Discusin:

El objetivo de esta prctica era que se realizara la trasformacin de clulas de

E.Coli DH5, dicha transformacin es un proceso por el cual las clulas captan
DNA libre presente en el medio. Para que nuestra transformacin tuviera lugar, la
bacteria tena que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre
en determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta
alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ADN
en la clula. En el laboratorio se consigui llevar a cabo con anterioridad de dos
meses una tcnica que induce el estado de competencia en bacterias que no lo
presentan de forma natural, como es el caso de E. coli mediante lavados
sucesivos en una solucin fra (4C) de Cl2Ca a cada una de las muestras
contenidas en los tubos eppendorf marcados como T5, T6, T7 y T8,
posteriormente se le coloco un agente criopreservante al tubo 5 y al tubo 7, al tubo
6 y 8 solo se les agrego NaCl, dicho agente ayuda a lograr la criopreservacin en
clulas, el cual es un proceso en el cual estas son congelados a muy bajas
temperaturas (-20 a -80C), generalmente para disminuir las funciones vitales de
una clula y poderlas mantener en condiciones de vida suspendida por mucho
tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biolgica, incluidas las
reacciones bioqumicas que produciran la muerte de una clula, quedan
efectivamente detenidas. Este tratamiento altera las envolturas (sobre todo la
membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN.
Para llevar a cabo la transformacin mencionada al inicio la tcnica utilizada fue la
de choque trmico para poder producir tericamente poros en la membrana
citoplasmtica de las E.Coli DH5 en donde el ADN del plsmido recombinado
que se tena de clases anteriores fuera mezclado con las clulas que estaban
estado de competencia (usando Cl2Ca), estas clulas recibieron un incremento
brusco de temperatura lo cual iba a permitir la entrada de ADN a las clulas con
cierta eficacia. Una vez que se llev a cabo esto se sembraron las clulas en dos
tipos de medio LB uno que contena Kanamicina a 50mg/ml y otro medio que no la
contena.
Al observar nuestros resultados podemos ver el crecimiento en el medio LB/
kanamicina fue nulo en todas las condiciones las que se encontraban nuestras
clulas con o sin agente criopreservante, para esto podemos planear diversas
teoras para dar una explicacin del por qu no crecieron colonias cuando estas
tenan que haber crecido, la primera teora plateada es que las clulas de E.Coli
DH5 pudieron perder su estado de competencia; pero al revisar diversas
bibliografas nos pudimos dar cuenta que las clulas se pueden mantener viables
por aproximadamente 3 meses y haciendo un breve recuento del tiempo que estas
llevaban guardadas podemos descartar esta terica ya que dicho tiempo fue de
aproximadamente 2 meses. Otro punto que podemos tomar en cuenta es que
posiblemente no se llev a cabo una ligacin de manera adecuada en el plsmido
que ya tenamos recombinado, pero esto se comprob anteriormente realizando
un gel de agarosa y revelando este en luz UV se pudieron observar las bandas de
ligacin, lo que se puede argumentar de aqu es que la reaccin de ligacin no fue
suficiente y que el plsmido no permaneci ligado a las condiciones en las que
este fue tratado, por otra parte tambin podemos tomar en cuenta la concentracin

de plsmido con la que trabajamos y de igual manera la concentracin de

poblacin bacteriana que se tena ya que se ha observado que a bajas
concentraciones de ADN, la cantidad de clulas transformantes ser proporcional
a la cantidad de DNA dador, lo que demuestra que la transformacin es la
consecuencia de la interaccin entre una clula receptora con una sola molcula
de DNA dador. Tambin se investig que por encima de una cierta concentracin
de DNA se est llevando a cabo un fenmeno de saturacin el cual se debe a que
se ha alcanzado el nmero mximo de clulas capaces de incorporar el DNA
exgeno, y lo mismo se puede decir en el caso de que all habido gran
concentracin de clulas bacterianas, en donde el plsmido no fue suficiente para
poder introducirse dentro de ellas o el caso contrario es que tuviramos muy
pocas clulas y mucho plsmido.
Como penltimo punto podemos tomar en cuenta que la concentracin de
kanamicina all sido superior a la que est establecida para la condiciones
ptimas que es de 50 mg/ml, en este paso pudo haber un error en la medicin de
dicha concentracin por lo cual las clulas no pudieron crecer en este medio.
Lo ms razonable a nuestra consideracin es que no se all llevado a cabo bien la
tcnica de choque trmico, ya que al incrementar la temperatura esta pudo haber
sido demasiada para dichas bacterias ya que la temperatura a la cual pueden
desarrollarse es de 44-46 C, sabiendo dicho dato al meter estas clulas al bao
Mara este pudo estar un poco ms de esa temperatura, destruyendo as la
membrana de nuestra bacteria. La otra y ltima teora es que simplemente al
momento de realizar la siembra el asa bacteriolgica que se esterilizo por
flameado no se dej enfriar y se hayan destruido nuestras clulas. Todo lo anterior
mencionado son diversas teoras planteadas pero los motivos por los cuales no
hubo crecimiento en el medio de cultivo que contena kanamicina no se pueden
saber con precisin ya que el plsmido contena un gen que lo haca resistente a
la kanamicina.
Por otro lado tambin se sembraron controles en medio LB sin kanamicina, en
donde se pudo observar crecimiento en todas las condiciones establecidas (con o
sin agente criopreservante), al hacer un anlisis de lo que contenan cada control
podemos decir que tericamente en el tubo 5 y 7 poda haber crecimiento de
bacterias en nuestro medio de cultivo ya que estas contenan un agente
criopreservante que es el glicerol y adems eran clulas que supuestamente
estaban competentes, pero en el tubo 6 y 8 no tena que haber crecimiento de
bacterias porque no haba agente criopreservante y las clulas no se encontraban
en estado competente porque a estas no se les agrego Ca2Cl. Lo que podemos
decir de esto es que, el estado de competencia no fue el adecuado y que
posiblemente ni siquiera se llev a cabo dicho estado, para esto no se si exista un
mtodo con el que se pueda corroborar que efectivamente las clulas se
encontraban en dicho estado.
Conclusin: En esta prctica podemos concluir que es importante tomar en
cuenta diversos factores que van a afectar la transformacin que se quiere llevar a
cabo, ya que dicha tcnica se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos
que producen microporos en la clula, lo que permite la introduccin del DNA
exgeno (transformacin) de modo bastante eficiente y si todos los pasos no se

llevan a cabo de manera adecuada desde el inicio la trasformacin de las clulas

no se llevara a cabo.
Pginas web consultadas [en lnea] el 12 de noviembre de 2014:
http://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/TP3-09.pdf
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4006097ES.pdf
http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter8.htm
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%20CON%20PL%C3
%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Manual%20del%
20Laboratorio%20de%20Biotecnologia%20Molecular.pdf
http://www.produccionanimal.com.ar/informacion_tecnica/carne_y_subproductos/44-escherichia_coli.pdf