Farmcia 2 e 3 Perodo 2014/02

MICROBIOLOGIA BASICA
Prof Esp. Luciana Cordeiro Mdica Veterinria

Aula Prtica 06 e 07
Tema da Aula: COLORAO DE GRAM (TCNICA DE GRAM)
BACTERISOSCOPIA GRAM ( - ) E GRAM ( + )

Data: ........../........../.............

Professor(a): LUCIANA CORDEIRO

Objetivo(s):

Preparao de esfregao;

Corar lmina pelo mtodo de Gram;

Por microscopia reconhecer bactrias Gram positivas e Gram negativas;

Compreender a importncia da tcnica para microbiologia clnica.

Proposta da aula:
a) Por raspado bucal, preparar um swab contendo amostra biolgica da cavidade oral;
b) Preparar um esfregao (por movimentos circulares, distribuir em lmina previamente
identificada, a amostra contida em swab);
c) Pela tcnica de GRAM, corar a lmina de esfregao;
d) Visualizar e esquematizar a morfologia das bactrias existentes na lmina;
e) Fazer a classificao bacteriana contida no esfregao corado.

COLORAO (OU TCNICA) DE GRAM

INTRODUO
A tcnica de Gram ou colorao de Gram um mtodo laboratorial de colorao
diferencial de microrganismos bacterianos para bacterioscopia. Tal pratica laboratorial se
deve ao mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1938) que a

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descobriu no ano de 1884, e desde ento vem sendo empregada em larga escala, sendo
muito utilizada na bacteriologia permitindo a distino bacteriana.
O mtodo se baseia na composio qumica da parede celular bacteriana, que de
acordo com a cor que adquirem, so classificadas em gram positivas (violeta ou roxo) ou
gram negativas (vermelho rsea). A diferena entre os dois tipos de clulas relaciona-se
com a estrutura qumica da parede celular das bactrias onde a parede celular das Gram
positivas formada por uma camada espessa de peptideoglicano, enquanto que a parede
celular das Gram negativas formada por uma camada fina de peptideoglicano, rodeada
por uma camada externa de lipopolissacardeo e protenas. Diferenas na permeabilidade
dessas membranas aos reagentes qumicos levam a diferenas de colorao.
Na tcnica de Gram, coram-se bactrias com um corante violeta especial, as
bactrias gram positivas ganham colorao roxa porque sua camada mais externa, a
parede celular, formada por peptidoglicano, absorve a tinta. J as gram negativas se
coram de rosa porque, apesar de tambm ter parede celular, esta fica abaixo de uma
membrana adicional, parecida com a mebrana plasmtica, tpica deste grupo de
bactrias, logo no ocorrendo absoro do corante violeta.

INDICAO DA TCNICA LABORATOLIAL

O mtodo laboratorial de colorao diferencial frequentemente indicado para a
pesquisa e identificao presuntiva de microrganismos em diferentes amostras biolgicas,
visando a um diagnstico provvel e rpido de variadas infeces bacterianas.

VANTAGENS DA TCNICA DE GRAN

Baixo custo;
Curto espao de tempo para a execuo;
Remete a um diagnstico presuntivo (sugestivo/provvel) e rpido de diferentes
infeces bacterianas;
Identificao de germes isolados de culturas de espcies biolgicas.

LIMITAO DA TCNICA
Embora a grande maioria das bactrias possa ser corada por tal mtodo, algumas
no o fazem satisfatoriamente, exigindo tcnicas especiais de colorao. Elas so as
micobactrias, nocardias, espiroquetas, micoplasma, riqutsias e clamdias.

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AMOSTRA
Diversas espcies biolgicas podem ser utilizadas na realizao da tcnica de
Gram. Independente da espcie biolgica, a coleta da amostra deve respeitar um
procedimento geral para garantir sua viabilidade, manuteno e segurana dos resultados
laboratoriais.
Procedimento geral para coleta de amostra em atendimento clnico:
Deve ser colhida antes que o paciente receba algum tratamento geral ou local;
Preparar todo o material, bem como a sala de coleta antes de receber o paciente;
Esclarecer ao paciente da necessidade do exame e do procedimento;
Dever ser colhida conforme caractersticas prprias;
Usar os equipamentos de proteo individual padronizados;
Posicionar paciente de forma adequada para coleta;
Expor o local da coleta e examinar cuidadosamente o tipo de material a ser coletado;
Usar swabs ou seringa com agulha, lmina de bisturi, etc., alm de foco de luz se
necessrio;
A primeira poro de secreo, se abundante, deve ser desprezada e havendo uma
crosta recobrindo leso, esta deve ser removida antes da coleta.
Espalhar o material o mximo possvel, por toda a lmina, at esgot-lo;
Descartar materiais contaminados;
Conferir os dados de identificao do paciente no canhoto de solicitao de exame;
Informar ao paciente o trmino do procedimento;
Encaminhar amostra para avaliao laboratorial.
Envio de amostra
As amostras devem ser encaminhadas ao laboratrio acondicionadas em lminas
lacradas ou dispostas em porta-lminas, devidamente identificadas e acompanhadas com
o pedido de solicitao de exame labratorial.

Rejeio de amostras
Material insuficiente;

Material no identificado.

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EQUIPAMENTOS
A tcnica de Gram, bem como a confeco do esfregao, feita manualmente. A
requisio de equipamento dada somente para obteno do resultado que exige a
utilizao de um microscpio ptico para visualizao microbiana e avaliao
microbiologia da morfologia bacteriana na identificao do microrganismo.

MATERIAIS
Placa de Petri
Lminas para preparao do esfregao
gua destilada
Ala de platina
Bateria/Kit de corantes para o Gram

PROCEDIMENTOS
a) Confeccionar o esfregao
Limpar uma lmina de vidro (com lcool)
Quando se tratar de uma cultura em meio lquido, com uma ala de inoculao,
tomar uma pequena poro da cultura, observando as precaues de assepsia, e
coloc-la sobre a lmina espalhando-a para formar um esfregao fino e uniforme.
Quando a cultura for a meio slido, colocar uma gota de gua destilada sobre a
lmina e com uma ala de inoculao, colher uma pequena quantidade de
crescimento bacteriano da superfcie do agar e suspend-la na gota de gua
destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregao fino.
Deixar a lmina secar temperatura ambiente;
Fixar na chama do Bico de Bunsem, cortando a chama por 3x.
b) Corar com cristal violeta por 60 segundos (o esfregao bacteriano dever ser coberto
com cristal violeta, permanecendo na lamina durante um minuto quando ento o corante
escorido na cuba) ;
c) Lavar com esguicho de gua (procedimento opcional para remover o excesso da
soluo de cristal violeta da lmina, lavando-a levemente com gua corrente);
d) Cubrir com Lugol ou Iodo de Gram por 60 segundos;

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e) Lavar com esguicho de gua (procedimento opcional);

f) Descorar rapidamente com lcool (95%) acetona, 10-30 segundos;
g) Lavar imediatamente com esguicho de gua (indispensvel);
h) Corar com Fucsina, cobrindo o esfregao por 60 segundos e retirar o corante
escorrendo na cuba;
i) Lavar com esguicho gua (indispensvel);
j) Secar (ao ar preferencialmente)
k) Observar ao microscpio em objetiva de 100x, aps colocar uma gota de leo de
imerso sobre o esfregao coado.

Ilustrao esquemtica do procedimento geral da Tcnica de Gram.

DESENVOLVIMENTO
As caractersticas estruturais qumica da parede bacteriana a base da tcnica de
Gram que funciona da seguinte forma:

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O primeiro corante (violeta de Genciana cristal violeta) penetra na bactria assim

como o soluto de Lugol. Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolvel
em gua, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano
maior em bactrias gram positivas que se coram de violeta/roxo, as gram negativas, por
sua vez possuem pouco peptidoglicano sendo coradas pelo vermelho de safranina.
A lavagem com lcool dissolve o complexo corante-iodo, e se a parede celular for
permevel a este, arrasta-o para fora da clula (no caso as Gram negativas), assim as
bactrias capazes de preservar a colorao roxa do 1 corante, o violeta de Genciana,
designam-se por Gram positivas, enquanto que as bactrias que, aps a lavagem com
lcool-acetona, so incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram
negativas, corando pela fucsina diluda que se fixa apenas nestas. Resumindo, as
bactrias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta
tcnica de colorao permite ento a distino entre bactrias com parede celular mais ou
menos rica em peptidoglicanos.

RESULTADOS

Gram (+) coram de rosa;

Pseudomonas aeruginosa (Bacilos gram-negativos)

Gram

(-)

coram

de

roxo

Staphylococcus aureus (Cocos gram-positivos)

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INTERPRETAO DAS RELAES PELA TCNICA DE GRAM

Gram Positivas
Cristal violeta (CV) = Clulas coradas em violeta
Soluo de lodo-Iugol (I) = Formao do complexo CV-I no interior das clulas, que
permanecem violetas
lcool = Desidratao das paredes celulares, diminuio da porosidade e da
permeabilidade: o complexo CV-I no pode sair das clulas que permanecem violetas.
Fucsina = As clulas no so afetadas, permanecendo violetas.

Gram Negativas
Cristal violeta (CV) = Clulas coradas em violeta
Soluo de lodo-Iugol (I) = Formao do complexo CV-I no interior das clulas, que
permanecem violetas
lcool = Extrao dos Iipdios da parede celular, aumentando a porosidade: O complexo
CV-I removido das clulas
Fucsina = As clulas absorvem o corante, tornando-se vermelhas.

EXEMPLOS

MICROORGANISMOS
Pseudomonas aeruginosa

BACTERIANOS GRAM-POSITIVOS

Haemophilus influenzae

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Lactobacillus sp.

Helicobacter pylori

Streptococcus pyogenes
EXEMPLOS

MICROORGANISMOS

BACTERIANOS GRAM-NEGATIVOS

Geralmente as bactrias "gram negativas" so mais patognicas, possuindo ainda

lipopolissacardeos na sua membrana exterior, que agravam a infeco.

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Prof Esp.Luciana S. de Mello Cordeiro
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RELATRIO DE AULA PRTICA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

Curso: FARMCIA

Professora: LUCIANA CORDEIRO

Tema da Aula: .......................................................................................................................................

Data: ............../............./................

N do Relatrio: ....................................................

Srie /Turma e (P): .......................

Aluno: ............................................................................................................. RA: .............................

Email:....................................................................................................................................................

TPICOS DE DESENVOLVIMENTO
a) N e Tema da aula;
b) Objetivo;
c) Introduo conceito garal e autor da tcnica, aplicao, importancia, vantagens e
limitaes, principio da tcnica;
d) Amostra;
e) Materiais e Equipamentos;
f) Procedimento;
g) Tempo de desenvolvimento;
h) Resultado;
i) Discusso (interpretao do resultado obtido pela aplicao metodolgica);
j) Consideraes finais;
k) Referencias Bibliogrficas.

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QUESTIONRIO

1.

Detalhe o passo a passo do desenvolvimento da tcnica de Gram.

2.

Descreva o mecanismo de ao a tcnica de Gram nas clulas bacterianas.

3.

Qual a importncia de utilizao do lcool na realizao da tcnica de Gram.

INDICAO BIBIOGRFICA
1) LACAZ, R.. Manual Prtico de Microbiologia Bsica. 1 ed. So Paulo: Edusp, 2000.
2) OPLUSTIL, Carmem P.. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2 ed. So Paulo: Sarvier, 2004.