UNIVERSIDAD TCNICA PARTICULAR DE LOJA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MICROBIANA

Prctica # 1
1. Tema: Tincin diferencial Gram
2. Objetivos:
2.1. Emplear la tincin Gram para la diferenciacin de microorganismos.
2.2. Reconocer y diferenciar microorganismos por su morfologa.
2.3. Identificar y comparar la pared celular de microorganismos Gram (+) y Gram (-).
3. Fundamento terico:
Los microorganismos estn constituidos por:

Elementos obligados, son aquellos que estn presentes en todas las bacterias y son
indispensables para su vida. Estos son: pared celular, membrana plasmtica, citoplasma,
ribosomas y el ncleo (Granados y Villaverde, 1997).

Elementos facultativos, son aquellos que pueden estar o no presentes en la bacteria, como por
ejemple: capsula, flagelos, pelos, endosporas e inclusiones citoplasmticas (Granados y
Villaverde, 1997).

Con respecto a la pared celular, sta limita a la clula del medio externo y posee una estructura
rgida parecida a la pared celular de las clulas vegetales. Entre sus funciones ms importantes
destacan: proteccin a la bacteria de cambios externos adversos, ayuda a mantener la morfologa de
la clula, permite el paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de
tipo en la sistemtica bacteriana (Granados y Villaverde, 1997).
Por otro lado, la tincin Gram fue desarrollada por el bacterilogo dans Christian Gram en 1844.
La tincin Gram permite diferenciar entre bacterias gram-positivias (Gram +) y gram-negativas
(Gram -) permitiendo demostrar las propiedades tintoriales de estas (Tortora et al., 2007).
Las bacterias Gram (+) y Gram (-) se tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en
la estructura de sus paredes celulares (Fig. 1). La pared celular de las Gram (+) es monoestratificada
y est compuesta por peptidoglinaco, polisacridos, protenas y cidos teicoicos. Es baja en lpidos y
el peptidoglicano presente forma una mono capa, el cual es un componente importante que
representa entre el 80% y 90% del peso seco de algunas bacterias. Mientras que la pared celular de
las Gram (-) es biestratificada; la primera capa est constituida por peptidoglicano (entre 10% a
20%), y la segunda capa est compuesta por: polisacridos, protenas, fosfolpidos y lpidos, pero no
posee cidos teicoicos (Forbes, 2009; Ledermann, 2007).

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El peptidoglicano es un heteropolmero de poli-N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico,

adems posee aminocidos (L-alanina, D-alanina, D-glutmico y lisina) o en otros casos cido
diaminopimelico. El peptidoglicano es el responsable de la rigidez de la pared celular y de la forma
de la clula (Brock, 1999; Forbes, 2009; Ledermann, 2007).

Fig. 1 Comparacin entre la pared celular de una bacteria Gram positiva y Gram negativa

4. Metodologa:
1. Realizar un extendido delgado de la muestra sobre un portaobjetos.
2. Fijar el extendido a la placa pasndola 2 o 3 veces por la llama de un mechero evitando el
excesivo calentamiento.
3. Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con CRISTAL VIOLETA durante 1 minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir la placa con LUGOL durante 1 minuto.
6. Lavar con agua corriente.
7. Cubrir la placa con ALCOHOL-ACETONA hasta que la muestra deje de perder color, 5 a 30
segundos.
8. Lavar con agua corriente.
9. Cubrir la placa con SAFRANINA durante 1 minuto.
10. Lavar con agua corriente.
11. Dejar secar al aire.
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12. Observar al microscopio con aceite de inmersin, objetivo de 100X.

5. Resultados y Discusin:

6. Preguntas:
6.1. Por qu se utiliza un mordiente en la tincin de Gram?
6.2. Realice un diagrama de flujo sobre el proceso de la tincin de Gram, indicando la funcin
de cada sustancia empleada.
6.3. Grafique y nombre los diferentes tipos de morfologa que pueden presentar los
microorganismos.
6.4. Mencione las diferencias que existen entre las bacterias Gram (+) y Gram (-).
6.5. Nombre 3 ejemplos de bacterias Gram (+) y Gram (-).
6.6. Por qu las bacterias teidas se lavan con alcohol?

6.7. Por qu la safranina tie de color rosa a las bacterias Gram (-)?

6.8. Cules son las fuentes de errores ms comunes en la tincin de Gram?

6.9. A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram (+) o
Gram (-)?
6.10. Para qu se necesita el aceite de inmersin?
6.11. Qu pasa si se omite el colorante cristal violeta?
6.12. Cul es el paso que puede omitirse en la tincin de Gram y aun as poder
diferenciar las clulas Gram (+) de las Gram (-)?
6.13. Defina los siguientes trminos:
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a) Colorante
b) Tincin diferencial
c) Tincin simple
d) Peptidoglicano
e) cido teicoico
f) Pared celular

Referencias
1. Brock., 1999.
2. Forbes, B., Sahm, D. y Weissfeld A. Diagnostico Microbiolgico. 12 edicin. Editorial
Panamericana. Argentina: 2009.
3. Granados, R. y Villaverde, M. Microbiologa Vol. 1. Paraninfo, 1997.
4. Ledermann, W. Una Historia personal de las Bacterias. Ril editores. Chile: 2007.
5. Tortora, G., Funke B. y Case C. Introduccin a la microbiologa. 9 edicin. Editorial Panamericana.
Argentina: 2007.