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Extraccin y cuantificacin de protenas

Arvalo Arcos Leonardo Josu; Camas Regalado Jos Eduardo; Cruz Rodrguez Julio; Hernndez Ovalle Karina; Sols Cruz
Karla Jazmn.

Resumen. En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas (todas globulares).
La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por
acidificacin y forma una masa blanca. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica, representa
cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida.
Palabras clave: Protenas, Extraccin, Cuantificacin, Casena.

Introduccin.
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina,
riboflavina, cido pantotico y vitaminas A, D y K),
minerales (calcio, potasio, sodio, fsforo y metales
en pequeas cantidades), protenas (incluyendo
todos los aminocidos esenciales), carbohidratos
(lactosa) y lpidos. Los nicos elementos
importantes de los que carece la leche son el hierro
y la vitamina C. Las protenas se pueden clasificar
de manera general en protenas globulares y fibrosas.
Las protenas globulares son aquellas que tienden a
agregarse en formas esferoidales y no establecen
interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrgeno (caractersticos de las protenas
fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones
coloidales.
En la leche hay tres clases de protenas: casena,
lacto albminas y lacto globulinas (todas
globulares). La casena es una protena conjugada
de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la
leche por acidificacin y forma una masa blanca.
Las fosfoproteinas son un grupo de protenas que
estn qumicamente unidas a una sustancia que
contiene cido fosfrico. En la casena la mayora
de los grupos fosfato estn unidos por los grupos
hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La
casena en la leche se encuentra en forma de sal
clcica (caseinato clcico). La casena representa
cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en
la leche y el 2,7% en composicin de la leche
lquida. La casena est formada por alpha (s1),
alpha (s2)-casena, -casena, y kappa-casena.
Materiales y Mtodos.
Reactivo de Biuret. Se prepar del siguiente modo:
se disolvieron 0,54 g de CuSO4.5H2O (sulfato de
cobre II pentahidratado) y 0,95 g de NaEDTA en
100 ml de H2O. Mientras estaba en agitacin se

aadieron 28,57 ml de NaOH 5N y luego 0,14 g de


KI como estabilizante y se guard en un frasco de
vidrio.
Reactivo de Bradford. Se prepar del siguiente
modo: se mezclaron 10 mg de azul de comassie con
10 ml de H3PO4 al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto.
Se aadi agua destilada hasta 100 ml y se filtr a
travs de papel filtro con la ayuda de la bomba de
vaco. Se guard en un frasco color mbar envuelto
con papel aluminio para evitar contacto con la luz.
Solucin estndar de protena. Utilizamos
albumina para la preparacin de la solucin,
tomamos 2100 mg de albumina y los disolvimos en
70 ml de agua destilada, para obtener una solucin
de 30 mg/ml.
Casena. La obtencin de casena consisti en 7
pasos: 1) se calent 150 ml de agua a 38 C en un
vaso de precipitado y se agreg 50 ml de leche
(Pradel Ligth). Despus gota a gota y con agitacin
se adiciono cido actico 1M hasta formar
precipitado, 2) Se dej sedimentar y se filtr con la
bomba de vaco, 3) se lav el precipitado con 20 ml
de etanol en el mismo filtro, 4) secamos el
precipitado con pliegues de papel filtro, 5) colocamos
el precipitado en un vaso de precipitado pequeo
previamente pesado, aadimos el precipitado y
volvimos a pesar, despus se agreg 5 ml de ter
etlico, 6) se volvi a lavar con etanol y se filtr
nuevamente, 7) se obtuvo casena.
Muestra de casena. Para la preparacin de la
muestra se disolvieron 0,50 g de casena en 20 ml de
agua destilada.
Mtodo de Biuret. Para la cuantificacin de
protenas por este mtodo se prepararon 5 tubos para
hacer la curva estndar: blanco) se agreg 1 ml de
agua destilada, 1) se agreg 0,25 ml de solucin
estndar de protena y 0,75 ml de agua destilada, 2)
se agreg 0,50 ml de solucin estndar de protena y
0,50 ml de agua destilada, 3) se agreg 0,75 ml de

solucin estndar de protena y 0,25 ml de agua


destilada, 4) se agreg 1 ml de solucin estndar de
protena. Para evaluar la muestra se us 1 tubo: 6) 1
ml de muestra.
A todos los tubos se le aadi 1,6 ml de reactivo de
Biuret y se ley la absorbancia a 545nm en el
espectrofotmetro.
Mtodo de Bradford: Para la cuantificacin de
protenas por este mtodo se prepararon 5 tubos para
hacer la curva estndar: blanco) se agreg 1 ml de
agua destilada, 1) se agreg 0,25 ml de solucin
estndar de protena y 0,75 ml de agua destilada, 2)
se agreg 0,50 ml de solucin estndar de protena y
0,50 ml de agua destilada, 3) se agreg 0,75 ml de
solucin estndar de protena y 0,25 ml de agua
destilada, 4) se agreg 1 ml de solucin estndar de
protena. Para evaluar la muestra se us 1 tubo: 6) 1
ml de muestra.
A todos los tubos se le aadi 1,6 ml de reactivo de
Bradford y se ley la absorbancia a 595nm en el
espectrofotmetro.
Resultados y discusin.
Se obtuvieron 1,24 g de casena como resultado de
la extraccin.
Utilizamos el espectrofotmetro para la elaboracin
de la curva de cuantificacin de protenas mediante
el mtodo de Biuret (cuadro 1) y Bradford (cuadro
2) calculamos la absorbancia y se obtuvieron los
siguientes datos:
Tubo SEP1 (ml) A545 nm
blanco
0
0
1
0,25
0.398
2
0,50
0.488
3
0,75
0.622
4
1
1.29
Cuadro 1. Resultados de
absorbancia reactivo de Biuret
Tubo
SEP (ml)
A595 nm
blanco
0
0
1
0,25
1.235
2
0,50
1.568
3
0,75
1.815
4
1
1.985
Cuadro 2. Resultados de
absorbancia reactivo de Bradford
1

Solucin Estndar de Protenas

La absorbancia de la muestra de casena, respecto a


los mtodos usados fue la siguiente (cuadro 3):
Biuret (545nm) Bradford (595nm)
Abs
1.543
1.77
Cuadro 3. Absorbancia de la casena

Para hallar la concentracion de nuestras


muestras utilizamos las siguientes graficas
(figura 1 y 2) ya que son con las que podemos
acercarnos con mas precision al valor
verdadero.

Figura 1.- Curva patrn de protenas con reactivo de


Biuret, albumina a 30 mg/ml.

Figura 2.- Curva patrn de protenas con reactivo de


Bradford, albumina a 30 mg/ml.
Al elaborar la curva de calibracin obtuvimos dos
ecuaciones lineales, una para Biuret (1) y otra para
Bradford (2).

De las cuales despejamos a la variable x que


representa la concentracin de protena y obtuvimos
que:

En donde y representa la absorbancia de la


muestra, del modo que al sustituir a la ecuacin nos
queda que las concentraciones obtenidas son las
siguientes (cuadro 4):

una curva patrn originada a partir de una protena


conocida.
Tenemos que de casena se extrajo un total de 1,24
gr de 50 ml de leche de vaca marca Pradel Light,
respecto a la concentracin normal terica que es de
2.73 gr de 100 ml de leche de vaca3, podemos decir
la leche Pradel contiene una cantidad bastante
aproximada de casena que debe tener la leche vaca.
Bibliografa.
Miller D. D. 2001. Qumica de los alimentos, manual
de laboratorio. Limusa Wiley, Mxico.

Casena con
Casena con
Biuret
Bradford
Concentracin
44.58 mg/ml
22.61 mg/ml
Cuadro 4. Concentracin de la casena
Para la cuantificacin de protenas mediante el
mtodo de Biuret y Bradford se hallaron diferentes
resultados, lo anterior puede ser explicado
considerando que el mtodo de Biuret es de baja
sensibilidad, por lo que son tiles para muestras
altamente concentradas mientras que el de Bradford
es de alta sensibilidad.
Otro de los factores a discutir es la utilizacin de
albumina en lugar de BSA (Albumina Serica
Bovina) que es la indicada para este tipo de pruebas
por ser ms estable y aumentar la seal en los
ensayos.
En cuanto a los resultados de concentracin
expresados podemos notar que la diferencia es
significativa y esto se debe a que el reactivo de
Bradford es algo sensible con la luz, por lo cual
deducimos que ese fue el factor que influy en la
variacin de nuestros datos.
Conclusiones.
La cuantificacin de protenas se realiz aplicando
los mtodos de Biuret (poco sensible) y Bradford
(ms sensible) 2 , los cuales de manera eficiente y
sencilla permiten determinar la concentracin de
protena en una o varias muestras problema, que
resultan al interpolar los valores de absorbancia en
2

La inmunologa en el diagnstico clnico; Susana


Fiorentino; Santaf de Bogota: Centro Editorial Javeriano,
CEJA; 1994; Pagina 57; 200 p.; Coleccin textos y
manuales.

http://www.unicef.cl/lactancia/docs/mod01/Mod%201be
neficios%20manual.pdf