CURSO DE MICROBIOLOGA DIAGNOSTICA

PRCTICA NMERO 1

Facultad de Medicina Humana

Escuela: Farmacia y Bioqumica
Docente: Jos Manuel Villanueva Carlos

TECNICA DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA

COLORACIN DE GRAM

REALIZADO POR:
Guzmn Prez Jhenny
Torres vila Jess
Alegre paredes Nadyd
Aguilar Villareal Geraldine
Morillo Herrera Ketty

COLORACIN DE GRAM.

OBJETIVO:
Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos.

FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede
utilizarse para separar la mayora de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a
saber, las que captan el colorante bsico, cristal violeta (es decir las bacterias gran
positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o
acetona (es decir las bacterias gram negativas).

INTRODUCCIN:
El tamao de la mayora de las clulas
bacterianas es tal que resultan difciles de ver
con el microscopio ptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la clula
y el medio que la rodea. El modo ms simple de
aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste
de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos que usan un solo
colorante llamado de tincin simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan mtodos que no
tien de igual modo todas las clulas, es el
proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en
microbiologa es la tincin Gram. Basndose en su reaccin a la
tincin Gram, las bacteras pueden dividirse en dos grupos:
grampositivas y gramnegativas. Esta tincin tiene gran importancia
en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de
la
pared
celular
de
las
distintas
bacterias.
Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su
reaccin, los microorganismos grampositivos pueden presentar
respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlbiles). Por
ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias grampositivas
pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia,
se tien por la safranina apareciendo como gramnegativas. Anlogo
efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del
organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica.
Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento
establecido.Para explicar el mecanismo de la tincin de gram se han

propuesto varias hiptesis fundadas en la naturaleza qumica de las

paredes celulares de los microorganismos. Aqu puedes ver las
diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared
bacteriana:
Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800
A)
cidos teicoicos
polisacridos
protenas (pocas veces)
glicopptido (50% del peso seco)

Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A

cubierta por capas externas de
densidad menor)
lipopolisacridos
lipoprotenas
protenas
glicopptido (10% del peso seco)

Productos
que se
utilizan
1) Cristal
violeta
2) Lugol
solucin
iodada
3) Alcohol

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM +
Clulas color violeta

GRAM Clulas color violeta

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan
teidas de color violeta.
Se deshidratan las paredes
celulares. Se contraen los
poros. Disminuye la
permeabilidad. El complejo
CV-I no sale de las clulas
que continan teidas de

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan
teidas de color violeta.
Eliminacin por extraccin
de grasas de las paredes
celulares. Aumenta la
porosidad. El complejo CV-I
se separa de la clula.

color violeta.
4) Safranina Clulas no decoloradas;
Clulas decoloradas; se
quedan teidas de color
tien de color rosado.
violeta.
El mecanismo de la tincin Gram esta reseado en el siguiente
esquema:

MTODO:
MATERIALES:
Cultivo de bacterias ( E. Coli y Streptococcus)
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asas de inoculacin
Mechero Bunsen
Hisopos
Colorantes: Cristal Violeta, Lugol, Safranina.
Agua destilada
Alcohol Acetona
Aceite de Imersin
Microscopio

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.

1. Extensin: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a
la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a
la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de
bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el
porta y se fija la extensin por el calor, calentando
suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

2. Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante
inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner
una gota muy pequea de aceite de cedro y observar al
microscopio con el objetivo de inmersin.

3. Observacin
Debe utilizarse el objetivo de
inmersin.
Se coloca una gota de aceite
de cedro sobre la
preparacin. Se enfoca,
preferentemente, con el
micromtrico.
Despus de utilizar el
objetivo de inmersin debe
limpiarse con xilol .

RESULTADOS:

Staphylococcus

Para visualizar el Staphylococcus en el microscopio se utiliz la tincin gram. Los

Staphylococcus songrampositivas y se tien de color violeta, aun as cuando se
retir el exceso de colorante con agua destilada, debido de que el colorante
cristal violeta se queda atrapado en la capa gruesa de peptidoglucanos que
rodea a la clula, y tambin se observ en el microscopio bacterias con racimos,
pares y cadenas cortas con forma redonda (coco). Tomando este color
caracterstico que se le denomina a las bacterias que lo presentan Gram
positivas. Estas bacterias presentan este color ya que la envoltura celular de las
bacterias Gram- positivas cubren la membrana citoplasmtica y una pared
celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la
anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante
molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano le proporciona una
gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante
la tincin de Gram al poseer una gran proporcin de este polmero complejo
(murena) la cual no la hace susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea. A diferencia de las Gram-negativas, estas bacterias no presentan una
segunda membrana lipdica externa.

EscherichiaColi

Para visualizar el EscherichiaColi en el microscopio se utiliz la tincin gram. Los E.coli

son gramnegativos y se tien de color violeta, debido que la capa de pptidoglicano
(murena) unida a una membrana externa formada por protenas, fosfolpidos y
polisacridos que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdindose la coloracin azulviolceay por esto las clulas se tien con safranina y las
observamos rojas.En comparacin a las bacterias Gram positivas, que tiene varias capas
de peptidoglicano unido a la membrana plasmtica, donde se encuentra el cido
lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico, por lo cual el complejo de las
molculas de cristal violeta, lugol y cido teicoico que se forma en la pared celular de las
Gram positivas, es muy difcil de remover, lo que no sucede con las Gram negativas,
porque el cristal violeta y el lugol no reaccionan con el cido teicocio, debido a que las
bacterias Gram negativas en su pared celular no lo tienen. Por otra parte, la membrana
externa que poseen las bacterias Gram negativas es soluble en compuestos orgnicos
como a la mezcla de alcohol y acetona, por lo tanto al momento de agregar el
decolorante alcohol 95, el complejo de cristal violeta y lugol se perdi.
Tambin se observ en el microscopio bacterias con forma de bacilo (forma de barra o
vara). Tomando este color caracterstico que se le denomina a las bacterias que lo
presentan Gram negativas.

CONCLUSIONES:
Las diferencias de composicin de las paredes de las bacterias
grampositivas, que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con
numerosos enlaces cruzados de acido teicoico, y las paredes de las
clulas gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es ms
delgada, explican las diferencias de la tincin de Gram entre estos
dos grupos principales de bacterias es probable que la gran cantidad
de enlaces cruzados de acido teicoico de los microorganismos gram
positivos contribuya a su capacidad de resistir la decoloracin con
alcohol.(Fig. 2) Si bien el colorante de contraste puede ser captado
por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se
altera.

Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y

GRAM(-).

*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de

la pared celular debido al tratamiento antibitico, al envejecimiento o
a la accin de enzimas autolticas permiten que el violeta se elimine
durante la decoloracin y pueden aparecer como gram variables, con
algunas clulas coloreadas de rosa y otras de violeta.
Sin
embargo,
con
propsitos
de
identificacin,
estos
microorganismos se consideran gram positivos verdaderos.
Por otro lado, las bacterias gram negativas raras veces (o nunca)
retienen el cristal violeta si el procedimiento de tincin se ha
realizado de manera apropiada.
Las clulas husped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos),
pierden el cristal violeta con la decoloracin y aparecen de color rosa
en los frotis preparados y teidos de manera correcta.
OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.
Una vez teido el frotis se observa con el objetivo de inmersin
(1.000x). Cuando el material orgnico se tie con Gram (p. ej., frotis
directo) el portaobjetos se evala en busca de la presencia de clulas
bacterianas as como de las reacciones Gram, (Fig. 3) las morfologas
(p. ej., cocos y bacilos) y la disposicin (p. ej., cadenas pares,
racimos) de clulas observadas (Fig.4). Esta informacin a menudo
proporciona un diagnostico preliminar con respecto a los agentes
infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo
inicial del paciente.

Fig.3.- Reacciones Gram.

Fig 4. Clasificacin de las bacterias de acuerdo a su morfologa

agrupacin.

Si bien la evaluacin de la tincin de Gram del frotis directo se

utiliza de rutina como una ayuda en el diagnostico de las infecciones
bacterianas, es posible que se detecten y no deben ignorarsehallazgos inesperados pero importantes de otras etiologas
infecciosas. Por ejemplo, las clulas y los elementos micticos por lo
general se tien como grampositivos pero pueden captar el cristal
violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej.,
rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la tincin de Gram
pueden detectarse otros agentes infecciosos adems de las bacterias,
todas las clulas o las estructuras inusuales observadas en el frotis
deben evaluarse de nuevo antes de descartarse como no importantes.

DISCUCINES:
La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen
microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de
importancia clnica pueden detectarse con este mtodo.
Las nicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad
dentro de las clulas husped (p. ej., clamidias).

Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y

ureoplasmas).

Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por

el microscopio ptico (p. ej., espiroquetas).

Los que tienen una diferente composicin en su pared y no

captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

TINCIN DE GRAM DE LAS BACTERIAS QUE CRECEN EN CULTIVOS.

(Frotis indirectos).
La tincin de Gram tambin desempea un papel clave en la
identificacin de las bacterias en crecimiento en cultivos. De manera
similar a los frotis directos, en los preparados a partir del
crecimiento bacteriano se evalan las reacciones de Gram, las
morfologas y las disposiciones de las clulas bacterianas. Si se va a
teir ms de una muestra en el mismo portaobjeto, puede utilizarse
un lpiz de cera para crear divisiones.es til dibujar una especie de
mapa de ese portaobjetos de modo que los resultados de las
diferentes tinciones de Gram puedan registrarse de manera
organizada. Los resultados del examen del frotis se utilizaran para
determinar comprobaciones ulteriores para la identificacin y la
caracterizacin de los microorganismos aislados a partir de la
muestra del paciente.

Para que se necesita el aceite de inmersin?

El aceite de inmersin tiene un ndice de refraccin similar al del

vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.
.
BIBLIOGRAFA
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(2013). Examen microscpico de las bacterias - SlideShare. Retrieved

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ANEXOS
1.

2.