la denomina Actividad Especfica y
se expresa como el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena
(UE/mg). La actividad especfica de una enzima indica el grado de pureza de
la preparacin enzimtica y es mxima cuando la enzima se encuentra pura.
199
Otra unidad empleada para expresar la actividad de una enzima,

especialmente en los campos de medicina y bioqumica, es el Katal (kat). Un
katal es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de
sustrato por segundo. Esta unidad introducida recientemente por la Unin
Internacional de Bioqumica: 1 kat equivale a 60 x 106 UE. Debido a que se
trata de una unidad muy grande, frecuentemente se utilizan submltiplos
como microkatal (kat) y nanokatal (nkat). Tambin suele emplearse la
Actividad Molecular (nmero de recambio): es el nmero de molculas de
sustrato transformadas por minuto por una molcula de enzima. Se calcula
dividiendo la velocidad mxima de la enzima por el peso molecular; es una
caracterstica de las enzimas individuales y no refleja la pureza de la
preparacin.
Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas. Los estudios cinticos proporcionan informacin directa acerca
del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La
velocidad de una reaccin enzimtica puede determinarse midiendo la
aparicin de los productos o bien la desaparicin de los reactivos como
funcin del tiempo. Al medir la aparicin de producto (o la desaparicin del
sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance o de
progreso de la reaccin (Figura 1), o simplemente, la cintica de la reaccin.
A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de aparicin del
producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reaccin.
200
10
[P] Mm
Concentracin
de Producto
(mM)
Curva de progreso de la reaccin

8
[S]O = 1 KM
vo
0
0
100
200
300
400
500
600
TIEMPO (min)
Tiempo (minutos)
Valores medidos
-- Velocidad inicial (v0)
Para que los valores determinados reflejen la cantidad de enzima

presente en la preparacin siempre se procede a medir la velocidad inicial de
la reaccin (v0) que es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo
cero. As, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total
del sustrato, entonces puede considerarse la concentracin molar del sustrato
([S]) como esencialmente constante a lo largo del ensayo. En estas
condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa ya que la cantidad
de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre.
E+S
P+E
En la prctica se debe determinar el rango de tiempo en el que la

variacin de la concentracin del producto formado (o de sustrato consumido)
es directamente proporcional al tiempo de la reaccin. Por ejemplo, en la
201
Figura 1 se observa una respuesta lineal hasta los 50 minutos de incubacin;

en consecuencia, para medir la actividad de esa enzima basta con incubar
como mximo durante tiempos inferiores a 50 minutos (por ejemplo 30 40
minutos) y de esta manera estamos seguros de medir actividades
correspondientes a la velocidad inicial de la enzima.
Factores que afectan la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas

La velocidad de las reacciones enzimticas es afectada por una serie de
factores tales como pH, temperatura, concentracin de enzima, concentracin
de sustrato y presencia de molculas efectoras (activadores o inhibidores de la
enzima).
La determinacin de la actividad enzimtica se realiza generalmente en
las condiciones ptimas de pH y temperatura, en presencia de cofactores y en
concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de
reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). Sin embargo, dichas
condiciones deben ser cambiadas cuando se quiere estudiar el efecto de
alguna de estas variables (pH, temperatura, concentracin de sustrato, etc.) o
de otros factores (inhibidores o activadores) sobre la velocidad de la reaccin.
Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin.

La concentracin del sustrato es uno de los principales factores que
determinan la velocidad de una reaccin enzimtica. La relacin entre la
concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin enzimtica puede
expresarse de manera cuantitativa a travs de la ecuacin de MichaelisMenten.
V= Vmax. [S] / Km+[S]
202
Km representa:
1. Constante de equilbrio de disociacin del complejo ES
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
3. Concentracin de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad
de La mxima (V 0.5)
4. Se define para un dado complejo enzima-sustrato
5. Se mide en unidades de concentracin
Km
Considerando la recproca de la ecuacin de Michaelis Menten obtenemos la
ecuacin de Lineaweaver Burk
203
Experimentacin
ENZIMAS
Objetivos
Determinar la actividad de una enzima hidroltica (invertasa cida soluble
de Ricinus communis) mediante mtodos espectrofotomtricos.
Determinar la velocidad inicial de la enzima (efecto del tiempo de
incubacin).
Determinacin del pH ptimo de enzima mediante el ensayo del efecto del
pH sobre la actividad de enzima.
Determinar la KM y la Vmax de la enzime mediante el estudiao del efecto de
la concentracin de sustrato.
Anlisis cuantitativo de la actividad enzimtica

Invertasas:
Son hidrolasas involucradas en el metabolismo de los hidratos de
carbono
de
especies
vegetales.
Tambin
se
las
denomina
-D
fructofuranosidasa pues hidrolizan el enlace glicosdico entre la fructosa y la

glucosa del disacrido sacarosa. La sacarosa es un azcar no reductor pues no
tiene grupos carbonilos libres. La hidrlisis enzimtica del disacrido origina
glucosa y fructosa, ambos azcares reductores. Por lo tanto, la actividad de
esta enzima se puede medir mediante la aparicin del poder reductor de
la glucosa y fructosa originadas, segn la siguiente reaccin:
204
INVERTASA
SACAROSA
GLUCOSA + FRUCTOSA
No Reductor
Reductores
Las invertasas atacan al disacrido desde el residuo de fructosa y

aunque su principal sustrato es la sacarosa (Glu-Fru), algunas tambin
hidrolizan otros oligosacridos -D fructsidos como la rafinosa (Gal-GluFru) y la estaquiosa (Gal-Gal-Glu-Fru), aunque en menor proporcin.
INVERTASA
RAFINOSA
GAL-GLU + FRUCTOSA
No Reductor
Reductores
INVERTASA
ESTAQUIOSA
No Reductor
GAL-GAL-GLU + FRUCTOSA
Reductores
A. Determinacin de azcares reductores por el Mtodo de SomogyiNelson

Fundamento:
Los azcares con un grupo aldehdo o cetona libre son capaces de
reducir los iones Cu++ del Reactivo alcalino de Somogyi, en iones Cu+, que al
reaccionar con el cido arseno-molbdico del Reactivo de Nelson producen
compuestos coloreados que se leen fotocolorimtricamente a 520 nm.
205
Reactivos:
a) Reactivo cprico de Somogyi. Se prepara en el momento de usar
mezclando 1 volumen de la solucin A con 9 volmenes de la solucin B:
Solucin A: CuSO4.5 H2O al 10 %.

Solucin B: Disolver 28 g. de Na2HPO4 anhidro en 700 ml de agua destilada.
Agregar 40 g de Tartrato de Sodio y Potasio. 4 H2O. Cuando la disolucin es
completa agregar 100 ml de NaOH 1N y 120 g de Na2SO4 anhidro. Llevar a
900 ml con agua destilada y dejar en reposo durante 48 horas, filtrar y guardar
en frasco color caramelo.
b) Reactivo de Nelson. Disolver 25 g de molibdato de amonio. 4 H2O en 450
ml de agua destilada, aadir 21 ml de H2SO4 concentrado. Luego de mezclar
con cuidado (reaccin exotrmica) y agregar 3 g de arseniato disdico. 7 H2O.
Dejar en reposo durante 48 horas a temperatura ambiente, filtrar y guardar en
frasco color caramelo.
c) Glucosa 1 mM, como solucin estndar.
Procedimiento: cargar tubos con cantidades crecientes de la solucin de

glucosa, entre 0,05 y 0,30 moles, para realizar la curva estndar y diluciones
de las muestras problema centrifugadas para su valoracin. Completar con
agua destilada hasta 0,5 ml, agregar 0,5 ml del Reactivo de Somogyi y
calentar en BM hirviente durante 15 minutos. Enfriar, agregar 0,5 ml del
Reactivo de Nelson y 1 ml de agua destilada. Mezclar y leer a 520 nm.
Procesar simultneamente un Blanco de Reactivos. Graficar la DO leda en
funcin de moles de glucosa y determinar la concentracin de azcares
reductores de las muestras problema.
Sensibilidad del Mtodo: 0,05-0,3 moles de azcares reductores.
206
Curva estndar de azcares reductores (Somogyi-Nelson)

Solucin estndar: glucosa 1mM (1 mol/ml).
Tubo Glucosa
(ml)
H 2O
Reactivo
Reactivo
H 2O
(ml)
Somogyi
Nelson
(ml)
(ml)
(ml)
0,50
0,50
100
0,50
Leer
0,10
0,40
DO
0,15
0,35
15
520
0,20
0,30
min.
nm
0,25
0,25
0,30
0,20
B. Determinacin del efecto del tiempo de incubacin sobre la

actividad de la enzima
Tubo
T0
T5
T10
T20
Cont.
Sac T0
Cont.
Sac.T5
Cont.
Sac T10
Cont.
Sac T20
Cont. Ez.
Buff. 0,2
M pH 5,5
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
Sac. 0,3 M
(ml)
0,1
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
H2O d.
(ml)
------------------------0,2
Enzima
(ml)
0,2
0,2
0,2
0,2
-------
Tiempo
(minutos)
0
5
10
20
0
0,2 ml
0,1 ml
0,2
-------
0,2 ml
0,1 ml
0,2
-------
10
0,2 ml
0,1 ml
0,2
-------
20
0,2 ml
-------
0,1
0,2
20
207
1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reaccin

con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C el
tiempo indicado en cada caso y finalizar la reaccin mediante el
agregado de 0,5 ml del Reactivo de Somogyi.
2- En cada tubo determinar los azcares reductores que se
formaron durante la reaccin enzimtica segn el mtodo de SomogyiNelson (medir la DO 520 nm).
3- Estimar la DO que corresponde a los nuevos azcares
reductores formados ( DO = DO mezcla DO Cenz. DO Csust.).
4- Transformar los datos de DO en micromoles de azcares
reductores usando una curva estndar del mtodo empleado.
5- Transformar los micromoles de azcares reductores en
micromoles de sacarosa hidrolizado (dividiendo en 2).
6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada tiempo
como micromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en
los minutos que se incub cada mezccla).
7- Confeccionar en papel milimetrado un grfico de v en
funcin de tiempo.
208
C. Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato sobre

la actividad de la enzima
Tubo
Sac
Sac
Sac
Sac
Sac
Buff.
pH 5,5
H 2O
d.
Enzima
0,025
M
0,05
M
0,10
M
0,20
M
0,30
M
-------
-------
-------
-------
-------
0,2 ml
0,1 ml
0,2 ml
5 mM
0,1 ml
-------
-------
-------
-------
0,2 ml
-------
0,2 ml
C. 5
mM
0,1 ml
-------
-------
-------
-------
0,2 ml
0,2 ml
-------
10
mM
-------
0,1 ml
-------
-------
-------
0,2 ml
-------
0,2 ml
C. 10
mM
-------
0,1 ml
-------
-------
-------
0,2 ml
0,2 ml
-------
20
mM
-------
-------
0,1 ml
-------
-------
0,2 ml
-------
0,2 ml
C. 20
mM
-------
-------
0,1 ml
-------
-------
0,2 ml
0,2 ml
-------
40
mM
-------
-------
-------
0,1 ml
-------
0,2 ml
-------
0,2 ml
C 40
mM
-------
-------
-------
0,1 ml
-------
0,2 ml
0,2 ml
-------
60
mM
-------
-------
-------
-------
0,1 ml
0,2 ml
-------
0,2 ml
C. 60
mM
-------
-------
-------
-------
0,1 ml
0,2 ml
0,2 ml
-------
0
(C.Ez)

con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C
durante 15 minutos y finalizar la reaccin mediante el agregado de 0,5
ml del Reactivo de Somogyi.
209

6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada
concentracin de sustrato como micromoles de sacarosa hidrolizados
por minuto (dividiendo en 15 minutos).
funcin de concentracin de sustrato.
210
D. Determinacin del efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Tubo
2,5
C Sac
2,5
3,5
C. Sac
3,5
4,5
C.
Sac.
4,5
5,5
C Sac.
5,5
6,5.
C Sac.
6,5
C. Ez.
Buff.
pH 2,5
0,2 ml
0,2 ml
Buff.
pH 3,5
-------------
Buff.
pH 4,5
-------------
Buff.
pH 5,5
-------------
Buff.
pH 6,5
-------------
Sac.
0,3 M
0,1 ml
0,1ml
H 2O
d.
------0,2 ml
Ez.
0,2 ml
-------
-------------
0,2 ml
0,2 ml
-------------
-------------
-------------
0,1 ml
0,1 ml
------0,2 ml
0,2 ml
-------
-------------
-------------
0,2 ml
0,2 ml
-------------
-------------
0,1 ml
0,1 ml
------0,2 ml
0,2 ml
-------
-------------
-------------
-------------
0,2 ml
0,2 ml
-------------
0,1 ml
0,1 ml
------0,2 ml
0,2 ml
-------
-------------
-------------
-------------
-------------
0,2 ml
0,2 ml
0,1 ml
0,1 ml
------0,2 ml
0,2 ml
-------
-------
-------
-------
-------
-------
-------
0,4 ml
0,2 ml

con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C
durante 15 minutos y finalizar la reaccin mediante el agregado de 0,5
ml del Reactivo de Somogyi.
211

6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada pH como
micromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en 15
minutos).
funcin de pH.
212
CIDOS NUCLEICOS
Definicin de cidos nucleicos. Composicin. Bases nitrogenadas. Estructura de los
nuclesidos, nucletidos y polinucleticos. ADN conformacin. ARN. Tipos. Funcin
INTRODUCCION
Los cidos nucleicos son las biomolculas portadoras de la
informacin gentica. Tienen una estructura polimrica, lineal, cuyos
monmeros son los nucletidos. Son molculas formadas por centenares de
millones de nucletidos en una sola estructura covalente. El nucletido est
formado por un fosfato esterificado a una pentosa, la que a su vez est unida
por un enlace -glicosdico a una base nitrogenada.
De la misma manera que las protenas son polmeros lineales
aperidicos de aminocidos, los cidos nucleicos lo son de nucletidos. La
aperiodicidad de la secuencia de nucletidos implica la existencia de
informacin. Los cidos nucleicos constituyen el depsito de informacin de
todas las secuencias de aminocidos de todas las protenas de la clula. Existe
una correlacin entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que cidos
nucleicos y protenas son colineares; la descripcin de esta correlacin es lo
que llamamos Cdigo Gentico, establecido de forma que a una secuencia de
tres nucletidos en un cido nucleico corresponde un aminocido en una
protena. Adems hay
cidos nucleicos implicados en la transmisin y
procesado de la informacin gentica, otros con funciones catalticas

(ribozimas), y hay secuencias regulatorias que controlan la expresin de
diferentes genes (hormonas, factores de crecimiento, seales qumicas en
general).
213
La hidrlisis enzimtica completa de un cido nucleico da lugar a una

mezcla de nucletidos. La hidrlisis completa de un nucletido da lugar a una
mezcla equimolar de:
Una Base nitrogenada heterocclica, que puede ser de dos tipos:

Purina o Pirimidina
Una Pentosa, que puede ser Ribosa o 2-Desoxirribosa
Ortofosfato
Bases nitrogenadas
Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos son bases heterocclicas
que pertenecen a una de dos familias:
Unas estn basadas en el Anillo pirimidnico, las Pirimidinas que
constituyen un sistema plano de seis tomos, cuatro carbonos y dos
nitrgenos. Los tomos del anillo pirimidnico tienen la siguiente numeracin:
N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N3
4 5
6
2
1
N
Las distintas bases pirimidnicas se obtienen por sustitucin de este
anillo con grupos oxo (=O), grupos amino (-NH2) o grupos metilo (-CH3).
O
O
H N
O
CH3
N
H
TIMINA
2,4 di oxo 5 metil pirimidina
H
O
NH2
N
N
N
H
URACILO
2,4 di oxo pirimidina
N
H
CITOSINA
2 oxo 4 amino pirimidina
214
Timina se encuentra slo en la molcula de ADN; Uracilo slo se

encuentra en el ARN y Citosina es comn a ambos cidos nucleicos.
La otra familia de bases nitrogenadas est basada en el Anillo purnico,
son las Purinas, las que constituyen un sistema plano de nueve tomos, cinco
carbonos y cuatro nitrgenos. El anillo purnico puede considerarse como la
fusin de un anillo pirimidnico con uno imidazlico. Ambas bases pricas
(Adenina y Guanina) se encuentran tanto en ADN como en ARN. Los tomos
del anillo purnico se numeran de la forma siguiente: N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N7: C8: N9
N1
2
6
3
N
5
4
8
9
N
H
PURINA
O
NH2
N
N
N
N
H
ADENINA
6 amino purina
NH2
N
H
GUANINA
2 amino 6 oxo purina
Nuclesidos
La unin de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los
compuestos llamados nuclesidos. Obsrvese el sufijo sido, caracterstico de
todos los glicsidos. La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en
cuyo caso hablamos de Ribonuclesidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (Ddesoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonuclesidos. Todos los
nuclesidos son del tipo anomrico beta. Esto nos introduce a la distincin
215
bsica entre ADN (constitudo por desoxirribonucletidos) y ARN (por

ribonucletidos), que est dada por las distintas pentosas y bases nitrogenadas.
Nucletidos
Cuando un ortofosfato se esterifica a alguno de los -OH de la pentosa
de un nuclesido, la estructura resultante se llama nucletido. En los
ribonuclesidos, el ortofosfato puede esterificarse en tres posiciones distintas:
2', 3' y 5'. En los desoxirribonuclesidos, la esterificacin con grupos fosfato
se da en 3, 5 de la pentosa.
La pentosa se une a la base nitrogenada por un enlace N-glicosdico que
se establece entre el tomo de C1 del azcar y el tomo de N9 de las bases
pricas o el N1 de las bases pirimidnicas. El grupo fosfato se halla unido por
un enlace ster al tomo C5 de la pentosa.
NH2
N
O
-
5'
CH 2
4'
Nucletido de ADN
Desoxiadenosina 5monofosfato (AMP)
H 1'
H
3'
OH
2'
H
Adems de los nucletidos formados por un ortofosfato aparecen entre

las biomolculas nucletidos formados con un polifosfato. Ej. ADP, ATP.
NH2
-
O
-
P
O
O
O
P
O
5'
CH 2
4'
H
H
3'
OH
Adenosina 5difosfato (ADP)
ON
H 1'
2'
OH
216
Aparte de su carcter como monmeros de cidos nucleicos, la

estructura de nucletido est generalizada entre las biomolculas, y
particularmente como coenzimas, por ej. NADP, FAD, CoA.
Polinucletidos
Dos nucletidos pueden unirse a travs de un enlace fosfodister. Un
nucletido est fosforilado en 3' y este fosfato, a su vez, esterifica al 5'-OH del
siguiente nucletido
El enlace as establecido se llama enlace
fosfodister, y es caracterstico de los cidos
nucleicos. A su vez, el grupo 3' -OH del segundo
nucletido puede esterificarse a otro fosfato que
por su parte se esterifica al 5'-OH del siguiente
nucletido y este ltimo se une de la misma
manera a otro nucletido y as sucesivamente.
Convencionalmente los polinucletidos se numeran desde el residuo 5'
terminal, que es aquel que tiene un 5'-OH libre (extremo 5') el cual muy
frecuentemente aparece esterificado a un fosfato o polifosfato mientras que en
el extremo opuesto de la molcula hay un grupo 3' -OH libre que recibe el
nombre de extremo 3'.
Las enzimas que hidrolizan polinucletidos, genricamente llamadas
nucleasas, son, por lo tanto, fosfodiesterasas (su accin consiste en la
hidrlisis de un fosfodister).
Acido Desoxirribonucleico, ADN

La conformacin B del ADN fue propuesta por Watson y Crick en su
trabajo original de 1953. Son dos cadenas de polinucletidos enrollados uno
217
en torno a otro, constituyendo una doble hlice dextrgira de tipo

plectonmico (lo cual quiere decir que para separar uno de otro es preciso
desenrollar previamente la hlice). Puede observarse que las bases estn en
planos aproximadamente perpendiculares al eje mayor de la doble hlice y
dirigidas hacia dentro de la estructura mientras que las desoxirribosa-fosfato
se dirigen hacia el exterior.
Los dos polinucletidos as estructurados tienen polaridad opuesta.
En uno de sus extremos hay un grupo 5'-OH libre, el extremo 5' mientras que
en el otro extremo hay un grupo 3'-OH libre, el extremo 3'
El
otro
polinucletido
presenta
una
polaridad opuesta. Su extremo 5' est del mismo

lado que el 3' del otro polinucletido; mientras
que el extremo 3' est del lado del 5' del otro
polinucletido, son por lo tanto, antiparalelos.
Los dos polinucletidos interaccionan
entre
mediante
enlaces
de
hidrgeno
establecidos entre las bases nitrogenadas de uno

y de otro. Esta interaccin slo puede tener lugar
entre adenina y timina (el par A-T) entre las
que se establecen dos enlaces de hidrgeno. O bien, entre guanina y citosina
(el par G-C) entre las que se establecen tres enlaces de hidrgeno.
La estructura del DNA se mantiene gracias a los enlaces de hidrgeno
establecidos entre las bases, por una parte, y a una interaccin de naturaleza
hidrofbica que se da entre pares de bases contiguos, la interaccin de
apilamiento (stacking).
218
Conformacin A
La conformacin A del ADN aparece en cristales de baja hidratacin y
menor grado de polimerizacin que el ADN-B. Se trata de una estructura ms
ancha y corta que el ADN-B.
Conformacin Z
La conformacin Z del ADN aparece fundamentalmente en zonas
ricas en el par G-C.
Existen algunas diferencias entre la conformacin Z y las otras dos. En primer
lugar las hlices son levgiras, es una doble hlice ms estrecha y alargada
que el ADN-B.
Tambin puede hallarse ADN en las mitocondrias o en los cloroplastos
(clulas eucariotas) o los plsmidos (clulas procariotas), virus y
transposones.
219
El ADN mitocondrial y cloroplastdico

Las mitocondrias poseen su propio ADN, no asociado con histonas, que
se replica dentro del mismo orgnulo y forma nuevas mitocondrias (o
cloroplastos, en el caso de las clulas vegetales) por divisin simple;
asimismo, se transcribe y se traduce -aunque a escasas protenas. En
aproximadamente de todas las especies de plantas, el gameto masculino no
aporta los cloroplastos al cigoto. De modo semejante, en animales (incluidos
los humanos) el espermatozoide no contribuye con citoplasma al huevo
fecundado y, en consecuencia, las mitocondrias son de origen materno.
El ADN adicional de las bacterias: los plsmidos

Aunque las bacterias contienen en su cromosoma todos los genes
necesarios para su crecimiento y reproduccin, se ha encontrado, virtualmente
en todos los tipos de bacterias, molculas de ADN adicionales conocidas
como plsmidos. Los plsmidos son, al igual que el cromosoma bacteriano,
circulares y auto replicantes y van asociados a alguna cualidad o factor que
otorgan a la clula husped. En algunos casos la replicacin es independiente
y, entonces, la bacteria puede contener mltiples copias.
Los ms conocidos son el plsmido o factor F (sexual) y el R (resistente
a las drogas). La transferencia de plsmidos, y con ellos las caractersticas que
proveen a la bacteria, se lleva a cabo por conjugacin o por transformacin
(pasando simplemente, de una clula a otra a travs de las membranas).
Propiedades:
Absorcin de luz UV a 260 nm. En el ADN doble hlice se da el

fenmeno de hipocromismo: el ADN desnaturalizado por el calor
absorbe un 20-30 % ms que el ADN nativo
Reaccin positiva de los polidesoxirribonucletidos a la difenilamina y al
220
reactivo de Schiff
Reaccin con orcinol
Reaccin con agentes intercalantes (acridinas)
Resistencia a hidrlisis por lcalis.
Metilacin de purinas: por tratamiento con dimetil sulfato (DMS) y

calentamiento a pH neutro se produce la metilacin de las purinas. El
tratamiento a pH bajo produce la ruptura del enlace glicosdico con
formacin de un sitio apurnico. El tratamiento posterior con cido
diluido rompe la cadena por el sitio apurnico.
El tratamiento de ADN con hidrazina rompe el enlace glicosdico de las

pirimidinas, quedando un sitio apirimidnico; el tratamiento posterior con
piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidnico
-
O
N
H2C
H2C
O
P
H3C
H2 C
H2C
H3C
P
N
OH
O
O
O
H2 C
Sitio apurnico
O
P
O
O
O
P
H
N
H
pH bajo
H3C
H2C
O
-
N
N
H
O
221
P
-
H
N
O
N
H 2C
P
-
O O
O O
P P
- -O
O
H C
O O 3
H 2C
H2C
O -O O O
P P
O -O
O O
H2CH C
2
H N
HN
O
OO
O
P
P
O
H 2C
O
O-O
OO
H N
H
N
N
H
N
O- N
H 2C
N
OH
H
O
O
H 3C O
O
H 2C
O
H 2C
N
Sitio
apurnico
N
O
H3C
DMS
N
O O
O
-
H2C
P
-
O
-
H
N
O
H2C
O
O
H 3C
H 2C
O
O
H N
H3C
H 2C
O
-
N
N
H N
P
N
N
O
O
H 2C
cido diludo
P
N
O-
H
O
H
N
H 2C
O
Ruptura enzimtica de polinucletidos: a) Endonucleasas: atacan

enlaces fosfodister situados en el interior de una cadena polinucleotdica,
y suelen ser especficas de cada cido nucleico Ribonucleasas,
Desoxirribonucleasas b) Exonucleasas: atacan enlaces fosfodister
situados en los extremos (3 o 5) de una cadena polinucleotdica, y suelen
222
atacar indistintamente ambos tipos de cidos nucleicos. Ruptura tipo

a: Da lugar a una mezcla de 5-nucletidos y Ruptura tipo b: Da lugar a
una mezcla de 3-nucletidos
P
-
H2C
O P O CH2
O
P
H
N
O P O CH2
O-
H3C
H N
P
O
O P O CH2
O-
H N
H
O
H
N
O
N
OH
H2C
O
N
H3C
H
-
H2C
OH
O
P
-
O
-
O
H2C
OH
H
O-
H
H
O P O CH2
O-
OH
223
Los fragmentos de restriccin del DNA pueden separarse mediante

tcnicas electroforticas. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio
(un agente intercalante) y se observan bajo luz UV.
cido Ribonucleico, ARN

Sin importar el tipo de ARN del que se trate, el producto de la transcripcin es
siempre una cadena simple de ARN. Las monohebras tienden a adoptar una
conformacin helicoidal con giro a la derecha, dirigida por las interacciones
del apilamiento de bases.
Reactividad Qumica: El RNA, al tener el grupo 2-OH, es mucho ms
reactivo
qumicamente
que
el
DNA.
En
concreto,
puede
ser
completamente hidrolizado por lcali a una mezcla de 2- y 3-nucletidos.

Estructura tridimensional: Las formas en doble hlice del RNA adoptan
la configuracin A (en lugar de la B, propia del DNA), as como los

hbridos DNA-RNA.
Tamao molecular: Aun con ser grande, es de bastante menor tamao
que el DNA.
Funciones: El cido ribonucleico (RNA, ARN) cumple una serie de
importantsimas funciones en la clula,

1- RNA mensajero (mRNA), que porta la informacin necesaria para el
establecimiento de una secuencia correcta de aminocidos por parte de la
maquinaria de sntesis proteica
2- A su vez, el mRNA deriva del transcrito primario o RNA nuclear
heterogneo (HnRNA), que es el primer producto de la transcripcin y
sufre una serie de modificaciones antes de convertirse en mRNA.
3- RNAs nucleares pequeos (snRNA) o RNAs nucleolares pequeos
(snoRNA), que participan en la conversin de HnRNA en mRNA.
4- RNA de transferencia (tRNA), al cual se unen los distintos aminocidos,
224
que quedan as activados y aptos para integrarse en la biosntesis de

protenas.
5- RNA ribosmico (rRNA) que integra, junto con protenas, la partcula
conocida como ribosoma.
6- RNAs genmicos: en algunos virus, el RNA es el material gentico. En
ciertos casos, este RNA se retrotranscribe a DNA mediante el proceso de
transcripcin inversa y se integra en el genoma del husped; es el caso de
los retrovirus.
7- RNAs como enzimas: Algunos RNA son capaces de catalizar reacciones
qumicas del mismo modo que las enzimas, son las ribozimas. Participan
en el procesado del RNA transcrito primario (mRNA) y en la formacin de
enlace peptdico en la sntesis de protenas.
O
-
O
-
P
O
5'
CH 2
4'
H
H
3'
OH
Nucletido de ARN
Uridina 5monofosfato
H 1'
2'
OH
225
Experimentacin
cidos nucleicos: ARN y ADN
Objetivos
Obtener el cido ribonucleico precipitado de la levadura de cerveza.
Obtener el cido desoxirribonucleico precipitado del timo de ternera
Comprobar la solubilidad de los cidos nucleicos en diferentes solventes.
Realizar la hidrlisis de los cidos nucleicos obtenidos.
Verificar el resultado de la hidrlisis a travs de reacciones caractersticas
de cada uno de sus componentes.
A. Obtencin de cido ribonucleico

Disgregar 50 g de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y disolver en
150 ml de NaOH al 0,3%. Calentar a Bao Mara (B.M), 100C. durante 30
minutos removiendo de vez en cuando. Enfriar y agregar cido actico glacial
hasta reaccin ligeramente cida, enfriar y filtrar para eliminar las protenas.
Verter la solucin agitando vigorosamente en 20 ml de alcohol etlico al 95%
el que contiene 2 ml de HCl 36%. Dejar reposar y lavar el precipitado 2 veces
con etanol, por decantacin y luego con ter, decantar el exceso de lquido,
transferir a un papel de filtro y secar el residuo por aspiracin sobre Bchner
con bomba de vaco. Usar el precipitado as obtenido para estudiar las
propiedades del cido nucleico como sigue:
1. Solubilidad: Evaluar la solubilidad en agua fra y caliente y en alcohol
2. Solubilidad en lcalis: Agregar HCl 10% hasta que la solucin se torne
cida y luego NaOH 2 N. Observar.
226
3. Hidrlisis: A una cantidad pequea de precipitado agregar 10 ml de H2SO4

10% y calentar a ebullicin durante 10 min.
4. Ensayo con pentosas: Colocar 2 ml de hidrolizado en un tubo de ensayo,
agregar unas gotas de reactivo de Bial y calentar en B.M. a ebullicin durante
3 minutos. La aparicin de un color verde revela la presencia de pentosas. El
reactivo de Bial contiene orcinol en cido clorhdrico y forma complejos slo
con las pentosas.
Reactivo de Bial: 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de agua destilada.
Aadir 1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro frrico al 1%
5. Ensayo de fosfatos: Agregar un ligero exceso de amonaco, acidificar con

cido ntrico y agregar molibdato de amonio 10% a la solucin en ebullicin.
Un precipitado color amarillo revela la formacin de fosfomolibdato de
amonio.
H3PO4 + 3 NH3 + 24 HNO3 + 12 (NH4)2MoO4
12 MoO3PO4 (NH4)3 + 24 NH4NO3 + 12 H2O
6. Ensayo de bases: Colocar 2 ml del lquido hidrolizado en un tubo de

ensayo y aadir unas gotas de solucin de Ag NO3 0,1 M, un precipitado
blanco indica la presencia de bases. Las mezclas de bases nitrogenadas
precipitan por el agregado de soluciones de plata.
227
B. Aislamiento del cido desoxirribonucleico

El mtodo consta de cinco pasos:
1. Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena).
El propsito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los
complejos nucleoproteicos que se encuentran presentes en el timo de ternera:
la ribonucleoprotena (RNP) y la desoxirribonucleoprotena (dRNP).
Esta separacin se consigue homogeneizando el tejido en una solucin
salina de baja fuerza inica (ClNa: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la
estabilidad de ambos complejos y disuelve a la mayor parte de las molculas
que se encuentran presentes en el timo (incluso la RNP) pero no disuelve a
las dRNP. En el mtodo elegido se utiliza una solucin isotnica (ClNa 0,15
M = 0,9 %).
Los mtodos de baja fuerza inica son adecuados para el aislamiento de
las dRNP; sin embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberacin
de las nucleasas; estas enzimas producen la degradacin enzimtica parcial de
los cidos nucleicos y requieren, para su actividad la presencia de ciertos
cationes bivalentes (Mg++, Mn++. Fe++ y Co++). Para evitar este inconveniente,
la homogeneizacin se realiza en presencia de agentes quelantes como el
EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del
medio los cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas
enzimas. En el mtodo que elegimos se utiliza el citrato para complejar los cationes bivalentes (citrato de sodio 0,015 M).
Si se quiere mantener la integridad de la molcula de ADN es necesario
verificar que las soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a
pH 7. Los cidos, a pH inferior a 2 producen la ruptura del enlace Nglucosdico de las purinas dando origen a un sitio apurnico.
A pH alcalino se produce la desnaturalizacin del ADN o sea la ruptura
de los puentes hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas
228
polinucleotdicas. Tambin se recomienda agregar algunas gotas de alcohol

octlico normal, porque evita la formacin de espuma y produce hemlisis con
lo cual se facilita la eliminacin de la hemoglobina del tejido.
Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a
5C) se inhibe la ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo
de la glndula y que actan sobre el ADN produciendo la degradacin de su
molcula. Por ese motivo en esta primera etapa todos los pasos deben
realizarse en fro (0 a 5C), aunque se trabaje en presencia de inhibidores.
Los dos tipos de nucleoprotenas (RNP y dRNP) que se encuentran
presentes en el homogenato, diferenciables por su distinta solubilidad, pueden
separarse por centrifugacin en fro; se obtiene un precipitado formado por el
material insoluble en la solucin salina (dRNP) y un sobrenadante que
contiene el material soluble en esa solucin (RNP).
Mtodologa: Pesar 15 g de timo en una cpsula de Petri y cortar con un
cuchillo o navaja en lminas delgadas; colocar el tejido en un vaso de
licuadora y agregar 45 ml de citrato de sodio 0,015 M y 45 ml de cloruro de
sodio 0,15 M (SSC-1X). Mantener el pH de la suspensin en 7 mediante el
agregado de tampn TRIS-HCl 20 mM pH= 7. Homogeneizar hasta obtener
una suspensin de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.
Centrifugar el homogenato durante 5 minutos a 5.000 r.p.m. a 5C. Se obtiene
un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color
rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.
2. Disociacin del complejo en sus dos componentes: DNA y protenas.
La homogenizacin del tejido con solucin SSC-1X y la centrifugacin
posterior, realizadas en la primera etapa, han permitido aislar el DNA del timo
de ternera combinado con protenas en forma de un complejo dRNP.
El propsito de esta segunda etapa es disociar el complejo aislado,
liberando el DNA (como desoxirribonucleato de sodio) de las protenas que lo
229
acompaan. Esta disociacin se consigue mediante el empleo de Lauril sulfato

de sodio o dodecil sulfato de sodio (SDS), reactivo que en presencia de
cloruro de sodio, disocia el complejo dRNP y precipita las protenas liberadas
sin producir la despolimerizacin del nucleato.
Metodologa: Colocar en un erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y
agregar 30,75 ml de citrato de sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio
a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml de solucin de SDS al 5% en etanol
al 45%.Agregar los siguientes reactivos en el orden indicado mezclando
despus de cada adicin: 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml
de ClNa 2 M y 3,78 ml de citrato de sodio 0,015 M.
3. Eliminacin de las protenas.
Las protenas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con
SDS se eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico, que las
desnaturaliza y coagula. La preparacin cruda de ADN se agita vigorosamente
con cloroformo-alcohol isoamlico. La emulsin resultante se centrifuga en
fro para acelerar la separacin de las fases. Se separan dos fases bien
definidas separadas por una interfase slida; ellas son:
I-Fase Orgnica: (cloroformo - alcohol isoamlico) se separan en el fondo del
tubo y contiene los compuestos lipdicos.
II-Fase acuosa: en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio del
ADN y nucleoprotena.
III-Interfase slida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores;
est constituida por el gel que se forma entre el clorhidrato de protena y la
mezcla de cloroformo - alcohol isoamlico.
Mtodoga: En una ampolla de decantacin colocar la suspensin obtenida y
agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1, v/v),
agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsin resultante
en tubos de centrfuga y centrifugar en fro (5C) durante 10 minutos a 5000
230
r.p.m. Retirar los tubos suavemente de la centrfuga para mantener la

separacin de las fases. Con una pipeta capilar retirar la capa acuosa superior
que contiene la sal de sodio del ADN tratando de no perturbar la fase proteica.
4. Precipitacin del desoxirribonucleato de sodio.
El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso
que puede ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite
separar el ADN de otras macromolculas que coagulan de una manera no
fibrosa, como por ejemplo el ARN y las protenas.
Metodologa: A la capa acuosa desproteinizada agregar dos volmenes de
etanol al 95% (5C). Verter lentamente sobre las paredes del recipiente
tratando de formar una capa alcohlica sobre la fase acuosa viscosa. Con una
varilla de vidrio gruesa agitar la solucin de ADN con un movimiento de
rotacin suave y continuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras
del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla
Presionar las fibras de ADN sobre las paredes del recipiente para eliminar el
exceso de solvente. Posteriormente colocar la varilla sobre un papel de filtro.
Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo
que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga ter etlico. . Todo
el procedimiento se efecta a baja temperatura (5C). Retirar el ADN de la
varilla y colocar en un vidrio de reloj. Dejar secar 10 minutos para eliminar
por completo el solvente.
5. Disolucin e hidrlisis del desoxirribonucleato de sodio. La sal de sodio
del ADN es soluble en agua destilada y en soluciones de baja fuerza inica.
Metodologa: A una cantidad pequea de precipitado agregar 10 ml de cido
sulfrico 10 % y calentar a ebullicin durante 10 min (hidrlisis). Ensayar los
productos de hidrlisis: pentosas, fosfatos y bases utilizando la metodologa
descripta previamente.
231
CROMATOGRAFA Y ELECTROFORESIS
Generalidades,
electroforesis
clasificacin
de
mtodos
cromatogrficos,
aplicaciones,
El trmino cromatografa, del griego khromatos (color) y graphos

(escrito), fue usado por primera vez en 1906 por el botnico ruso Miguel
Tswett para describir la separacin de pigmentos vegetales. Tswett defini la
cromatografa como un mtodo en el cual los componentes de una mezcla de
solutos (analtos) son separados en una columna adsorbente (fase estacionaria)
dentro de un sistema fluyente (fase mvil). La separacin, basada en la
velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos, se establece al ser
arrastrados los mismos por la fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un
lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria (slida o lquida).
La separacin entre dos sustancias empieza cuando una es retenida ms
fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms
rpidamente en la fase mvil. Las retenciones mencionadas pueden tener su
origen en fenmenos de adsorcin, que es la retencin de una especie
qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando
delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases, o bien de
absorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de una masa,
debido a la tendencia que sta tiene a formar una mezcla con la primera
(absorcin pura) o a reaccionar qumicamente con la misma (absorcin con
reaccin qumica) considerando ambas como un fenmeno msico y no
superficial.
Las tcnicas cromatogrficas aprovechan alguna o algunas propiedades
fsicas o fsico-qumicas de los analitos, como solubilidad, adsorcin,
232
volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla

de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica
donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por
duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes, como ocurre en
cromatografa lquido-lquido. Por otro lado, se considera improbable que dos
especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o
fsico-qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas
diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin
cromatogrfica. As, las propiedades de los componentes de una mezcla
determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. Se eligen
las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los
componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la
separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de
migracin de los mismos.
Clasificacin de los mtodos cromatogrficos: Para clasificar globalmente a

los mtodos cromatogrficos es necesario tener en cuenta dos criterios:
Tipo de fenmeno fsico-qumico que prevalezca o fundamento del
proceso cromatogrfico, lo que conduce a los tipos de cromatografa.
Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo que constituye

las distintas tcnicas cromatogrficas
Tipos de cromatografa
- Fase estacionaria slida:
Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que
inicialmente estaba en fase mvil, lquida o gaseosa (Fuerzas de Van der
Waals).
Cromatografa de intercambio inico: el slido es un intercambiador de
iones (fuerzas electrostticas).
233
Cromatografa de exclusin (o de geles): el slido es un gel formado por

polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su
tamao.
Cromatografa de afinidad: es un tipo especial de cromatografa de
adsorcion, utilizada especialmente en bioqumica, en la que un slido tiene
enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un
indicador enzimtico o un anticuerpo.
- Fase estacionaria lquida: en ese caso el lquido se encuentra soportado en

un slido inerte, se trata de la Cromatografa de particin. El soluto se
reparte entre la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria.
Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica

correspondiente recibe el nombre de dicha fase mvil:
- Fase mvil lquida o cromatografa liquida, cabe distinguir:
Cromatografa lquido-lquido (CLL), en la que ambas fases son lquidas y,
por tanto, se trata de una cromatografa de particin.
Cromatografa liquido-slido (CLS), en la que la fase estacionaria es slida
(adsorcin, intercambio inico, exclusin, afinidad).
- Fase mvil gaseosa o cromatografa de gases, puede ser:
Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.
Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.
Tcnicas cromatogrficas
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, cabe
distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en columna y plana.
Cromatografa en columna: se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se
coloca la fase estacionaria y a travs de ella se hace pasar la fase mvil. El
234
flujo de la fase mvil (lquido o gas) a travs de la fase estacionaria se

consigue por: presin, capilaridad, gravedad.
Cromatografa plana: en este caso la fase estacionaria est colocada en una

superficie plana. Se divide en dos tipos generales:
Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase
estacionaria (cromatografa de particin).
Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria
(cromatografa de particin), que se extiende en una capa delgada sobre una
placa, generalmente de vidrio o aluminio.
Adems, en estos casos el flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos
formas:
Por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente).
Por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente).
La cromatografa plana es considerada la ms simple de todas las
tcnicas cromatogrficas. La diferencia principal con la cromatografa en
columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase
estacionaria. Sin embargo el fundamento de ambas tcnicas es el mismo.
En la cromatografa plana, la muestra a separar se sita sobre el plano
que contiene la fase estacionaria (papel o placa fina) en forma de mancha, o a
235
veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una
vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone
en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en
una cmara cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los
componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa
plana las sustancias analizadas no abandonan el lecho cromatogrfico, de
forma que el proceso se detiene cuando la fase mvil ha alcanzado una
determinada zona del plano.
En la cromatografa en papel, la celulosa acta como soporte de la fase
estacionaria que suele ser agua. No obstante, tambin existen en el comercio
papeles impregnados (gel de slice o almina, silicona, intercambiadores
inicos, etc.) o tratadas qumicamente (grupos intercambiadores incorporados
al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad de esta
tcnica.
En cromatografa en capa fina, un slido o soporte de la fase
estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie
rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno o una placa de aluminio,
de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las
caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin,
adsorcin, intercambio inico o exclusin.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la cromatografa en capa fina
(CCF) o Thin Layer Cromatography (TLC) era considerada una tcnica
cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no demasiado complejas,
pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras
tcnicas cromatogrficas. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios
introducidos en esta tcnica (calidad de los soportes, equipos para aplicar
muestras y sistemas de deteccin), es considerada una tcnica til para separar
236
y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de

trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la tcnica,
denominndose Cromatografia en Capa Fina de Alta Resolucin (CCFAR) o
High Performance Thin Layer Cromatography (HPTLC). Lo mismo ocurri
cuando se mejor la capacidad de resolucin de la cromatografa lquida en
columna, pasando a denominarla Cromatografa Liquida de Alta Resolucin
(CLAR) o High Performance Liquid Cromatography (HPLC).
Diferencias entre cromatografa plana y en columna

Aunque con algunas modificaciones, los principios tericos de la
cromatografa en columna pueden ser aplicados, en general, a la
cromatografa plana. Las diferencias entre estas tcnicas hay que buscarlas en
la distinta configuracin de ambos sistemas cromatogrficos ya que la
cromatografa plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la
cromatografa en columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base
pueden indicarse las diferencias siguientes:
En la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras
que en columna se hace por tiempos o volmenes de elucin.
En cromatografa plana la velocidad de la fase mvil slo puede
controlarse indirectamente ya que est gobernada por fuerzas capilares que
237
son las que permiten el paso de dicha fase a travs del lecho
cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad
de la fase mvil puede controlarse regulando el gradiente de presin a
travs de la columna (por ej. cromatografa de alta presin).
En la cromatografa plana, el tiempo que dura la separacin est
determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente
llegue a una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente
del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografa
en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la
columna, por lo que el tiempo que dura la separacin est determinado por
el tiempo que tarda el componente ms lento en llegar al detector.
En la cromatografa en columna la separacin de varias muestras se realiza
de forma secuencial, es decir, cada muestra debe sembrarse, fraccionarse
y detectarse individualmente, mientras que en cromatografa plana, la
separacin de varias muestras se realiza de forma simultnea, siendo todas
ellas sometidas al mismo tiempo a igual proceso separativo, lo cual supone
un ahorro de tiempo.
Otra diferencia se encuentra en la forma de llevar a cabo la deteccin.
Mientras que en cromatografa en columna este es un proceso dinmico,
pasando cada soluto eludo por el detector (por ejemplo UV-visibles;
ndice de refraccin), en cromatografa plana es un proceso esttico ya que
se analizan o revelan todas las fracciones de distintas muestras a la vez.
Aplicaciones de la Cromatografa
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de
separacin, ya que es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. Las
tcnicas cromatogrficas se pueden emplear para la separacin, aislamiento,
purificacin e identificacin de diversos compuestos (orgnicos, inorgnicos o
238
biomolculas) de diversos tamaos o pesos moleculares. De esta manera,

poseen mltiples aplicaciones en diversas reas (mdicas, biolgicas,
bioqumicas, bromatolgicas, toxicolgicas, farmacuticas, alimenticias,
qumicas, industriales, agronmicas, etc.). As por ejemplo, estas tcnicas son
muy usadas en la purificacin de protenas (como enzimas, lectinas,
anticuerpos, etc.), como tambin en el estudio de azcares y de otro tipo de
compuestos tales como los compuestos fenlicos, alcaloides, etc.
Tcnicas cromatogrficas en columna para la separacin de protenas

Cromatografa de intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre matrices (fase
estacionaria) que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la
matriz de la columna as como la carga de las protenas depender del pH del
solvente y de su fuerza inica (proporcional a la concentracin de iones). En
condiciones determinadas sern retenidas en la columna las protenas que
tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las protenas
cargadas
negativamente
sern
retenidas
por
una
matriz
cargada
positivamente), siendo eludas las restantes. Para elu ir las protenas retenidas
se puede variar la carga inica de la fase mvil o su pH de forma que se
alcance el punto isoelctrico de la protena de inters o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las protenas en la columna.
239
Las partculas cargadas negativamente

se unen a la matriz slida cargada
positivamente, y son retenidas.
Las partculas cargadas positivamente
son rechazadas por la matriz slida
cargada positivamente y son eluidas.
La elucin de las partculas cargadas
negativamente se consigue cambiando
el pH del solvente hasta igualar a su
punto isoelctrico o hasta invertir su
carga neta
Cromatografa de filtracin en gel

La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas
matrices (fase estacionaria) formadas por unas esferas porosas. El volumen de
los poros es muy elevado y su dimetro est determinado. Cuando penetran en
el lecho de la columna dos protenas de tamaos tales que una penetra en los
poros de las esferas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio
entre las esferas y el interior de los poros, reducindose la concentracin en la
fase libre entre las esferas. La segunda protena, por su tamao, slo puede
encontrarse entre las esferas. El flujo de solvente usado como fase mvil es
ms elevado entre las esferas que en el interior de los poros de stas, por lo
que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las protenas de
mayor peso molecular respecto a las de menor peso molecular. En esta
cromatografa se eluyen primero las protenas mayores, y en segundo lugar las
menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna
y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor
calidad. La filtracin por gel se emplea para determinar el peso molecular de
protenas desconocidas mediante el uso de patrones de peso molecular de
protenas conocidas.
240
Las molculas pequeas penetran en

los
pequeos
conductos que
presentan las bolas de gel, donde la
velocidad de flujo de solvente es
menor.
Las molculas grandes, incapaces de
penetrar en los pequeos conductos
de las bolas de gel se mueven entre
ellas, donde la velocidad de flujo de
solventes es superior. Como
consecuencia, las molculas de
mayor peso molecular son eluidas
antes que las de menor peso
molecular
Cromatografa de afinidad y de inmunoafinidad

En la cromatografa de afinidad las esferas de gel que conforman el
lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una
molcula ante la que tiene afinidad una o ms de las protenas presentes en la
mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la
superficie de las esferas de gel la protena afn, y deja pasar el resto. La
elucin de la protena afn se puede conseguir modificando las propiedades de
carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isolctrico, variando
la fuerza inica del solvente, etc.) con lo que se reduce la intensidad de la
interaccin hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor
(protena) unido a las esferas, que seleccionar su/s ligando/s de una mezcla
compleja, o un antgeno (usado en una inmunizacin) que recubre las esferas
y que retendr del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen
(anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la
inmunoafinidad el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que
241
retienen en la columna a aquellas protenas que contienen los eptopes que

reconocen.
En ocasiones la cromatografa de afinidad se realiza incubando el gel
recubierto con el ligando directamente con la solucin que contiene las
protenas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a
la elucin, primero de las protenas no unidas ('run throught') y
posteriormente de las retenidas (eluido especfico).
Las bolas de gel estn recubiertas de un
ligando por el que tiene afinidad alguna
de las protenas a aislar. Al pasar la
mezcla compleja a travs de la columna
la protena es retenida en la superficie
de la bola, eluyndose de las dems.
Para eluir la protena retenida por
afinidad se suele aumentar la fuerza
inica de la solucin de solvente o
incluir en ste el ligando soluble a alta
concentracin de forma que compita
con el que est unido a las bolas de gel
por la unin a la protena
Electroforesis
La electroforesis es una tcnica para la separacin de protenas (y
tambin de aminocidos, pptidos y cidos nucleicos) que se basa en el
desplazamiento de las protenas cargadas en un campo elctrico. Si se coloca
a las protenas en un campo elctrico, el sentido en que se mueven las
molculas depende del pH de la solucin. Si el pH es igual al punto
isoelctrico (pI) de una protena, sta no migra. A un pH por debajo de su pI,
predominan las cargas positivas y la protena migra hacia el ctodo (polo
negativo). A un pH superior al pI, existe un predominio de cargas negativas y
la protena migra hacia el nodo (polo positivo). En general, se puede decir
que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover
242
hacia uno u otro electrodo dependiendo de: su carga elctrica, su tamao, la

intensidad del campo elctrico y la temperatura del medio.
Generalmente sta tcnica no se utiliza para purificar protenas en
grandes cantidades porque existen mtodos alternativos ms sencillos y
porque a menudo afectan la estructura y por tanto la funcin de las protenas.
Pero la electroforesis es muy til como mtodo analtico. Su ventaja es que las
protenas pueden visualizarse adems de separarse, lo que permite hacer una
estimacin rpida del nmero de protenas en una mezcla o del grado de
pureza de una preparacin proteica determinada. La electroforesis tambin
permite la determinacin de propiedades de una protena tales como su pI, e
incluyendo marcadores de peso molecular durante la corrida electrofortica,
permite determinar la masa de la protena de inters.
Muestra
Direccin
de la
migracin
a) Cuba de electroforesis para placas de geles de poliacrilamida (PAGE). El gel se

encuentra encerrado entre dos placas de vidrio (como un sandwich). La muestra se
siembra en la parte superior (ctodo o polo negativo) y las protenas de la mezcla,
que se encuentran a un pH alcalino, migran hacia el nodo (polo positivo).
b) Placa de PAGE corrida y revelada con un reactivo para protenas. Las
protenas de la mezcla original se separan en bandas de acuerdo a su carga/masa
(en condiciones nativas) o a su masa (condiciones desnaturalizantes).
243
Existen mtodos electroforticos rpidos y sensibles que involucran un

soporte slido para la solucin investigada. Entre los ms empleados se puede
citar a los geles de poliacrilamida que consisten en geles porosos cuya
porosidad se puede regular en funcin de la concentracin de la
poliacrilamida y donde las protenas migran en funcin de su relacin
carga/masa. Las electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) poseen
mltiples aplicaciones para el estudio de protenas. Existen dos tipos
principales: en condiciones nativas y en condiciones desnaturalizantes. En
el primer caso, las protenas se separan en funcin de su carga/masa. Las
condiciones desnaturalizantes implican la presencia de un detergente
aninico, el SDS (dodecil sulfato sdico). El SDS, se une a todas las protenas
en la misma proporcin formando una especie de micela cargada
negativamente que enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que
stas se separan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga.
El nico inconveniente de esta tcnica es que el SDS al ser un detergente
desnaturaliza las protenas y adems separan en sus subunidades a las
protenas multimricas. Las electroforesis en SDS permite calcular el peso
molecular de las cadenas polipeptdicas y el nmero de subunidades que
posee la protena.
Otro mtodo electrofortico frecuentemente usado para la separacin y
caracterizacin de protenas y otras molculas es el que usa como soporte tiras
de acetato de celulosa, que presenta propiedades de adsorcin mnimas, por lo
que los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Esta tcnica
presenta algunas ventajas como su rapidez y la posibilidad de analizar
cantidades de muestra pequeas; por otro lado, las tiras pueden disolverse y
por lo tanto es factible la cuantificacin de las bandas separadas.
244
Experimentacin
Cromatografa y electroforesis
Objetivos
Separar mediante cromatografa en capa fina e identificar por mtodos
qumicos un alcaloide a partir de una especie vegetal
Separar mediante tcnicas cromatogrficas pigmentos de una especie
vegetal
Purificar protenas mediante cromatografa de filtracin por gel
Separar e identificar protenas de suero sanguneo mediante tcnicas
electroforticas
A. Extraccin, separacin e identificacin de un alcaloide a partir de

hojas de Nicotiana tabacum
-Extraccin: Pesar 5 g de material vegetal seco (Nicotiana tabacum) y
triturado y agregar 50 ml de etanol. Filtrar por gasa doble. Rotular.
-Separacin
identificacin:La
separacin
se
efectuar
mediante
cromatogrfa en capa fina (CCF) y la identificacin por revelado qumico.

Aplicar con micropipeta sobre la lnea base en un cromatofolio de slica
gel (Kieselgel G60 F254 0.2 mm, Merck, fase estacionaria), 10 l del extracto
etanlico de N. tabacum y 10 l de una solucin de Nicotina como testigo,
dejar evaporar el disolvente. El desarrollo de la placa se lleva a cabo en un
recipiente de vidrio, por el mtodo ascendente. Colocar en el interior del
recipiente metanol:amonaco (99/1, v/v, fase mvil) hasta una altura de 0,5 a 1
cm y tapar, para conseguir que la atmsfera est saturada de vapor del
disolvente. Luego de un perodo de tiempo apropiado, introducir la placa de
245
slica gel. Dejar desarrollar la placa hasta que el disolvente alcance unos 5 cm
por encima del origen. Sacar la placa de la cuba, marcar el frente de
disolvente y dejar evaporar el mismo. Revelar con reactivo de Dragendorffs
(solucin acuosa de cido tartrico, nitrato de bismuto y ioduro de potasio).
Determinar y comparar los valores de Rf para el alcaloide presente en el
extracto y el compuesto testigo.
B. Extraccin, separacin e identificacin de pigmentos de frutos de

Capsicum annuum
-Preparacin de la muestra: Secar los frutos de pimiento en atmsfera de
aire forzado hasta peso constante y triturar. Resuspender 100 mg del material
vegetal triturado en 5 ml de n-hexano
-Separacin (cromatografa en columna) e identificacin: En una columna
de vidrio (15 mm d.i x 25 cm largo) introducir una pequea cantidad de
algodn compactado y presionar (para retener la fase estacionaria sin
dificultar el paso de la fase mvil).
246
Preparar una suspensin con 10 g de silicagel previamente activada por

calentamiento a 100C y la cantidad de n-hexano necesaria para hacer una
papilla. Verter la suspensin en el interior de la columna y compactar el
adsorbente con suaves golpecitos a la vez que se abre la llave de la columna
para permitir la salida del solvente.
La superficie superior del adsorbente debe estar completamente
horizontal y el solvente debe quedar a la altura del nivel de la silica gel.
Sembrar con pipeta Pasteur la muestra preparada por las paredes de la
columna. Abrir la llave lentamente para que la siembra quede inmersa en la
silica gel. Cerrar la llave y aadir una pequea cantidad de solvente para lavar
la pared interior de la columna. Abrir la llave para permitir la salida del
solvente, cuidando siempre que ste quede a nivel de la slica gel.
247
Iniciar la elucin agregando con pipeta Pasteur por las paredes de la

columna, 20 ml de n-hexano, luego 25 ml de una mezcla de n-hexano: acetato
de etilo al 30 %, continuar con una mezcla al 50%, 70% y finalmente 25 ml de
acetato de etilo (aumenta la polaridad de la mezcla de solventes). Recoger el
volumen inicial de solvente, que corresponde al volumen muerto de la
columna ste no contiene ningn producto y puede despreciarse. Luego
recoger fracciones de 3 ml utilizando un colector automtico. Los
componentes de la mezcla eluyen en orden creciente de polaridad
Analizar las fracciones mediante CCF para observar los distintos
componentes del extracto de Capsicum annuum y seguir el curso de la
separacin. Desarrollar las placas con n-hexano:acetato de etilo (2:1, v/v) y
revelar con luz UV a 254 nm o con solucin alcohlica de cido
fosfomolbdico y posterior calentamiento a 110 C. Las fracciones con igual
perfil cromatogrfico se reunen en un mismo baln y se concentran en
evaporador rotatorio.
C. Separacin de protenas mediante cromatografa de filtracin por gel

En una columna de vidrio (15 mm d.i x 25 cm largo) introducir una
pequea cantidad de algodn compactado y presionar.
Con la columna cerrada aadir 5 ml de buffer fosfato de sodio 0,2 M
pH 7 (fase mvil), a continuacin comenzar a aadir el gel (Sephadex G-150,
fase estacionaria) debidamente hidratado en el mismo tampn, lentamente y
evitando hacer burbujas de aire dentro de la columna. En este momento;
colocar un recipiente debajo de la columna para recoger el lquido que va a
fluir, abrir la columna para realizar el proceso de empaquetado. Hacer pasar
unos ml de buffer y dejar que la columna gotee hasta que se elimine todo el
tampn de la parte superior del gel.
248
Sembrar 0,1 ml de solucin coloreada (Azul Dextrano) para determinar

el volumen de exclusin (Vo) de la columna. Abrir la llave dejando entrar la
muestra, eluir la columna con la fase mvil, al mismo tiempo se comienza a
recolectar fracciones del eludo (2 ml). Se procede as hasta que el volumen
del lquido que ha atravesado la columna sea el volumen total de la misma. En
ese momento se cierra la llave, terminando la recoleccin de las fracciones.
Vo se determina cualitativamente, corresponde al volumen de elucin
del pico de Azul dextrano. A continuacin sembrar la muestra. Dejar gotear
hasta que toda la muestra entre en el gel. Agregar a la columna solucin
tampn y recoger fracciones de 2 ml utilizando un colector automtico.
Analizar las fracciones determinando su absorbancia a 280 nm en
espectrofotmetro.
Cromatograma: graficar el perfil de elucin de la protena de la muestra
problema representando en el eje de abscisas el volumen eludo y en
ordenadas las lecturas de DO a 280 nm para cada fraccin de la columna.
Determinar el volumen de elucin (Ve) de la protena de la muestra
problema, volumen de exclusin (V0) y volumen total (Vt).
El Vt de la columna se calcula usando la frmula: r 2 x h
Ve
Ve
Nmero de
fraccin
Respuesta del detector= Abs 280 nm
249
D. Electroforesis
Determinacin de las protenas del suero humano
-Preparacin de la muestra: Por centrifugacin de una muestra de sangre se
obtiene el suero humano.
-Separacin e identificacin: La separacin se realizar mediante
electroforesis en membrana de acetato de celulosa.
Humedecer en tampn (Buffer Veronal sdico 0,04M pH=8,6)
membranas de acetato de celulosa gelatinizadas (CELLOGEL) durante 10
minutos. Eliminar el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de
papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. Cargar
la cuba del aparato de electroforesis con tampn. Extender las tiras sobre el
puente de la cubeta de electroforesis de modo que la cara mate de la tira de
acetato de celulosa quede hacia arriba, teniendo cuidado que ambos extremos
queden sumergidos en la solucin buffer. Sembrar con ayuda de un aplicador
de plstico, la muestra de suero en la tira a 2 cm del ctodo. Conectar el
aparato de electroforesis dejando pasar la corriente durante 60 minutos a un
voltaje fijo de 200 V.
Una vez finalizada la electroforesis, depositar las tiras en una cubeta
con solucin colorante (0,5% , p/v negro amido en metanol 45% + cido
actico 10%), de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10
minutos. Seguidamente lavar las tiras en solucin de lavado (metanol 45% +
cido actico 5%) hasta que se observen bien las bandas de protena (azules)
sobre un fondo blanco.
Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto
de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.
250
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252

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Captulo III

Consideraciones tericas y prcticas

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

Los aminocidos son compuestos nitrogenados que tienen un papel

Funciones de las protenas

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

1. Niveles de organizacin en las protenas

son: enlaces hidrgeno,

interaccin hidrofbica, electrosttica, puentes disulfuros, y enlaces ester

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

2. Propiedades de las protenas

3. Aislamiento, purificacin y caracterizacin de protenas

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

Mtodos de ruptura celular y extraccin de protenas

preliminar para una subsiguiente purificacin, pero de hecho constituye un

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

3.4 Cuantificacin de protenas

Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

Protenas (mg/ml) = 1.55 A280 0.76 A260

Mtodo de Bradford - Fijacin no Covalente de Colorante

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2) Tambin en medio bsico, el cobre acta como catalizador de la

Reaccin entre la protena y los reactivos de Cu2+ y de Folin

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-10 veces ms sensible que UV

-5 veces ms sensible que el de

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Extraer, concentrar y purificar protenas de origen animal y vegetal.

Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas.

Determinar el punto isoelctrico de una protena.

Estudiar el efecto de solventes orgnicos sobre las protenas.

Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalizacin reversible e

Emplear un mtodo colorimtrico para el anlisis cuantitativo de las

A. Extraccin de protenas solubles de hojas de trtago (Ricinus

B. Tcnica de concentracin de extracto de protenas solubles

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volumen del extracto que se va a concentrar y calcular la cantidad de sal

Advertencia: el 2-mercaptoetanol es un producto combustible y

C. Propiedad amortiguadora de las protenas: titulacin con cido.

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centrifuga 5 min a 2000 rpm. Se descarta el precipitado. El sobrenadante

D. Solubilidad de la casena a diferentes pH

Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de cido

Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.

Tomar 5 ml de la solucin del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y

Medir el pH a cada solucin (rango de pH esperado 3,5-5,9).

Agregar 1 ml de casena a cada tubo de la escala de pH y mezclar

Observar la solubilidad de la casena a distintos pH a tiempo cero (T0) y a

E. Precipitacin y desnaturalizacin de protenas.

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volmenes iguales de alcohol y acetona a la solucin de ovoalbmina.

Coagulacin de ovoalbmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,

Explicar el fenmeno observado.

F. Determinacin cuantitativa de protenas.

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El mtodo como en todo mtodo cuantitativo colorimtrico requiere de

Tcnica: Rotular 8 tubos y agregar la solucin estndar o las muestras y

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Las reacciones qumicas de los sistemas biolgicos raramente ocurren

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