Ctedra de Parasitologa General-FCNyM

Tcnicas para el estudio de parasitosis en sangre y otros tejidos

La sangre se examina en busca de los siguientes parsitos:
- Protozoos apicomplejos (especies de Plasmodium, Leucocytozoon, Haemoproteus, Babesia,
Theileria)
- Protozoos hemoflagelados (especies de Trypanosoma, Leishmania)
- Microfilarias

TCNICAS UTILIZADAS
Para la deteccin de microfilarias y tripanosomas suelen utilizarse preparaciones hmedas
de sangre entera fresca o sangre centrifugada. Esto slo consigue demostrar la existencia
de infeccin y es preciso examinar extensiones teidas para confirmar la especie de que se
trata.
Examen de sangre en fresco
Es la manera ms fcil y econmica de revelar parsitos en sangre, pero es tambin la prueba
menos sensible. Se la utiliza cuando se quiere detectar parsitos mviles (Trypanosoma spp.,
microfilarias).
Procedimiento: Colocar una gota de sangre sobre un portaobjetos y aadir una gota de igual
tamao de solucin salina. Mezclar con una esquina del cubreobjetos y tapar con este ltimo
la preparacin. Examinar todo el preparado al microscopio. El primer signo de presencia de
trypanosomas o microfilarias vivos es un movimiento rpido entre los glbulos rojos. Los
trypanosomas pueden visualizarse mejor con 400X totales y para las microfilarias es
suficiente con 100X totales.
Este mtodo es til en el caso de alta concentracin de parsitos en sangre pero no permite la
diferenciacin de caracteres morfolgicos.

Examen de sangre en preparados fijos

Material necesario: portaobjetos (limpios y desengrasados en alcohol-ter), algodn, lancetas
estriles, guantes.
- Preparaciones de gota gruesa
Procedimiento:
-Poner 2-3 gotas grandes de sangre (recin tomada) sobre un portaobjetos.
-Unir estas gotas y extenderlas en un dimetro de 1 cm, con la esquina de otro portaobjetos
(este procedimiento permite la desfibrinacin del material).
-Secar a 37C durante 1-2 horas o a temperatura ambiente al menos 8-10 horas al abrigo del
polvo e insectos.

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- Extendido o frotis en capa fina

Procedimiento:
-Colocar una gota pequea de sangre recin tomada en un extremo del portaobjetos.
-Apoyar en un ngulo de 45 por delante de la gota otro portaobjetos y dejar que la sangre se
extienda a lo ancho del mismo
-Deslizar hacia adelante el segundo portaobjeto a lo largo del primero con un movimiento
suave y firme, sin levantarlo y manteniendo una inclinacin de 45. Esto arrastrar la sangre
en una capa fina quedando as listo el extendido.
-Dejar secar al aire.
Para el examen microscpico rutinario del paludismo (Plasmodium spp.), se hace una
extensin fina y otra de gota gruesa en el mismo portaobjetos.
Ambos tipos de preparados deben ser teidos.

Tincin de los preparados

El colorante ms comnmente utilizado es el colorante de Giemsa (1)
Material necesario: Alcohol metlico, solucin de Giemsa, cubetas de tincin, soportes para
los portaobjetos.
Fijacin previa: Debe fijarse slo la extensin fina, aadiendo 2-3 gotas de metanol o
sumergindola en metanol durante algunos segundos. La preparacin de gota gruesa no debe
fijarse, para poder permitir la deshemoglobinizacin durante el proceso de tincin. Se debe
entonces evitar que esta parte del preparado entre en contacto con el metanol o con sus
vapores.
Coloracin:
- Mtodo normal:
-Colocar los portaobjetos en la cubeta de tincin.
-Cubrirlos con una solucin de Giemsa al 3% en agua amortiguada, destilada o desionizada,
pH 7,2 y dejar actuar el colorante 30-45 min.
-Lavar suavemente con agua corriente o sumergir la cubeta en un recipiente con agua limpia,
hasta que no quede ms colorante.
-Retirar los portaobjetos, colocarlos en un soporte con la extensin hacia abajo y dejar secar al
aire.
- Mtodo rpido:
-Preparar una solucin de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada o desionizada, pH
7,2 (3 gotas de colorante/ml de agua). Cada portaobjetos necesitar aprox. unos 3 ml. de
colorante preparado.
-Verter suavemente con una pipeta el colorante sobre el portaobjetos, cubrirlo y dejar actuar
el colorante 5-10 min.
-Eliminar completamente el colorante del portaobjetos aadiendo agua gota a gota,
suavemente y sin inclinar el preparado para que no queden depsitos de colorante.
-Colocar los portaobjetos en un soporte con la extensin hacia abajo y dejar secar al aire.

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Existen otros mtodos de tincin para las extensiones sanguneas como el colorante de Field,
especial para Plasmodium spp. o la hematoxilina de Delafield (2), especial para microfilarias.

Conservacin de los preparados

Los extendidos sin fijar no deben permanecer al aire libre.
Cuando estn coloreados deben guardarse en cajas.
El aceite de cedro que se usa para la observacin por inmersin, debe eliminarse con el
pulpejo del dedo antes de guardarse (no debe usar gasa ni algodn). Puede usarse una gota de
xilol, si el aceite de cedro est extendido.
Las preparaciones mal teidas o decoloradas pueden decolorarse con alcohol metlico y
teirse nuevamente.

Tcnicas especiales para Plasmodium spp.

Recuento de parsitos
Por qu puede ser necesario establecer el nmero de parsitos?
- Para saber cul es el grado de severidad de la malaria.
- Para saber si un tratamiento antimalrico que est siendo administrado est dando el
resultado esperado.
- Los recuentos de parsitos son especialmente importantes en infecciones por P. falciparum
que son potencialmente fatales.
Existen dos mtodos para el recuento de parsitos en extensiones de gota gruesa.
Mtodo 1: parsitos por ml de sangre.
El nmero de parsitos presentes en una extensin de gota gruesa se cuenta en relacin a un
nmero estandarizado de leucocitos (8000). Se necesitan dos contadores, uno para los
parsitos y otro para los leucocitos.
Si al cabo de 200 leucocitos contados se identificaron y contaron 10 o ms parsitos, los
resultados se registran como nmero de parsitos por 200 leucocitos.
Si al cabo de 200 leucocitos contados se identificaron y contaron 9 o menos parsitos, se
contina hasta contar 500 leucocitos y los resultados se registran como nmero de parsitos
por 500 leucocitos.
En cada caso, el nmero de parsitos relativo al recuento de leucocitos puede convertirse a
parsitos /ml de sangre a travs de esta frmula:
n de parsitos x 8000
n de leucocitos

= parsitos /ml de sangre

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Es decir que, si se contaron 200 leucocitos, el n de parsitos se multiplica por 40 y si se

contaron 500 leucocitos, el n de parsitos se multiplica por 16.
Deben contarse todas las especies presentes.
Mtodo 2: el mtodo +
Es menos satisfactorio. Debera utilizarse slo cuando no es posible realizar el otro tipo de
recuento.
Utiliza un cdigo de signos +, como sigue:
+
=1-10 parsitos cada 100 campos examinados
++ =11-100 parsitos cada 100 campos examinados
+++ =1-10 parsitos por 1 solo campo examinado
++++ = ms de 10 parsitos por 1 solo campo examinado

Tcnicas especiales para microfilarias

Debe recordarse que, cuando se sospecha una filariasis, es muy importante la hora del da a la
que se toma la muestra de sangre, ya que algunas especies de filarias presentan una
periodicidad. Esto significa que las microfilarias estarn presentes en la sangre perifrica
slo a ciertas horas del da, de modo que para detectar su presencia debe recogerse la sangre
en el momento apropiado.
Para detectar microfilarias en sangre perifrica se utilizan principalmente 3 mtodos:
(1) Gota gruesa. Los procedimiento de preparacin, y tincin, con ligeras variantes son
los vistos ms arriba.
(2) Examen de sangre capilar en fresco (ya explicado)
(3) Examen de sangre venosa hemolizada
(1) Antes de colorear el preparado totalmente seco se debe deshemoglobinar sumergindolo
en agua corriente o destilada 3- 5 min. Se deja secar nuevamente y se fija en metanol 30-60
segundos. Dejar secar al aire y proceder a la tincin con Giemsa o hematoxilina de Delafield.
Si las microfilarias presentes en la sangre son escasas no sern observables en exmenes
directos, por ello se utilizan tcnicas de concentracin o enriquecimiento como (3). Al
centrifugar la sangre, tambin sedimentan los eritrocitos, por ello se debe producir primero la
hemlisis.
Examen de sangre venosa hemolizada (mtodo de Knott)
Material necesario: Sangre venosa, formol al 2%, tubos de centrfuga, centrfuga.
Procedimiento:
-Colocar en un tubo de centrfuga 1 ml de sangre venosa y 10-12 ml de formol al 2%,
agitando enrgicamente. El formol lisa los hemates.
-Centrifugar 2 a aprox. 3000 rpm.
-Volcar el sobrenadante.

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-Colocar una gota de sedimento en un portaobjetos, tapar con un cubreobjetos y examinar al

microscopio. Se puede tambin con parte del sedimento realizar un extendido en capa gruesa
que, una vez completamente seco, se colorea con Giemsa o con hematoxilina.
Otro mtodo de concentracin es la Centrifugacin de sangre citratada:
Se mezclan 10 ml de sangre venosa con 1 ml de solucin fisiolgica con citrato de sodio al
10%. Se centrifuga durante 30 min a 3000 rpm, se decanta el plasma y se separa la capa de
leucocitos formada sobre los hemates. Con este material tambin se preparan extendidos que
se colorean con Giemsa.
Mtodo para observar las microfilarias inmviles y teidas:
Se prepara una solucin con:
Formol al 5%
Acido actico
Solucin alcohlica concentrada de violeta de genciana (3)

95ml
5ml
2ml

A 10 ml de esta solucin se agregan 3 a 5 ml de sangre venosa y se centrifuga. En el

sedimento se hallarn las microfilarias teidas y los leucocitos.
Recuento de microfilarias
Se puede hacer un recuento preciso de las microfilarias a partir de extensiones en capa gruesa
teidas de volmenes de sangre determinados. Se debe hacer un cuidadoso barrido de la
extensin de sangre con el objetivo de bajo aumento del microscopio.

Tcnicas especiales para Leishmania

Aunque a veces pueden detectarse amastigotes en los leucocitos mononucleares de la sangre
perifrica, el examen microscpico de material aspirado de bazo, mdula sea y ganglios
linfticos es ms sensible. Cualquiera de estas tcnicas es de alto riesgo y debe hacerse con
sumo cuidado por personal especializado.
Con el material resultante del aspirado se hacen extensiones que se colorean con Giemsa.

MUESTRAS CUTNEAS
Usualmente la piel se examina en busca de microfilarias en los casos de oncocercosis, una
filariosis presente en Africa, Amrica Central y del Sur y algunas partes de la regin
mediterrnea oriental.
Tambin se puede examinar la piel en las lesiones sospechosas de leishmaniasis cutnea.
Procedimiento para la bsqueda de microfilarias:
-Colocar una gota de solucin salina en el portaobjetos
-Depositar el fragmento de piel en la gota y tapar con un cubreobjetos, sin ejercer presin.
-Dejar reposar 30 min.

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-Examinar al microscopio con el objetivo 10X. Si hay microfilarias, se las ver en

movimiento. Si no hay, dejar el fragmento de piel en solucin salina una noche en estufa de
incubacin a 37C o a temperatura ambiente y examinar nuevamente.
Si se quiere obtener preparaciones permanentes, eliminar los trozos de piel, dejar que se
evapore el lquido en el portaobjetos y cuando ste est seco, fijar las microfilarias en metanol
y teir con Giemsa o con hematoxilina.
La muestra no debe estar manchada con sangre para evitar la posible contaminacin de la
biopsia por parsitos sanguneos.
Si el paciente presenta ndulos (usualmente en el trax, cadera, pantorrillas y regin
escapular), se toma la muestra del centro de uno de estos ndulos. Si no los presentara, se
toma la muestra de la parte alta de las nalgas, la pantorrilla o en el centro de la regin
escapular.
Leishmaniasis cutnea:
Se raspa con un bistur el borde de la lesin y se realiza un extendido con el material
obtenido.

IMPRONTA DE RGANOS
Unas pocas parasitosis se pueden diagnosticar con este mtodo. Las impresiones se pueden
realizar con material de necropsia o con lesiones cutneas (en leishmaniasis por ej.). Se
imprime la superficie de corte del rgano problema sobre un portaobjetos perfectamente
limpio. El material que queda sobre el mismo, es fijado y coloreado como un extendido
sanguneo. Suelen hacerse improntas de bazo en busca de Leishmania sp.

OTROS TEJIDOS
Tambin se pueden detectar parsitos en los siguientes tejidos:
Lquido cefalorraqudeo. Se obtiene el LCR por puncin lumbar, se centrifuga y se observa
inmediatamente. Se buscan tripomastigotas de las especies de Trypanosoma que afectan el
SNC: T. brucei gambiense y T. brucei rhodesiense en etapas avanzadas de la infeccin.
Tambin se pueden buscar en LCR trofozotos de amebas (meningitis amebianas), larvas de
Angiostrongylus cantonensis (meningoencefalitis eosinoflica), taquizotos de Toxoplasma
(toxoplasmosis cerebral).
Tambin pueden aparecer: larvas de Toxocara spp. y Strongyloides sp., Encephalitozoon.
Ojo. Por raspado corneal. Trofozotos de Acanthameba sp.
Msculo. Biopsias, usualmente de bceps, deltoides o diafragma. Larvas de Trichinella
spiralis.

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INOCULACIN DE ANIMALES DE LABORATORIO

Si se sospecha la existencia de una parasitosis y no es posible observar los parsitos de
manera directa puede recurrirse a la inoculacin de animales de laboratorio, con el fin de
reproducir en ellos la enfermedad.
Ej: en las tripanosomiasis por Tripanosoma equinum, en las cuales el parsito no se
visualizar por otras tcnicas.
Se inocula la sangre del animal enfermo en un animal de laboratorio por va subcutnea o
intraperitoneal. Estos animales cursan la enfermedad en forma clnica. En el lapso de 6 das
pueden hallarse los tripanosomas en la sangre.

(1) La solucin madre de Giemsa est compuesta por:

Azul II eosina
Azul II
Alcohol metlico
Glicerina

3 grs.
0,8 grs.
375 ml.
125 ml.

(2) Hematoxilina de Delafield:

Cristales de hematoxilina
1g
Etanol absoluto
10 ml
Sol. sat. de NH 4 Al(SO 4) en agua destilada 100 ml
Glicerol
25 ml
Metanol absoluto
25 ml
(3) El violeta de genciana se prepara al 4% en alcohol 96.

Bibliografa
Brown, H. 1977. Parasitologa clnica. Ed. Interamericana. 320 pp.
Feldmann, R. E. 1986. Diagnstico coproparasitolgico. Federacin Bioqumica de la Pcia.
Buenos Aires. 26 pp.
Organizacin Mundial de la Salud, 1992. Mtodos bsicos de laboratorio en parasitologa
mdica. Ginebra, 116 pp.
Organizacin Mundial de la Salud, 1997. Medios auxiliares para el diagnstico de las
infecciones filricas. Ginebra, 116 pp.
World Health Organization, 1991. Basic malaria microscopy. Part I. Learners guide.
Geneva, 72 pp.

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Tcnicas para el estudio de parsitos en lquido duodenal, orina y

secreciones
Lquido duodenal
El examen del lquido duodenal se realiza en busca de ciertos enteroparsitos de cuya
existencia se sospecha pero que, por distintos motivos, no son evidenciables en las muestras
fecales.
Hay dos maneras de obtener el lquido duodenal:
Sondaje duodenal:
Se introduce una sonda por nariz o por boca, asegurando que el extremo alcance el duodeno,
el extremo libre se coloca en un tubo de ensayo. Los parsitos se buscan en la bilis que drena
por la sonda. Preferentemente se toman las flculas con una pipeta Pasteur y se observan al
microscopio entre porta y cubreobjetos. No se recomienda la centrifugacin ya que la elevada
densidad de la bilis dificulta la acumulacin de los parsitos en el sedimento.
Entero-test:
Se hace tragar al paciente un hilo de nylon enrollado dentro de una cpsula de gelatina. Un
extremo del hilo est sujeto a una pequea pesa y el otro debe quedar fuera de la boca. Al
disolverse la cpsula en el estmago el hilo se libera y ste se va desenrollando por accin de
la pesa, que avanza por peristalsis al duodeno. Todo se recupera con las deposiciones luego de
4 horas. El hilo recuperado tiene adherido el moco intestinal, teido de bilis. El hilo se raspa y
se recoge el material en una cpsula.

Observacin:
Si es en fresco, debe ser inmediatamente a la obtencin de la muestra, si se quiere comprobar
la existencia de organismos mviles.
Tambin pueden hacerse extendidos coloreados:
Sobre un portaobjetos, homogeneizar una gota de material con una gota de solucin fijadora
(PVA).
Dejar secar y colorear.

Qu se puede encontrar en el lquido duodenal?

- trofozotos de Giardia lamblia
- huevos de Fasciola hepatica
- larvas de Strongyloides stercoralis
- larvas de Trichinella spiralis
- ooquistes de Cryptosporidium parvum e Isospora belli

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Orina
La orina se examina en busca de:
-huevos de helmintos asociados al rin y vas urinarias
-formas qusticas y vegetativas de protozoos asociados a las vas urinarias o genitales
Las muestras de orina deben centrifugarse a 3000 rpm durante aprox. 5 minutos. Se recoge
una muestra del sedimento con una pipeta y se coloca entre porta y cubreobjetos para observar
al microscopio.
Qu se puede observar en un examen de orina?
En el hombre:
-huevos de Schistosoma haematobium
-trofozotos de Trichomonas vaginalis (en varones)
En otros animales:
-huevos de helmintos parsitos del rin y vas urinarias: Dioctophyma renale (perros),
Pearsonema plica (antes: Capillaria plica) (perros), Stephanurus dentatus (cerdos)
- tripomastigotes de Trypanosoma equiperdum (en caballos) en infecciones tempranas
- esporoquistes de Klossiella spp. (Coccidio) en varias especies

Mtodos especiales para huevos de S. haematobium

- Mtodo de filtracin en jeringa:
Con una jeringa se hacen pasar a presin 10 ml de orina por un filtro (poro: 12-20 micras)
sujeto a un soporte que se ajusta a la jeringa.
El filtro se extrae del soporte, se coloca sobre un portaobjetos y se coloca encima una gota de
lugol.
Se examina todo el filtro al microscopio con el objetivo de 40X. Los huevos de Schistosoma
se tien de naranja y pueden verse claramente. La tasa de infeccin se mide por el nmero de
huevos por 10 ml de orina.
En general:
Infeccin leve: 1-49 huevos/10 ml de orina
Infeccin grave: > 50 huevos/10 ml de orina

Exudados vaginal y uretral

Se estudian para evidenciar la presencia de flagelados parsitos asociados a las mucosas
genitales. En humanos: Trichomonas vaginalis. En bovinos: Tritrichomonas foetus. En
equinos: Trypanosoma equiperdum.

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Obtencin de la muestra:
Hombre: con un ansa de platino esterilizada, o con un hisopo estril directamente del tracto
uretral.
Mujer: del tracto vaginal, con un hisopo estril o con una esptula de madera.
En cualquier caso el hisopo con la muestra puede utilizarse directamente para realizar la
observacin directa o el frotis o bien colocarse en un tubo con solucin fisiolgica.
En otros animales:
Vacas, yeguas: con un hisopo o cuchara de mango largo, o con una pipeta, o inyectando en la
vagina solucin fisiolgica y recuperando luego el lquido.
Toros, caballos: por lavado de la cavidad prepucial con solucin fisiolgica y posterior
recuperacin del lquido, o por sondaje uretral.

Preparacin de las muestras:

Para observacin en fresco (en busca de parsitos mviles):
Colocar el material sobre una gota de solucin salina y observar al microscopio entre porta y
cubreobjetos.
Si el material fue recuperado por lavaje o irrigacin, o viene impregnado en un hisopo en
solucin fisiolgica se centrifuga el lquido a baja velocidad por 2 min y se examina el
sedimento.
Para realizar preparaciones fijas:
Frotar el material sobre un portaobjetos. Dejar secar, fijar y colorear como para las
extensiones de sangre.

Bibliografa
Laboratorio Veterinario Central, Weybridge, Gran Betaa, 1971. Manual de tcnicas de
parasitologa veterinaria, Ed. Acribia, Zaragoza, 196 pp.
Organizacin Mundial de la Salud, 1992. Mtodos bsicos de laboratorio en parasitologa
mdica. 116 pp.

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