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BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

GUIA DE LABORATORIO

PRCTICA N05:
1.- TITULO:

2.- INTRODUCCION:
Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un
lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas
(proliferacin de la poblacin).
En lo que se refiere al crecimiento de clulas individuales, este consiste en el aumento
del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular.
Las bacterias se dividen por fisin binaria, a travs de la una cual clula madre al
alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas.

3.- OBJETIVOS:
Estudiar la curva de crecimiento de bacterias lcticas y al mismo tiempo construir la
curva de sntesis de cido lctico.
Comparar los resultados de una cepa con fecha de vencimiento vencida con una de
fecha no vencida.

4.- FUNDAMENTO TEORICO:


En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las
estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Segn ello, el aumento de la
masa celular producido por acumulacin de productos de reserva (glucgeno, polihidroxibutirato) no constituyen crecimiento.
Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un
lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas
(proliferacin de la poblacin). En lo que se refiere al crecimiento de clulas
individuales, este consiste en el aumento del tamao y peso de las clulas que precede
a la divisin celular. Esta divisin trae aparejada un aumento en el nmero de clulas
(proliferacin de la poblacin).
Las bacterias se dividen por fisin binaria, a travs de la una cual clula madre al
alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas. El proceso de fisin
binaria consiste en la autoduplicacin del material hereditario seguido de la reparticin
en las dos clulas hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana
celular y formacin de la pared celular

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Basado en el concepto que una clula se divide dando dos clulas hijas, y stas a su
vez se vuelven a dividir dando dos clulas cada una de ellas, se presenta en el
siguiente cuadro la proliferacin de una poblacin de clulas a partir de una sola, con un
tiempo de generacin de 30 minutos

Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el nmero de clulas


(ordenadas) se obtiene una grfica como la que se muestra en el siguiente esquema:

Como se observa en la grfica la curva aumenta su pendiente. Frecuentemente es til


transformar los datos de nmero de clulas a su logaritmo decimal ( graficar el nmero
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de clulas versus el tiempo transcurrido en una grfica semilogartmica). Se obtiene as
una grfica en la que la relacin es lineal.

Se conoce como tiempo de duplicacin generacional al tiempo en que tarda una


poblacin en duplicar su nmero. sta ltima grfica permite fcilmente encontrar el
tiempo de duplicacin para la poblacin estudiada. Es frecuente que a partir de
mediciones de crecimiento a intervalos conocidos y graficando estos datos se calcule el
tiempo de duplicacin de una poblacin. Los tiempos de duplicacin varan segn el
microorganismo del que se trate. Por ejemplo:
Escherichacoli0,35 hs
Rhizobiummeliloti1,8 hs
Nitrobacterspaproximadamente 20 hs
El estudio grfico del crecimiento es muy til, pero a veces es conveniente conocer la
expresin matemtica que representa este crecimiento exponencial

Ciclo normal del crecimiento.


Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial
prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estara tapada de una masa
microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento est normalmente limitado
por el agotamiento de nutrientes o por la acumulacin de productos del mismo
metabolismo microbiano, que les son txicos a la poblacin. La consecuencia es que el
crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. En la figura 4
se presenta la grfica de una curva tpica de crecimiento bacteriana. Como se puede
observar, en la grfica se ha relacionado el tiempo transcurrido con el logaritmo del
nmero de clulas bacterianas. Cuando se realiza este tipo de grficas se obtiene una
lnea recta, sin embargo en esta slo un sector (fase exponencial) corresponde a una
recta.
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Es posible distinguir cuatro fases:
1) fase de latencia o de retardo
2) fase exponencial
3) fase estacionaria
4) fase de muerte
En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las clulas sintetizan las
enzimas necesarias para la actividad metablica que deben llevar adelante. Cuando se
hacen mediciones del nmero de clulas en distintos tiempos dentro de esta fase, el
valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las clulas trabajan
activamente adaptando el equipo enzimtico al medio de cultivo. La bacteria se prepara
para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de
adaptacin al medio, con aumento de la masa celular pero no del nmero de clulas. La
edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la
acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la
clula durante el crecimiento anterior. En general, inculos viejos alargan la fase de
latencia.

Pasado este perodo, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento


exponencial, donde la velocidad de crecimiento es mxima.La velocidad de crecimiento
que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismoque se trate y diversos
factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenacin,etc.La velocidad de
crecimiento comenzar a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la fase
estacionaria, ya que cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entreel
cultivo del inculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin dela
actividad enzimtica.Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algn
nutriente esencial o poracumulacin de productos metablicos que sean txicos.
Tambin puede ser por ladisminucin de la oxigenacin o cambios en las condiciones
de pH del medio de cultivo(acidificacin o alcalinizacin):En esta fase se equilibran el
nmero de clulas nuevas con el nmero de clulas quemueren.Por ltimo, el cultivo
entra en la fase de muerte, en la que el nmero de clulas quemueren se va haciendo
mayor. La pendiente de esta fase puede ser ms o menos pronunciada de acuerdo al
tipo de microorganismo de que se trate. Suelen presentarse pendientes menos bruscas
cuando el microorganismo presenta alguna forma de resistencia (esporas, glicocalix).

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Factores fsicos y qumicos que influyen en el crecimiento bacteriano.


Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la
temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la
cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la
temperatura ptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta temperatura
ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
El aumento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento
generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se
denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad
de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones
bioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la
que tienen lugar. La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a la reduccin de
la velocidad de las reacciones bioqumicas y al cambio de estado de los lpidos de la
membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento
de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la
desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones producidas en las membranas
lipdicas a esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es
lento y las clulas paran de crecer; aunque suelen morir. Sin embargo, cuando la
temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente y las
clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la
temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro. Hay varios tipos de
microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima, mxima y
ptima.
Tipo
de
microorganismo

Temperatura
mnima

Temperatura
ptima

Temperatura
Mxima

Mesfilo
Psicrfilo
Psicrtrofo
Termfilo

5 - 15
-5 + 5
-5 + 5
40 45

30 - 45
12 - 15
25 - 30
55 - 75

35 47
15 20
30 35
60 90

Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas


bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es
importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran
contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeracin (4 8C) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 C).
Desde el punto de vista clnico, los microorganismos capaces de producir infecciones
en pacientes son los mesfilos y algunos psicrtrofos ya que sus temperaturas ptimas
de crecimiento coinciden con las corporales.
FORMULACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN

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La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa


fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los componentes de
los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean
un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del
crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes
categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por
litro.
c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes
orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin
metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en:
Medios sintticos o medios qumicamente definidos.
Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.
que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son
qumicamente indefinidas y de composicin variable
CRECIMIENTO Y SNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.
Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un
metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del
microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca del
final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase estacionaria del
crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un metabolito secundario se
ilustran en la imagen de la izquierda.
Metabolitos primarios microbianos.
Un proceso microbiano tpico, en el que el producto se forma durante la fase primaria del
crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentacin*. El etanol es un producto
del metabolismo anxico de la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte
del metabolismo de la energa. Debido a que el crecimiento slo puede tener lugar si
puede producirse energa, la formacin de etanol tiene lugar en paralelo con el
crecimiento.

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Metabolitos secundarios microbianos.


Un tipo ms complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado
no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria.
Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos
secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes y ms importantes de
inters industrial. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas
las clulas, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y
otro. Las caractersticas reconocidas del metabolismo secundario son:
-

Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos organismos.


Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y
la reproduccin.
Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de
estructuras estrechamente relacionadas.
Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproduccin de metabolitos
secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como estn al
metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan
espectacular.

5.- MATERIALES, METODOS Y PROCEDIMIENTOS


MATERIALES.
-

01 vaso de precipitado de 1 lt estril.


Pipetas de 10, 5, 2 ,1 ml
Placas petri
Tubos de ensayo
Cepas de lactobacillus
Agar rogosa
Equipo para incubacin anaerbica,
Equipo para determinacin de acidez titulable

PROCEDIMIENTOS:
1. Sembrar la leche con lactobacillus.

2. Verter leche (aproximadamente 1Lt) en un vaso de precipitado de 1000ml.

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3.

Luego en un matraz con 50ml de leche inocular el cultivo lctico BIFLORA (decima
parte), agitar y verter al vaso de precipitado con 1Lt de leche. Agitar con una varilla
de vidrio.

4. Preparar los tubos de ensayo para las diluciones.

5. En 36 tubos de ensayo previamente rotulados echar 9 ml de agua peptonada (solo


en el tubo 10-1 agregar 0.5ml de leche con el cultivo lctico). Realizar las diluciones
hasta 10-4 para cada tiempo.

6. Incubar a 43 C.

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7. Controlar el proceso de fermentacin realizar las siembras y titulaciones necesarias.
8. Utilizar una cepa con fecha de vencimiento recientemente vencida. Comparar con
los resultados anteriores. Graficar los resultados vs. Tiempo.

6.- CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION:

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TABLA N01: RESULTADOS DE CEPAS CON FECHA DE VENCIMIENTO NO


VENCIDA (2013)

Hora de
anlisis

Tiempo min

D(acidez)

Recuento de Bacterias
lcticas

Ufc/ml
4

9:05

18

1 x 10

9:40

35

18.5

0 x 10

10:20

40

20

1 x 10

11:00

40

32

4 x 10

11:40

40

50

6 x 10

12:20

40

64

17 x 10

13:00

40

72

34 x 10

13:50

50

78

68 x 10

14:20

30

80

75 x 10

4
4
4
4

TABLA N02: RESULTADOS DE CEPAS CON FECHA DE VENCIMIENTO

NO

VENCIDA (2013)

Hora de
anlisis

1
2
3
4
5
6
7
8
9

9:05
9:40
10:20
11:00
11:40
12:20
13:00
13:50
14:20

Tiempo
min
0
35
40
40
40
40
40
50
30

Tiempo
( )
min
0
35
75
115
155
195
235
285
315

D
(acidez)
18
18.5
20
32
50
64
72
78
80

Recuento de
Bacterias lcticas
Ufc/ml
1 x 104
0 x 104
1 x 104
4 x 104
6 x 104
17 x 104
34 x 104
68 x 104
75 x 104

Log
X
4
4.60
4.78
5.23
5.53
5.83
5.87

No se consideraran las placas N1 y N2 en los siguientes grficos debido a que


no se control la temperatura de fermentacin de 43C, bajando este a 38C.
Placas N1 y N2: Poca produccin de cido lctico y mal desarrollo y crecimiento
de Bacterias lcticas.

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GRAFICOS DE RESULTADOS
Recuento de
Bacterias lcticas
Ufc/ml

1 x 10

Tiempo ( )
min

75

4 x 10

6 x 10

17 x 10

115

155

195

34 x 10

68 x 10

235

285

75 x 10

315

Variacin de Biomasa
800000
x (Ufc/ml)

700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
75

115

155

195

235

285

315

(min)

D(acidez)

20

32

50

64

72

78

80

Tiempo ( )min

75

115

155

195

235

285

315

Acidez (D)

Produccin de cido lctico


90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
75

115

155

195

235

285

(min)

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Log X

4.60

4.78

5.23

5.53

5.83

5.87

Tiempo ( )
min

75

115

155

195

235

285

315

Nmero de Celulas
7
6

Log X

5
4
3
2
1
0
75

115

155

195

235

285

315

(min)

Para determinar el tiempo de vida de una cepa liofilizada es necesario comparar el


crecimiento de la biomasa con la velocidad de sntesis del producto final.

+ X

Recuento de
Bacterias lcticas
Ufc/ml

1 x 104

4 x 104

6 x 104

17 x 104

34 x 104

68 x 104

75 x 104

D(acidez)

20

32

50

64

72

78

80

x (Ufc/ml

VS

D )

100
Acidez (D)

80
60
40
20
0
10000

40000

60000 170000 340000 680000 750000


x (Ufc/ml)

X = 10 000 Ufc/ml

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5.1. DISCUSION DE RESULTADOS


En esta prctica se monitore el crecimiento de bacterias lcticas, con el fin de medir el
cambio de diferentes parmetros, como pH, acidez y unidades formadoras de colonias,
as como la duracin de cada etapa del crecimiento. Y as adquirir conocimientos para
realizar experimentos de este tipo y adems aplicarlo en la elaboracin de productos
fermentados.

7.- CONCLUSIONES:
En esta prctica se monitore la cintica de crecimiento de bacterias lcticas,
evaluando parmetros como pH, acidez, consumo de sustrato, densidad y unidades
formadoras de colonias; y de esta forma conocer cmo varan cada uno de ellos con
respecto al tiempo (manteniendo constantes las condiciones de operacin), adems
se llev a cabo la medicin del crecimiento, que arroj una grfica en la que se
observ claramente las cuatro etapas del crecimiento.
La prctica realizada nos mostr de manera sencilla un mtodo de crecimiento de
bacterias lcticas; haciendo uso de la leche como sustrato; as se pudo obtener a
diferentes tiempos la reproduccin inmediata de estas bacterias, entonces as se
pudo hacer una curva de crecimiento de bacterias; teniendo en los primeros minutos
un crecimiento minsculos hasta que llega a los 315 minutos donde el nmero de ufc
lleg a 75 x 104. Entonces se puede decir que a ms tiempo las colonias aumentan
hasta un punto tope donde estas bacterias mueren y esta curva debera descender.
La fermentacin cido lctica es aquella que se lleva a cabo por las bacterias cido
lctica cuya actividad se desarrolla en ausencia de oxgeno (anaerobiosis).

8.- BIBLIOGRAFIA:
http://www.monografias.com/trabajos15/fermentacion-acidolactica/fermentacionacidolactica.shtml
http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/cyt2006/08-Exactas/2006-E-060.pdf
http://www.biologia.edu.ar/microind/cultivo%20y%20biorreactores.htm
http://itmorelia.edu.mx/2012-admin/extras/Bioquimica2010/BQF-1012.pdf
Mller, G. Microbiologa de los Alimentos Vegetales. Ed. Acribia S.A. Zaragoza,
Espaa 198
Jagnow, G. y Dawid, W. Biotecnologa. Introduccin con experimentos modelo.
Ed.Acribia S.A. Zaragoza, Espaa.1991
WILLET, Hilda. ZINSSER Microbiologa. Editorial Mdica Panamericana S.A. 2
edicin (Espaa 1994).

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