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UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS


CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA
BIOLOGIA MOLECULAR
Integrantes: Aguirre Sofa, Jacqueline Jcome, Manjarrez Israel, Muso Edwin,
Villarroel Diana
Docente: Dr. Carlos Rodrguez PhD.
Semestre: Sptimo U Bioqumica
Fecha: 01/06/14
Tema: Determinacin de la poblacin, diversidad y caracterizacin molecular de
levaduras asociadas a las frutas manzana y pera pia localizadas en el cantn Ambato.
1.-INTRODUCCIN
Las levaduras son hongos unicelulares que poseen una estructura morfolgica esfrica u
ovalada, son los organismos eucariotas ms primitivos del planeta, no poseen cloroplastos, son
hetertrofos y su principal fuente de carbono proviene de los azucares bsicos que asimilan tales
como las hexosas, disacridos y trisacridos tales como D-glucosa, sacarosa y rafinosa
respectivamente (Rodrguez, 2007).
Su tamao vara entre 1-5 m de ancho por 5 a 30 m de largo. Su forma puede ser desde
esfrica a ovoide, alimonada, piriforme, cilndrica, triangular e incluso alargada; estas formas del
microorganismo se dan independientemente de las condiciones ambientales. Cada especie
tienen su forma caracterstica (Garcia, et.al. 2009).
Las levaduras se encuentran en la mayora de frutas plantas y exudados de las mismas, muchas
especies de levaduras pueden convertir mediante su metabolismo los azucares en alcohol etlico
y dixido de carbono lo cual es de suma importancia desde el punto de vista industrial pues
intervienen en procesos de produccin de cerveza, vino, alcohol industrial, glicerol, vinagre y
adems por su elevada cantidad de protenas es usado como suplementos alimenticios tanto
animal como para el consumo humano (Jhon L, 1999).
Las levaduras desde la antigedad han sido muy importantes por su metabolismo al realizar
fermentacin alcohlica con lo cual se producan bebidas alcohlicas, hoy en da el inters sobre
las levaduras se ha inclinado hacia lo que es la bioproduccin de etanol como un biocombustible
como respuesta a la contaminacin excesiva por el uso de combustibles fsiles (Carrillo, 2003).
2.- OBJETIVOS
2.1.- Objetivo General:
Determinar la diversidad en la poblacin de levaduras asociadas a manzana y pera pia.

2.2.- Objetivos Especficos:


Caracterizar tanto microscpica y macroscpicamente a las diferentes levaduras
obtenidas en la manzana y pera pia.
Calcular las unidades formadoras de colonias de las levaduras sembradas en los
distintos medios tanto de manzana como de pera pia.

3.- METODOLOGA
3.1.- RECOLECCIN DE MUESTRAS
Las muestras fueron recolectadas en dos diferentes sitios productores de manzana y pera-pina
de la Ciudad de Ambato, en los sectores de Lacn ubicado en la parroquia de San Bartolom de
Pinllo (1 13 8" S; 78 39 2" W) y Querochaca el 17 de Abril del 2014. Las muestras se
almacenaron en fundas negras para su posterior trasladado al laboratorio. Se seleccionaron
frutos maduros de formacin completa debido a que contiene mayor concentracin de azcares
fermentables. Los frutos recolectados se dividieron por cada sector muestreado. Todos los
materiales para manipular y lavar las muestras fueron previamente esterilizados en el laboratorio.
Los frutos tras ser muestreados, fueron lavados con agua potable y posteriormente se realiz
una desinfeccin superficial al 20% con Hipoclorito sumergido por 2 min, luego se realiz
pequeos orificios en la fruta con ayuda de una aza de puncin para permitir el paso de oxgeno
y realice el proceso de fermentacin. Finalmente se guard en fundas hermticas con su
respectivo cdigo para ser llevadas a incubacin a 28C por 72 hr.
3.2.- CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS MUESTRAS DE MANZANA Y PERA
PIA
3.2.1 Determinacin del pH
Para determinar el pH de las muestras, se pes 10g de fruta (manzana y pera pia) y se coloc
en un frasco estril al que se aadieron 90ml de agua destilada luego se procedi a licuar
manteniendo condiciones estriles, finalmente se tomaron las lecturas correspondientes de cada
una de las muestras mediante el uso de un pH-metro.
3.2.2 Determinacin del porcentaje de humedad
Se pes 2 gramos de cada una de las muestras en trozos pequeos que fue coloco en una
balanza de humedad por 1 hora aproximadamente. Al retirar las muestras el equipo nos da el
valor directamente en %.
3.2.3 Determinacin del porcentaje de materia orgnica
Se pes previamente los crisoles a utilizarse y se coloc 2 gramos aproximadamente de cada
una de las muestras luego fueron llevadas a la estufa a 105C por 24 horas. Al retirar las
muestras se las dej enfriar en un desecador y se procedi a pesar nuevamente (Peso 1). Las
muestras procedentes de la estufa se colocaron en una mufla, a 400C por 3 horas. Al trmino
de este tiempo se las dej enfriar en un desecador y finalmente se obtuvo el peso final (Peso 2).

El porcentaje de materia orgnica fue determinado mediante la siguiente frmula.


1 2
100
1
Todos los clculos involucraron nicamente el peso de la muestra, por lo que el peso del crisol
fue restado.
%. =

3.3.- PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO


Se prepar cajas petri con agar SABORAUD (Anexo 1), y cajas petri con agar YM (Anexo 2),
para esto se calcul el volumen requerido del medio de cultivo asignado, considerando que en
cada caja petri se dispensaron alrededor de 25ml de medio. Para la preparacin de los medios
de cultivo, se pesaron los ingredientes con excepcin del agar, y se los coloc en un frasco para
medios de cultivo que contena la mitad del volumen de agua destilada, se los disolvi y se
complet el volumen de agua para ajustar el pH a 5, luego se agreg la cantidad respectiva de
agar.
Los materiales a utilizar, junto con los medios de cultivo preparados se los llev a esterilizar en el
autoclave a 121C por 20min.
Se aadi a cada medio estril fue suplementado con sulfato de estreptomicina, a una
concentracin de 10 g/ml, y rifampicina a una concentracin de 50 g/ml para evitar el
crecimiento de bacterias, se agit para obtener una mezcla homognea. Finalmente se verti los
medios de cultivo en las cajas petri estriles y se esper a que se solidifiquen.
3.4.- AISLAMIENTO SELECTIVO DE LEVADURAS
3.4.1 Determinacin de la Poblacin y Diversidad de Microbiota de Levaduras
Se emple el mtodo de difusin en placa y diluciones seriadas para determinar la poblacin y
diversidad de levaduras presentes en frutas.
3.4.1.1 Preparacin de Diluciones
Para preparar la dilucin 1/10 se utiliz 10 gr de cada muestra previamente pesadas en frascos
plsticos estriles, se aadi a 90 ml de agua potable estril luego se procedi a licuar
manteniendo sus respectivas condiciones estriles para evitar ser contaminado. La suspensin
resultante fue agitada e incubada a 28C por 24 horas con el fin de obtener una fermentacin
espontnea y promover el desarrollo de las levaduras. Posteriormente, se prepararon las
diluciones 1/102, 1/103,1/104, 1/105 para ello se, transfiri 500 l de la dilucin 1/10, a un tubo
con 4,5ml de agua de llave estril, con esto se obtuvo la dilucin 1/102, se realiz el mismo
proceso para las siguientes diluciones.
3.4.1.2 Difusin en placa
Se inocul 100l de cada dilucin sobre las superficies de las cajas petri que contenan el medio
SABORAUD y YM a pH de 5. Luego con la ayuda de un dispersor estril, se extendi la gota
aadida sobre la superficie del medio de cultivo. Las cajas inoculadas se incubaron a 25C por 4
das. Luego de la incubacin se procedi con el conteo de colonias presentes en cada una de las

cajas. Adems se anot el nmero de colonias diferentes.


El nmero de ufc por gramo de muestra se calcul para aquellas diluciones en las que el nmero
de colonias se encuentre en un rango entre 30 hasta 300.

3.4.1.3 Determinacin de ufc/g muestra seco


Para la determinacin de ufc/g muestra seco e reemplaz los datos obtenidos en el conteo de
colonias en la siguiente formula:
ufc # colonias * F .D * V .inicial

g
V . final * g.suelo. sec o
Para esto se utiliz los gramos obtenidos en el clculo de porcentaje del suelo seco.
3.5.- AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y ALMACENAMIENTO DE LEVADURAS
Las cajas petri que presentaron crecimiento visible y diversidad de colonias de levaduras se
escogieron para proceder con el aislamiento y purificacin de las colonias. Con la ayuda de un
palillo estril se tom una pequea cantidad de biomasa de una colonia, para inocularla
mediante estra simple en cajas tetrapetri con agar YM. Los platos fueron incubados a 25 C, por
72 horas. Los cultivos puros fueron repicados en estra compuesta en nuevos platos con agar
YM. Aquellos que luego del perodo de incubacin presentaron caractersticas de cultivo puro,
fueron etiquetados y posteriormente almacenados en glicerol al 20% (w/v) en tubos crioviales a 18C en un congelador, para su preservacin a largo plazo. Adems de esto, se realizaron
suspensiones en agua de llave estril de los cultivos puros para utilizarlos en ensayos
posteriores.

3.6.- CARACTERIZACIN MACROSCPICA DE LEVADURAS


Los cultivos puros obtenidos se agruparon de acuerdo a la coloracin y morfologa de las
colonias. Las caractersticas generales de las colonias se describen de acuerdo a la Tabla 1.

Tabla 1: Caracterizacin Macroscpica

3.7.- CARACTERIZACIN MICROSCPICA DE LOS CULTIVOS DE LEVADURAS


Los cultivos puros de levaduras se utilizaron para preparar muestras que se observaron bajo el
microscopio ptico. Se determin el tamao y forma de la clula. Se tom un portaobjetos y se
lo limpi con alcohol y se coloc una gota de agua destilada. Con un asa estril se tom una
fraccin pequea de la colonia a estudiar y se emulsific en la gota de agua. Cuidadosamente se
coloc el cubreobjetos procurando la ausencia de burbujas o montajes muy densos. Se enfoc la
muestra utilizando objetivo de 100X.

3.8 PRUEBAS FISIOLGICAS DE LAS LEVADURAS AISLADAS


Las levaduras aisladas fueron caracterizadas en funcin de perfiles fisiolgicos y metablicos
que se describen a continuacin.

3.8.1 Rango de crecimiento en funcin de la temperatura


Se inocularon 5 l de suspensiones de levaduras en agua potable estril, previamente
preparadas, sobre la superficie de un plato de Petri con agar YM, los mismos que se incubaron a
4, 10 y 37 C durante 48 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin se observ el crecimiento
de las levaduras y se evalu mediante cdigo binario. Si la levadura present crecimiento, se
asign como 1, en caso contrario, es decir ausencia de crecimiento, 0.

3.8.2 Rango de crecimiento en funcin de la salinidad


Se inocularon 5 l de las suspensiones de levaduras previamente preparadas, sobre la
superficie de agar YM ajustando la concentracin de cloruro de sodio. Se empez con una
concentracin de 0% [w/v], se prosigui con una solucin de cloruro de sodio al 1 y 5%. Si hubo
crecimiento en el plato con concentracin del 5% de NaCl se prosigui a ver si hay crecimiento al
10% de concentracin de NaCl en el medio y en caso de haber crecimiento se inocul al 15% de
concentracin de NaCl en el medio. Las cajas se incubaron a 28C, por 48 horas. Transcurrido
el tiempo, se evalu el crecimiento de las levaduras mediante cdigo binario. Si la levadura
present crecimiento, se asign 1, en caso contrario, es decir ausencia de crecimiento, 0.
3.9 CARACTERIZACIN MOLECULAR DE LEVADURAS
3.9.1 Extraccin de ADN genmico de Levaduras
Se tom la cantidad suficiente de biomasa microbiana con ayuda de un asa de trasferencia para
ser disuelta en 200 ul de buffer 1X-TE, luego se lo llevo a las suspensiones microbianas a
congelacin en un congelador a -20C por 1 hora. Al trascurrir el tiempo se coloc cada
suspensin de biomasa microbiana en un termobloque a 55C, luego fueron agitadas cada 10
minutos en un vrtex, a mxima velocidad por un lapso de 30min, se procedi a centrifugar
durante 3minutos a 14000 rpm. Finalmente fue desechado el sobrenadante de cada muestra.
Despus en el precipitado quedado por cada muestra se coloc 180ul de buffer de digestin y 20
ul de proteinasa K la cual se encargara de degradar a las protenas, luego se llev cada muestra
a incubar en el termobloque a 55C por 45 min, luego se aadi 50 ul ARNasa y 200 ul de Etanol
al 96%. Posteriormente se tom unas columnas las cuales fueron rotuladas con su respectico
cdigo.
Binding
En las columnas se coloc 800ul de las suspensiones microbiana para luego ser llevadas a
centrifugacin por 1 min a 10000rpm, despus se descart el tubo de coleccin para luego
colocar la columna en un tubo limpia con el lavado de ADN posteriormente se aadi 500ul de
buffer para el lavado 1, luego se lo centrifuga a 1min por 10 000rpm. Finalmente se cambi de
tubo por uno nuevo se coloc 500ul de buffer para el lavado 2 para centrifugar por 3min a 14 000
rpm.
Elucin
Se transfiri la columna a un nuevo tubo de centrifuga para aadir 30ul de buffer de elucin,
despus se incubo a temperatura ambiente por 1 min para luego ser llevado a centrifugacin
por 15 min posteriormente se realiz una segunda elucin para finalmente descartar la columna
y lo que quedo en el tubo es el ADN lo cual se utilizar posteriormente y se incubo a -22C.
3.9.2 Electroforesis
Se prepar el buffer TBE 10X y se autoclave. Se realizaron geles de agarosa. Se usa Buffer TBE
0.5X tanto para la preparacin del gel como para la corrida a 100V durante 1hora.

4.- RESULTADOS:
Tabla N1: Informacin geogrfica de las muestras recolectadas
Fruta:
Manzana
Pera
Cdigo:
PIN001
QUE001
Lugar:
San Bartolom de Pinllo Sector Lacn Querochaca
Latitud:
1 13 8 5
1,868282
Longitud:
78 39 2 w
78,607640
Variedad:
Golden Delicious
Pera-Pia
Fuente: GPS
Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
Tabla N2: Determinacin de pH de las muestras
Fruta:
pH1:
pH2:
Ph3:
Prom:

Pera
6,43
6,41
6,40
6,41

Manzana
6,25
6,24
6,23
6,24

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
Tabla N3: Determinacin de la conductividad elctrica de las muestra
Fruta:
Pera
Manzana
CE:
341 S/cm 391 S/cm

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
Tabla N4: Determinacin de Humedad de las muestra
Fruta: Pera Manzana
% H:
79,72 86,25

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
Tabla N5: Determinacin de Materia Orgnica de las muestra
Fruta:
Pera
Manzana
W. muestra Hidratada
3,020g
2,822g
W.muestra deshidratada
0,495g
0,512g
W. crisol vaco
19,7436g 23,6347g
W. crisol+muestra antes de la mufla
20,2347g 24,1089g
W. crisol+muestra despus de la mufla 19,7311g 23,6090g
W. de muestra despus de mufla
0,0125
0,0257
%Materia Orgnica en base seca
97,47%
94,98%

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N6: Conteo de Colonias


FRUTA
PERAPIA

Manzana

DILUCION
103
104
105
103
104
105
103
104
105

MEDIO
YM
Saboraud
YM

# COLONIAS
610
178
Incontable
366
67
38
Incontable
70
12

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N7: Determinacin de UFC/gr


FRUTA:
DILUCION:
MEDIO:
UFC/gr
UFC/gr seco

104
YM
1.602*108
7.899*108

PERA-PIA
104
105
Saboraud
3.420*108
6.03*107
1.686*109
2.973*109

MANZANA
104
YM
6.3*107
4.581*108

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N8: Caracterizacin Microscpicas


Forma de la Celula
CODIGO
LDS001
LDS002
LDS003
LDS004
LDS005
LDS006
LDS007
CDS008
CDS009

DILUCION FRUTA
103
103
104
103
PERA
104
103
103
104
MANZANA
105

LARGO
5
3
3
1
4
2
3
6
5

ANCHO
2
4
1
3
7
4
1
4
4

ESF
0
0
0
0
0
0
0
0
0

ELI
1
1
1
1
1
1
1
1
1

OVI
0
0
0
0
0
0
0
0
0

CIL
0
0
0
0
0
0
0
0
0

FP
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N9: Caracterizacin Macroscpicas


CDIGOS

LDS
001
Crema

LDS
002
Marrn

LDS
003
Marrn

LDS
004
Blanca

LDS
005
Marrn

LDS
006
Blanca

LDS
007
Marrn

CDS
008
Crema

CDS
009
Crema

Circular
Irregular

1
0

1
0

0
1

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

Entero
Ondulado

1
0

1
0

0
1

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

ELEVACIN

Plana
Convexa

0
1

0
1

0
1

0
1

0
1

0
1

0
1

0
1

0
1

SUPERFICIE DE LA
COLONIA

Lisa

Opaca

Traslucida

Viscosa
Membranosa
Butirosa

1
0
0

0
1
0

0
1
0

1
0
0

0
1
0

1
0
0

0
1
0

0
0
1

0
0
1

PIGMENTACION
FORMA

MARGEN

CARACTERIZACIN
PTICA

CONSISTENCIA

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N10: Rango de crecimiento de microorganismos en funcin de la temperatura


Levaduras
LDS001
LDS002
LDS003
LDS004
LDS005
LDS006
LDS007

4C
0
0
0
0
0
0
0

TEMPERATURA
28C 35C Clasificacin
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1
Mesfilo
1
1

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

Tabla N11: Rango de crecimiento de microorganismos en funcin de la concentracin de


NaCl en el medio de cultivo
Levaduras
LDS001
LDS002
LDS003
LDS004
LDS005
LDS006
LDS007

NaCl (%)
1%
1
1
1
1
1
1
1

5%
1
0
0
1
1
1
0

10%
1
0
0
1
1
1
0

15%
1
0
0
1
0
1
0

Clasificacin
Halfilo extremo
Halfilo dbil
Halfilo dbil
Halfilo extremo
Halfilo
Halfilo extremo
Halfilo dbil

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014

5. GRAFICO:

6.- DISCUSION:
El presente trabajo de investigacin se proyect a estudiar la poblacin y diversidad de levaduras asociadas a
frutas como, pera-pia y manzana, localizadas en el cantn Ambato que fueron recolectadas en los sectores
de Lacn ubicado en la parroquia de San Bartolom de Pinllo y Querochaca. Se obtuvieron un total de 9
levaduras con caractersticas morfolgicas casi similares 7 de pera-pia y 2 de manzana
En la investigacin se emplea frutas con alto contenido de azcar como es el caso de la manzana el 12.2% y
la pera pia el 10%, los cuales permiten que el proceso de fermentacin de azucares ocurra con eficiencia
para la produccin de alcohol siendo un factor importancia en la industrial de las levaduras.

CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA
En la determinacin de los diferentes parmetro fsico qumicos evaluados a las frutas como mora, fresa,
pera-uvilla, membrillo, pera-pia y manzana presenta una similitud bibliogrficamente, al determinar su pH
indica que es acido en manzana 6.24 y pera-pia 6.41, al comparar el pH con mora, pera-uvilla y membrillo
indica un pH que oscila entre 6.1 - 6.5, mientras que en fresa presenta mayor acidez con pH 3, al determinar
el % de humedad la manzana 86 % y en pera-pia 80%, al ser comparado con el resto de frutas oscila entre
68-88% lo cual indica un alto contenido de agua en la composicin de cada fruta. Finalmente el contenido de
materia orgnica presente en pera-pia y manzana es del 18% y de igual forma el resto de frutas va desde
12-18%, tomando en cuenta que en fresa recolectada en Huachi La Magdalena posee mayor cantidad de
materia orgnica con el 31% .
DETERMINACIN DE LA POBLACIN Y DIVERSIDAD DE LEVADURAS
El aislamiento se realiz por el mtodo de difusin en placa y diluciones seriadas 104 y 105 para determinar la
poblacin y diversidad de levaduras en medios de cultivos selectivos como es el Saboraud y YM a los cuales
se aadi inhibidores sulfato de estreptomicina, a una concentracin de 10 g/ml, y rifampicina a una
concentracin de 50 g/ml para evitar el crecimiento de bacterias y solo permita el crecimiento de levaduras,
se encontr diferencias en los dos medios en cuanto al nmero de colonias y por consiguiente ufc/g seco. En
mora, fresa, pera-pia y manzana el medio YM resulto muy eficiente ya que se encontr mayor nmero de
colonias en comparacin al medio Saboraud, pudo ser por el nmero de fuentes nutritivas como glucosa
fuente de energa, peptona y el extracto de levadura fuente de nitrgeno. El extracto de malta debido a su
elevado contenido en diversos carbohidratos, sobre todo en maltosa y glucosa es la base para el crecimiento
de levaduras, siendo muy favorable para su crecimiento. Mientras que el medio Saboraud fue factible para
pera-uvilla y membrillo, presento mayor nmero de colonias en comparacin con el medio YM, tomando en
cuenta que la gran mayora de las levaduras son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento
entre 24 y 48C, pero que responden mejor a temperaturas menores a 30C por lo que se incubo a 28C
asegurando as un ptimo crecimiento por otro lado el pH adecuado es acido que va entre 4.5 y 6.5
permitiendo as el crecimiento, cabe recalcar que de igual forma el medio de cultivo presenta un pH acido de
5.5-6.0, ajustndose as al pH de las muestras fermentadas como manzana 6.24 y pera-pia 6,41, llegando a
la conclusin que el pH de crecimiento , su fuente de nutricin y la fruta fermentada se encuentran en medio
acido lo cual garantiza buenas condiciones apropiadas para crecimiento de levadura.
El recuento obtenido dentro del rango de 30 300 colonias las unidades formadoras de colonias por gramo
de muestra seca (ufc/g) en medio YM mostraron valores altos en fresa AJC 8.76 *109 ufc/g y AJP 6.66*109
ufc/g con una diferencia altamente significativa seguida la mora con 7.99*109 ufc/g HB, membrillo 4.589*109
ufc/g en Querochaca, se encontraron mayor nmero de colonias resultando favorable, este tipo de frutas tal

vez se hallaron muy maduras las cuales facilito el proceso de fermentacin, partiendo de esta informacin se
podra dar paso una investigacin a fondo con el fin de encontrar especies nuevas que se aplique industrial,
mientras que en manzana su valor es menor en comparacin al resto de frutas 4.581*108 ufc/g. En medio
saboraud resulto favorable para pera-uvilla con 7.74*109 ufc/g en Huachi San Jos y seguido mora PT
2.21*109 ufc/g, pera-pia 2.973*109 ufc/g existe diferencia, puede deberse a varios factores como su proceso
de fermentacin no se dio completamente o lento.
AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y ALMACENAMIENTO DE LEVADURAS
Se obtuvieron 2 levaduras aisladas de manzana proveniente del sector Lacn ubicado en la parroquia San
Bartolom de Pinllo correspondientes a los cdigos CSD008, CSD009. Los arboles de las cuales se tomaron
las muestras eran pequeas, frondosas y produccin normal, adems se encontr 7 levaduras aisladas de
perapia proveniente de Querochaca correspondientes a los cdigos LSD001, LSD002, LDS003, LSD004,
LDS004, LDS005, LDS005, LDS006, LDS007. Las arboles de donde se tomaron las muestras eran frondosas,
altas y cargadas.
En fresa se encontraron 15 levadura las cuales 8 provienen de Tisaleo y 7 de Huachi, mientras que en perauvilla se hall 5 levaduras provenientes de Huachi San Jos y membrillo 5 levaduras proveniente de
Querochaca, en mora 28 levaduras 15 provenientes del Casero Galpn Patate y 13 de Huachi Beln,
indicando mayor diversidad de levadura debido a su alto contenido de azcares fermentables.

CARACTERIZACIN MACROSCPICA
En la caracterizacin macroscpica de los cultivos aislados de levaduras a partir de frutas con alto contenido
de azucares. Fueron evaluados parmetros como margen de las colonias aisladas, obteniendo resultados
predominantes de margen entero un 83% se encuentra en fresa, mora, membrillo, pera-pia, manzana y el
17% presenta un margen ondulado en pera-pia. El 83 % de los aislados present la superficie de colonia lisa
en fresa, mora, pera-uvilla, pera-pia y manzana, mientras que 17% presenta la superficie de colonia rugosa
en membrillo.
Un 33% de las colonias aisladas presentaron brillo en pera-uvilla, y membrillo, mientras que el 67% de las
colonias fueron opacas presentes en manzana, pera-uvilla, mora, fresa y el 17% es translucida presente en
pera-pia. La textura predominante es butirosa con un 67% en manzana, pera-uvilla, mora, fresa mientras el
17% present una textura membranosa por parte de pera-pia y viscosa por el membrillo. El 33% de las
levaduras aisladas presentaron colonias de color blanco por parte de la mora, pera-uvilla, adems
presentaron color crema con el 33% por la manzana, fresa y tan slo un 17% de aislados present un color
de colonia blanco metlico por el membrillo y marrn en la pera-pia. Por ltimo, solamente presentaron
pigmento difusible de color rosa en el medio de cultivo las levaduras en fresa, mora y naranja en el medio de
cultivo las levaduras de y pera-uvilla.

CARACTERIZACIN MICROSCPICA
En la caracterizacin microscpica de los cultivos aislados de levaduras a partir de fresa, mora, pera-uvilla,
membrillo, pera-pia y manzana fueron evaluadas con ayuda del microscopio ptico, la diversidad de
morfologa celular siendo evidente la forma celular elipsoidal como predominante en 12 aisladas de fresa, (24
aisladas)mora, (4 aisladas) pera-uvilla, (7 aisladas)pera-pia, (2 aisladas)manzana corresponde al 87%,
seguida de la forma ovoide en 4 aisladas de membrillo correspondiente al 17%. Adems se midieron las
clulas obteniendo un rango que oscila entre 1 - 7 m de dimetro.

7.- CONCLUSIONES:

Se determin la poblacin y diversidad de levaduras presentes en frutas procedentes de dos


puntos de la provincia de Tungurahua, pertenecientes a San Bartolom de Pinllo y
Querochaca.

Se caracteriz tanto macroscpica como microscpicamente

las diferentes levaduras

presentes en manzana y pera pia, identificando as la morfologa, tamao y consistencia


de cada colonia aislada.

Al obtener levaduras aisladas se calcul las unidades formadoras de colonias por gramo
de Fruta seca (ufc/g), siendo la de mayor formacin la pera pia con mayor diversidad.

8.- BIBIOGRAFIA:
RODRIGUEZ ESTHER, 2007.Anlisis Genmico y Molecular de Levaduras Vnicas. Aplicacin a la
Mejora del Proceso de Fermentacin de Vinos mediante Seleccin de Levaduras Autctonas, CadizEspaa, 27-39.
CARRILLO Leonor. 2003. Los Hongos de los alimentos y forrajes. Universidad Nacional de Salta.
Garca, Vera, Cortez, 2004 Introduccin a la microbiologa, Editorial EUNED, Segunda edicin,
costa rica, 116-120 (Jhon L, 1999).
JOHN L., CATHERINE A., 1998, Introduccin a la microbiologia volume2 , Editorial reverte,
Edicin ilustrada,p 735.
9.- ANEXOS:
9.1 Receta de los medios de Cultivo
Anexo 1: MEDIO SABORAUD
Reactivos Cantidades
Peptona
10g
Glucosa
40g
Agar
15g
Agua
1000mL
pH
5

Anexo 2: MEDIO YM
Reactivos
Extracto de levadura
Extracto de Maltosa
Peptona
Glucosa
Agar
Agua
pH

Cantidades
0.3% p/v
0.3% p/v
0.5% p/v
1% p/v
2% p/v
1000mL
5

8.2 Caracterizacin Macroscpica


LDS 001

LDS 002

LDS 003

LDS 004

LDS 005

LDS 006

Fuente: Laboratorio de Biologa Molecular de la FCIAL


Elaborado por: Aguirre S., Muso E., Manjarrez I., Villarroel D., Jcome J. 2014
9.3 Coordenadas del muestreo
Grfico N 7: Coordenadas de recoleccin de Manzana

Grfico N 8: Coordenadas de recoleccin de Pera-Pia