Informe Laboratorio

NOMBRES Y APELLIDOS:
MEDINA ZAVALETA ERICA
CARRERA PROFESIONAL:
BIOLOGIA
LUGAR DE PRCTICAS:
LABORATORIO REFERENCIAL
DE
SALUD
PBLICA LA
LIBERTAD
PERIODO DE PRCTICAS:
03/12/2013 25/04/2014
FECHA DE ENTREGA DEL

INFORME: 20/05/2014
2014
INTRODUCCION
1. DESCRIPCION DE LA INSTITUCION:
VISIN
La Gerencia Regional de Salud La Libertad contribuye al desarrollo humano con justicia
social generando ambientes saludables, un mejor estado de salud de la poblacin, polticas
intersectoriales de estado y descentralizadas en salud e incrementando el ejercicio de los
derechos y deberes de los cuidados en salud.
MISIN
La Gerencia Regional de Salud La Libertad es el rgano tcnico de lnea del Gobierno
Regional La Libertad, responsable de la implementacin de las polticas nacionales y
regionales de salud, en su mbito territorial; para mejorar la salud de la poblacin; est
encargada de generar las condiciones adecuadas a travs del cuidado integral de las
personas y el ambiente, el aseguramiento universal, la conduccin sectorial, la promocin
de los derechos y deberes ciudadanos en salud con nfasis en la salud del hogar y la
comunidad.
ORGANIZACIN
FUNCIONES:
a) Orientar la investigacin cientfica - tecnolgica segn niveles de complejidad para

resolver problemas nutricionales y de enfermedades transmisibles y no transmisibles que
afectan a la poblacin dentro del mbito jurisdiccional.
b) Lograr la efectividad del funcionamiento de la red de centros de hemoterapia y bancos
de sangre de acuerdo a la normatividad vigente.
c) Efectuar investigaciones y anlisis en drogas orientadas a la vigilancia, prevencin y
control de enfermedades transmisibles, no transmisibles y carencias nutricionales
prevalentes en el mbito regional de su competencia.
d) Supervisar tcnicamente los laboratorios de salud en la jurisdiccin en las actividades
destinadas a la vigilancia, prevencin y control de enfermedades transmisibles, no
trasmisibles y carencias nutricionales prevalentes dentro del mbito de su regin.
e) Proponer normas y procedimientos de prevencin, diagnstico y control en salud
pblica, en coordinacin con el Instituto Nacional de salud y en concordancia con las
normas de salud.
f) Supervisar y monitorear la aplicacin de procedimientos diagnsticos de los laboratorios
de salud en la jurisdiccin, segn normas establecidas por los organismos competentes.
g) Disear, ejecutar y evaluar la investigacin, para el diagnstico clnico y epidemiolgico,
segn los lineamientos y prioridades establecidas, en coordinacin con el Instituto Nacional
de Salud.
h) Monitorear la aplicacin de mtodos y valoracin de resultados en los laboratorios de
salud en la jurisdiccin.
i) Implementar y mantener el control de calidad de los medicamentos y afines, productos
biolgicos e insumos de uso humano y veterinario, as como de los productos de la
medicina tradicional.
j) Lograr el apoyo de anlisis y diagnsticos para la investigacin, prevencin y control de
riesgos y daos ocupacionales y la proteccin del medio ambiente centrado en la salud de
las personas.
k) Investigar y proponer al organismo competente la transferencia tecnolgica y difusin de
conocimientos en el campo de la salud intercultural.
l) Evaluar y programar los requerimientos de capacitacin en investigacin del personal
que integran los laboratorios de salud en la jurisdiccin.
m) Realizar la confirmacin diagnstica de enfermedades de importancia en Salud Pblica.
n) Participar en la investigacin de brotes epidmicos en la Regin.
o) Garantizar el normal funcionamiento del sistema de referencia y contrarreferencia de la
red regional y nacional de laboratorios.
p) Implementar el Control de Calidad e Inocuidad de Alimentos, el cual comprende los
anlisis fsico-qumicos y microbiolgicos.
q) Coordinar e integrar sus actividades con la de las otras instancias de la regin de salud
correspondiente.
r) Cumplir y desarrollar las estrategias que a nivel nacional el INS proponga en materia de
laboratorios.
2. ACTIVIDADES DESARROLLADAS:
2.1.
DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS EN CADA AREA

AREA DE TUBERCULOSIS
- Preparacin de medios de cultivos: Ogawa y Lowenstein-Jensen.
Ejecucin de procesos: MODS, GRIESS Y CULTIVO OGAWA.

Preparacin y Esterilizacin de material de trabajo.
Lectura y reporte de resultados.
AREA DE MICROBIOLOGA
- Preparacin de:
Medio de transporte: Cary y Blair
Medio de Enriquecimiento: Caldo Cerebro-Corazn (BHI), Agar CerebroCorazn (BHA).
Medios de selectivos: Agar Mac Conkey, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato,
Agar Salmonella Shigella, Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, Agar
Sangre.
Medios de Identificacin: Agar Triple Sugar Iron, Lisina Iron Agar, Agar
Citrato de Simmons, Agar Urea, Medio SIM.
- Procesamiento de muestras
- Identificacin de Gram negativos y Gram positivos.
REA DE INMUNOLOGIA
- Procesamiento de: VIH, DENGUE, HEPATITIS Y SIFILIS.
AREA DE ENTOMOLOGIA
- Identificacin taxonmica de vectores: Aedes aegypti, Lutzomyia, Culex sp.,
Anopheles sp., Siphonaptera.
2.2.
DETALLES DE LOS MTODOS Y PROCEDIMIENTOS

REA DE TUBERCULOSIS
CULTIVO Mycobacterium tuberculosis

Muestra
Esputo, orina, contenido gstrico, lquido cefalorraqudeo, pleural, peritoneal.
Tanto para la muestra de orina como para el contenido gstrico se deber centrifugar a 3000 o
3500 RPM durante 20 a 30 minutos.
Descontaminacin de la Muestra
La descontaminacin de las muestras se realiza con hidrxido de sodio 4 (NaOH) al 4%, solucin
acuosa estril.
Descontaminacin sin Centrifugacin y empleo del Medio Ogawa acidificado
Procedimiento
1. Colocar las muestras numeradas en orden creciente sobre la mesa de trabajo, poner en una
gradilla igual cantidad de tubos estriles numeradas con la misma secuencia de las muestras.
2. Trasvasar en cada tubo 1 mL de muestra de esputo o de suspensin obtenida por macerado y
en caso de muestras centrifugadas emplear todo el sedimento (flamear los bordes de los
tubos al abrir y cerrar las tapas). Agregar 4 mL de solucin estril de hidrxido de sodio al 4%.
3. Dejar a 37 C por 20 minutos en estufa.
4. Retirar los tubos de la estufa, homogenizar la muestra e inocular 0.1 mL en medio de Ogawa y
baar toda la superficie del medio.
5. Colocar los tubos en una bandeja de fondo inclinado e incubar a estufa a 37 C.
6. Despus de 48 horas revisar los tubos y ajustar las tapas, adems de verificar si algn tubo
est contaminado, alcalinizado (color blanco amarillento) o acidificado (color azul oscuro) por
mala neutralizacin de la muestra.
El desarrollo de colonias antes de 48 horas es indicativo de contaminacin, algunas veces el
medio se licua por accin de grmenes proteolticos.
Revisiones posteriores se realizarn durante la incubacin a los 7, 30 y 60 das.
LECTURA
El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas. Las colonias
tpicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor y de borde irregular.
Si no se observan colonias en el tiempo antes mencionado se deja los cultivos hasta las 8
semanas, antes de proceder a informar resultado negativo.
INFORME DE RESULTADOS DE CULTIVO
Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa
No se observa colonias
N
Nmero total de colonias, si hay menos de 20
+
De 20 a 100 colonias
++
Colonias separadas ms de 100
+++ Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda superficie del medio)
C
Cultivo Contaminado
Se debe realizar frotis y coloracin Ziehl-Neelsen de las colonias que no tienen morfologa tpica.
De observarse B.A.A.R. se enviar el cultivo para su tipificacin al INS.
Fig. 1. Caractersticas de las colonias de M. tuberculosis en el medio Ogawa: friable, mrgenes

irregulares,
crecimiento
eugnico
con un centro
amarillento que semeja
coliflores.
Fig. 2. (Izquierda) Crecimiento disgnico. Crece pobremente. Ellas aparecen como colonias
pequeas, menores de 1 mm de dimetro adheridas al medio. (Derecha) Crecimiento eugnico.
Crecimiento profuso. Son fciles de separar de la superficie del medio.
MTODO DE NITRATO-REDUCTASA (GRIESS) PARA LA DETECCIN RPIDA DE LA

SUSCEPTIBILIDAD A ISONIACIDA Y RIFAMPICINA
ETAPA PRE ANALTICA
rea de preparacin del medio
El ambiente y la mesa de trabajo deben estar limpio y todos los materiales deben estar
esterilizados.
Evite abrir y cerrar puertas, as como la circulacin del personal durante la preparacin del
medio.
Utilizar una cabina de bioseguridad clase II, tipo A 2, para proteger el medioambiente.
Para desinfectar la mesa de trabajo utilizar etanol al 70% (v/v) o 3% (v/v) de hipoclorito de
sodio.
Los desinfectantes deben ser recin preparados (no utilizar soluciones preparadas con ms de
24 horas).
SELECCIN DE LA MUESTRA
Todas las muestras de esputo recolectadas de pacientes primarios sintomtico respiratorio con
riesgo de estar infectados con tuberculosis resistente o mutirresistente (MDR) que tengan
como resultado baciloscopia positiva del esputo con una carga bacteriana igual o mayor a una
cruz (BK1+ ), pueden ser analizadas mediante el mtodo Griess.
Las muestras de esputo de pacientes con antecedentes de tratamiento previos (crnicos) y
que estn con esquemas estandariza-dos o individualizados no deben ser analizadas por este
mtodo.
La cantidad mnima de muestra requerida es de 3 mL (3-5 mL de preferencia).
Utilizar nicamente envases de plstico descartable de boca ancha y tapa rosca.
En caso de que la muestra no se procese el mismo da de la recoleccin, deber conservarse
en refrigeracin (4 a 8 C) y ser enviada al laboratorio dentro de las 72 horas (tres das) de
haber sido recolectada. Adems, no deber mantenerse sin refrigerar por ms de cuatro
horas.
El laboratorio de la DISA, una vez que reciba la muestra, deber procesarla por el mtodo
Griess dentro de las 72 horas.
ETAPA ANALTICA: PROCEDIMIENTO

Fundamento de la descontaminacin
La N-Acetil-L-Cistena (NALC) es un agente mucoltico utilizado para una rpida digestin del
esputo. El hidrxido de sodio al 4% (w/v) es el agente descontaminante. El citrato de sodio 2,9%
(w/v) se incluye en la mezcla de digestin para aglutinar los iones de metales pesados que
podran estar presentes en la muestra y que podran desactivar la acetil cistena. El acetil cistena
pierde su actividad rpidamente en solucin, por lo que debe prepararse diariamente. Despus de
la digestin y de la descontaminacin, el buffer fosfato estril (0,067M, pH 6,8) se aade para
minimizar la accin del NaOH y reducir la gravedad especfica de las muestras antes de la
centrifugacin.
Digestin y Descontaminacin
1. Trabajar las muestras en grupos iguales al nmero de tazas del rotor de la centrifuga (ej. ocho
pacientes a la vez). Usando pipetas de vidrio de punta gruesa coloque de 3 a 5 mL de esputo
en un tubo plstico de tapa rosca para centrifuga de 50 mL y aadir un volumen equivalente de
la solucin de NALC-NaOH, proporcin 1:1.
2.
Cerrar la tapa del tubo y mezclar en un vortex por aproximadamen-te diez segundos. Evitar
la agitacin excesiva para minimizar la oxidacin y la inactivacin de la N-acetil, L-Cisteina.
3.
Mantener los tubos a temperatura ambiente por aproximadamente quince minutos para la
descontaminacin.
4.
Aadir 0,067M buffer fosfato estril (pH 6,8) al volumen total de 50 mL para minimizar la
accin del NaOH y reducir la gravedad es-pecfica de la muestra antes de centrifugar.
5.
Ajustar las tapas de los tubos y mezclar agitando o por inversin.
6.
Centrifugar a 3000 x g por quince minutos utilizando una centrfuga refrigerada para evitar
el sobrecalentamiento durante la centrifuga-cin de las muestras.
7.
Decantar el sobrenadante en un recipiente que contenga el desin-fectante fenol 5% .
8.
Aadir 1- 2 mL de buffer fosfato para resuspender el sedimento.
9.
Realizar un frotis (usando una gota del sedimento resuspendido) si-guiendo el protocolo
estndar de laboratorio.
10.
Despus de obtener los resultados del frotis, solamente las muestras de esputo con una
carga bacteriana igual o mayor a una cruz (BK1+) sern apropiadas para la prueba de
sensibilidad rpida mediante el mtodo Griess. Las muestras de esputo con una carga
bacteriana menor a una cruz (bK1+) sern sometidas para el cultivo convencional y los
mtodos de PS.
Ejemplo: para cada esputo, preparar el siguiente juego de cinco tubos de medio L-J
3 tubos control de crecimiento
1 tubo con RIF
1 tubo con INH
2 tubos L-J para otras pruebas
11. Incubar a 37 C (leer a los 14, 21 y 28 das, segn sea necesario) (Ej. Si el control no es
positivo a los 14 das, leer a los 21 das, etc.)
LECTURA DE LA PRUEBA
1. A los 14 das aadir 0,5 mL de reactivo Griess recin preparado en uno de los tubos Control y
observar el cambio del color a rojo grosella.
2.
Si no hay ningn cambio o hay cambio de color leve en el tubo control, incubar
por siete das adicionales.
3.
A los 21 das, repetir el paso (1) utilizando otro tubo control. Si en el tubo control
no hay cambio de color o el cambio de color es muy leve, seguir incubando los tubos.
4.
Cuando la intensidad del color sea evidente en el tubo control, aadir 0,5 mL del
reactivo Griess a los tubos con el frmaco.
5.
Comparar intensidad de color en el tubo que contienen el frmaco con los del tubo
control.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se considera que un aislamiento es sensible a un determinado frmaco, si al comparar el tubo
control con los tubos que contienen el frmaco, no se observa ningn cambio de color o el
cambio es muy leve.
Un aislamiento se clasifica como resistente a cierto frmaco si hay un cambio de color en el

tubo que contiene el frmaco igual o mayor al del tubo control.
La prueba no se considerar vlida si hay muy poco o ningn cambio de color en el tubo de
control (en este caso, estas muestras se debern cultivar y enviar al INS para la prueba de
susceptibilidad final (PSF).
REPORTE DE LOS RESULTADOS

En el caso de los aislamientos resistentes a INH y RIF, se debern emitir reportes preliminares
que sealen claramente que estos resulta-dos sern confirmados ms adelante por la prueba
sensibilidad final (PSF). Deber haber un formulario nico de notificacin de resulta-dos entre
los laboratorios de la DISA y el laboratorio del INS. La notificacin final contendr ambos
juegos de resultados y en caso de discrepancias se debern incluir estipulaciones que
permitan al INS (utilizando el mtodo de APP para la PSF) reemplazar los resultados del
laboratorio de la DISA.
Para los aislamientos sensibles a uno o ambos frmacos, los resultados emitidos por la DISA
se notificarn como informe final.
SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE
OBSERVACIN MICROSCPICA (MODS)
Mycobacterium
tuberculosis
MEDIANTE
ETAPA PREANALTICA
Retirar de la congeladora la solucin stock de los antibiticos (8 mg/mL), dejar
descongelar a temperatura ambiente.
Preparacin de la solucin de trabajo de los antibiticos en la microplaca de 24
pozos
Disponer de dos tubos con 10,8 mL de caldo 7H9, aadir a estos tubos 1,2 mL del
suplemento OADC. (volumen total 12 mL)
Dispensar 1 mL del caldo 7H9+OADC a los pozos C y D de la columna de la
microplaca.
Empleando una micropipeta, retirar del pozo C 5 L de medio y aadir 5 L de la
solucin stock de INH. Mezclar bien (0,04 mg/mL = 40 g/mL INH dilucin 1).
Empleando una micropipeta, retirar del pozo D correspondiente a rifampicina 12,5 L de
medio y luego aadir 12,5 L de la solucin stock de RIF; mezclar bien
(0,1 mg/mL =100
g/mL RIF dilucin 1).
Preparacin de la solucin de trabajo.
-
Dispensar 2 mL de caldo 7H9+OADC a los 4 pozos A, B, C, y D de la columna 2 de la

microplaca.
Empleando una micropipeta, retirar 200 L del pozo C de la columna 2 y aadir 200 L
de la dilucin 1 de INH al mismo pozo C de la microplaca; mezclar bien (4 g/mL INH
solucin de trabajo).
Empleando una micropipeta, retirar 200 L del pozo D de la columna 2 y aadir 200 L
de la dilucin 1 de RIF al mismo pozo D de la microplaca; mezclar bien (10 g/mL RIF
solucin de trabajo).
Empleando una micropipeta multicanal cargar 100 L de la solucin de trabajo de los
pozos A, B, C, y D de la columna 2 y dispensar a los pozos A, B, C, y D de la columna 1 de
una nueva microplaca destinada para las muestras.
Repetir el mismo procedimiento hasta llenar todos los pozos de la microplaca. (incluyendo
el control negativo de la columna 3).

Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL, el volumen requerido de la solucin
buffer fosfato (pH 6,8, para enrasar de acuerdo a la capacidad del tubo utilizado en proceso de
cada muestra de esputo.
Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL la solucin stock de NaOH+citrato de
sodio, para la descontaminacin de las muestras de esputo) (ver Anexo B).
Cada 2 mL de muestra de esputo requiere 2 mL de solucin NaOH citrato de sodio.
Pesar la cantidad necesaria de NaLC que se va a aadir a la solucin NaOH - citrato de
sodio.
Dispensar 4,5 mL de caldo 7H9 a los tubos 16 x 100 mm para las muestras de esputo y
aadir 0,5 mL de OADC a cada tubo.
Reconstituir PANTA y aadir 0,1mL a los tubos con 4,5 mL caldo 7H9+OADC para
muestras y controles negativos.
Separar dos tubos con 5 mL de 7H9+OADC para los controles positivos (estos no requieren
PANTA).
Muestras de esputo. La cantidad mnima de muestra requerida es 2 mL, con tiempo de
recoleccin no mayor a 72 h, de pacientes con diagnstico de TB pulmonar con baciloscopa
positiva o negativa que an no hayan iniciado tratamiento antituberculosis, pacientes nunca
tratados, recadas o abandonos recuperados.
En caso de que la muestra no se procese el mismo da de la recoleccin, conservar la muestra
en refrigeracin de 4 a 8 C. Enviar la muestra al laboratorio dentro de las 72 h (3 das) de
haber sido recolectada.
Todas las muestras de esputo deben ser recolectadas en recipientes plsticos de boca ancha
y tapa rosca suministrados por la ESNP y CTB.
Las muestras de esputo son recolectadas en establecimientos de salud bajo la supervisin de
trabajadores de salud capacitados, quienes instruyen a los pacientes sobre la forma de
obtener la muestra de esputo adecuada durante la consulta con el mdico (primera muestra) y
la segunda muestra tomada en la maana siguiente despus de la consulta. Las muestras
deben ser transportadas siguiendo el protocolo establecido para la red de laboratorios.
ETAPA ANALTICA
-
Procedimiento de descontaminacin. Colocar 2 mL de esputo en un tubo de polipropileno

de centrfuga de 15 mL o 50 mL.
Aadir 2 mL de la solucin NaOH-NaLC a una proporcin (1:1).
Asegurar bien la tapa y mezclar en el agitador por 20 s; mover el tubo por inversin para
asegurar que la solucin NaOH-NALC est en contacto con todo el interior del tubo y con
la tapa.
Dejar reposar dentro de CSB por un mnimo de 15 min. Puede prologarse por unos
minutos ms si la muestra es demasiado mucoide.
Evitar el tiempo de sobreexposicin, este no debe exceder los 20 min.
Adicionar buffer fosfato (pH 6,8), para neutralizar la reaccin alcalina y terminar con el
proceso de descontaminacin, mezclar bien invirtiendo el tubo por cuatro veces.
Centrifugar a 3000 g por 15 min.
Decantar cuidadosamente el sobrenadante, en un recipiente que contenga hipoclorito de
sodio al 3% u otro desinfectante apropiado, mantener el sedimento de la muestra.
Resuspender el sedimento de la muestra con 2 mL del medio 7H9-OADC-PANTA (5,1 mL).
Homogenizar bien la suspensin evitando formar burbujas de aire.
De esta suspensin de la muestra extraer 1 mL y hacer la siembra en dos tubos con medio
L-J a razn de 0,2 mL por tubo y el resto en un criovial para conservarlo a 2-8 C, como
muestra de contingencia.
Aadir el otro mililitro de la suspensin de la muestra al resto del medio 7H9-OADC-PANTA

que est en el tubo; mezclar bien. Esta es la suspensin final de la muestra lista para
dispensarse en la placa.
Los tubos que contienen PANTA (7H9-OADC-PANTA) se emplean para las muestras y
para los controles negativos.
Se emplea 7H9-OADC sin PANTA para los controles positivos y para la preparacin de la
solucin de INH y RIF.
Preparacin final de la placa de MODS

-
Dispensar 900 L de la suspensin final de la muestra a cada uno de los cuatro pozos de la
placa de 24 pozos. Excepto los pozos de la columna 3.
Dispensar 900 L del medio 7H9-OADC-PANTA sin muestra en los 4 pozos de la
columna 3 de cada placa de MODS (controles internos negativos).
Cerrar la placa, colocar en una bolsa de polietileno tipo ziplock y cerrar (la bolsa no
se debe abrir de ahora en adelante).
Incubar a 37 C entre 5 a 21 das.
Preparacin de las cepas control positivo - Control de Calidad Interno

-
Cada vez que se procesan muestras, deben incluir dos cepas: control positivo, sensible y
resistente INH y RIF.
Mezclar 5 L de cada suspensin de cepas (escala MacFarland N. 1) con 5 mL del
medio 7H9+OADC
Empleando una pipeta multicanal, adicionar a los cuatro pozos, 100 L de caldo
7H9+OADC y la solucin de trabajo de antibiticos, igual que para las muestras.
Alicuotar 900 L de cada suspensin de cepas en los cuatro pozos de una columna
en la placa separada para los controles positivos.
Cerrar la placa y colocarla en la bolsa tipo ziplock.
Incubar a 37 C junto con las otras placas procesadas el mismo da.
Lectura de las placas

Un resultado positivo es definido como el crecimiento de dos o ms unidades formadoras de
colonia (>2 ufc) en cada uno de los pozos sin droga.
-
Las placas son retiradas de la incubadora para su observacin en el microscopio de luz

invertida con las bolsas selladas, las cuales no deben abrirse.
La lectura de las placas se inicia por los pocillos sin antibiticos en el da 5 de
incubacin.
En sus inicios (entre los das 5 a 9) el crecimiento de MTB se observa como
pequeas curvas, comas o espirales.
La formacin de las colonias, por lo general, progresa a la formacin de cordones y
luego a un crecimiento irregular ms enmaraado.
Para las lecturas iniciales, examinar los pozos con el objetivo 10X (aumento total de
100X) en el microscopio de luz invertida, buscando el temprano crecimiento de las
microcolonias. Para subsecuentes lecturas se utiliza el objetivo de 4X (40X total de aumento)
para examinar todo el contenido de cada pocillo.
No es muy comn la contaminacin con bacterias u hongos, pero usualmente
aparece al da 5 un aspecto turbio y con crecimiento abundante. Si se produce la
contaminacin se deben volver a descontaminar y reprocesar las alcuotas de la muestra de

contingencia o solicitar una nueva muestra al paciente.
Los medios de cultivo no deben tener un aspecto turbio con el crecimiento de MTB.
Los desechos acompaantes en la muestra pueden dificultar la deteccin temprana
de micobacterias, pero con el tiempo, las colonias ms maduras pueden ser detectadas,
sobre todo en la periferia de los pozos.
El crecimiento en un solo pozo (con ausencia de contaminacin), o menos de 2
UFC en cada pozo, debe considerarse como un resultado indeterminado y se debe solicitar
inmediatamente la repeticin del proceso de la muestra, y la bsqueda de evidencias de
contaminacin cruzada.
El intervalo entre las lecturas puede ser flexible para adaptarse al trabajo y
calendario del laboratorio. Lecturas ms frecuentes conducen a obtener resultados ms
rpidos.
Interpretacin de resultados
Interpretacin
Combinando los hallazgos en
ambos pozos (A y B)
Ambos pozos positivos
Ambos pozos negativos
Interpretacin general
de los cultivos
Positivo
Negativo
Uno o dos pozos indeterminados

Un pozo positivo, y otro pozo negativo
n pozo positivo, y otro pozo
indeterminado
Indeterminado
Indeterminado
Indeterminado
Uno o dos pozos contaminados
Contaminado
Determinacin de la resistencia a medicamentos antituberculosis
Los pozos con antibiticos solo deben examinarse cuando los pozos sin droga son positivos (
2 UFC).
La resistencia es definida como el crecimiento >2 UFC en los pozos con drogas (INH y RIF) el
mismo da en que ambos pozos sin droga son positivos.
Si hubiese crecimiento en un pozo que contiene droga, la muestra es resistente a esa droga (a
la concentracin especfica); si no hay crecimiento significa que la muestra es sensible.
Si existe crecimiento en ambos pozos conteniendo INH y RIF, la muestra es considerada
MDR.
Los pozos con droga NO deben volver a examinarse despus del da que los pozos sin droga
hayan sido identificados como positivos. Despus de una incubacin prolongada, el progreso
en el crecimiento en los pozos con droga no es indicativo de resistencia.
El crecimiento de MTB resistente en los pozos que contienen drogas, suele ser fcilmente
identificable cuando los pozos sin droga son positivos.
En pocas ocasiones es detectado una sola UFC en los pozos que contienen droga, si esto
sucediera, la interpretacin es indeterminada.
Observacin de los pozos ( C o D)
que contienen drogas
No hay crecimiento (0 UFC)
Crecimiento de 2 UFC
Interpretacin de los
hallazgos en los pozos
Sensible
Resistente
Crecimiento de solo 1 UFC
Indeterminado
Crecimiento de bacterias /hongos
Contaminado
AREA DE ENTOMOLOGA
CLAVE PARA LOS TAXONES SUPRAESPECFICOS DE SIPHONAPTERA
Las pulgas (Siphonaptera) constituyen un interesante taxn de insectos ectoparsitos y
hematfagos, que no solo ocasionan molestias a sus huspedes, sino que les transmiten diversos
virus, bacterias, protistas y helmintos.
Bsicamente, los Siphonaptera parasitan especies de mamferos, siendo los roedores el grupo
ms atacado, y secundariamente especies de aves. Su biologa e importancia sanitaria hacen que
el estudio de las pulgas posea particular relevancia.
De acuerdo con la clasificacin de Smit (1987), las mexicanas se asignan a tres superfamilias,
siete familias y 14 subfamilias.
Nuestro objetivo es proporcionar una clave ilustrada actualizada destinada a identificar los
taxones supraespecficos de Siphonaptera.
AREA DE MICROBIOLOGIA:
IDENTIFICACIN BACTERIANA
Para un adecuado sistema de vigilancia de las infecciones intrahospitalarias es
necesario realizar la identificacin de casos y su etiologa, la determinacin de las
caractersticas epidemiolgicas, aplicar medidas de control y una contina supervisin
para determinar el xito de esas medidas. El laboratorio de microbiologa tiene
responsabilidades importantes relacionadas con cada paso de este proceso, pero tal
vez su papel ms relevante es la identificacin del microorganismo causante de una
infeccin, ms an cuando el espectro de los agentes responsables de infecciones
intrahospitalarias han cambiado en los ltimos aos.
Esta seccin describe los protocolos bsicos de trabajo recomendados para la
identificacin de las bacterias involucradas en el sistema de vigilancia de infecciones
intrahospitalarias. Si bien es cierto que el desarrollo de sistemas de multipruebas,
pruebas bioqumicas rpidas y pruebas enzimticas nos brindan facilidades en la
identificacin de las bacterias, su uso no est al alcance de todos los laboratorios,
debido a ello se describen protocolos de trabajo con

convencionales para la identificacin de bacterias.
pruebas
bioqumicas
En la identificacin bacteriana es necesario considerar las caractersticas

macroscpicas de las colonias teniendo en cuenta el medio de aislamiento original y
sus caractersticas microscpicas para poder elegir las pruebas diferenciales
correspondientes.
Se deben mantener las medidas de bioseguridad en el manejo de reactivos y cultivos.
IDENTIFICACIN BACTERIANA DE COCOS GRAM POSITIVOS: Staphylococcus y
Enterococcus
Objetivo:
Describir los procedimientos para la identificacin de cocos Gram
Staphylococcus y Enterococcus aisladas a partir de muestras clnicas.
positivo:
Campo de aplicacin
Esta parte comprende la identificacin de cocos Gram positivos: Staphylococcus y
Enterococcus.
Condiciones generales
a) La primera consideracin prctica a tomar en cuenta es determinar, si un
aislamiento es estafilococo, estreptococo o enterococo. Esta diferenciacin se realiza
basndose en la morfologa de la colonia, tipo de hemlisis, forma de las bacterias por
coloracin Gram a partir de un cultivo y de la prueba de reaccin de la catalasa.
b) Las colonias de estafilococos son comnmente grandes (2 mm a 3 mm a las 24
horas), convexas, lisas, enteras, opacas y con frecuencia pigmentadas, a diferencia de
las colonias de estreptococos y enterococos que son ms pequeas (menos de 2 mm
de dimetro), puntiformes, con aspecto translcido a semiopaco.
c) Los estafilococos pueden ser fuertemente hemolticos en agar sangre de carnero,
pero las zonas de hemlisis son menores en relacin al tamao de las colonias que las
generadas por los enterococos y estreptococos hemolticos.
d) Los estafilococos se agrupan generalmente en racimos, a diferencia de los
estreptococos y enterococos que se renen en pares o cadenas.
Identificacin de estafilococos
Lectura de cultivos en agar sangre de carnero
a) Morfologa de las colonias
Las colonias de la mayora de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden
aproximadamente de 1 a 3 mm de dimetro a las 24 horas. Si las placas se siguen
incubando tres das a 34 37 C las colonias pueden medir de 3 8 mm dependiendo
de las especies.
Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, stas siguen
desarrollando si se deja en incubacin por unos das ms. Son de borde entero, de
superficie lisa, la mayora de ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo

crema hasta el naranja.
Las colonias de Staphylococcus epidermidis son algo ms pequeas dependiendo de
las cepas, usualmente no se detecta pigmentos. Las colonias de Staphylococcus
saprophyticus son ms grandes que S. epidermidis, son lustrosas y ms convexas que
otras colonias de estafilococos. Un 50% de las cepas son pigmentadas (Figura 4).
b) Coloracin Gram
Para la identificacin de bacterias en Gram positivo (+) y Gram negativo (-)
Reactivos:
Lugol
Cristal violeta
Metanol
Alcohol acetona (decolorante)
Safranina (colorante de contraste)
Procedimiento:
- Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.
- Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tincin, pasando rpidamente el
portaobjeto 3 4 veces por la llama del mechero o con metanol y dejar secar.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de cristal violeta.
- Colorear un minuto y lavar con agua de cao.
- Cubrir la lmina con lugol de Gram durante un minuto. Lavar nuevamente con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas de alcohol acetona hasta no
arrastrar ms colorante violeta. Generalmente requiere de unos diez segundos o menos.
- Lavar con agua de cao y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte.
- Cubrir la superficie con safranina durante un minuto. Lavar con agua de cao.
- Dejar secar la lmina.
- Examinar la lmina coloreada al microscopio con objetivo 100 x de inmersin (aceite).
c) Prueba de la catalasa
Determina la presencia de la enzima catalasa, esta enzima descompone el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno.
Procedimiento
Con el asa de siembra, recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y
colocarla sobre un portaobjetos limpio.
Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta Pasteur.
No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2.
Observar una inmediata efervescencia (formacin de burbujas) que indica una
prueba positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
Desechar el portaobjeto colocndolo en un desinfectante.

Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles:
Control positivo: S. aureus.
Control negativo: Streptococcus spp
Nota: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del
medio de agar sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos puede dar
resultados falsos positivos.
No invertir el orden del mtodo porque puede producir resultados falsos positivos.
Si son catalasa positivas determinar primero si el organismo es o no Staphylococcus
aureus, para ello se realiza la prueba de la coagulasa.
d) Prueba de la coagulasa
Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por
accin de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulacin del
plasma. El resultado final es la formacin de un cogulo de fibrina.
Reactivo
Plasma liofilizado de conejo. (Reconstituir de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.)
Nota: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido cuidadosamente
probado de no contener algn agente infeccioso, capacidad de coagulacin e
inhibidores.
Controles
Positivo: S. aureus.
Negativo: S. epidermidis o S. saprophyticus.
Prueba en tubo
Procedimiento
Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de plasma
reconstituido (en un tubo de vidrio estril de 13 x 100).
Girar el tubo suavemente para lograr la suspensin del organismo. No agitar.
Incubar la mezcla a 35 37 C (en bao mara de preferencia) por 4 horas; observar
si hay formacin de cogulo inclinando lentamente el tubo.
Observar cuidadosamente si hay formacin de cogulo inclinando lentamente el tubo
(sin agitar) en intervalos de hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulacin es una
prueba positiva.
La mayora del S. aureus formarn cogulo en una hora.
Si es negativa a las 4 horas, seguir incubando hasta el da siguiente a temperatura

ambiente. Esto es recomendado porque un pequeo nmero de cepas de S. aureus
puede requerir ms de cuatro horas para la formacin del cogulo. Considerar que
Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el cogulo.
Realizar el control de calidad del reactivo utilizando las pruebas de resistencia a la
polimixina B y novobiocina (disco de 5g) para tener una identificacin presuntiva. S.
saprophyticus es resistente a la novobiocina y S. epidermidis es resistente a la
polimixina B.
Nota: Es preferible utilizar bao mara para esta prueba (Figura 6).
e)Resistencia a la novobiocina
Esta prueba se realiza principalmente para distinguir S. saprophyticus de otras
especies de importancia clnica.
Medios y reactivos
TSA con sangre de carnero o agar Mueller Hinton.
Suero fisiolgico o caldo tripticasa soya.
Discos de novobiocina (5 g por disco).
Escala 0,5 de Mc Farland.
Incubadora a 3537 C.
Vernier o regla.
Procedimiento
A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas, hacer una suspensin
equivalente a la escala 0,5 de Mc Farland.
Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin ajustada y rotarlo varias veces
presionando sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido. Esto
remover el exceso de inculo del hisopo.
Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar sangre de carnero estriando
homogneamente con el hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el procedimiento
dos veces ms rotando la placa 90.
Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que cualquier exceso de
humedad superficial sea absorbido.
Colocar el disco de novobiocina y presionar suavemente con una pinza estril.
Incubar a 35 37 C toda la noche 24 horas.
Lectura
Medir el halo de inhibicin. Un halo 16 mm es resistente a la novobiciona, si es
mayor entonces es sensible.
La resistencia a novobiocina es intrnseca en S. saprophyticus

f) Resistencia a la polimixina B
Medios y reactivos
TSA con sangre de carnero.
Suero fisiolgico o caldo tripticasa soya.
Disco de polimixina B (300 U por disco)
Escala 0,5 de Mc Farland.
Vernier o regla.
Procedimiento
Realizar el mismo procedimiento descrito para detectar la resistencia a la novobiocina.
Ambas pruebas pueden realizarse en la misma placa.
Lectura
La resistencia a la polimixina B se define por una zona de inhibicin menor de 20 mm.
S. aureus y S. epidermis son usualmente resistentes.
Resultados:
Comparar los resultados con la tabla 3 que muestra las principales caractersticas de
S. aureus y estafilococus coagulasa negativos comnmente asociados con infecciones.
Nota: Las identificaciones de los estafilococos coagulasa negativos son presuntivas y

deben ser confirmadas en el Laboratorio Referencial.
Tabla 3. Principales caractersticas fenotpicas de
Staphylococcus comnmente aisladas en infecciones.
Pigmento
de colonia
S. aureus
subespecie
aureus
S. epidermidis
S.
haemolyticus
S. lugdunensis
S.
saprophyticus
subespecie
saprophyticus
S.
schleiferi
schleiferi
S. warneri
Hemolisina
Estafilo
coagulasa
Factor de
aglutinacin
las
especies
de
Resistencia a
novobiocina
Resistencia
polimixina
Ornitin
a
descar
boxila
sa
Acidez
de
manitol
(d)
(+)
+
-
(d)
-
d
d
(+)
-
(+)
-
d
-
+
-
(+)
(d)
90% o ms especies, o cepas positivas.
90% o ms especies, o cepas negativas.
11% - 89% de especies o cepas positivas. (+)
(*)
En agar sangre de carnero.
Zona amplia de hemlisis dentro de 24 36 horas.
Reaccin retardada.
(+)
Hemlisis retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 72
horas. (d)
No hay hemlisis o es retardada.
No hay hemlisis o hay una zona muy angosta ( 1 mm) dentro de las 72
horas. Algunas de las cepas pueden producir un ligero color verdusco o marrn en
agar sangre de carnero.
Identificacin de enterococos
Los enterococos pueden presentarse como clulas nicas, en pares o en cadenas
cortas. Se ven de forma cocobacilar cuando la coloracin de Gram se realiza de una
placa de agar y pueden verse en cadenas cuando se prepara la coloracin de Gram a
partir de caldo thioglicolato. Son anaerobios facultativos y su crecimiento ptimo es a
35 C. Muchas cepas crecen a 10 y 45 C.
Lectura de cultivos en agar sangre de carnero
a) Apariencia de las colonias
Usualmente son alfa hemolticas o no hemolticas en agar sangre de carnero 5%
aunque tambin puede haber especies hemolticas como las cepas de E. durans.[5]
(Figura 7)
b)
Coloracin Gram
Si se observan cocos Gram positivos y se presentan solos, en pares o en cadenas

cortas, algunas veces cocobacilares, realizar la prueba de la optoquina. Aplicar el
procedimiento descrito en el Anexo B. Mtodo de coloracin de Gram.
Tabla N 4. Principales caractersticas fenotpicas de cocos gram positivos en cadena,

catalasa negativos.
Cl Na 6,5%
Enterococc
us
Streptococ
cus
Lactococcu
s
Crecimiento
Hemlisis
10 C
+
45 C
+
, , n
, , n
, n
Vagococcu
s
, n
Algunos estreptococos hemolticos crecen en 6,5% de cloruro de sodio.
No hemoltico.
95% reacciones positivas.
reacciones variables.
c) Prueba de la catalasa
Enterococcus es catalasa negativo.
Nota: Algunas veces se produce una seudocatalasa y se puede observar una dbil
efervecencia. Esto ocurre cuanto E. faecalis se desrrolla en medios que contienen
sangre, en este caso, subcultivar la colonia en estudio en TSA o agar Mueller Hinton y
repetir la prueba.
d) Tolerancia al cloruro de sodio
Para determinar la facultad de un organismo de desarrollarse en presencia de una
concentracin de 6,5% de cloruro de sodio.
Procedimiento
a) Inocular en el caldo TSB con cloruro de sodio un cultivo de 18 24 horas de
incubacin.
b) Incubar a 35 37 C por 24 horas.
c) Se puede controlar peridicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar
como negativo.
Lectura
Positivo:
Hay desarrollo bacteriano.
Negativo:
No se observa crecimiento en el caldo.
Controles
Control negativo: Escherichia coli.
Control positivo: Staphylococcus aureus.
Observar el oscurecimiento del agar indicando si hubo hidrlisis de la esculina y
el crecimiento en el caldo con cloruro de sodio. Con estas pruebas tenemos dos
identificaciones presuntivas posibles:
Casi todos los enterococos (95%) son esculina positivos y crecen en medios con 6,5%
de cloruro de sodio produciendo acidez.
5% - 10% de Streptococcus del grupo viridans son bilis esculina positivos.
Nota: Una vez que se ha establecido que el microorganismo en estudio es
presuntivamente un Enterococcus o un gnero cercano a l (Lactococcus o
Vagococcus) se puede hacer la identificacin de las especies de acuerdo con la Tabla
5.
a) Crecimiento en telurito de potasio
Es til para la identificacin presuntiva de E. faecalis (Figura 9)
Procedimiento
a) Sembrar la cepa en estudio en TSA con 0,04% de telurito de potasio.
b) Incubar a 35 37 C. Si hay desarrollo de colonias negras se identifica
presuntivamente como E. faecalis.
6.1.5.3 Sembrar en caldo para fermentacin de carbohidratos con manitol, sorbosa,
rafinosa, sorbitol y arabinosa, y en caldo base descarboxilasa con arginina.
a) Metabolismo de carbohidratos
Procedimiento
a) A partir de un cultivo puro de 24 horas, inocular los caldos conteniendo los
diferentes carbohidratos con las colonias sospechosas.
b) Incubar a 3537 C hasta por 4 das.
Lectura
a) Positivo: Viraje de color hacia el amarillo (indicador prpura de bromocresol), indica
produccin de acidez.
b) Negativo: No hay viraje de color.
b) Descarboxilacin de la arginina
Seguir los pasos descritos en el procedimiento: Produccin de desarboxilasas en
IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGA- TIVOS FERMENTADORES: Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae y Enterobacter.
Tabla 5. Principales caractersticas fenotpicas usadas para la identificacin de
Enterococcus de mayor importancia clnica y gnero relacionados.
10% reacciones positivas. v
Excepciones ocasionales (<3% de cepas muestran reacciones aberrantes).
reacciones variables.
IDENTIFICACIN
DE
BACILOS
GRAM
NEGATIVOS
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter
FERMENTADORES:
Objetivo
Describir los procedimientos de cultivos e identificacin de bacilos Gram negativos
fermentadores: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter
Campo de aplicacin
Comprende el cultivo e identificacin por pruebas bioqumicas de las colonias
desarrolladas en agar Mac Conkey de las siguientes bacterias: Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae y Enterobacter.
Las bacterias Gram negativas fermentadoras se desarrollan en agar sangre de carnero
y agar Mc Conkey, pero en agar sangre de carnero no podemos hacer mayor
diferenciacin entre las colonias, sin embargo, en el agar Mc Conkey podemos
diferenciar las colonias lactosa positivas y lactosa negativas.
Lectura de cultivos en agar Mac Conkey
En agar Mc Conkey, Escherichia coli lactosa positiva forma colonias de borde entero,
de color fucsia, opacas, de 2 mm 3 mm de dimetro, usualmente rodeadas de una
zona opaca alrededor de la colonia (bilis precipitada). Las cepas de E. coli que son
lactosa negativa dan colonias incoloras de 3 4 mm.
En agar Mc Conkey, K. pneumoniae forma colonias de borde entero, de color rosado a
rosado oscuro, de 3 4 mm de dimetro y aspecto mucoide.
En agar Mc Conkey, Enterobacter spp forma colonias de borde entero, de color
rosado de 2 4 mm de dimetro, no tan mucoides como K. pneumoniae.
Las colonias con estas caractersticas son subcultivadas en medios diferenciales.
Pruebas bioqumicas
a) Utilizacin de lactosa.
b) Utilizacin de glucosa.
c) Produccin de gas de glucosa.
d) Descarboxilacin de lisina.
e) Produccin de cido sulfhidrico.
f)
Utilizacin de citrato.
g) Produccin de ureasa.
h) Prueba MR.
i)
Prueba VP.
j)
Motilidad.
k) Produccin de indol.
l)
Prueba de ONPG.
Procedimiento
a) Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.
b) Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero deBunsen.
c) Enfriar el asa.
d) Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del
medio de cultivo ni otra colonia vecina.
e) Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato, urea
(en la superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del
tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la parte inclinada), caldo para la
prueba de indol, MRVP.
f)
Sembrar por puntura en el centro del agar movilidad hasta una profundidad
aproximada de 1,5 cm.
g) Incubar a 35 37 C de 18 a 24 horas.
Lecturas
a) Agar TSI
En estos medios se determina la capacidad de la bacteria de utilizar la lactosa,
glucosa y sacarosa (en TSI), con produccin o no de gas y la produccin de cido
sulfhdrico.
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 24 horas para no obtener resultados
errneos. La lectura se hace sobre la base.de tres caractersticas: Utilizacin de
hidratos de carbono, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico.
Utilizacin de hidratos de carbono:
Utilizacin de lactosa: Reaccin cida en el pico de flauta(color amarillo)

Abreviatura: (A).

Utilizacin de glucosa: Reaccin cida en la columna del medio (color amarillo)
Abreviatura: (A).
No hay utilizacin del carbohidrato: Se puede observar una reaccin alcalina (color
rojo) o que no hay cambio de color (permanece del mismo color que el medio no
inoculado) Abreviaturas: (K) o (N) respectivamente.
Nota: Cuando el microorganismo tambin produce H S el precipitado negro puede
ocultar la acidez.
Produccin de gas de glucosa:
Se considera positivo: Presencia de una sola burbuja de gas, burbujas en el medio,

divisin del medio, desplazamien- to completo del medio del fondo del tubo dejando
un rea clara o una ligera muesca del medio en el costado del tubo.
Se registra la lectura por medio de cruces (+).
Produccin de cido sulfhdrico:
Se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio de
cultivo o slo en la parte superior.
Se registra la lectura por medio de cruces (+).
Resultados
Ejemplo de simbolizacin e interpretacin:
K/A +: Significa alcalinidad en la inclinacin y acidez en el fondo (fermentacin de
glucosa),
Gas negativo y
H S positivo.
N/N :
Significa que no hay utilizacin de la lactosa y glucosa ni produccin de H S.
Controles
Columna vertical (fondo)
E. coli (lactosa positivo)
Shigella
Salmonella paratyphi B
amarillo/gas
amarillo/sin gas
amarillo/negro/con gas
Superficial inclinada (Pico de

flauta)
amarillo
rojo
rojo
Recomendaciones
Si se observa que no hay cambio de color en el tubo hasta las 24 horas, seguir
incubando hasta las 48 horas. Si no se observa viraje de color y hay desarrollo, se
trata de una bacteria no fermentadora
b) Agar lisina hierro
En este medio se determina simultneamente la produccin de lisina descarboxilasa y

de la formacin de cido sulfhdrico.
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 24 horas; si la lectura se realiza antes
podemos obtener resultados falsos positivos, as como falsos negativos si se lee
despus de las 24 horas.
Realizar la lectura en la columna y en la superficie inclinada y observar la formacin
de cido sulfhdrico el cual se evidencia por una coloracin negra.
Nota: Generalmente las cepas del grupo Proteus y Providencia, desaminan la lisina a
cido -cetocarbnico. Este ltimo forma compuestos pardo-rojizos en la regin
superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno.
Recomendaciones
No incubar ms del tiempo necesario para no ocasionar una alcalinizacin en la
superficie del medio y por lo tanto producir un viraje hacia el violeta.
Controles
Columna vertical (fondo)
E. coli
Proteus mirabilis
Morganella morganii
amarillo
amarillo y negro
amarillo
Superficial inclinada (Pico de

flauta)
violeta
rojo-parduzco
rojo parduzco-violeta
c) Utilizacin de citrato
Para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente
de carbono para su metabolismo.
Procedimiento
a) Incubar a 3537 C de 24 horas 48 horas. En algunos casos es necesario una
incubacin hasta por 4 das.
b) Ver el viraje de color.
Resultados
a) Prueba positiva: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta, o
presencia de colonias en ausencia del color azul.
b) Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde).
Controles
Positivo:
Enterobacter cloacae
Negativo:
Escherichia coli
d) Hidrlisis de la urea (produccin de ureasa)

Es til para determinar la capacidad de un organismo de de- gradar la urea, formando
dos molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa.
Procedimiento
Realizar la lectura despus de 18 horas 24 horas de incubacin observando el viraje
de color.
Resultados
Prueba positiva: Color rosado intenso en el pico de flauta o todo el agar. Puede haber
una reaccin positiva retardada despus de 24 horas y hasta 6 das de incubacin
(algunas cepas de Klebsiella por ejemplo).
Prueba negativa: No se produce cambio de color.
Controles
Negativo:
Escherichia coli
Positivo:
Klebsiella pneumoniae
e) Rojo de metilo
Permite comprobar la capacidad del microorganismo para producir y mantener
estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa
determinando cualitativamente el pH del medio.
Procedimiento
El caldo debe ser incubado a 3537 C de 48 a 72 horas. Aspticamente retirar 2,5 mL
de caldo a un tubo estril.
Aadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo (indicador de pH).
Interpretar el resultado del viraje de color inmediatamente.
Si la lectura fuera negativa, continuar la incubacin para repetir la prueba.
Nota: No debe realizarse la lectura antes de las 48 h de incubacin para evitar
resultados errneos.
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la
produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba
positiva. Un color naranja (pH 5 a 5,8) indica una prueba negativa.
Resultados
Prueba positiva: Color rojo.
Prueba negativa: Color amarillo o naranja.

Controles
Control positivo:
Escherichia coli.
Control negativo:
Klebsiella pneumoniae.
f) Motilidad (Medios SIM, o MIO o agar movilidad)

Para determinar si un organismo es mvil o inmvil.
Procedimiento
Incubar a 35 37 C de 24 a 48 horas.
Resultados
Positivo: Los microorganismos migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio
provocando turbidez. Tambin puede manifestarse semejando vellosidades a lo largo
del trazo de siembra.
Negativo: Se observa un crecimiento bacteriano acentuado siguiendo el trazo de
siembra, y el medio circundante se mantiene claro.
Controles
Control positivo:
Escherichia coli.
Control negativo:
Klebsiella pneumoniae.
g) Prueba de indol
Es til para determinar la capacidad de un microorganismo de producir indol a partir
del aminocido triptfano.
Medios y reactivos
Caldo de triptfano o de peptona o caldo de triptona. Reactivo de indol de Kovacs.
Procedimiento
Retirar aspticamente 2 mL de caldo de cutivo con 24 horas de incubacin.
Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs.
Mover suavemente el tubo y realizar la lectura.
Evaluar el cultivo a las 24 horas, si la lectura es negativa, deber incubarse otras 24
horas el cultivo restante y repetirse la prueba.
Resultados
Prueba positiva: Formacin de un anillo rojo en la superficie del medio (la capa
alcohlica).
Prueba negativa: No se produce color en la capa alcohlica, y toma el color del
reactivo empleado.
Controles
Control positivo:
Escherichia coli.
Control negativo:
KlebsielPrueba de la galactosidasa (ONPG)
Es til para demostrar la presencia o ausencia de la enzima - galactosidasa utilizando

el compuesto orgnico o nitrofenil -D galactopiransido (ONPG) y para diferenciar
los organismos con reaccin retardada a la lactosa de los organismos lactosa
negativos.
Reactivos
Discos o tabletas de ONPG.
Procedimiento
Seguir las instrucciones del fabricante.
Resultados
Prueba positiva: Formacin de un color amarillo (formacin de ortonitrofenol a partir
del ONPG).
Prueba negativa: No hay cambio de color.
Controles
Control positivo:
Escherichia coli.
Control negativo:
Proteus spp.
NOTA
Todas las Escherichia coli producen acidez de glucosa en el TSI o KIA (5% no
producen gas) y un 98% son indol positivo, VP , MR+ (99%), mviles (95%).
Todas las Klebsiella pneumoniae son Indol negativo, ornitina descarboxilasa negativa,
no mviles. VP + (98%), citrato + (98%), urea + (95%), lisina descarboxilasa (98%),
gas de glucosa (97%).
NOTA 2: Si se dispone de los medios y reactivos adicionalmente se pueden realizar
pruebas de produccin de descarboxilasas como:
Descarboxilacin de la ornitina (*).
Descarboxilacin de arginina.
(*) Si no se dispone del medio MIO.
j) Produccin de descarboxilasas
Las pruebas de descarboxilacin se realizan para medir la capacidad enzimtica de un

microorganismo para descarboxilar un aminocido, el que da lugar a una amina,
produciendo la alcalinizacin del medio.
Procedimiento
Inocular el cultivo en dos tubos con caldo descarboxilasa, uno de los cuales deber
contener el aminocido a estudiar.
Cubrir con aceite mineral los tubos e incubar a 35 37 C durante 24 48 horas.
Lectura
Positivo: Color azul prpura en el tubo que contiene el aminocido.
Negativo: Color amarillo.
Anotar los resultados de las pruebas de utilizacin de carbohidratos y produccin de
descarboxilasas.
Realizar la identificacin de acuerdo con las Tablas 6, 7 y 8.
Tabla 6. Principales caractersticas bioqumicas de Escherichia spp.
Prueba
Indol
Rojo de metilo
Voges Proskauer
Citrato (Simmons)
Hidrgeno sulfurado (TSI)
Hidrlisis de urea
Lisina descarboxilas
Arginina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Motilidad
Hidrlisis gelatina(22
C)
Acidez D-glucosa
Gas D-glucosa
Lactosa (fermentacin)
ONPG
E. coli
E.coli
Inactiva
E.
fergusonii
E.herman
nii
E.
vulneris
98
99
0
1
1
1
90
17
65
95
0
80
95
0
1
1
1
40
3
20
5
0
98
100
0
17
0
0
95
5
100
93
0
99
100
0
1
0
0
6
0
100
99
0
0
100
0
0
0
0
85
30
0
100
0
100
95
95
95
100
5
25
45
100
95
0
83
100
97
45
98
100
97
15
100
Cada nmero representa el porcentaje de reacciones positivas despus de dos das de

incubacin a 36 C. La mayora de estas reacciones positivas suceden dentro de las 24
horas. Las reacciones que se vuelven positivas despus de los dos das no se
consideran.
BACTERIOLGICOS EN INFECCIONES INTRAHOSPITALARIAS
Tabla 7. Principales caractersticas bioqumicas de Klebsiella
Prueba
K.pneumoniae
K.
oxytoca
K. arnithinolytica
K. planticola
K. ozaeneae
K. rhinoscleromatis
Indol
99
100
20
Rojo de metilo
10
20
96
100
98
100
Voges Proskauer
98
95
70
98
Citrato (Simmons)
Hidrgeno
98
95
100
100
30
sulfurado
(TSI)
0
Hidrlisis de urea
95
90
100
98
10
Lisina descarboxilas
98
99
100
100
Arginina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
100
40
Motilidad
Hidrlisis gelatina (22 C)
Acidez D-glucosa
100
100
Gas D-glucosa
97
97
Lactosa (fermentacin)
ONPG
98
99
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
100
100
50
100
100
30
80
15
0
Cada nmero es el porcentaje de reacciones positivas de dos das de incubacin a 36

C. La mayora de estas reacciones positivas suceden dentro de las 24 horas. La
reacciones que se vuelven positivas despus de los dos das no se consideran.
Tabla 8. Principales caractersticas bioqumicas de Enterobacter spp
gergoviae
Cada nmero es el porcentaje de reacciones positivas despus de dos das de

incubacin a 36 C. La mayora de estas reacciones positivas suceden dentro de las 24
h, las reacciones que se vuelven positivas despus de los dos das no son
consideradas.
IDENTIFICACIN DE BACILO GRAM NEGATIVO NO FERMENTADOR: Pseudomonas

aeruginosa
Objetivo
Describir los procedimientos de identificacin de Pseudomonas aeruginosa por medio
de pruebas bioqumicas.
6.3.2
Pseudomonas aeroginosa es fcilmente reconocida en medios de aislamiento primario

por sus caractersticas:
- Morfologa de la colonia
- Produccin de pigmentos difusibles si estn presentes.
- Olor caracterstico.
Identificacin
Morfologa de las colonias
Las colonias generalmente son planas, algo extendidas, bordes aserrados y tienen un
brillo metlico.
Nota: Algunas cepas de P. aeruginosa pueden no producir pigmentos, frecuentemente
estas cepas son bastante mucoides y se aslan a partir de muestras de secreciones
respiratorias de pacientes con fibrosis qustica.
Determinacin de las caractersticas bioqumicas
Identifica la colonia sospechosa. Realizar las siguientes pruebas:
a) Utilizacin de lactosa. b) Utilizacin de glucosa. c) Prueba de oxidasa.
d) Crecimiento a 42 C. e) Utilizacin de citrato. f)
Reduccin de nitrato.
g) Hidrlisis de la gelatina.
Procedimiento
a) Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.
b) Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen.
c) Enfriar el asa.
d) Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del
medio de cultivo ni otra colonia vecina.
e) Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato (en
la superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo,
retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la parte inclinada), caldo para la prueba de indol y caldo nitrato.
f) Sembrar por puntura en el centro del agar gelatina (hasta una profundidad de 1,5
cm 2,5 cm) y agar movilidad hasta una profundidad aproximada de 1,5 cm.
g) Quemar el asa y dejar enfriar.
h) Con el asa recta obtener la misma colonia trabajada y cogerla tratando de no tocar
el fondo del medio de cultivo ni otra colonia vecina y sembrar haciendo pequeos
trazos en el extremo de dos placas de TSA o Mueller Hinton (sembrar solo una placa
de TSA o Mueller Hinton si no se dispone de incubadora a 42 C).
i)
Utilizando un asa de siembra en aro estril y tomando como referencia central el
inculo de la colonia, realizar la siembra por dispersin agotamiento en los cuadrantes
de la placa.
j) Incubar a 35 37 C de 18 a 24 horas a excepcin de una placa de TSA que debe
ser incubada a 42 C.
Nota: De no disponer de estufa a 42 C, una opcin es utilizar un bao mara graduado

a 42 C y sembrar el cultivo en estudio en TSB o BHI e incubarlo de 18 a 24 horas.
Lecturas
a)
Agar TSI
P. aeruginosa da un reaccin: K/K o N/N y no hay produccin de sulfuro de hidrgeno.

b)
Prueba de utilizacin de citrato
Procedimiento
Nota: 95% de cepas de P. aeruginosa son positivas.
c)
Prueba de hidrlisis de la gelatina
Determina la capacidad de un microorganismo de producir gelatinasas (enzimas de

tipo proteoltico) que lican la gelatina.
Medio
Gelatina nutritiva pH 6,8
Procedimiento
Utilizando una asa de siembra en punta, y a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas,
coger un inculo abundante y hacer una puncin en el centro y en forma vertical en el
medio de gelatina hasta una profundidad de 1,5 a 2,5 cm.
Utilizar un tubo con medio de gelatina sin inocular como control de prueba.
Incubar los cultivos en estudio y de control a 2225 C por 24
48 horas y hacer la lectura.
Evaluar diariamente el cultivo durante 14 das.
Al trmino de cada perodo de 24 horas colocar el tubo control y el de estudio en el

refrigerador o en un recipiente con hielo durante 2 horas aproximadamente para
determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin).
Realizar las lecturas observando si hay crecimiento (turbidez) y licuefaccin.
Controles
Positivo:
Serratia marcescens
Negativo:
E. coli
Resultados
Positivo:
medio de cultivo semilquido. Negativo:
Recomendaciones
medio de cultivo slido.
En todos los ensayos debe prepararse un tubo control (sin inoculacin del
microorganismo). Pasar los tubos de la incubadora al refrigerador sin agitarlos para
evitar resultados falsos negativos (Figura 24).
d)
Prueba de reduccin de nitrato a nitritos
Se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato a

nitritos o en nitrgeno libre.
Medios y reactivos Caldo con nitrato: pH7. Reactivo A (Ver Anexo C). Reactivo B (Ver
Anexo C). Polvo de zinc.
Procedimiento
Incubar a 35 37 C de 16 a 24 horas. Algunas cepas pueden requerir una incubacin
hasta de 5 das, pero no es frecuente. Agregar directamente al caldo de cultivo, 1 gota
del reactivo A y 1 gota del reactivo B.
Resultados
Primera prueba:
Positivo: cambia a un color rojo dentro de 30 60 segundos (prueba completa).

Negativo: no cambia de color.
Segunda prueba
Agregar aproximadamente 20 mg de polvo de zinc, y observa el color en el trmino

de 510 minutos.
Positivo: no hay desarrollo de color. El nitrato ha sido reducido a nitrgeno libre (ausencia de nitrito en el medio). Negativo: color rosado rojo
intenso, el nitrato no fue reducido por el organismo (el zinc redujo el nitrato en
nitrito).
Controles
Un medio sin inocular (para determinar si hay nitrito en el medio) y un control
positivo, ambos tratados en las mismas condiciones que para el tubo con la muestra
problema.
Control positivo:
Escherichia coli
Control negativo:
Acinetobacter calcoaceticus (Figura 25)
e)
Prueba de la oxidasa
La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que

activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular, el que a su vez
acta como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de
electrones. Con esta prueba se determina la presencia de la enzima oxidasa.
Reactivos
N, N, N, N, tetrametil-p fenilenediamina o
N, N, dimetil-p fenilenediamina solucin acuosa al 1%.
Procedimiento
Se trabaja a partir del crecimiento bacteriano en TSA o Mueller-Hinton.
Humedecer un trozo de papel de filtro con el reactivo dentro de una placa petri.
Con la ayuda de un mondadiente o un asa de platino o aluminio
(el nicrn u otro material de las asas que contienen fierro pueden causar reacciones
falsas positivas) se coge la colonia a probar y se coloca extendindola sobre el papel
filtro.
Controles
Positivo:
P. aeruginosa
Negativo:
E. coli
Resultados
Positivo: Viraje de color hacia el azul violeta (con el reactivo N, N, N, N, tetrametil-pfenilenediamina) o prpura (con el reactivo N, N, dimetil-p fenilenediamina) despus
de 10 15 segundos. Negativo: No hay viraje de color.
Alternativamente una solucin de reactivo al 0,5% puede ser goteada directamente
sobre la colonia.
Nota: De no ser posible preparar los reactivos, se debe adquirir las tiras comerciales.
El 99% de cepas de P. aeruginosa son oxidasas positivas.
f)
Crecimiento a 42 C
Luego del perodo de incubacin observar si hay desarrollo del cultivo en estudio.
Resultados
Todas las cepas de P. aeruginosa crecen a 42 C.
g)
Produccin de pigmentos
Despus del perodo de incubacin, realizar la lectura verificando la produccin de

algn pigmento en el TSA o agar Mueller Hinton. P. aeruginosa produce pigmentos:
verdoso o azul verdoso bri- llante, rojo o marrn.
Ocasionalmente algunas cepas de P. aeruginosa slo producen
pioverdina siendo difcil su diferenciacin de otras P. seudomonas como P. fluorescens
o P. putida, sin embargo se puede diferenciar de las otras especies por la temperatura
de crecimiento (42 C).[7]
Lectura
Si no se observara pigmento dejar la placa incubando a temperatura ambiente y

realizar la lectura a las 48 horas (Figura 27).
Resultados
Realizar la lectura e identificar la especie de acuerdo con la Tabla 9
Nota: Si se dispone de estufa a 42 C o bao mara graduado a 42 C para la
identificacin de P. aeruginosa, es suficiente realizar las pruebas de oxidasa, cultivo en
TSI, crecimiento a 42 C y demostracin de produccin de pigmento verde-azulado,
rojo o marrn en el agar TSA o Mueller Hinton.[7]
Tabla 9. Caractersticas de P. aeruginosa y otras Pseudomonas que producen pigmento
encontradas en muestras clnicas.
Prueba
P. aeruginosa
Oxidasa
P. fluorescens
99
P. putida
97
100
Crecimiento en:
Agar Mc Conkey
100
100
100
42 C
100
Reduccin de nitrato
98
19
Pioverdina
65
96
93
Hidrlisis de la Gelatina
82
100
Citrato de Simmons
95
93
94(6)
Indol
Porcentaje de cepas positivas

Porcentajes en parntesis representan cepas con reacciones retrasadas.
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE DISCO DIFUSIN

Las diferentes especies y cepas de un microorganismo tienen grados variables de
susceptibilidad a los antimicrobianos, adems esta susceptibilidad puede cambiar
especialmente durante el tratamiento. Es por eso que en un proceso infeccioso es
importante que el clnico conozca adems de la identidad del microorganismo, los
antimicrobianos a los cuales es sensible para brindar un eficaz tratamiento. Esta
informacin la debe dar el microbilogo haciendo un diagnstico preciso y
determinando la susceptibilidad del microorganismo a varios antimicrobianos.
Para determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de las diferentes especies y
cepas de un microorganismo se aplica el mtodo de disco difusin el cual se describe
en los documentos NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk Susceptibility
Test: Approved Standard. 8 ed M2-A8.17(1) 2003. NCCLS Disk Diffusion Supplemental

tables M100- S15.25(1) 2005. (Clinical and Laboratory Standars Institute).
Nota: Solicitar al proveedor de los discos de susceptibilidad un certificado de calidad
expedido por el Centro de Control de Calidad del INS.
CONTROL DE CALIDAD
El propsito de llevar a cabo el control de calidad en el laboratorio de microbiologa es

asegurar al mdico y al paciente un diagnstico confiable y oportuno mediante el
monitoreo de la exactitud, precisin, calidad de los reactivos y pruebas realizadas, as
como el desempeo laboral del personal de laboratorio.
Control interno de la calidad
8.1.1 Los colorantes y reactivos usados para la identificacin bacteriana deben

probarse inmediatamente despus de la preparacin y peridicamente para evaluar
las caractersticas de tincin esperadas y la correcta reactividad de los medios
apropiados con cepas referenciales o de reactividad conocida.
8.1.2 Debe llevarse un registro de control de calidad de los medios de cultivo,

colorantes y reactivos en el que se incluya: fecha, nmero de control o lote, control
positivo y negativo utilizado, resultados de la prueba y nombre de la persona que
realiz la prueba. Los registros deben estar a disposicin de todo el personal del
laboratorio.
8.1.3 Es necesario llevar registros de temperatura y de mantenimiento de los equipos

para documentar su correcto funcionamiento y demostrar que los hallazgos de
laboratorio constituyeron realmente determinaciones vlidas.
8.1.4 Para asegurar la confiabilidad del diagnstico microbiolgico de las

infecciones intrahospitalarias se realiza la verificacin del cumplimiento de las
especificaciones contenidas en el presente Manual de Procedimientos.
8.1.5 Se verifica el cumplimiento de la frecuencia programada para controlar el

estado de calibracin de los equipos y los medios de medicin.
8.1.6
En caso de identificarse disconformidades en la aplicacin de las
especificaciones, se informa al personal responsable del laboratorio, quien decide la
adopcin de medidas correctivas necesarias y la identificacin de las causas.
PROCESO DE MUESTRA PARA INFLUENZA HUMANA.
Criterios de rechazo de la muestra.
Muestra contaminada
Un solo hisopo
Escaso muestra menor a 500 ul.
Procedimiento
1) Realizar el homogenizado del tubo conteniendo las muestras clnicas por 10 a 15
segundos en el agitador del tubo.
2) Remover los hisopos haciendo presin en las paredes del tubo, luego desecharlos en la
solucin desinfectante.
3) Alicotar 2 ml de muestra en un vial estril para la prueba PCR y aislamiento viral que ser
enviado al INS (conservar la muestra a -70C por 72 horas como mximo, para su envi).
4) El volumen restante de la muestra centrifugar a 1700 rpm por un periodo de 7 minutos.
5) Agregar 3 ml de la solucin PBS 1X al sedimento de clulas, luego en el agitador de tubos
15 segundos.
6) Centrifugar la muestra a 1700 rpm por un periodo de 7 minutos al finalizar eliminar el
sobrenadante.
7) Repetir el procedimiento 5 y 6 una vez ms. (En caso de visualizar la muestra con moco
realizar un lavado adicional)
8) Limpiar las lminas de inmunoflorecencia y laminillas con acetona
9) Rotular las lminas con el cdigo y fecha de cada una de las muestras.
10) Cargar 17 ul de muestras en cada pocillo (tener en cuenta los controles positivos o
negativos segn protocolo de trabajo)
11) Secar a temperatura de 42C durante 15 minutos.
12) Fijar en acetona fra a -20 C durante 10 minutos.
13) Agregar una gota de reactivo del kit (monoclonal y policlonal segn sea el caso), en cada
uno de los pocillos de las lminas de inmunoflorescencia.
14) Incubar las lminas de inmunoflorescencia en cmara humeda a 37C durante 25
minutos.
15) Lavar 3 veces con la solucin PBS 1X, para eliminar los colorantes y dejar secar a
temperatura ambiente.
16) Agregar la solucin de montaje y colocar la laminilla.
17) Leer al microscopio de fluorescencia con un aumento a 400X a 520- 540 nm.
18) Observar inmediatamente despus de agregar la solucin de montaje, en caso contrario
guardar en refrigeracin 2 a 6C en oscuridad.
Nota: la acetona reutilizada no permitir la fijacin adecuada de las clulas en la almina y se
desprendern durante el proceso.
PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIO DE CULTIVO

BUFFER FOSFATO
PREPARACIN
Solucin A: Na2HPO4 (fosfato de sodio dibsico).Disolver 9,47g de fosfato de sodio dibsico en
1000 mL de agua destilada.
Solucin B: KH2PO4 (fosfato de potasio monobsico).Disolver 9,07 g de fosfato de potasio
monobsico en 1000 mL de agua destilada.
Medir el pH, el cual debe estar en 6,8 0,2. Para ajustar: aadir la solucin A para aumentar el
pH. Aadir la solucin B para bajar el pH.
Esterilice en la autoclave a 121-124 C por 15 min. Rotular con el nombre del
buffer y fecha de preparacin.
Para confirmar la esterilidad de la solucin buffer fosfato, colocar una alcuota de 100 l en un
medio de agar nutritivo e incubar por 48 h a 37 C.
Almacenar en el refrigerador a 2-8 C por un mes.
Notas
Cada muestra de esputo requiere 10 mL de la solucin buffer fosfato (pH 6,8).
La solucin buffer estril puede ser almacenada en botellas estriles de 50-200 mL para ser
usadas en el da o ser almacenada en volmenes mayores. Si se almacenan en volmenes
mayores, se puede alicuotar la cantidad necesaria de buffer el mismo da del proceso de las
muestras, usando tcnicas estriles.
SOLUCIN DESCONTAMINANTE (NaOHNALC)
Solucin stock de NaOH citrato de Na (4% NaOH/2,9% citrato de sodio para la
descontaminacin de las muestras de esputo).
(400 mL suficiente para 200 muestras).
Componentes
Hidrxido de sodio
Citrato de sodio
Agua destilada
8,0 g
5,8 g
400 mL
Procedimiento
Disolver 8,0 g de hidrxido de sodio en 200 mL de agua destilada. Disolver 5,8 g de citrato
de sodio en otros 200 mL de agua destilada.
Combinar las soluciones de hidrxido de sodio y citrato de sodio (en volmenes iguales).
Mezclar y esterilizar en el autoclave a 121-124 C por 15 min. Rotular con el nombre
del reactivo y fecha de preparacin. Almacenar en refrigeracin a 2-8 C por un mes.
Notas
Cada 2 mL de muestra de esputo requiere 2mL de solucin NaOH citrato de Na.
Se puede almacenar la solucin stock en alcuotas de menor volumen usando tubos tapa rosca, el
volumen apropiado va a depender de la cantidad de muestras que se procesan por da.
Disolver 0,1g de los cristales de NALC por cada 20 mL de la solucin de descontaminacin (0,5%
de NALC en NaOH-citrato de Na = solucin de descontaminacin NaOH-NALC).
Preparacin de la solucin de descontaminacin
Notas
Descartar el remanente de la solucin de decontaminacin NaOH-NALC no utilizado, porque
despus de 24 horas el NALC pierde su accin mucoltica.
CALDO MIDDLEBROOK 7H9

Medio lquido Middlebrook 7H9 con casitona y glicerol (900 mL suficiente para 200 muestras).
Componentes
Caldo base Middlebrook 7H9
5,9 g
Glicerol
3,1mL
Casitona
1,25 g
Agua destilada estril
900ml
Procedimiento
Disolver 5,9 g del medio 7H9 en polvo en 900ml de agua destilada estril conteniendo 3,1 mL de
glicerol y 1,25 g de casitona.
Mezclar en constante agitacin hasta que est completamente disuelto (se recomienda usar
pastillas magnticas en el mezclador).
Esterilizar en la autoclave a 121-124 C por 15 min.
Enfriar y alicuotar 4,5 mL del medio en tubos de vidrio estriles de 16x 100 mm para las muestras
y alcuotas de 10,8 mL, para la preparacin de las soluciones de antibiticos y para los controles
internos.
Tomar una muestra al azar de los tubos e incubarlos a 37 C por 48 horas luego dejarlos a
temperatura ambiente durante las subsiguientes 48 horas para controlar la esterilidad (que se
traduce como ausencia de turbidez).
Registrar el lote, la fecha de preparacin y el volumen.
Disponer que se haga el control de sensibilidad del lote.
Registrar el da en que se pone en uso y el da en que se termine cada lote. Almacenar el frasco y
los tubos con las alcuotas de medio 7H9 con las tapas bien cerradas a 2-8 C por el periodo de
un mes.
Notas
Cada muestra de esputo y los controles internos requieren tubos que contengan 4,5 mL de medio
7H9.
Cada tubo con 10,8 mL de medio 7H9 es suficiente para preparar las soluciones de antibiticos y
para los controles internos de quince muestras de esputo. La cantidad a prepararse (mL) depende
de las necesidades de cada laboratorio. Si se almacena en frascos de mayor volumen, se puede
repartir el medio de forma estril el mismo da de proceso de las muestras.
Mezcla de antibiticos PANTA
Es una mezcla de antibiticos que se comercializa en forma liofilizada y que puede ser agregada
al medio Middlebrook 7H9. Luego de reconstituida en agua destilada estril (3 mL), la mezcla
contiene por mL de solucin:
La solucin debe ser utilizada dentro de las 72 h despus de reconstituirla.

Si se quiere mantener la eficiencia del PANTA por ms tiempo, se debe de alicuotar en crioviales
cantidades de 500 L aproximadamente, para luego colocarlas en refrigeracin a -20 C por un
mes.
PREPARACIN DE ANTIBITICOS
STOCK DE INH (8 mg/mL)
Componentes
Isoniacida
20 mg
2,5 mL
Procedimiento
Disolver completamente 20 mg de INH en 2,5 mL de agua destilada estril. Filtrar empleando
un jeringa de 0,2 m para solventes acuosos.
Almacenar en alcuotas de 20 l en tubos estriles de microcentrfuga a -20 C hasta por 6 meses.
Notas
Cada alcuota almacenada de 20 l es suficiente para 100 muestras (incluyendo sobrantes).
STOCK DE RIF (8 mg/mL)
Componentes
Rifampicina
Dimetil sulfoxido
20 mg
1,25 mL
1,25 mL
Procedimiento
Disolver completamente 20 mg de RIF en 1,25 mL de DMSO. Aadir 1,25 mL de de
agua destilada estril y mezclar.
Filtrar empleando un filtro de jeringa de 0,2 m para solventes orgnicos. Almacenar en alcuotas
de 20 l en tubos estriles de microcentrfuga a -20 C hasta por 6 meses.
Cada alcuota congelada de 8 mg/mL de la solucin stock de antibitico es suficiente para 100
pozos de INH o RIF.
Los volmenes de 2 mL de medio y la solucin de trabajo de los antibiticos preparados en la
columna 2 son suficientes para tres placas de MODS (que corresponde a quince muestras de
esputo, tres controles negativos y dos controles positivos, estos ltimos van en una placa aparte).
Si se van a procesar ms muestras se puede emplear la columna 3 (y la columna 4 si fuera
necesario), de la misma manera que la columna 2 (colocar 2 mL de 7H9-OADC en la columna 3 y
seguir el procedimiento antes mencionado).
Cuando se realicen los clculos para la preparacin de la solucin de trabajo, hay que recordar en
incluir los controles negativos en cada placa y los controles positivos as como tener en cuenta las
posibles prdidas.
No congele o reuse de nuevo la solucin stock y la solucin de trabajo de antibiticos, porque la
actividad de los antibiticos se puede perder. Descarte al final todo el resto de la solucin stock de
antibiticos que no se emple.
Dilucin de la solucin de trabajo de los antibiticos
AREA DE INMUNOLOGIA
RECUENTO DE CD4/CD8/CD3
PROCEDIMIENTO
1
Marque las pestaas de los dos pares de tubos como sigue:

Marque el CD4 (cuello verde)------------------------ Zero
Marque el CD8 ( cuello transparente)-------------- Low (bajo)
Marque el CD4 (cuello verde)------------------------ Medio
Marque el CD8 ( cuello transparente)-------------- Hight (alto)
Agite los pares de tubos con ayuda de un vortex. (Boca abajo y luego boca arriba por 5). Abra
los pares de tubos con ayuda de la perforadora.
Homogenice la sangre completa normal y pipetee en inversa 50 L de la sangre completa

normal en cada uno de los cuatro tubos de reactivos.
Tape los tubos y agite en vortex boca arriba durante 5
Incube los tubos 60 a Tambiente
A
CN
Destape los tubos de reactivo, deseche las tapas en contenedor
B
CP
adecuado de desechos biopeligrosos
4 C
Pipetear
en inversa 50 L de perlas de control y aada a cada uno de los tubos
CAL
de reactivo respectivamente.
D
1
E
2
Destape los tubos
3
5 F
Pipetee en inversa 50 L de la solucin fijadora en cada tubo de reactivo
6 Leer
RECUENTO DE CD4/CD8/CD3
PREPARADO Y CORRIDO DE MUESTRAS
1 Marque las pestaas de los tubos re reactivo con el cdigo del paciente.
2 Agite los pares de tubos con ayuda de un vortex. (Boca abajo y luego boca arriba por 5). Abra
los pares de tubos con ayuda de la perforadora.
3 Homogenice la sangre completa normal y pipetee en inversa 50 L de la sangre completa
normal en cada uno de los cuatro tubos de reactivos.
Tape los tubos y agite en vortex boca arriba durante 5 (boca arriba durante 5)
Destape los tubos de reactivo, deseche las tapas en contenedor adecuado de desechos
biopeligrosos
4 Pipetee en inversa 50 L de la solucin fijadora en cada tubo de reactivo
5 Leer
PRECEDIMIENTO DE CAPTURA NS1 DENGUE (PANBIO)

1 Remover el nmero requerido de micropocillos del envase e insertarlo en el porta pocillo.
Cinco micropocillos sern requeridos para control negativo, control positivo y calibrador en
triplicado.
2 Diluir control negativo, control positivo, calibrador y suero del paciente 75 L de suero en 75
L de diluyente de muestra, mezclar bien.
3 Pipetear 100 L de las muestras y de los controles diluidos en los respectivos micropocillos de
la placa de ensayo.
4
5
6
7
8
9
10
Cubrir la placa e incubar 1 hora a 37C 1C

Lavar 7 veces con 350 L buffer de lavado diluido (1/20)
Piper 100 L conjugado Anti NS1 HRP Mab a los micropocillos de la placa de ensayo.
Lavar 7 veces con 350 L de lavado diluido (1/20).
Pipetear 100 L de TMB en cada micropocillo
Incubar 10 a T ambiente (20-25C) tomando el tiempo desde la 1 adicin. Un color azul se
desarrollar.
11 Pipetear 100 L de solucin de Parada en cada micropocillo. Mezclar bien. El color azul
cambiar a un color amarillo.
12 Dentro de los 30 leer la absorbancia de cada micropocillo a una longitud de onda de 450 nm
con un filtro de referencia de 600-650 nm.
CLCULOS:
Factor de calibracin: FC
Valor de punto de corte: VC
Absorbancia del calibrador X FC = VC
Absorvancia de lamuestra
= RESULTADO
VC
RESULTADO:
_ (NEGATIVO)
<
0.9
+ (POSITIVO)
>
1.1
DODOSO
0.9 -1.1
PROCEDIMIENTO ELISA DE CAPTURA IgM DENGUE TARIKI

1 Diluir a 1/40 el control negativo, control positivo y suero de pacientes con buffer diluyente (234
l de buffer diluyente y 6 l de sueros controles y sueros problemas) mezclar.
2 Remover el nmero requerido de pocillos del envase e insertarlo en el porta pocillos, para
control negativo (CN) por triplicado, control positivo (CP) y muestras.
3 Dispense 100 l de las muestras y de los controles diluidos en los respectivos micropocillos
de la placa de ensayo.
A
B
C
D
E
F
G
H
CN
CN
CN
CP
1
2
3
4
4
5
Cubrir la placa e incubar 1 hora a 37C

Simultneamente preparar mezcla con igual volumen de solucin antgeno e igual volumen de
solucin conjugado (para 2 tiras 900 l de conjugado y 900 l de Ag).
Preparacin conjugado
Para 2 tiras: 10 l de conjugado para 990 l de buffer diluyente.
Preparacin del antgeno
Para 2 tiras: 500 l antgeno dengue y 500 l de buffer diluyente
6 Lavar 5 veces con 350 l solucin tampn de lavado diluido 1 x (1/19)
7 Aada 100 l de solucin preparada del Antgeno-conjugado (paso 5) a cada pocillo.
8 Cubrir la placa e incubar 1 hora a 37C
9 Repita los pasos de lavado
10 Pipetear 100 l de sustrato (TMB) en cada micropocillo
11 Incube por 30 1 minutos a temperatura ambiente. Un color azul se desarrollar.
12 Detenga la reaccin aadiendo 100 l de Reactivo de Paro a todas las celdas, el color azul
cambiar a amarillo.
LECTURA: Leer con filtro de 450nm.
CLCULOS:
PROMEDIO DE CONTROLES NEGATIVO + FC = VC
= RESULTADO
VC
RESULTADO:
_ (NEGATIVO)
+ (POSITIVO)
EQUIVOCO
<
>
0.9
1.1
0.9 -1.1
PROCEDIMIENTO ELISA DE CAPTURA IgG DENGUE PAMBIO

1 Remover el nmero requerido de micropocillos del envase e insertarlo en el porta pocillo.
Cinco micropocillos sern requeridos para control negativo, control positivo y calibrador en
triplicado.
2 Diluir el control negativo, control positivo, calibrador y suero del paciente 10 L de suero en
1000 L de diluyente de muestra, mezclar bien.
3 Diluir el antgeno 1/250 utilizando el diluyente de antgeno. Utilizar el volumen requerido de
diluyente de antgeno y mezclar en igual volumen de Mabtracer en un vial de plstico, esto
deber ser preparado 10 minutos antes de colocar las muestras en los micropocillos.
4 Pipetear 100 L de las muestras y de los controles diluidos en los respectivos micropocillos de
la placa de ensayo.
A
B
C
D
E
5
P
CAL
CN
1
2
6
7
8
9
10
11
12
13

Mezclar la solucin antgeno-Mabtracer antes de transferirlo. Pipetear 100 L de complejo
antgeno-Mab a los micropocillos de la placa de ensayo.
Pipetear 100 L de TMB en cada micropocillo
Incubar 10 a T ambiente (20-25C), tomando el tiempo desde la 1 adicin. Un color azul se
desarrollar.
Pipetear 100 L de solucin de Parada en cada micropocillo. Mezclar bien. El color azul
cambiar a un color amarillo.
Dentro de los 30 leer la absorbancia de cada micropocillo a una longitud de onda de 450 nm
con un filtro de referencia de 600-650nm.
CLCULOS:
Absorbancia del calibrador X FC = VC
= RESULTADO
VC
RESULTADO:
_ (NEGATIVO)
+ (POSITIVO)
DODOSO
<
>
1.8
2.2
1.8 - 2.2
3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Recomendaciones
- Recuerde el uso obligatorio de la blusa y los guantes.
- No descarte las muestras sino hasta despus de su observacin microscpica.
- No deje extendidos sin colorear.
- Desinfecte el rea de trabajo con fenol o hipoclorito al 5%.
- Incinere el material contaminado.

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NOMBRES Y APELLIDOS:

MEDINA ZAVALETA ERICA

FECHA DE ENTREGA DEL

a) Orientar la investigacin cientfica - tecnolgica segn niveles de complejidad para

DESCRIPCIN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS EN CADA AREA

Ejecucin de procesos: MODS, GRIESS Y CULTIVO OGAWA.

DETALLES DE LOS MTODOS Y PROCEDIMIENTOS

CULTIVO Mycobacterium tuberculosis

Fig. 1. Caractersticas de las colonias de M. tuberculosis en el medio Ogawa: friable, mrgenes

MTODO DE NITRATO-REDUCTASA (GRIESS) PARA LA DETECCIN RPIDA DE LA

ETAPA ANALTICA: PROCEDIMIENTO

Un aislamiento se clasifica como resistente a cierto frmaco si hay un cambio de color en el

REPORTE DE LOS RESULTADOS

Dispensar 2 mL de caldo 7H9+OADC a los 4 pozos A, B, C, y D de la columna 2 de la

el control negativo de la columna 3).

Procedimiento de descontaminacin. Colocar 2 mL de esputo en un tubo de polipropileno

Aadir el otro mililitro de la suspensin de la muestra al resto del medio 7H9-OADC-PANTA

Preparacin final de la placa de MODS

Preparacin de las cepas control positivo - Control de Calidad Interno

Lectura de las placas

Las placas son retiradas de la incubadora para su observacin en el microscopio de luz

contaminacin se deben volver a descontaminar y reprocesar las alcuotas de la muestra de

Uno o dos pozos indeterminados

Uno o dos pozos contaminados

Determinacin de la resistencia a medicamentos antituberculosis

Crecimiento de solo 1 UFC

Crecimiento de bacterias /hongos

debido a ello se describen protocolos de trabajo con

En la identificacin bacteriana es necesario considerar las caractersticas

superficie lisa, la mayora de ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo

Desechar el portaobjeto colocndolo en un desinfectante.

Si es negativa a las 4 horas, seguir incubando hasta el da siguiente a temperatura

TSA con sangre de carnero o agar Mueller Hinton.

Suero fisiolgico o caldo tripticasa soya.

Discos de novobiocina (5 g por disco).

Escala 0,5 de Mc Farland.

La resistencia a novobiocina es intrnseca en S. saprophyticus

Nota: Las identificaciones de los estafilococos coagulasa negativos son presuntivas y

90% o ms especies, o cepas positivas.

90% o ms especies, o cepas negativas.

11% - 89% de especies o cepas positivas. (+)

En agar sangre de carnero.

Zona amplia de hemlisis dentro de 24 36 horas.

Si se observan cocos Gram positivos y se presentan solos, en pares o en cadenas

Tabla N 4. Principales caractersticas fenotpicas de cocos gram positivos en cadena,

Algunos estreptococos hemolticos crecen en 6,5% de cloruro de sodio.

95% reacciones positivas.

Hay desarrollo bacteriano.

No se observa crecimiento en el caldo.

90% reacciones positivas.

10% reacciones positivas. v

Excepciones ocasionales (<3% de cepas muestran reacciones aberrantes).

Utilizacin de hidratos de carbono:

Utilizacin de lactosa: Reaccin cida en el pico de flauta(color amarillo)

Produccin de gas de glucosa:

Se considera positivo: Presencia de una sola burbuja de gas, burbujas en el medio,

Se registra la lectura por medio de cruces (+).

Produccin de cido sulfhdrico:

Se registra la lectura por medio de cruces (+).

Superficial inclinada (Pico de

En este medio se determina simultneamente la produccin de lisina descarboxilasa y

Superficial inclinada (Pico de

d) Hidrlisis de la urea (produccin de ureasa)