Reporte Angel Octubre +GMS2

INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DEL SUR
DEL ESTADO DE YUCATN

Organismo Pblico Descentralizado del Gobierno del Estado de Yucatn
INFORME TCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL

DITERPENOS SEMISINTTICOS ACTIVOS CONTRA CEPAS
MULTIDROGORRESISTENTES (MDR) Y CON RESISTENCIA EXTENDIDA
(XDR) DE Mycobacterium tuberculosis
ANGEL DE JESS DZUL BEH

101T0031
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL;

UNIDAD MDICA DE ALTA ESPECIALIDAD
HOSPITAL DE ESPECIALIDADES DEL CENTRO MDICO NACIONAL
IGNACIO GARCA TELLEZ
UNIDAD DE INVESTIGACIN MDICA YUCATN
ASESOR INTERNO: MC. JACINTO ALBERTO LOEZA PERAZA

ASESOR EXTERNO: DRA. GLORIA MARA MOLINA SALINAS
OXKUTZCAB, YUCATN, MXICO
DICIEMBRE DE 2014
Agradecimientos
2
CONTENIDO
1. INTRODUCCIN............................................................4
1.1 TUBERCULOSIS.......................................................................4
1.2 TRATAMIENTO DE TB...............................................................5
1.3 TB XDR Y MDR....................................................................6
1.4 PRODUCTOS NATURALES.............................................................7
1.4.2 GENERO APIACEAE...............................................................8
2.- JUSTIFICACIN.......................................................12
3.- OBJETIVOS.............................................................14
3.1.- GENERAL:.....................................................................14
3.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS.............................................14
4.- PROBLEMAS A RESOLVER, PRIORIZARLOS......................15
5.- PROCEDIMENTO Y DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS..................................................................17
5.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE AZORELLANOS Y MULINANOS
MAYORITARIOS............................................................................. 17
1. INTRODUCCIN
1.1 tuberculosis
La
tuberculosis
(TB)
es
una
enfermedad
infecto-contagiosa
causada principalmente causada principalmente por Mycobacterium

tuberculosis (Mtb), se presenta con signos respiratorios como
tos seca o productiva, expectoracin con o sin hemoptisis,
dolor
torcico
sntomas
generales:
anorexia,
astenia,
adinamia, sudoracin nocturna, prdida de peso y a veces fiebre

prolongada; afecta mayormente al pulmn, adems de Mtb se sabe
de
la
existencia
de
M.
bovis
M.
africamun
como
agentes
etiolgicos de esta enfermedad. Existen otras especies como M.

kansasin,
M.
avium,
M.
intracellulare,
M.
xenopi
M.
fortuitun, las cuales producen en el hombre sntomas clnicos

similares a los de la tuberculosis pulmonar (TBP)(Nolte FS y B
Metchock, 1995).
Fig. 1. Mycobacterium tuberculosis. Bacteria que causa la tuberculosis pulmonar, amplificada

por micrografa por barrido electrnico. Crdito: NIAID (flickr)
Actualmente la TB es un importante problema de salud

pblica por su amplia distribucin, prevalencia y mortalidad;
ya que afecta sobre todo a la poblacin econmicamente activa y
principalmente a varones. En el ao de 1995 la Organizacin
Mundial de la Salud declara esta enfermedad como una emergencia
global. Hasta el 2002 saba que un tercio de la poblacin
mundial estaba infectada con Mtb, los cuales estaban entre 8
millones de nuevos casos y 3 millones de muertes por ao (WHO
Report, 2002).
En 2012 la OMS informa 8.6 millones de casos nuevos y
1.3 millones de muertes por TB a nivel mundial, mientras que
nuestra Secretara de Salud (SS) registr 15,999 casos nuevos.
Adems report en 2011 para TB pulmonar una tasa de incidencia
de 14.5 casos por 100,000 habitantes, y una prevalencia de la
co-infeccin TB-VIH de 6.2% (WHO Report, 2012)
1.2 Tratamiento de TB
Desde hace varios aos hasta la actualidad, los medicamentos
para tratar la TB se dividen en dos grupos o categoras. Los
compuestos de primera lnea los cuales combinan eficacia con un
grado aceptable de toxicidad, es decir que los daos que estos
pueden causar a nuestro cuerpo son relativamente aceptables,
esta categora incluye a la isoniazida, rifampicina, etambutol,
estreptomicina y priazinamida (fig. 2). La mayor parte de los
6
pacientes con TBP tratados con estos medicamentos presentan

resultados satisfactorios. Debido la aparicin de resistencia
microbiana o por factores propios de paciente como infeccin
por VIH o algn tipo de adiccin, a veces se necesita recurrir
a frmacos de segunda lnea adicionales; de esta manera el
tratamiento
se
inicia
con
cinco
seis
productos
de
esta
categora como ofloxacina, coprofloxacina, etionamida, cido

pamnosalicilico,
cicloserina,
amikacina,
kanamicina
capreomicina, estos frmacos no estn diseados especficamente

para TBP, pero se ha observado que puede ser una alternativa
para el tratamiento, la desventaja es que el grado de toxicidad
que estos presentan es muy alto(Mandel GL y WA Petri, 1997,
Iseman MD, 1993; WHO 1997).
a)
b)
c)
Fig. 2. Frmacos de primera lnea contra la TBP. Estructura qumica de la a) rifampicina,
b) estreptomicina e c) isoniazida.
1.3 TB XDR y MDR

La prescripcin inadecuada, falta de adherencia, uso prolongado
y efectos adversos de los frmacos han favorecido la aparicin
de cepas resistentes. El panorama de la TB se agrava con la
presencia
de
cepas
multidrogorresistentes
(MDR)
que
son
resistentes al menos a isoniazida (I) y rifampicina (R) los dos

frmacos de primera lnea ms eficaces, y ms aun con las de
resistencia extendida (XDR) a frmacos de segunda lnea, esto
es
resistentes
I+R
(MDR)
adems
al
menos
una
fluoroquinolona y un frmaco inyectable (WHO, 2012).
Las
cepas
MDR
XDR
conservan
infectocontagiosaidad. El tratamiento de TB
una
notable
MDR es de 50 a 200
veces ms costoso y duradero, y an ms para XDR. La OMS estima

en 2012 un total de 450,000 de casos de TB que fueron MDR
distribuidos en 92 pases incluyendo Mxico
En este mismo ao la SS informa 472 casos de TBP

resistentes
al
menos
un
frmaco.
recientes informa 472 casos de TBP
Reportes
cientficos
MDR en nuevo len, Sinaloa,
Chiapas y Chihuahua (7.8-17.9%). Se ha identificado casos de

TBP XDR en el rea metropolitana de Monterrey.
El aislamiento de cepas de Mtb MDR y XDR de pacientes

con TB en nuestro pas est documentado. La duracin y el costo
del
tratamiento
de
enfermos
de
TB
MDR
XDR
son
considerablemente mayores que los de los pacientes portadores

de cepas sensibles y en numerosos casos de TB resistentes a
frmacos el desenlace es mortal.
Existe la necesidad de bsqueda y desarrollo de nuevos

agentes
anti-TB
con
estructuras
novedosas
mecanismos
de
accin diferentes a los frmacos asequibles, con menos efectos

adversos y especialmente resulta imperante que sean eficaces
para tratar la TB MDR y XDR.
1.4 Productos naturales

Los
productos
naturales
son
reconocidos
como
una
fuente
importante de nuevos y mejores tratamientos para diferentes

enfermedades,
incluyndose
la
TB.
Cerca
del
50%
de
los
frmacos aprobados por Federal Drug Administration de EEUU son

o se basan en productos naturales en su mayora obtenidos de
plantas (21) (22)
1.4.2 Genero Apiaceae

De la gran variedad de plantas medicinales utilizadas hoy en
da, Chile presenta una gran diversidad de estas que han sido
9
producto
de
los
diferentes
climas
presentes
en
areas
geogrficas, favorecido por barrera natural la cordillera de

los andes , tiene una riqueza vegetal muy variada, sin embargo,
con
los
limitados
investigaciones,
recursos
hay
escasa
que
se
informacin
entrega
de
la
las
variedad
de
plantas medicinales, cuando an en la poblacin esta tiene una

alta demanda, por tanto, es necesario que las plantas sean
objeto de estudio para determinar su composicin qumica, y
como
esta
acta
malestares,
con
entre
el
las
organismo,
plantas
para
el
empleadas
tratamiento
como
de
medicinales
podemos mencionar algunos representantes de la familia de las

Apiaceae, familia que era conocida con el nombre umbelferas,
hasta que Lindey en 1836 fue el primer autor en dar un nombre
alternativo de Apiaceae(Arenas et. al. 1993).
Algunas especies de la familia de las Apiaceae son

usadas como plantas medicinales, sin embargo, existen especies
de
este
mismo
gnero
que
son
venenosas,
de
acuerdo
la
composicin qumica que estas presentan. Entre las especies con

propiedades
medicinales
podemos
encontrar
Laretia
acaulis
(Cav,) Gill et Hook 1830, Azorella compacta (Phillippi 1891) y

Apium panul (Bertero ex DC.) Reiche 1899, que se encuentran en
el pas, y son de usos comn en la personas, sus propiedades
medicinales son conocidas popularmente, y han sido centro de
10
investigaciones
Azorella
para
son
verificar
gneros
su
propiedades.
principalmente
Mulinum
sudamericanos,
caractersticos de la estepa patagnica y de regiones elevadas

de los Andes australes.
Tabla I. Taxonoma de la Laretia acaulis (Cav) Gillies & Hook. 1830
Clasificacin:
Divisin
Magnoliophyta
Clase
Magnoliopsida
Orden
Apiales
Familia
Apiaceae
Gnero
Laretia
Especie
Laretia acualis (Cav) Gillies& Hook 1830
Fuente: http://especies.mma.gob.cl/CNMWeb/Web/WebCiudadana/ficha_indepen.aspx?
EspecieId=242&Version1
Figura 3: Laretia acaulis. Fuente: Darian Stark INIA. http://www.florachilena.cl/especies.php?

id=2243.
Tabla II. Taxonoma de la Azorella compacta (Phill 1891)
11
Clasificacin :
Divisin
Clase
Orden
Familia
Gnero
Especie
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Apiales
Apiaceae
Azorella
Azorella Compacta (PHILL. 1891)
Fuente: http://www.florachilena.cl/especies.php?id=465
Figura 4: Estructura qumica de los compuestos. Muoz et. al. 1999.
Figura 5: Foto de Azorella compacta.

Fuente:http://www.chileflora.com/Florachilena/FloraGerman/HighResPages/GH2013.htm
Recientemente se report que la evaluacin de diterpenos

tipo
azorellanos
mulinanos
naturales
sus
derivados
semisintticos contra dos cepas de MTb H37Rv sensible (a los

12
cinco frmacos de primera lnea) y CIBIN 99 un aislado MDR

resistente a estos, permiti identificar un grupo carboxilo C20
de
los
diterpenos
como
importante
en
la
expresin
de
actividad con valores de CMI de 25 y 12.5 g/mL para steres npropil
n-butil
contra
las
cepas
sensible
MDR,
respectivamente, y un blanco potencial para la obtencin de

nuevos derivados de azorellanos y mulinanos. Por otro lado
tambin encontraron que el incremento de la lipoficidad del
sustituyente en una serie de derivados de oxadiazoles, favorece
su actividad frente a cepas MDR in vitro y su eficacia in vivo;
estos resultados coinciden con lo reportado por otros autores
para
derivados
lipoflicos
de
distintas
entidades
qumicas
activas sobre cepas MDR y XDR.
Con base a lo anterior, en este proyecto se pretende

llevar a cabo la preparacin de nuevos derivados semisintticos
de
azorellanos
hidrocarbonadas
y
los
mulinanos,
diterpenos
incorporando
naturales,
con
cadenas
el
fin
de
modificar la lipoficidad de los productos y la expresin de su

actividad frente a cepas MDR y XDR de Mtb en modelos in vitro e
in vivo.
2.- JUSTIFICACIN
13
La TB es un importante problema de la Salud Pblica por su

amplia distribucin, prevalencia y mortalidad que afecta a toda
la poblacin, mayormente a hombres. Siendo adems la segunda
causa de muerte por enfermedad infectocontagiosa despus del
VIH. En nuestro pas se han registrado desde 1990 entre 13 y 16
mil nuevos casos de TBP por ao.
El incremento de nuevas cepas resistentes a frmacos

conduce
la
compuestos
crudos
necesidad
con
de
actividad
compuestos
bsqueda
antiTB.
puros
y/o
Como
aislados
de
sntesis
pueden
de
ser
plantas,
nuevos
extractos
que
en
los
ltimos aos se han reportado una amplia variedad de ellas con

actividad antibacteriana y antiTB, de aqu nos basa que los
productos naturales son una excelente alternativa.
A pesar de que en nuestro pas existe gran conocimiento

sobre medicina tradicional as como de plantas medicinales,
stas no han sido estudiadas en su totalidad, mucho menos han
sido utilizadas en las instituciones de salud pblica, lo cual
lo hace una alternativa
de tratamiento de enfermedades de la
salud.
Recientemente
azorellanos
mulinanos
se
report
naturales,
que
la
y
evaluacin
sus
de
derivados
14
semisintticos contra dos cepas de Mtb H37Rv (sensible a todos

los
frmacos
de
primera
lnea)
CIBIN
99
un
aislado
MDR
resistente a stos, permiti identificar al grupo carboxilo C20 de los diterpenos como importante en la expresin de la
actividad anti-TB MDR, y un blanco potencial para la obtencin
de nuevos derivados de azorellanos y mulinanos ms potentes.
Por otro lado se encontr que el incremento de la

lipoficidad
del
oxadiazoles,
sustituyente
en
una
serie
de
derivados
de
favorece su actividad frente a cepas MDR in vitro
y su eficacia in vivo.
Con base en lo anterior, en este proyecto se pretende

llevar a cabo la preparacin de nuevos derivados semisintticos
de
azorellanos
hidrocarbonadas
mulinanos,
los
diterpenos
incorporando
naturales,
con
cadenas
el
fin
de
modificar la lipoficidad de los productos y la expresin de su

actividad frente a cepas MDR y XDR de Mtb en modelos in vitro e
in vivo, con el propsito de obtener productos semisinteticos
con
potencial
para
su
desarrollo
como
medicamento
para
el
tratamiento de pacientes con TB causada por cepas MDR y XDR de

Mtb,
que
favorecer
los
derechohabientes
enfermos
de
TB
resistente a frmacos de primera y segunda lnea.
15
3.- OBJETIVOS
3.1.- GENERAL:
16
Preparar
diterpenos
semisintticos
con
distintos
grados
de
lipofilicidad y evaluar su actividad anti-TB contra cepas MDR y

XDR de M. tuberculosis in vitro e in vivo.
3.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Aislar suficientes cantidades de los azorellanos y mulinanos
mayoritarios, producidos por especies de los gneros Azorella y
Mulinum.
2. Preparar diferentes derivados semisintticos de azorellanos
y mulinanos, por ejemplo: teres, steres, amidas y aminas con
cadenas de diferentes nmeros de tomos de carbono.
3.
Evaluar
la
semisintticos
actividad
sobre
anti-TB
cepas
de
in
vitro
sensibles,
de
los
derivados
resistentes
de
M.
con
la
tuberculosis.
4.
Correlacionar
la
actividad
anti-TB
in
vitro
lipofilicidad de los diterpenos semisinteticos.

5. Evaluar la toxicidad de los derivados semisintticos con
mayor
actividad
anti-TB
in
vitro
sobre
cultivos
de
lneas
celulares de mamfero.
6.
Evaluar
la
actividad
anti-TB
in
vivo
de
los
derivados
semisintticos con mayor actividad anti-TB in vitro y menor

toxicidad.
4.- PROBLEMAS A RESOLVER, PRIORIZARLOS
17
El aislamiento de cepas de M. tuberculosis que no responden a

frmacos disponibles es cada da ms frecuente. La duracin y
el
costo
del
tratamiento
de
enfermos
con
TB
resistente
frmacos es considerablemente mayor que los de los pacientes

portadores
causada
de
por
cepas
cepas
sensibles
resistentes
en
numerosos
frmacos
el
casos
de
TB
desenlace
es
mortal.
Existe la necesidad de la bsqueda y desarrollo de

nuevos agentes anti-TB con estructuras novedosas y mecanismos
de
accin
diferentes
los
frmacos
asequibles,
con
menos
efectos adversos y especialmente resulta imperante que sean

eficaces para tratar la TB resistente.
Una fuente con gran potencial son los productos

naturales, en especial las plantas (Rates S, 2001; Fabricant DS
y NR Farnsworth, 2001).
Por
lo
cual
se
utilizar
la
cepa
H37Rv
de
M.
tuberculosis, para el desarrollo experimental, el cual es el

modelo universal para estos trabajos, la cual es sensible a
todos
los
medicamentos
de
primera
lnea:
estreptomicina,
isoniazida, rifampicina, etambutol y priazinamida.
18
Tomando en cuenta que los compuestos purificados de los

productos
naturales
antimicrobiana
los
anti-TB
cuales
son
muy
pueden
poseer
diferentes
en
actividad
cuanto
estructura y modelos de accin frente a los medicamentos que

actualmente se conocen, se pretende realizar este proyecto con
la finalidad de obtener nuevos y mejores compuestos que podran
se activos frente a estas cepas XDR y MDR.
5.- PROCEDIMENTO Y DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES

REALIZADAS
5.1 Aislamiento y purificacin de azorellanos y mulinanos
mayoritarios.
19
Los extractos de azorellanos y mulinanos se obtuvieron por el

mtodo de percolacin en fro de las partes areas de la planta
seca (Mulinum crassifolium, Azorella compacta, A. yareta y/o A.
madreprica)
utilizando
como
disolvente
n-hexano.
El
procedimiento se describe a continuacin:
Se
tom
el
material
vegetal
colectado,
despus
previamente lavado y seco. Se cort en pedazos pequeos (mm).

El material vegetal a extraer se coloc en un percolador de
vidrio tambin conocido comnmente como pera, cabe la pena
distinguir que dentro del percolador se lo coloc una cama de
algodn
para
poder
recuperar
los
extractos
con
la
menor
cantidad de residuos slidos, y por consecuencia una eficiente

extraccin. Despus de este proceso se procedi a aadir el
disolvente, el cual se aadi hasta cubrir todo el material
molido, el percolador se cubri con papel metlico y una placa
de vidrio para evitar su evaporacin. El material vegetal se
dej macerar por una semana, no sin realizar un monitoreo todos
los das de una mayor intensidad en el color del extracto. Al
final de la semana se abra la vlvula del percolador y se
colectaba
el
procedimiento
se
extracto
en
llev
cabo
colectado se le conoce como
matraces
por
Erlenmeyer.
triplicado.
Al
Este
extracto
extracto crudo. La eliminacin del
20
disolvente se llev a cabo a presin reducida con ayuda de un

rotavapor.
a)
b)
Fig. 6 Material vegetal colectado a) Mulinum crassifolium, b) Azorella compacta.
a)
b)
Fig. 7. Preparacin del material vegetal (a) y maceracin del material vegetal mediante
percolacin en fro con n-hexano (b).
21
Fig. 8. Extracto crudo de Mulinum crassifolium, Azorella compacta
22

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ANGEL DE JESS DZUL BEH

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL;

UNIDAD DE INVESTIGACIN MDICA YUCATN

ASESOR INTERNO: MC. JACINTO ALBERTO LOEZA PERAZA

OXKUTZCAB, YUCATN, MXICO

causada principalmente causada principalmente por Mycobacterium

adinamia, sudoracin nocturna, prdida de peso y a veces fiebre

etiolgicos de esta enfermedad. Existen otras especies como M.

fortuitun, las cuales producen en el hombre sntomas clnicos

Fig. 1. Mycobacterium tuberculosis. Bacteria que causa la tuberculosis pulmonar, amplificada

Actualmente la TB es un importante problema de salud

pacientes con TBP tratados con estos medicamentos presentan

categora como ofloxacina, coprofloxacina, etionamida, cido

capreomicina, estos frmacos no estn diseados especficamente

1.3 TB XDR y MDR

resistentes al menos a isoniazida (I) y rifampicina (R) los dos

fluoroquinolona y un frmaco inyectable (WHO, 2012).

veces ms costoso y duradero, y an ms para XDR. La OMS estima

En este mismo ao la SS informa 472 casos de TBP

recientes informa 472 casos de TBP

MDR en nuevo len, Sinaloa,

Chiapas y Chihuahua (7.8-17.9%). Se ha identificado casos de

El aislamiento de cepas de Mtb MDR y XDR de pacientes

considerablemente mayores que los de los pacientes portadores

Existe la necesidad de bsqueda y desarrollo de nuevos

accin diferentes a los frmacos asequibles, con menos efectos

1.4 Productos naturales

importante de nuevos y mejores tratamientos para diferentes

frmacos aprobados por Federal Drug Administration de EEUU son

1.4.2 Genero Apiaceae

geogrficas, favorecido por barrera natural la cordillera de

plantas medicinales, cuando an en la poblacin esta tiene una

podemos mencionar algunos representantes de la familia de las

Algunas especies de la familia de las Apiaceae son

composicin qumica que estas presentan. Entre las especies con

(Cav,) Gill et Hook 1830, Azorella compacta (Phillippi 1891) y

caractersticos de la estepa patagnica y de regiones elevadas

Tabla I. Taxonoma de la Laretia acaulis (Cav) Gillies & Hook. 1830

Laretia acualis (Cav) Gillies& Hook 1830

Figura 3: Laretia acaulis. Fuente: Darian Stark INIA. http://www.florachilena.cl/especies.php?

Tabla II. Taxonoma de la Azorella compacta (Phill 1891)

Figura 4: Estructura qumica de los compuestos. Muoz et. al. 1999.

Figura 5: Foto de Azorella compacta.

Recientemente se report que la evaluacin de diterpenos

semisintticos contra dos cepas de MTb H37Rv sensible (a los

cinco frmacos de primera lnea) y CIBIN 99 un aislado MDR

actividad con valores de CMI de 25 y 12.5 g/mL para steres npropil

respectivamente, y un blanco potencial para la obtencin de

activas sobre cepas MDR y XDR.

Con base a lo anterior, en este proyecto se pretende

modificar la lipoficidad de los productos y la expresin de su

La TB es un importante problema de la Salud Pblica por su

El incremento de nuevas cepas resistentes a frmacos

ltimos aos se han reportado una amplia variedad de ellas con

A pesar de que en nuestro pas existe gran conocimiento

semisintticos contra dos cepas de Mtb H37Rv (sensible a todos

Por otro lado se encontr que el incremento de la

favorece su actividad frente a cepas MDR in vitro

Con base en lo anterior, en este proyecto se pretende

modificar la lipoficidad de los productos y la expresin de su