UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131

GUA N 5:
ORGANIZACIN SUBCELULAR

INTRODUCCIN
Las clulas aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de aos, probablemente debido a la
agregacin espontnea de molculas. Las primeras clulas eran relativamente simples y
pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes.
Luego aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja,
que hoy forman parte de animales y plantas.
Por definicin y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un
ncleo que contiene la mayora del ADN envuelto en una membrana. Esto deja al material
gentico en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la clula o
citoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas.
En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo
endoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula.

Fig. 1: Clula Eucarionte animal

Fig. 2: Clula Eucarionte Vegetal

El Ncleo (Fig.3) es el organelo ms grande de la clula y est separado del citoplasma por
una envoltura nuclear compuesta por dos membranas; estas membranas aparecen
perforadas por poros, a travs de los cuales se comunica con el citosol. El ncleo contiene
todo el ADN cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su
asociacin con protenas denominadas histonas.

Fig. 3: Ncleo.

La Membrana Plasmtica (Fig.4) es la envoltura externa de la clula. Corresponde a una

bicapa continua de fosfolpidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas
protenas integrales y perifricas. Algunas de estas protenas sirven como bombas y canales
para el transporte de molculas hacia el interior de la clula, as como hacia el exterior de
ella.

Fig. 4: Membrana plasmtica.

Las Mitocondrias (Fig.5) son muy similares a las bacterias tanto en tamao como en forma.
Poseen dos membranas una externa y otra interna, que dan lugar a dos compartimentos, el
espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Las Mitocondrias contienen su propio
ADN, sintetizan protenas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por lo que se cree que
proviene de la simbiosis de una clula eucarionte primitivo con un organismo procarionte.
Este organelo es responsable de los procesos de respiracin celular y produccin de
energa.

Fig. 5: Mitocondria.

Los Cloroplastos (Fig.6), al igual que las mitocondrias, contienen su propio de ADN y
tambin tendran un origen simbitico. Se encuentran slo en los organismos capaces de
realizar la fotosntesis, como las algas verde-azules y las plantas.
Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y estn rodeados de una
membrana doble. Los cloroplastos estn compuestos por la envoltura, estroma y los
tilacoides.

Fig. 6: Cloroplasto.
El Retculo Endoplsmico (R.E.) (Fig.7) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas
que se extienden a travs del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la clula. La
membrana del Retculo endoplsmico es una continuacin de la membrana nuclear. Se
especializa en la sntesis de lpidos y protenas de membrana, as como tambin de
materiales que estn destinados a ser exportados de la clula. El Retculo endoplsmico
rugoso (R.E.R.) est asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se
encargan de la sntesis de protenas. El Retculo endoplsmico liso (R.E.L.) est constituido
por un sistema laberntico de tbulos irregulares, ramificados que no contienen ribosomas y
se encarga del metabolismo de lpidos.

Fig. 7: Esquema del retculo endoplsmico y microfotografa.

El Aparato de Golgi o Dictiosomas (Fig.8) est constituido por cisternas discoidales

aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoproteicas. Se encarga de
la modificacin, destinacin, y empaquetamiento de macromolculas de secrecin o que
estn destinadas a otros organelos. Alrededor de l se encuentran numerosas vesculas
pequeas que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes
compartimentos de la clula.

Fig. 8: Aparato de Golgi.

Los Lisosomas son vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas requeridas
para la digestin de molculas al interior de la clula. De este modo, estas enzimas se
mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradacin de
molculas como protenas y cidos nucleicos.
Los Peroxisomas tambin corresponden a vesculas. En ellas se produce perxido de
hidrgeno (H2O2) durante la oxidacin por el oxgeno de varios tipos de molculas. Esta
sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada del
resto de los componentes de la clula.
Los Ribosomas (Fig.9) son grandes complejos de ARN y protenas. Se componen de una
subunidad mayor y una subunidad menor que se ensamblan para formar un complejo que se
encarga de llevar a cabo el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. Los ribosomas
procariontes y eucariontes son muy similares y pueden encontrarse tanto libres en el
citoplasma como unidos a membranas formando parte del retculo endoplsmico rugoso.

Fig. 9: Esquema del retculo endoplsmico con ribosomas y microfotografa.

El Citoesqueleto est constituido por filamentos de protenas que forman un enrejado en el

citoplasma. Esta red de filamentos est formada por los microtbulos, filamentos de actina
y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la clula su forma y provee la base de sus
movimientos. Generalmente se organiza desde una regin cercana al ncleo donde se
encuentran los centrolos y desde ah se extiende al resto de la clula.
Aunque tcnicas avanzadas como la Microscopa Electrnica permiten una visualizacin
detallada de la estructura de la clula, esto no es suficiente para definir la funcin de sus
componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la clula para
realizar estudios bioqumicos que permitan determinar la funcin exacta de cada uno de
ellos.
Objetivo General del laboratorio.
Comprender el fundamento de la tcnica de fraccionamiento subcelular por medio del
rompimiento de la clula y la separacin de los organelos mediante un campo gravitacional.

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen, con las tcnicas
adecuadas la clula puede separarse en los diferentes organelos y macromolculas que la
componen. Una de las tcnicas ms utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento
Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y
con alto grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y
Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separacin de los componentes de la
clula basndose en su tamao y densidad.
El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenizacin de
la muestra. Esto se logra a travs de diferentes procedimientos como sonicacin
(exposicin a sonidos de alta frecuencia), shock osmtico, o simplemente moliendo las
clulas en homogenizadores mecnicos.
En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la clula, incluyendo la membrana
plasmtica y el retculo endoplsmico, las que quedan formando pequeos fragmentos o
vesculas que dan origen a la fraccin microsomal. El resto de los componentes celulares
(ncleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas)
permanecen intactos. Las partculas y vesculas as obtenidas conservan la mayor parte de
sus propiedades bioqumicas originales y permiten el estudio de la funcin de cada
organelo celular por separado.
La suspensin de clulas rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u
homogenizado y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a
travs de una serie de etapas sucesivas de centrifugacin en las que los componentes de la
clula se separan en un campo gravitatorio.

Si dos componentes de distinta masa e igual tamao y forma estn en un mismo medio, el
cuerpo de mayor masa sedimentar (se ir al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor
Peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto si la
fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentacin tambin aumentar.
Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrfugas (Fig.10). Estos instrumentos
consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes
velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor.
Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras
palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la
velocidad de rotacin.
Al trmino de una centrifugacin se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del
tubo se obtiene un sedimento o pellet y sobre l una parte lquida llamada sobrenadante.

Fig. 10: Esquema de una centrfuga.

Generalmente, la primera etapa de separacin consiste en una centrifugacin a baja
velocidad a la cual sedimentan slo las clulas que permanecen enteras y las partculas
subcelulares ms grandes, los ncleos. As, el primer pellet obtenido corresponde a una
fraccin enriquecida en ncleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes
celulares en suspensin.
El sobrenadante se somete a una segunda centrifugacin que se realiza a velocidades
intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El
nuevo sobrenadante se re-centrifuga a alta velocidad obtenindose un pellet enriquecido en
membrana plasmtica y retculo endoplsmico (fraccin microsomal). Una ltima
centrifugacin del sobrenadante anterior a velocidades an mayores permite sedimentar
finalmente los ribosomas, dejando en el sobrenadante slo la porcin soluble del
citoplasma, el citosol.

Fig. 11. Esquema de un fraccionamiento subcelular tpico.

Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas,
pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de
centrifugacin en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con
soluciones de sacarosa, polmeros o protena. Permiten realizar el proceso de separacin en
gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayor grado de pureza.
Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evala mediante el anlisis de la
forma en que se distribuyen algunos componentes celulares, de localizacin subcelular
conocida en las diferentes fracciones obtenidas. Estas molculas son llamadas marcadores
de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el ADN es un marcador de la presencia de
ncleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de
mitocondrias, y el proceso de fotosntesis indica la presencia de cloroplastos. De este modo,
el anlisis de la distribucin de los diferentes marcadores en todas las fracciones
subcelulares obtenidas permite conocer la distribucin y pureza relativa de los distintos
organelos, y el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fraccin.
La obtencin de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma
relativamente especfica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos
particulares, aislndolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se
puede estudiar la sntesis de protenas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el
transporte de sustancias a travs de la membrana plasmtica, la fotosntesis en cloroplastos,
el procesamiento de glicoprotenas en el aparato de Golgi, etc.

ACTIVIDADES PRCTICAS
ACTIVIDAD N 1: Fraccionamiento subcelular
A) Fraccionamiento Subcelular de Hgado:
El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u
homogeneizacin y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal.
El fraccionamiento o separacin de los distintos componentes celulares se realiza mediante
una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un
campo gravitacional dependiendo de su masa y tamao.
Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que
corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante que corresponde a la fraccin
lquida que permanece sobre el material sedimentado.
Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, stos se
resuspenden y se guardan para el resto de los anlisis bioqumicos, mientras que los
sobrenadantes se vuelven a centrifugar.
La etapa de ruptura y homogeneizacin de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a
fraccionar y una cantidad adecuada de solucin tampn, la que deja los organelos en
suspensin y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un
homogeneizador. Todo el proceso se realiza adems en fro (4C) para evitar una posible
degradacin de las estructuras celulares y as conservar intactas la mayor parte de las
caractersticas funcionales originales del organelo que se pretende aislar.
Procedimientos y observaciones
Sus profesores prepararn un homogenizado filtrado, el cual se obtendr de la siguiente
manera:
A.1. Preparacin y fraccionamiento de la muestra.

Muestra: hgado de pollo, lavado en tampn o buffer IBc, fro un par de veces para
eliminar restos de sangre
Pre picar el hgado con bistur y lavar en buffer al menos tres veces cada 10 min en
hielo.
Homogenizar el tejido unas tres veces en al menos 10 veces su volumen en buffer
IBc.
Mantener este Homogenizado Total (HT) en hielo y repartir un volumen de 10 mL
a cada grupo de trabajo.
Cada grupo filtrar su muestra de HT a travs de gasa en un embudo de vidrio.
Recibir en un tubo Falcon de 15 ml y mantener en hielo.

Se obtiene as el Homogenizado Crudo (HC). Guardar al menos 1 ml en tubo

eppedenof de 2 mL para posterior anlisis
Centrifugar el HC a 600xg por 10 min, (3000 o 5000 rpm x 5min) se obtiene un
pellet (P1) y un sobranadante (SN1)
Transferir cuidadosamente el SN1 sin perturbar el pellet a un nuevo tuvo Falcon de
15 mL.
Agregue 1 mL de Buffer IBc a P1 y resuspndalo cuidadosamente. Mantener P1
en hielo para posterior anlisis
Transferir 2 mL de SN1 a tubos de centrifuga eppendorf de 2 mL (usar 2 tubos por
grupo)
Centrifugar a mxima velocidad en microcentrifuga (13 mil rpm) por 10 min
Colectar cuidadosamente el sobrenadante (SN2) con micropipeta de 1 mL y
traspasar a un tubo Falcn de 15 mL.
El pellet obtenido (P2) resuspndalo en 500 ul de buffer IBc y djelo en un solo
tubo en hielo

Recordar:
A 4C se minimiza la activacin de dao generado por fosfolipasas y proteasas.
El radio ptimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10
(peso:volumen)
Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5 minutos antes de iniciar el
procedimiento.
Marcar adecuadamente los tubos eppendorf para no confundir las muestras
Este proceso se puede resumir en el siguiente esquema de trabajo:
HIGADO DE POLLO
Lavado en buffer
Picado del tejido
Ruptura tisular y celular
HOMOGENIZADO
TOTAL
Filtrado en gasa
HOMOGENIZADO
CRUDO
Centrifugacin
600xg 10 min
PELLET
(FRACCION NUCLEAR)
P1

SOBRENADANTE
(SN1)

Centrifugacin
15000xg 5 min
PELLET
(FRACCION MITOCONDRIAL)
P2
SOBRENADANTE
(SN2)

A.2. Evaluacin del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares.

Cada organelo contiene enzimas o molculas que lo caracterizan, las que no
se encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos.
El DNA es la molcula marcadora de ncleos. Esta macromolcula puede ser identificada
mediante colorantes bsicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul
de tripn, azul de toluidina y azul B.
Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato
deshidrogenada (SDH) que cataliza la deshidrogenacin estreo especfica de
Succinato a Fumarato durante el ciclo de Krebs, segn la siguiente reaccin:
SDH
Succinato --------------> Fumarato + 2 H+ + 2 eLos protones y electrones liberados permiten seguir la reaccin a travs de la decoloracin
del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin
embargo, el azul de metileno reducido puede fcilmente ser oxidado por el oxgeno
del aire, y recobrar su coloracin azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de
reaccin con aceite mineral o vaselina lquida, lo que permite realizar la reaccin en
ausencia de oxgeno.

Procedimientos y observaciones
A.2.1. Deteccin de mitocondrias a travs de reaccin de SDH en las fracciones.
Esto se realizar segn esquema adjunto
Tubo
N

Succinato
0,1 M

Azul
Metileno

Agua

Muestra

Muestra

Reaccin

volumen

nombre

(+) (-)

Control

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

HC

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

P1

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

SN1

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

P2

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

SN2

400 uL

100 uL

400 uL

400 uL

Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 200 uL de aceite
mineral o vaselina lquida.

Coloque los tubos en un bao termorregulado a 37 C y observe si ocurre

decoloracin en algunos de los tubos (5-10 min).

A.2.2. Observacin microscpica de las fracciones

En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensin de ncleos

P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo.
Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparacin al microscopio
usando para ello el objetivo de 40X.
Agregue el azul de tripn y vuelva a observar su preparacin de ncleos. Qu
observa?
Repita el proceso con la fraccin enriquecida en mitocondrias P2. Coloque una
gota de la muestra en un portaobjetos, coloque sobre ella un cubreobjetos,
realice la tincin con azul de tripn y observe al microscopio usando el objetivo
de 40X. Qu ocurre?

ACTIVIDAD N 2: Observacin de un corte de hgado de Rattus norvegicus

(Berkenhout) utilizando el objetivo de inmersin.
El poder de resolucin de un microscopio depende tambin de la apertura numrica,
capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen.
sta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con
ndice de refraccin mayor al del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersin.
Procedimientos y observaciones
Basndose en sus conocimientos de microscopa, observe la muestra de hgado de
rata utilizando los objetivos de 4, 10 y 40X.
Enfoque la zona que desea observar con el objetivo seco de aumento mayor (40X).
Sin bajar la platina ni cambiar la preparacin de posicin, gire el revlver
portaobjetivos de modo que quede en una posicin intermedia entre el objetivo
mayor seco y el de inmersin. El objetivo de inmersin corresponde al aumento de
100X y tiene una inscripcin que dice oil.
Deposite cuidadosamente sobre el cubreobjetos de su preparacin una gota de aceite
de inmersin. Tenga cuidado de no manchar con aceite su microscopio. El aceite de
inmersin NO deber ser utilizado en los otros objetivos, por lo tanto, una vez que se
ha colocado el aceite NO deber cambiar de objetivo sin antes limpiar
cuidadosamente el aceite usando para eso un trozo de papel absorbente especial
embebido en xilol.
Lleve el objetivo de inmersin al eje ptico y enfoque utilizando para ello el
TORNILLO MICROMTRICO. El objetivo de inmersin DEBE quedar
inmerso en el aceite.
Una vez finalizado su trabajo retire la preparacin y limpie muy bien su
microscopio con xilol de manera que no queden en l restos de aceite. Recuerde
limpiar tambin su preparacin.

BIBLIOGRAFIA
Biologa Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresin, 1998,
Ed. El Ateneo, Bs. Aires.
Biologa Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4 Edicin, Ed. Panamericana.
Elementos de Biologa Celular y Gentica. Parte 2: Estructura y Funcin Celulares.
Mtodos de Estudio en Biologa Celular. Fraccionamiento Subcelular. Lpez, R.
1 ed., 1985, Departamento de Biologa Celular y Gentica, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile.
Molecular Biology of de Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson. 3ra ed.,
1994, Garland Publishing Inc. , New York & London.
The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press, Washington,
U.S.A.
Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured
filroblasts. Christian Frezza, Sara Cipolat & Luca Scorrano. NATURE PROTOCOLS VOL.2
NO.2. 2007.

Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular

1. Para el homogenizado
Higado de pollo
Pinzas.
Bistur.
Tijeras.
Homogenizador.
Embudo.
Gasa.
Centrifuga.
Hielo.
Buffer IBc
2. Para el laboratorio ( p/g = por grupo de 3 alumnos)
3 Microscopios.
Corte de hgado de rata
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 Lpiz rotulador

Centrifuga.
Bao termorregulador.
Hielo
2 gotarios. (p/g)
8 tubos de ensayo (p/g).
Gradilla para tubos de eppdenf
micropipetas 1000 ul
micropipetas 200 uL
1 baso precipitado de 50 ml (p/g).
Azul de Metileno diluido 50 veces del stock.
Succinato 0.1 M.
H2O destilada. (picetas).
Azul de tripan.
Aceite mineral o vaselina.
Tubos Falcon 15 mL para centrifuga (5 p/g)
tubos eppdendorf 2 mL (5 p/g)
Tubos eppdendorf 1.5 mL (5 p/g)
Puntas de pipeta para 1 mL
Puntas pipeta 200 uL

Buffer IBc:
Buffer para el aislamiento de clulas y mitocondrias de hgado de ratn:
Para 100 ml de IBc:
10 ml de Tris-MOPS 0,1 M
1 ml de EGTA/Tris
20 ml de sucrosa 1 M
Aforar a 100 ml con agua destilada
Ajustar pH a 7,4
Tris-MOPS 0,1 M: disolver 12,1 g de Tris en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4
utilizando MOPS en polvo (4-Morpholinepropanesulfonic acid). Llevar la solucin a 1 litro y
guardar a 4 C.
EGTA/Tris 0,1 M: disolver 38,1 g de EGTA (Ethylene -bis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid) en
500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 utilizando Tris en polvo. Llevar la solucin a 1 litro y
guardar a 4 C.
Sucrosa 1 M: disolver 342,3 g de sucrosa en un litro de agua destilada, mezclar bien y almacenar a
-20 C.