Chromatographie sur colonne

Cette chromatographie est base sur le mme principe que la

CCM, sauf que la silice est place dans une colonne et non sur
une plaque.
Le but est toutefois diffrent:
La chromatographie sur colonne sert sparer des produits,
soit purifier un produit de raction. Cest la mthode
standard de purification dans un laboratoire de chimie
organique.
Cest une mthode prparative, elle permet de purifier 50 mg
environ 20 g en laboratoire, et jusqu 1 kg en industrie.

Chromatographie sur colonne

Deux types de chromatographie existent:
Chromatographie par gravit: elle utilise des particules de silice de
70 200 m et le solvant scoule au goutte--goutte. Cette technique
est dsuette car elle demande une plus grande quantit de silice et de
solvant.
Chromatographie clair (flash): elle utilise des particules de silice
de 35 70 m et le solvant scoule sous pression dair comprim.

Premire rfrence la chromatographie clair:

Still, C.W.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem., 1978, 43, 2923-2925:
Rapid chromatographic technique for preparative separations with
moderate resolution.
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Prparation de la chromatographie clair

Plusieurs choix sont faire en fonction de la quantit de produit et de
laspect de la CCM:
Diamtre de la colonne
Hauteur de silice

Choix de lluant
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Choix de lluant
Il faut faire des essais sur CCM avec diffrents luants pour avoir une
bonne sparation entre les produits, tout en recherchant un Rf ~ 0.3
pour le produit le moins polaire.

Mauvaise sparation
mme si a parat facile
car lluant est trop polaire

Ok, mais il faudra

augmenter la polarit de
lluant pour faire sortir le
produit le plus polaire.

La polarit de lluant peut rester la mme tout au long de la

chromatographie (lution isocratique) ou aller en augmentant
(gradient de solvant).
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Que se passe-t-il?
Soit deux produits de polarit diffrentes (rouge et vert) qui migrent travers
une colonne de silice:
Le compos rouge est moins polaire
donc moins retenu.
Sort en premier !
Le compos vert est plus polaire
donc plus retenu.
Sort en deuxime !
On na qu changer rgulirement
le rcipient (prouvettes de
format variable)
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Prparation de la colonne

Mlanger silice
et luant=slush

Ouate bien tasse

Sable
Un peu dluant

Verser doucement
la slush
Compacter avec
pression dair

Sable
Baisser lluant
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Attention ne pas scher la silice! Rgler le dbit dair: 1-2 gouttes/sec.

Prparation de la colonne

Dpt du produit:
Il seffectue robinet ferm, la pipette pasteur de
faon homogne sur les bords de la colonne, le
plus bas possible.
Choix du solvant?
Si possible, luant de dpart
Le plus petit volume possible
Le dpt doit ensuite tre absorb intgralement
avant lajout du solvant dlution.

Dpt de produit solide

Deux possibilits soffrent vous si le produit brut

est solide:
Sable
Tte de colonne

le solubiliser dans lluant et lajouter tel que dcrit

prcdemment
faire une imprgnation sur silice: mlanger le
produit en solution avec ~ 5 x sa masse de silice.
vaporer sec et additionner ce solide sur le haut
de la colonne avant de mettre le sable. On utilise
souvent cette technique si le produit brut nest pas
soluble dans lluant choisi.

Colonne de chromatographie clair

Additionner doucement lluant.
Remplir les prouvettes.
Veiller ne pas manquer dluant pour ne pas scher la colonne.
Si vous utilisez un gradient dluant, laissez couler le premier solvant
avant de rajouter le deuxime.

Analyses de la purification par

chromatographie clair
Dposer une micro-goutte de chaque
prouvette sur une CCM.
Prparer une CCM avec les prouvettes
qui contiennent un chromophore.

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Chromatographie sur colonne

Que faire en cas de mlange ?

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Conseils gnraux :
- Toujours garder un chantillon du produit brut avant flash et le spotter
- Attention la polarit de lluant pour les CCM changer souvent!
Doit-il tre le mme que lluant pour la flash ??

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Purification par chromatographie clair :

fin
Regrouper les prouvettes qui contiennent le mme produit pur.
Concentrer lvaporateur rotatif.
Scher la pompe mcanique.
Calculer le rendement de la flash
et de la raction.

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Paramtres influenant la sparation

Diamtre et hauteur de la colonne
Quantit de silice
Dbit de lluant
Granulomtrie de la silice
Polarit de lluant
Volume du dpt
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Systmes automatiss

Il existe maintenant des systmes

automatiss o la colonne est
prpaquete, le gradient est
programm, et lappareil collecte des
fractions. Linterface nous donne
directement les fractions qui
contiennent un chromophore. Il reste
juste faire les CCM et vaporer!

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Cahier de laboratoire
Indiquer les informations suivantes:
Pour les CCM:
lluant
le rvlateur
les Rf des produits
Pour les chromatographies clair:
Diamtre et hauteur de la colonne de silice
luant utilis (variations, quoi, quand, comment)
Quantit de chaque fraction recueillie
Reproduction des CCM de chaque fraction
Rendement de la colonne

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