Universidad de Colima

FACULTAD DE MEDICINA

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

CANALES IONICOS Y F OTOCORRIENTES

EN
PLANTAS V ASCULARES

Tesis que para Obtener el Grado de:

Doctor en Ciencias Fisiológicas

con Especialidad en Fisiología

Presenta:

Leandro Sandoval Alvarez

Asesor: Dr. J. Jesús Muñiz Murguía

Co-asesor: Dr. Igor Pottosin

Colima, Col. 1998

 2

AGRADECIMIENTOS

A los asesores de esta tesis:

Dr. J. Jesús Muñiz Murguía
Dr. Igor Pottosin

Al CONACYT por el apoyo económico para realizar los estudios

correspondientes
 3

INDICE DE CONTENIDOS

INDICE DE CONTENIDOS ................................................................................... 3

INDICE DE FIGURAS ........................................................................................... 5

INDICE DE TABLAS ............................................................................................. 7.

. .............................................. .............................................. ........... 8

REVISION DE CONCEPTOS BASICOS Y OBJETIVO DEL TRABAJO . . . . . . . . . . . . . 8

1.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 8
1.1.1 El proceso fotosintktico.. ......................................................................................................... .8
1.1.2 Organización Espacial y funcional de las reacciones lumínicas en la fotosíntesis ................. l l
1.1.3 Métodos y técnicas de investigación del proceso fotosintético ............................................. .22
1.1.3.1 La técnica de “Patch Clamp”. .............................................................................................. 24
1.2. ANTECEDENTES A ESTE TRABAJO ......................................................................................... 29
1.3 OBJETIVO ...................................................................................................................................... 39

. ............................................. ............................................. ........... 40

EQUIPO, MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS ................................................ 40

2.1 EQUIPO DE EXPERIMENTACIÓN Y REGISTRO ..................................................................... .40
2.2 PREPARACIÓN ............................................................................................................................. .42
2.3 MICROELECTRODOS ................................................................................................................... 44
2.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.. ....................................................................................... .44
2.5 EXTENSIÓN DE LA MEMBRANA TILACOIDE ........................................................................ 46
 4

. ......................................... ......................................... ............ 47

CANALES IONICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 47
3.2 RESULTADOS.. .............................................................................................................................. 47
3.3 DISCUSION ......... ........................................................................................................................... 60

. ................................................. ................................................. ........... 65

CORRIENTES FOTOINDUCIDAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.1 RESULTADOS ................................................................................................................................ 65
4.1.1 Resultados generales. ............................................................................................................ .65
4.1.2 Cinética de las fotocorrientes: efecto de los estados previos de iluminación. ....................... .78
4.1.3 Efectos de la preiluminación sobre la cinética del transiente de corriente fotoinducida. ...... .80
4.1.4 Efecto de la duración del pulso de luz sobre la cinética del transiente de corriente
fotoinducida .................................................................................................................................... 84
4.2 DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
................................................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.2.1 Observaciones generales ........................................................................................................ 88
4.2.2 Efectos de la Preiluminación Sobre la Cinética del Transiente de Corriente Fotoinducida. ..9 1

5 . ....................................................... ...................................... 95

95
CONCLUSIONES .................................................................................
5,1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .95
5.2 Conclusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

REFERENCIAS . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

Anexo: copia de artículo publicado en relación con el presente trabajo

 5

Figura 1.1 Esquema para la electrólisis del agua. 10

Figura 1.2 Cloroplasto. ll

Figura 1.3 Detalle de la forma en que se dobla la membrana tilacoidea. 12 ’

Figura 1.4 Componentes de la membrana tilacoidea. 13

Figura 1.5 Detalle de los componentes de la membrana tilacoidea. 14

Figura 1.6 Esquema Z. 16

Figura 1.7 Detalle del Esquema Z desde el punto de vista energético 17

Figura 1.8 Detalles de componentes y procesos en la membrana tilacoidea. 20

Figura 1.9 Comparación entre mitocondria y cloroplasto 21

Figura 1.10 Fluorescencia y asimilación del carbono. 24

Figura 1. II Técnica de “Patch Clamp “. 26

Figura 1.12 Configuración “Ce11 Attached”. 27

Figura 1.13 Conjiguración “Inside Out ” 27

Figura 1. I4 Conjiguración ” Whole Ce11 “. 28

Figura 1.15 Variación fotoinducida del potencial de membrana en Peperomia

metallica. 31

Figura 1.16 Comparación entre el potencial de membrana fotoinducido en Pep-

eromia metallica medidosimultaneamente con micropipeta y con lectrodo sensi-
ble a pH 33

Figura 1.17 Separación de los componentes del gradiente electroquímico 34

Figura 1.18 Registros de corriente y voltaje fotoinducidos y configuraciones

corresuondientes urobables 36
Figura 2.1 “Set” experimental 41

Figura 2.2 Instrumental de registro 42

Figura 3.1 Registros de canal en cloroplasto de Amaranthus 49

Figura 3.2 Fracción de registros de canal de cloroplastos de Amaranthus 57

Figura 3.3 Gráfico L/Vpara canal en Amaranthus 58

Figura 3.4 Registro de canal en cloroplasto de Zea maiz 59

Figura 3.4a Modelo para los flujos de H+ y Cl- 61 ,

Figura 3.5 Comparación entre canales de Nitelopsis y Amaranthus 63

Figura 4.1 Acceso de la pipeta al interior del cloroplasto 65

Figura 4.2 Fotocorrientes en Amaranthus 66

Figura 4.2a Registros de fotocorrientes en Amaranthus 68

Figura 4.3 Fotocorrientes en Zea mays 78

Figura 4.4 Cinética de la fotocorriente en Amaranthus 79

Figura 4.5 Efecto de la preiluminación en la cinética de la fotocorriente 82

Figura 4.6 Efecto de la oscuridad en la cinética de la fotocorriente 83

Figura 4.7 Amplitud del componente rápido VS. tiempo en la oscuridad 85

Figura 4.8 Amplitud del componente rápido VS. duración del prepulso 86

Figura 4.9 Detalle del esquema Z desde el punto de vista de los procesos 94
 7

INDICE DE TABLAS

Tabla 1.1 Ecuación del transporte fotosintético 18

Tabla 2.1 Solución aisladora 43

Tabla 2.2 Solución de pipeta 44

Tabla 2.3 Solución para obtener blebs 46

Tabla 4.1 Cinética de fotocorrientes 81

 8

REVISION DE CONCEPTOS BASICOS Y OBJETIVO DEL TRABAJO

1.1 INTRODUCCIÓN

1.1.1 El proceso fotosintético

La fotosíntesis es la base de casi la totalidad de la vida actual en la tierra. Es la única

manera de transformación de la energía solar en la energía química de los

componentes biológicos. Además el proceso fotosintético es el responsable de la

recuperación del oxígeno atmosférico y del mantenimiento de la vida, particularmente

la de la especie humana.

El proceso fotosintético es representable mediante la fórmula

luz
nH2O + nC02 + CnH2nOn + nO2

que representa el transporte de electrones del agua al bióxido de carbono y la posterior

formación de azúcares y liberación de oxígeno.

 Las reacciones que tienen lugar durante la fotosíntesis se pueden agrupar en dos

categorías muy amplias:

1) Las reacciones de transferencia electrónica fotosintética o reacciones

lumínicas, y

2) Las reacciones fijadoras de carbón, o reacciones oscuras.

El transporte electrónico fotosintético (categoría 1) es un proceso de reducción

representable por la analogía del proceso de electrólisis del agua como se ve en la figura
1.1. En presencia de luz la celda genera una corriente eléctrica por un proceso de

excitación básicamente similar a la excitación lurnínica de la clorofila. Así, la energía

lumínica se convierte en energía eléctrica que es usada luego para romper los enlaces O-H

y obtener el hidrógeno en el lado del cátodo y el oxígeno en el lado del ánodo.

El proceso electrolítico es análogo a la fotosíntesis en el sentido de que en éste

último la energía lumínica es usada para romper enlaces O-H con liberación de oxígeno

generando una corriente eléctrica en una reacción que incluye a la clorofila (molécula

sensible a la luz y en la que se inicia el proceso de conversión energética) en un proceso

similar, en lo fundamental, al que ocurre en una celda fotoeléctrica.

La diferencia entre ambos procesos radica en que el transporte de los electrones en

la fotosíntesis sucede como una transferencia de un transportador a otro en un proceso de

oxidación/reducción y no como un flujo de electrones a través de un conductor metálico,

como sucede en un sistema de electrólisis.

 10

+
“c$
2H20
02
+

c----- 2H++2OH-

e-
Fotocelda
l e-

Fig. 1.1 En este esquema se muestra el proceso de electrólisis del agua utilizando una fotocelda como
fuente de la energía eléctrica necesaria para la descomposición del agua. El proceso mostrado aquí es
análogo al fenómeno de liberación de oxígeno en la fotosíntesis. El trabajo realizado por la energía
eléctrica, en la que ha sido transformada la energía luminica, descompone dos moléculas de agua en dos
protones que se mueven hacia el cátodo donde aprovechan dos electrones para formar una molécula con dos
átomos de hidrógeno, y dos hidroxilos que se recombinan liberando una molécula de agua, un átomo de
oxígeno y dos electrones, siendo éstos últimos donados al ánodo.
 ll

1.1.2 Organización espacial y funcional de las reacciones luminicas en la fotosintesis

En las plantas verdes la fotosíntesis se lleva a cabo en un organelo intracelular

llamado cloroplasto y que se encuentra en algunas células vegetales.

La apariencia externa de los cloroplastos es lenticular y se encuentran inmersos en

el citoplasma de la célula que los contiene. Un cloroplasto está limitado externamente por

una cubierta conformada por una doble membrana (membranas interna y externa), y en su

interior se encuentra una estructura con la forma de apilamiento de discos, a los que se

llama grana, inmersos en una substancia a la que se llama estroma. La membrana que

conforma los grana es la membrana tilacoidea y es en ella que se encuentran alojados los
fotosistemas en los que se realiza la transformación energética que caracteriza la

fotosíntesis (Fig. 1.2).

Fig. 1.2 Cloroplasto de planta de arroz en la que se observa los grana

formados por la membrana tilacoidea además de algunos granos de
almidón (modificada de Laza et al, 1993)
 12

La membrana tilacoidea tiene insertas varias proteínas que desempeñan diferentes

funciones directamente relacionadas con la transformación de la energía lumínica en

energía adecuada para síntesis de moléculas altamente energéticas que a su vez

proporcionan la energía para la síntesis de compuestos orgánicos. Contiene, pues, todos

los sistemas transformadores de energía del cloroplasto. La imagen de los cloroplastos

ofrecida mediante microfotografia parece sugerir que la membrana tilacoidea es una

conformación de arreglos separados de pequeños discos o vesículas aplanadas, sin

embargo los resultados de microfotografías de membrana tilacoidea congelada y

fracturada parecen mostrar que se trata de una sola membrana complejamente plegada

(Fig. 1.3). La membrana tilacoidea está doblada de manera tal que separa un espacio,

llamado espacio intratilacoideo, del interior del cloroplasto al que se llama estroma.

Fig. 1.3 Detalle en la que se muestra la manera compleja en que la

membrana tilacoidea se pliega formando los grana (modificada de
Schönknechcht, 1990)
 13

Existe todavía mucho por conocer sobre la forma exacta como se distribuyen los

diferentes componentes en la membrana tilacoidea y de la forma como interactúan entre

ellos, así como de la estructura precisa de cada una de tales proteínas. La figura 1.4

presenta la organización principal de los componentes de la membrana fotosintética,

incluyendo los complejos fotosintéticos 1 y II, los complejos colectores de luz y el factor

de acoplamiento de H+ ATPasa. Un esquema más detallado que incluye los elementos de

los fotosistemas I y II, se muestran el la figura 1 5.

GRANA ESTROMA /

Fig. 1.4 Forma en que los componentes proteicos de la membrana

tilacoidea están organizados. PSI es el fotosistema 1, PSI1 es el
fotosistema II, LHC es el complejo colector de luz, CF1 es un factor de
acoplamiento llamado ATPasa, CF O es la base del factor de acoplamiento
(modificado de Walker 1992).
 14

TILACOIDE

. REDUCTASA

ESTR

4H+ ESPACIO
INTRATIIACIDEO
COMPLEJO PROTEINICG
CLOROFILICO DE PSI

TIIACOIDE

Fig. 1.5 Los complejos proteicos-clorofílicos colectores de luz llevan la energía de

excitación a P680, el centro de reacción de PSII, el cual eleva electrones hasta Q, y de
ahí, vía la plastoquinona y el citocromo f hasta P 700, el centro de reacción de PSI y que
no aparece representado en esta figura. La excitación lumínica de PSI eleva electrones
hasta una proteína de hierro- azufre, y de ahí a través de la ferredoxina hasta la
NADPreductasa. El transporte de electrones genera un gradiente de protones a través de
la membrana tilacoidea que se descarga a través de la ATPsintetasa generando ATP de
ADP y fosfato inorgánico (tomado de Walter 1992).Abreviaturas:ADP=difosfato de
adenina; ATP = ácido adenosin-trifosfórico; CFl, CFO=elementos de la ATPasa;
Q=quinona; P=pigmento f o t o - s e n s i t i v o ; Cyt-citocromo; Pc=plastocianina; Z ,
Y=sistema ensimático desintegrador de agua; A=aceptor; B=molécula conectora de
plastoquinona; PQ= plastoquinona; Pi=fosfato inorgánico.
 15

En la propuesta del esquema Z para la fotosíntesis que se muestra en la figura 1.6

se incluyen los diferentes eventos y la secuencia en que se dan durante el proceso

fotosintético. Es de notarse la existencia de procesos vectoriales de transporte electrónico

a través de la membrana tilacoidea en los complejos fotosintéticos 1 y II; el acoplamiento

del transporte electrónico y protónico entre fotosistemas; dos sitios de reacciones

protónicas adicionales: uno de liberación de protones en el complejo de desintregación

del agua y otro de absorción de protones por la reducción de NADP+. Lo anterior se

resume en la siguiente ecuación:

4hv+ H2O+ 3H+ + NADP’ + 1+O2 + 4H’ + NADPH(+Ap)

donde A$ es la diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana. En otras

palabras, el proceso fotosintético lleva a la formación de un gradiente electroquímico de

H+, según la siguiente ecuación,

AP/p =Av+ApH

El transporte de protones desde el lumen hasta el estroma en la dirección del

gradiente electroquímico a través del canal protónico CFo esta acoplado con síntesis de
ATP en el factor de acoplamiento CFI de la ATPasa. Este concepto, que es el fundamento

del bioenergética moderna, fue expresado por primera por P. Mitchell(l96 1, 1966).
 16

ESTROMA

òk,Ae, NADP+
\

e-T
S

;i ‘1 P 700

?r
PC
e-

‘2 0 2 H+ LUMEN
H+

Fig. 1.6 Esquema-Z de la fotosínteis. Los pasos electrogénicos se marcan con flechas huecas (movimiento
de cargas +). PQ/PQH2 es por plastoquinona/plastoquinol. PC es por plastocianina. FeS es por proteina de
Reske. Cyt f es por citocromo f. Los donantes primarios de PSI y PSII se designan como PToo y Pw,. Fd es
ferredoxina y A es un aceptor.

El papel que la luz desempeña en los procesos fotosintéticos puede ser entendido por

el diagrama energético mostrado en la figura 1.7 que en principio no es mas que el

esquema 2 presentado como un diagrama energético: absorción de la luz por los

pigmentos Pb80 y P700 con un cambio de nivel electrónico, el consecuente potencial

redox de aproximadamente 1.9 V y 1.8 V respectivamente. Una parte de la excitación

de los pigmentos se convierte en procesos fotosintéticos que siempre van

termodinámicamente cuesta abajo con disminución de la energía libre.

 17

PSI
-IA,

-11

-10
ZNADP+
-08 z+H+
i /
- o h - -1 (estroma)

- 0 . 4 -.. I
ZNADPH

-01-

o -
I’& )
OS?-

OA-

OR-
2”2O
0.8 - -
1 e,-
1.0 -?2+4.H
(tUacorde)
?2-

Figura 1.7 Detalle del esquema z para la fotosíntesis desde el punto de vista de la energía. Se
observa cómo los electrones excitados van perdiendo su energia hasta quedar en un estanque de
moléculas de plastoquinona (Q), convirtiendose en plastoquinol que reduce al citocromo b6f, el que
transfiere electrones con la consiguiente translocación de protones hacia el espacio tilacoideo. El
citocromo bf6 transfiere los electrones a la plastocianina (PC) que regenera al fotoxidadado P700.
Los electrones excitados en P700 también caen energéticamente hasta el sitio donde se da la
reducción de NADP’ en NADPH. Los electrones de P700 pueden regresar a b6f en proceso cíclico.
 18

Los productos de la fotosíntesis se estabilizan mediante los tres siguientes mecanis-

mos cinéticos:

- a) La primera transferencia electrónica es extremadamente rápida,

alrededor de 3 ps de modo que se evita la reacción inversa de des-

excitación, esto es, la fluorescencia;

- b) las transferencias electrónicas posteriores son cada vez más lentas

(al menos por un factor de lo), y

- c) una pérdida energética en pago por la estabilidad resultante.

Lo anterior dicho que expresado resumidamente en la tabla 1 .l para el caso del

fotosistema II, pero la estrategia es la misma para el fotosistema 1.

[Z 4ím Pheo QA QB 1 (centros abiertos)

&hv
[Z P&, Pheo Q, Q, ]
4 (3 PS)
[Z f& Pheo- QA QJ
(250-300 ps)
-1
[Z ps8,, Pheo QA QB] (centros cerrados)
4 (20 ns- PS)
[z’ eS,, Pheo QA QJ
Ae- (50 ,us-1.3 ms)
[Z esO Pheo QA QB]
&
(1 OO-200 #as)
[Z &, Pheo QA Qi] (centros abiertos)

Tabla 1.1 Ecuación que describe de manera breve los eventos involucrados en el transporte fotosintético de
electrones en el centro de reacción del PS II. Pheo es feofitina; QA y QB son aceptores de electrones tipo
quinona del fotosistema II; P es un pigmento; 2 es el donador secundario del fotosistema II; (tomada de
G.H. Krause y E. Weis, Chlorophyll Fluorescente and Photosynthesis. . The Basics, en Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mal. Biol. 1991. 42:3I3-349)
 19

La transferencia electrónica entre los fotosistemas 1 y II incluye transportadores de

uno y dos electrones. La interacción de transportadores de dos electrones, la quinona, con

una cadena de transportadores monoelectrónicos se realiza con la ayuda del ciclo Q el que

incluye el complejo b6f (ver figura 1.8). Este mecanismo es discutido por Andréasson y

colaboradores (1988).

Otro mecanismo interesante que aparece en el fenómeno del transporte electrónico

es el representado por el acoplamiento entre el proceso de desintegración del agua que

lleva 4 electrones para producir una molécula de oxigeno y la cadena monoelectrónica en

el núcleo del PSI1 está tratado en detalle por Beck y dePaula (1989), y Brudvig (199 1).

Finalmente, prestaremos atención a un aspecto importante referente a la

composición del gradiente electroquímico de H’ en los cloroplastos, el cual es muy

diferente en comparación con el de la mitocondria. (ver figura 1.9). En el cloroplasto el

diferencial electroquímico (A& es casi en su totalidad compuesto por ApH, mientras que

en la mitocondria éste está formado casi en su totalidad por un diferencial de potencial

eléctrico (A<p). Desde el punto de vista del funcionamiento de la ATPasa la composición

del gradiente electroquímico no tiene importancia, pero sí la tiene para propósitos de la

regulación del transporte electrónicolprotónico [Weis (1987), Heber (1992).

 20

embrana externa

Membrana interna

2H+ + 2NADP+
\

Estmma

Lumen
tilacoideo

Figura 1.8 Representación esquemática de la membrana tilacoidea mostrando los componentes de

la cadena transportadora de electrones. El sistema consiste de tres complejos proteicos: PSII, el
complejo de citocromos b6f y PSI, los que están conectados elCctricamente entre sí por la difusión
de los transportadores de electrones plastoquinol (Q) y plastocianina (PC). El transporte de
electrones fotoinducido desde Hz0 a NADP’ formando NADPH origina el transporte de protones
hacia el espacio tilacoideo (Fd es por ferredoxina). Los protones adicionales son obtenidos del agua
por el complejo productor de oxígeno (OEC), produciendo 02. El gradiente protónico resultante da
la energía necesaria para la síntesis de ATP en la ATPasa CFICFO translocadora de protones. En la
membrana también existen complejos colectores de luz cuya clorofila y otros cromoforos
transfieren sus excitaciones a PSI y PSI1
 21

MITOCONDRIA
pH7 pH*
1

membrana membrana
interna externa
estroma
\ \
i J

PH5 PH8 ti7

CLOROPLASTO

13 =ATPasa

Figura 1.9 Comparación entre las estructuras de la mitocondria y el cloroplasto. Es de notarse el

hecho de que aunque ambos organelos tienen sistemas ATPasa que funcionan gracias a un
gradiente electroquímico, la proporciones del gradiente correspondientes a los componentes
eléctrico y químico son diferentes en cada organelo. En el caso del cloroplasto es el componente
químico el preponderante, mientras que en la mitocondria se invierte la proporción.
 22

1.1.3 Métodos y técnicas de investigación del proceso fotosintético

Los métodos para investigar los diferentes aspectos involucrados en el proceso

fotosintético son de lo mas variado y responden al aspecto específico que se quiere

estudiar, ya se trate de la parte lumínica del proceso o de la parte oscura del mismo. La

parte oscura incluye sobre todo técnicas bioquímicas, mientras que la parte lurnínica se

estudia sobre todo por técnicas biofkicas.

Una lista no exhaustiva de tales métodos incluye:

- Evolución del oxigeno para estudiar el transporte electrónico en el fotosistema

II.

- Espectroscopia en diferentes rangos de la radiación electromagnética ha sido

utilizada para averiguar la orientación de las estructuras proteicas secundarias y

las reacciones primarias en la fotosíntesis. Por ejemplo, la espectroscopia de

absorción laser es usada para el estudio de los procesos rápidos en los centros de

reacción; la espectroscopia de absorción diferencial que ha sido usada en el

estudio de transporte electrónico en el interior de los fotosistemas.

- Resonancia electroparamagnética: uasada para el estudio de centros redox

mediante la detección electrones no apareados. Por ejemplo, en el complejo de

desintegración de agua, en la semiquinona y los centros FeS; en parte de los

aceptores de PSI y en el complejode citocromos b6f.

- Resonancia magnética nuclear: Para indagar sobre las características funcionales

y estructurales de los diferentes elementos que participan en el proceso

fotosintético.

- Por último, pero no siendo por ello la técnica menos importante, tenemos el
análisis de la fluorescencia que permite el estudio del estado abierto y cerrado de
 23

los centros de reacción y la consecuencia de ello en la regulación y control de la

fotosíntesis.

El estudio de la fluorescencia en las plantas, en particular, es uno de los métodos

que, junto con otras técnicas, ha sido muy esclarecedor de lo que ocurre en el fenómeno

fotosintético.

La fluorescencia de la clorofila, cuando es emitida desde una hoja, ofrece

información importante sobre el fenómeno de la fotosíntesis. Se origina en el fotosistema

II (PSII) alcanzando hasta un 3% de la luz absorbida, a diferencia del 30% para la

clorofila a en solución. Desde hace mucho tiempo se propuso que debe existir una

relación inversa entre la fluorescencia de la clorofila a emitida por las hojas y la

asimilación fotosintética del carbono.

La idea es que si la fotosíntesis es activada por el estado excitado de electrones de

la molécula de clorofila, entre más energía de excitación sea usada para el propósito

fotosintético menos de ella estará disponible para ser disipada en forma de luz o calor.

En la Figura 1.10 se muestra como la asimilación del carbono, representada por la

producción de oxígeno, empieza lentamente cuando la hoja, previamente en la oscuridad,

se ilumina abruptamente, mientras que la fluorescencia inicia con un valor muy alto para
luego irse invirtiendo los valores. Eso es precisamente lo que se esperaría que sucediera si

se supusiera que a los procesos bioquímicos de la fotosíntesis que no requieren de la luz

como fuente de energía, procesos a los que suele llamarse “bioquímica de la oscuridad”,
les toma algún tiempo iniciar, mientras que la fenómenos fotoquímicos empiezan

inmediatamente después de iniciado el flujo de fotones.

 24

,
OX/GF/vO ,xr’
/-
/
/
,,
,’
#’
<
,’ FLUORESCENCIA
/.
.-

I I I I I I
2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO CMI N)

Fig. 1.10 La asimilación fotosintetica del carbón inicia lentamente cuando una hoja que esta en la oscuridad
se ilumina abruptamente. Durante un periodo de inducción la fluorescencia se eleva rápidamente para
luego decaer, a veces mostrando picos secundarios, hasta un nivel de estado estable (tomado de Wulker,
David Energy, Plants and Man, Editorial Oxigraphics, segunda edición, 1992). Las unidades no vienen
indicadas en la referencia, pero en la literatura se reportan en uM para el O2 y unidades relativas para la
fluorescencia.

1.1.3.1 La técnica de “Patch Clamp”.

Hemos visto ya que se han usado diferentes técnicas para estudiar los procesos

fotosintéticos, cada una de ellas facilitando la observación de diferentes facetas del objeto

de estudio. Uno de los fenómenos relacionados con todas las membranas celulares o
membranas en organelos es el de los flujos de iones a través de ellas. Desde los anos

cincuenta los biólogos han tenido la capacidad de estudiar tales flujos a nivel

macroscópico, pero es solo a partir de los años setenta que se contó con una técnica que

permitiese el estudio de los canales individuales responsables de los flujos iónicos a

través de las membranas: es la técnica denominada en inglés “Patch Clamp” e inventada

por Erwin Neher y Bert Sakmann, trabajo por el que se hicieron acreedores al premio
Nobel en 199 1 (Neher y Sakmann, 1992).
 25

La técnica es esencialmente simple. Consiste en colocar la punta’de una pipeta de

vidrio, con un perfil adecuado, sobre la superficie de la célula u organelo de manera que

los bordes de la pipeta establezcan un sello que aísle del resto de la membrana la fracción

de la misma que queda al interior del hueco en la pipeta. Presumiblemente, la fracción de

membrana ahlada contendrá algunos canales que se pue&n estua!iíar. Los canales

La técnica también permite al investigador separar el pedazo de membrana en la

punta de la pipeta para exponer la superficie interna al exterior, o abrir una ventana al

interior de la célula u organelo vivos abriendo la posibilidad de alterar controladamente

los componentes al interior.

Neher y Sakmann se enfocaron, en 1973, a resolver un problema que existía para

la medición de eventos unitarios en las señales sinápticas: el ruido de fondo asociado con
las corrientes de iones cruzando las membranas de la células (Neher y Sakman, 1992). Si

bien ese ruido es del tamaño de una diezmillonésima de ampere, es 100 mayor que la

magnitud de la corriente correspondiente a un evento unitario de flujo iónico en el canal.

Su esfuerzo concluyó con la técnica mencionada antes.

En esta técnica se incluyen tres maneras o configuraciones principales de lograr el

“patch”:
- “Cell Attached”: Presionando la pipeta de Patch sobre la superficie
limpia de una célula (Fig. 1.11) se le aplica una succión suave,

pudiendo lograr de esta manera un sello en el orden de los GR (Fig.

1.12). En estas condiciones se pueden aplicar diferentes estímulos a la

 26

fracción de membrana desde el interior de la pipeta y medir las

respuestas de los canales aislados.

- “Inside Out”: Una vez establecido el sello, en vez de aplicar

estímulos inmediatamente se puede separar la fracción de membrana
sellada y exponer la abertura inferior de los canales (Fig. 1.13).

- “Whole Cell”: La tercera opción es la de romper la fracción de

membrana sin destruir el sello para exponer de esta manera el interior

de la célula o del organelo (Fig. 1.14).

Existe una cuarta configuración llamada “Outside Out” que es equivalente a

“Whole Cell” en el sentido de que el interior de la membrana queda expuesta al contenido

en la pipeta y el exterior de la misma es expuesta al medio exterior.

La técnica de “Patch Clamp” fue utilizada hasta antes de este trabajo para estudiar

corrientes iónicas fotoinducidas a través de las diferentes membranas de cloroplastos

gigantes (ver sección de antecedentes a este trabajo).

Figura 1.11 En la técnica de “Patch Clamp” la pipeta se coloca y se presiona sobre la superficie de
la membrana u organel para aislar una fracción de la superficie.
 27

Figura 1.12 Al hacer succión se aisla una tiacción de la membrana del resto de la membrana. A
esta configuración se le denomina “Cell Attached”.

Figura 1.13 Estando en la configuración “Ce11 Attached” se puede separar la fracción de la

membrana aislada mediante un ligero tirón. A esta configuración se le denomina “Inside Out”
 28

Figura 1.14 Estando en la configuración “Ce11 Attached” se puede, mediante una succión
adecuada, romper Ia membrana y exponer el interior de la célula. A ésta configuración se le
denomina “Whole Cellt”.
 29

1.2. ANTECEDENTES A ESTE TRABAJO

Los antecedentes al trabajo presentado en esta tesis están conformadas

básicamente por tres líneas de estudio: la primera se refiere al uso de electrodos para

estudiar procesos fotosintéticos en células vegetales, la segunda es el uso de métodos

indirectos para el estudio de variaciones de voltaje y de pH en el mismo tipo de objetos de

estudio y la tercera es el registro de canales únicos en membranas de cloroplasto.

En una serie de experimentos clásicos A. A. Bulychev (1972), utilizando la

técnica de microelectrodos, pudo registrar cambios de voltaje a través de la cubierta de

cloroplastos gigantes de Peperomia metdica. La existencia de potenciales eléctricos en

la membrana fotosintética del cloroplasto y su estudio eran importantes para aclarar la

conexión entre la electrogénesis y la fotosíntesis ya que la generación de un potencial

eléctrico inducido por luz en dicha membrana es una característica esencial de la hipótesis

quimiosmótica de P. Mitchel (1968). Los resultados obtenidos por Bulychev son de

mucho interés y son una confirmación de la hipótesis quimiosmótica.

Los experimentos de Bulychev fueron realizados colocando un electrodo en el

interior del cloroplasto y otro en el citoplasma. Se encontraron diferencias medias de

potencial in situ entre el interior del cloroplasto y el citoplasma, que variaban desde + 15

mV hasta -60 mV dependiendo de varias condiciones. El potencial de membrana en

cloroplastos aislados se midió entre -20 mV y +30 mV. El acto de iluminar la célula con

luz blanca provocó dos tipos de cambio en el potencial de membrana: uno lento y uno
rápido, pudiéndose en algunos casos observar ambos simultáneamente.

El cambio lento de potencial fotoinducido se observó asociado con un

deslizamiento en la dirección negativa de lo-20 mV durante un lapso de tiempo de l-3
 30

min, estabilizándose posteriormente. Al apagar la luz el potencial regresa a su estado

original. Los cambios rápidos de potencial se dan mediante un deslizamiento en la

dirección positiva de 1 O-30 mV que tiene lugar en un periodo de tiempo de lo-50 ms,
estabilizándose posteriormente en un valor constante. Bulychev comprendió que el

tiempo de elevación del potencial bien podría ser menor que 10 ms, pues ese era el límite

de resolución de su equipo.

Como ya se dijo, los registros de voltaje se realizaron tanto in situ como en

cloroplastos aislados, repitiéndose, en lo esencial, los resultados previos. En la figura 1 se

muestran algunos de los registros logrados por Bulychev.

La presencia de DCMU [3-(dichlorophenyl)- 1, 1 -dimethylurea], un bloqueador

del proceso fotosintético, inhibió los cambios de potencial tanto los rápidos como los

lentos, y la adición de “phenazine methasulpahate”, un transportador electrónico similar a

la quinona, pero mas rápido, restaura las variaciones. En cloroplastos aislados los
cambios de potencial quedaron inhibidos por un desacoplador de fosforilación, el

carbonyl cyanide p-trifluoromethoxy-phenylhydrazone (FCCP), tal como lo exige la

teoría quimiosmótica de Mitchel. La reversibilidad y la magnitud del efecto, el modo de

acción de los inhibidores y el espectro de acción son un indicador de que lo que se

registró no es un artefacto.

Los cambios fotoinducidos corresponden, en tiempo, a los cambios de

concentración de H+ fotoinducidos en cromatóforos de bacteria y en cloroplastos de

plantas superiores descubiertos por varios autores como Chance y colaboradores (1970) e

Izawa y colaboradores (1967).

 31

El decaimiento del potencial de membrana se podía interpretar cómo producto de

un proceso compensatorio de transporte iónico a través de la membrana tilacoidea.

On
0 5 10
S

Figura 1.15 En la parte izquierda de la figura se muestra el registro de una variación lenta del potencial
de membrana en un cloroplasto gigante de Peperomia metallica, mientras que en la parte derecha se
muestran varios registros de la variación rápida a varios intensidades de luz, según Bulychev (1972).

Bulychev y colaboradores, hicieron estudios posteriores utilizando la misma

técnica de electrodos en cloroplastos gigantes tanto para refinar la técnica como para

investigar aspectos particulares de los resultados obtenidos en los cambios de potencial

fotoinducidos. En particular existía interés en esclarecer la relación entre los cambios de

potencial inducidos por luz y los cambios de la permeabilidad a H+ inducidos por luz en
membranas del cloroplasto.
 32

Para 1986 era generalmente aceptado que el transporte electrótiico fotoinducido

en la membrana del cloroplasto estaba acoplado a la síntesis de ATP mediante un

diferencial electroquímico de H+,

A&f+

Para poder evaluar la contribución al gradiente electroquímico correspondiente a

cada uno de los componentes eléctrico (Acp) y químico (ApH) se hacía necesario realizar

las mediciones del potencial de membrana del gradiente de pH en las membranas

tilacoideas bajo condiciones y métodos similares. RemiS y colaboradores (1986)

utilizaron microelectrodos de antimonio aislados con vidrio sensibles a pH para medir la

diferencia de potencial entre el microelectrodo colocado en el interior de un cloroplasto

gigante de Peperomia metallica y un electrodo de referencia colocado en el exterior

durante una estimulación luminosa, comparando el resultado con el cambio de potencial

fotoinducido en la membrana.

Se detectaron dos componentes, uno rápido y uno lento, y se obtuvieron dos

conclusiones principales de los experimentos realizados:

l- Las propiedades del componente lento de la fotorespuesta registrada con

los electrodos de pH son consistentes con la sugerencia de que este
componente refleja una acidificación del interior de los tilacoides en
presencia de luz.

2- Una reducción en el gradiente de pH a través de la membrana tilacoidea

utilizando NH&1 es acompañada por un incremento en el potencial de
membrana.

En las figuras 1.16 y 1.17 se muestran algunos de los resultados obtenidos.

 33

Vale hacer notar que el voltaje registrado por el electrodo de pH cuando la punta

del mismo se encuentra en el interior del cloroplasto está dada por la ecuación,

AV = Ap- F(pH, - p H , )

en la que Acp es el potencial de membrana fotoinducido, pH¡ es el pH interno en tilacoides

iluminados, pHd es el pH interno en tilacoides en la oscuridad, R es la constante de los

gases, T es temperatura absoluta y F la constante de Faraday.

pH 25

Figura 1.16. (A) Potencial de membrana fotoinducido en un cloroplasto aislado de Peperomia metallica registrado
con microelectrodos capilares. (B) Sefial de voltaje fotoinducido registrado con un electrrodo de antimonio para pH
en un cloroplasto aislado (según RemiS et al, 1986).
 34

La variación fotoinducida de pH en el estroma es entre 4 y 5 veces más pequeño

que la variación correspondiente en el interior de los tilacoides, por lo que se puede

asumir que (pH¡-pHd) es casi igual a la diferencia de pH a través de la membrana

tilacoidea y, que por tanto, AV representa aproximadamente el curso temporal la

formación del diferencial electroquímico a través de la membrana tilacoidea.

Figura 1.17. Una representación esquemática de la seiíal registrada con un electrodo de antimonio para pH
como la suma de dos componentes, el potencial de membrana y el cambio de pH en el lumen tilacoideo.

En el proceso de estudio de los fenómenos producidos por la luz en los tilacoides

de cloroplastos se había determinado ya, como hemos visto antes, que el transporte
electrónico fotosintético está asociado con la introducción de protones al interior del

cloroplasto y la formación de un diferencial de potencial eléctrico a través de la

membrana. La cinética del desarrollo del potencial eléctrico en las membranas tilacoideas
 35

en presencia de luz sigue un patrón complejo, y su relación con los diferentes flujos

iónicos era entendida solo parcialmente a través del método indirecto de análisis de los
cambios de absorvancia electrocrómica (Junge y Jakson, 1982) y los esfuerzos realizados

con técnicas basadas en uso de varios tipos de microelectrodos, como hemos visto
previamente.

Se había determinado que el diferencial electroquímico genera un transporte

positivo de iones entre los tilacoides y el estroma del cloroplasto. Se había establecido
que la ATPasa produce un flujo inverso de H’ a través de canales disparado por la síntesis

de ATP. También se habían descubierto eflujos de K” y Mg2+ junto con la toma de Cl- en

presencia de luz (Hind et al, 1974; y Bulychev y Vrenderberg, 1976), flujos iónicos que se
consideraban mediados por canales iónicos y que forman parte de los mecanismos de

compensación eléctrica que hace que el diferencial electroquímico a través de la

membrana tilacoidea sea sobre todo un gradiente de pH y muy poco de potencial

eléctrico.

Schönknecht y colaboradores (1988) lograron caracterizar un canal de cloro

dependiente de voltajes en blebs de tilacoide de Peperomia metallica y Tester y Blatt

(1989) observaron canales de K” en membranas lípidas planas con tilacoides de espinaca

integradas. Pottosin (1992) y Thaler y colaboradores (1992) han detectado canales de

cloro en Nitellopsis y Eremospheara viridis mediante la técnica de “patch- clamp” y

microelectrodos selectivos de iones.

Tratando de clarificar algunos detalles observados en los registros de potencial

fotoinducido Bulychev y colaboradores registraron corrientes fotoinducidas bajo

potencial de membrana controlado utilizando la técnica de patch-clamp en la membrana

de cloroplastos aislados de Peperomia metallica tratando de distinguie los componentes

 36

relacionados con la translocación primariade K’ y los flujos iónicos secundarios con base

en las diferentes dependencias del potencial de membrana.

En la figura 1.18 se muestran algunos de los resultados obtenidos en cuanto al

registro de corriente, registro de potencial de membrana y las posibles configuraciones en

4ht 12”
que se realizaron las mediciones.

J - b -
d+

Figura 1.18 En (a) se muestra un corriente ionica entrante a un potencial de membrana de 0 mV. En
(b) se trata de la fotorespuesta del potencial de membrana en el mismo cloroplasto. En (c) se muestra la
probable configuración de patch-clamp ilustrando el origen de la focorriente entrante. En (d) se muestra
la inversión de una fotocorriente después de la separación de a la vesícula localizada en la punta de la
pipeta. En (e) se muestra un diagrama que explica el origen de una focorriente saliente después de que
se separó la vesícula en la pipeta. Las flechas muestran el encendido y apagado de la luz (según
Bulychev et al, 1992).

La idea que en el momento se tema era de que la transferencia de electrones

fotoinducida en la membrana fotosintética produce el bombeo activo de H” hacia el

interior del lumen tilacoideo produciendo un gradiente de pH a través de la membrana,

gradiente que activa una ATPasa translocadora de protones para la síntesis de ATP,
 37

mientras que la alcalinización del estroma es necesario para la activación de enzimas

importantes en el ciclo de fijación de CO2 (Junge y Jakson, 1982; Heldt et al, 1973; Baler

y Latzko, 1975).

En resumen, al momento de iniciar este trabajo la formación del gradiente

electroquímico para protones a través de la membrana tilacoidea en presencia de luz ha

sido explorado previamente por diferentes métodos indirectos incluyendo mediciones con

colorantes sensitivos a pH y a potenciales eléctricos (Auslander y Jung, 1974;

Schuurmans et al, 1978), el monitoreo de cambios de absorbaucia electrocrómicos de

pigmentos fotosintéticos a 515 nm (Junge y Jakson, 1982) y mediciones de intensidad de

fluorescencia desfasada (Bulychev et al, 1985). El registro directo mediante técnicas de

microelectrodo (Bulychev et al, 1972; 1976; 1985; Vrendenberg, 1976; RemiS et al, 1986)
solo había sido posible en dos especies de plantas, la Peperomia metallica y Anthoceros

sp., las cuales tienen cloroplastos anormalmente grandes. Recientemente Bulychev y

colaboradores (1992) demostraron la aplicabilidad de la técnica standard de “patch-

clamp” en la medición de la transferencia electrónica inducida por luz a través de la

membrana fotosintética de Peperomia metallica. La ventaja del método de “patch-clamp”

es la posibilidad de trabajar con objetos pequeños, en el rango de unos cuantos Pm y se ha

empleado con éxito en el estudio de canales iónicos en la cubierta de cloroplastos intactos

del alga Charophyte, Nitellopsis obtusa (Pottosin, 1992; 1993).

Igualmente, la actividad de los canales de la cubierta del cloroplasto también ha

sido investigada en diferentes sistemas reconstituidos (Flügge y Benz, 1984; Keller et al,
1988; Wang et al, 1993; Mi et al, 1994). Hasta antes de realizar este trabajo, no pudimos

conseguir ningún reporte sobre el uso de la técnica de “patch clamp” con este propósito

en cloroplastos de plantas vasculares.

 38

Dado lo anterior consideramos que podía resultar productivo aplïcar la técnica de

“patch clamp” tanto para registrar fotocorrientes como la actividad de canales en

cloroplastos de plantas vasculares cuyo tamaño es menor al de las especies hasta ahora

estudiadas.
 39

1.3 OBJETIVO

En este trabajo exploramos la aplicación de la técnica de “patch-clamp” para

estudiar los fenómenos electrofisiológicos de canales iónicos en la cubierta de

cloroplastos y corrientes fotoinducidas en la membrana tilacoidea en cloroplastos intactos

obtenidos de hojas de las plantas vasculares C4 Amaranthus hibridus y Zea mayz.
 40

EQUIPO, MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

2.1 EQUIPO DE EXPERIMENTACIÓN Y REGISTRO

Para realizar los experimentos se utilizó un “set” que incluyó: un microscopio

Nikon DIAPHOT-TMD, un amplificador electrónico de bajo ruido (descrito en el

siguiente párrafo), un sistema de iluminación con fibra óptica, el cuerpo de una cámara

Minolta XG-1, y una jaula de Faraday (ver Fig. 2.1). Además se utilizaron un

estirapipetas y una microforja para la fabricación de las pipetas utilizadas en los

experimentos.

El amplificador electrónico usado fue construido por Gilberto Ornelas

(CUICBAS, Universidad de Colima) y Carlos Onetti (CUIB, Universidad de Colima)

según el diseño descrito por F.J. Sigworth en “Electronic Design at the Patch Clamp” (en:

Single Channel Recording, B. Sackmann y E. Neher, eds; Plenum Press, 1983).

También se utilizaron una computadora y un osciloscopio para registro de

respuestas a los estímulos aplicados a las membranas, y una cámara tipo polaroid para

tomar fotografías de los registros en la pantalla del osciloscopio.

 41

Punta de prueba
Amplificador

Fuente de iluminación

Fibra óptica

Fig. 2.1 “Set” utilizado para los experimentos realizados en este trabajo. Todo el conjunto, con excepción
de la fuente de luz y el amplificador, va dentro de una jaula de Faraday, a su vez cubierta con tela obscura
para control de la luz. La fibra óptica permite llevar la luz desde la fuente de iluminación hasta la cámara
que controla la duración de los pulsos de luz.
 42

La computadora fue utilizada además para controlar los patrones de voltaje

utilizados en los experimentos. En la Figura 2.2 se muestra un diagrama de bloques para

las conexiones entre las partes del equipo relacionadas con el registro de repuestas y el

control de estímulos.

PIPETA Y
ELECTRODO

ELECT& & l0sc.l

DEL BAiiO

Fig. 2.2 Diagrama de bloques representando las

conexiones entre los diferentes equipos relacionados
con el registro de respuestas y control de estímulos.

2.2 PREPARACIÓN

Las plantas de las que se obtuvieron las hojas utilizadas para la experimentación

fueron plantas silvestres para el caso del Amaranthus hybridus, mientras que para Zea

mays se recurrió a plantas de los maizales cercanos al laboratorio (aunque al principio se

cultivaron ambas plantas, fueron mas las dificultades que las ventajas en hacerlo). Las

hojas se recolectaron por la mañana y se mantuvieron a 4 “C a lo largo del día, evitando

de esa manera la formación de almidón.

Después de la recolección de las hojas, el paso siguiente fue el aislamiento de los

cloroplastos a utilizar en los experimentos. Se probaron varios métodos para aislar

cloroplastos, incluyendo algunos que implicaban un proceso de centrifugado. Finalmente
 43

llegamos a determinar un procedimiento mecánico muy sencillo descrito por Bulychev et

al (1972): se colocan trozos de hoja en una solución similar a la descrita en la Tabla 2.1,

retirando cuidadosamente la cutícula con una navaja; luego se raspa, con mucha suavidad,
el tejido descubierto para romper las células y liberar los cloroplastos en la solución.

Cuando se realiza la operación con suficiente cuidado no queda mayor cantidad de

residuos, pero si sucediera así, la solución con cloroplastos se filtra en gasa triple, y

posteriormente se transfiere una porción de la misma a la cámara experimental que

previamente se llena con una solución similar a la usada para el aislamiento.

Tabla 2.1 Solución Aisladora

KCl 5 0 . 0 mM

Sorbito1 2 5 0 . 0 mM

EGTA 0 . 5 mM

HEPES-KOH 5.0 mM

pH=7.2

Para nuestros experimento se escogieron cloroplastos intactos de 10-l 5 Pm. La

observación al microscopio nos mostró que estos cloroplastos son de aproximadamente el

doble del tamaño medio y se encuentran localizados generalmente en las células de la

vaina.
 44

2.3 MICROELECTRODOS

Los microelectrodos se hicieron tanto de vidrio suave (hematocrito) como de

vidrio duro (7052 AM-system) por jalón en dos pasos. Los electrodos hechos de vidrio

suave requirieron en general de un pulido adicional por calor. Las pipetas se llenaron con

una solución filtrada a 0.2 Pm compuesta según lo indicado en la tabla 2.2. Después de la
inserción del electrodo de “patch” en la solución, el potencial de unión se corrigió

mediante la electrónica del amplificador, y se verificó al final del experimento por

interrupción del “patch” (alteración menor a f2 mV).

Tabla 2.2 Solución de Pipeta

KCl 1 0 0 . 0 mM

EGTA 0 . 5 n-M

CaCI 1.5 mM

HEPES-KOH 5 . 0 mM

2.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Los registros exitosos (n=142) se obtuvieron con electrodos que en promedio

tuvieron una resistencia de ll Mo. En la mayoría de los casos (82% de los registros

exitosos), el vidrio suave mostró mejor adherencia a la cubierta del cloroplasto. Para los

registros de canal iónico se usó la técnica standard de “patch-clamp” en las

 45

configuraciones “attached” e “inside-out”. El rompimiento secuencial de las membranas

externa e interna del cloroplasto y de la membrana tilacoidea dio acceso al lumen

tilacoideo haciendo posible la medición y registro de la transferencia fotoactivada de

protones a través de la membrana tilacoidea; la configuración correspondiente de registro

se consideró similar a “wholecell”.

Las fotocorrientes se indujeron mediante pulsos cortos de flash cuya intensidad

lurnínica máxima medida en el lugar de la muestra fue E=1388 W/m2, y cuya anchura, a

la mitad de la altura, fue de 1 ms; o mediante pulsos largos de luz blanca continua, con
una intensidad lumínica, medida también en el lugar de la muestra, E=8.2 W/m2. La luz

para los pulsos largos se generó en una fuente de luz Dolar-r-Janner del tipo Fiber-Lite,

modelo 170-D, (con una lampara de cuarzo-halógeno) y se llevó hasta la entrada del
microscopio mediante un cable de fibra óptica de 90 cm (36 pulgadas) de longitud. A la

entrada del microscopio se colocó una cámara para controlar la duración de los pulsos. La

duración de los estímulos de luz continua varió entre 1 y 1000 ms, y se determinó

mediante el control de exposición y el disparador del cuerpo de una cámara Minolta XG-

1 (ver Fig. 2.1).

La medición de la intensidad del flash o del pulso luminoso se hizo utilizando una

fotocelda conectada a un amplificador construido por Arturo Gonzalez (CGIC,

Universidad de Colima) y cuya respuesta en longitud de onda se caracterizó en el

Laboratorio Nacional de la Energía Solar y se corroboró en el Instituto de Materiales,

ambos de la UNAM.

La intensidad, tanto del flash como de la luz continua, se redujo mediante una

serie de filtros oscuros neutros (ND2 y ND4). De este modo se determinó que cuando la

intensidad del flash se redujo a un 6.5 % de la máxima intensidad (en un experimento de

 46

tres eventos, n=3, y una desviación estandar S.E.=1.3 %) la corrieñte medida en la

membrana tilacoidea como respuesta a ese estímulo fue el 90% de la respuesta máxima,

garantizando así que el estímulo estaba más allá del nivel de saturación.

Todos los voltajes que se reportan están referidos al interior del cloroplasto y las
corrientes negativas significan el movimiento de cargas positivas al interior del mismo.

Los registros se filtraron a 1 KHz, se digitalizaron, se almacenaron en disco duro, ylo se

desplegaron en la pantalla del osciloscopio de donde se fotografiaban.

2.5 EXTENSIÓN DE LA MEMBRANA TILACOIDE

Con el fin de estimar la extensión de la membrana tilacoidea de los cloroplastos

usados en los experimentos se obtuvieron blebs (membranas tilacoideas infladas) por un

procedimiento similar al reportado en: Schönknecht et al, (1988). Los cloroplastos, que se

aislaron según el procedimiento descrito antes, se sometieron a un esfuerzo osmótico para

romper la cubierta. Los blebs empiezan a aparecer aproximadamente 15 minutos después

de que los cloroplastos se aislan en una solución preparada según se indica en la tabla 2.3.

La medición del diámetro de los blebs se realiza 15 minutos después de que se observa el
primer bleb.

Tabla 2.3 Solución para obtener blebs

KCl 20.0 mM:

MgCl 5.0 mM:

Trizma 10.0 mM
~H=7.2
 47

CANALES IONICOS

3.1 INTRODUCCIÓN

Los primeros experimentos realizados estuvieron orientados a explorar la

aplicación de la técnica de “patch clamp” registrando macrocorrientes y probando

diferentes soluciones.

Una fase importante del procedimiento fue la obtención de cloroplastos con

membrana limpia, el acercamiento a los mismos y el contacto con la membrana externa.

A continuación se describen los resultados en cuanto a registros de corrientes a nivel de

canal único.

3.2 RESULTADOS

Después del acercamiento al cloroplasto con el microelectrodo el sello se logró,

por lo general, en dos fases:
 48

Fase l.- Después de la aplicación de una succión ligera la resistencia se

incrementaba hasta SO-100 MQ.

Fase 2.- La resistencia se elevaba espontáneamente hasta 0.5-10 GQ alcanzando

ahí un nivel sostenido.

En la segunda fase, la aplicación de un potencial “holding” positivo (= 30 mV) o

un pulso de succión ayudaba en muchos casos a mejorar la resistencia.

No todos los intentos de registro de canal (después de obtener el sello) fueron

exitosos. El porcentaje de éxito en el registro de actividad de canales únicos en

membranas intactas de plantas de Amaranthus hybridus de 4-5 semanas de edad fue de

alrededor del 20%.

Al realizar excisión del “patch” no se observaron cambios significativos en la

actividad de los canales, y los “patches inside-out” fueron generalmente estables a menos

que se aplicaran pulsos de potencial negativo relativamente grandes (< -30 mV).

En la Figura 3.1 se muestran registros típicos de actividad del canal detectado.

En la Fig. 3.2 se muestra un ejemplo de canal único a diferentes potenciales

obtenido en Amaranthus hybridus. En este registro se observa que ademas del estado

abierto existen subestados con una amplitud de corriente de menor tamaño y que
corresponden a una conductancia de aproximadamente 130 PS.
 49

Fig.3.1 Enseguida se muestran algunos registros típicos de canales iónicos en membrana de Amaranthus
hibridus. En cada caso se da el potencial de membrana utilizado para ese registro en paiticular. Al final del
registro se da la escala temporal y la escala para la corriente.

Registro realizado a un potencial de 40 mV.

 50

3072 0 15

1
100 ms

10 pA
 51

Registro realizado a un potencial de 0 mV.

 52

5120 0 lls

1
100 ms

20pA
I
 53

Registro realizado a un potencial de - 10 mV.

0 ms

1
 54

5 1 2 0 0 "5

6144 0 ms

!168 0 ms

8 1 9 2 0 .5

9216 0 m
 .
Registro realizado a un potencial de-30 mV.

256 OO ms
 56

20 ms

30 pA
 40 mV

C
20 mV

0 #Mp~

OmV

B 20 mV
5?
L-
250 ms

Fig. 3.2 Registro de actividad de canal iónico e n

cloroplastos de Amaranthus hybridus. 0 y C corresponden
a los estados totalmente abierto y totalmente cerrado
respectivamente. Las flechas indican los estados de baja
conductancia.

Se encontró que la frecuencia de aparición del estado abierto disminuye

irreversiblemente con tiempos largos de incubación, pero los subestados de 130 pS en

100/50 mM KCl se mantienen estables en el tiempo. Una cinética similar se obtuvo

cuando el potencial se elevó a valores positivos grandes (~40 mV), observándose que

cuando el voltaje retornó a valores bajos había una recuperación lenta (en segundos) de la

cinética original. Los pulsos de potencial a valores negativos tienen en general un efecto
menor, pero se registró un incremento en el ruido de la corriente en estado abierto (Ver

Fig. 3.2).
 58

PA

Fig. 3.3 Gráfico W para el estado abierto del canal de Amaranthus.

Las medias se obtuvieron promediando los datos de 10 muestras. Las
barras indican el error estandard. La línea sólida es un ajuste de los
datos según un polinomio de bajo orden. La solución en la pipeta de
“patch” contenía 100 mM KCl mientras que la solución del bafío
contenía 50 m KCl. El potencial de Nemst para K’, bajo las
condiciones dadas, fue de +17 mV. El potencial de inversión fue de +
7.8 mV, indicando una selectividad débil de K+ sobre Cl-.El signo de
voltaje definido como positivo corresponde al lado interno del
cloroplasto con referencia al ba?io. La corriente corresponde a la
afllwncia caticinica hacia el clnronlxto

Con el fin de calcular la selectividad del canal se analizó la relación corrientehol-

taje (IN) del canal en estado abierto en un gradiente 100/50 mM KCl (Fig. 3.3). El
potencial de inversión de la curva, Vr, calculado mediante la ecuación Goldman-

Hodgkin-Katz, fue 7.8+1.4 mV (n=lO), lo que implica poca selectividad de K+ sobre Cl-:
PK+ / PC,- = 2.94. Se observa una ligera rectificación de la curva UV lo que probablemente

tiene que ver con un flujo catiónico mayor desde el lado con mayor concentración salina.

Mediante regresión lineal se obtuvo una conductancia principal de 73Ok40 pS para el

estado abierto en fas condiciones íchicas indicadas.

 59

Con los cloroplastos de maíz nunca logramos una resistencia de’sello >lOO MR.

Estos cloroplastos mostraron generalmente muy poca adhesión a la pipeta de patch, y en

la mayor parte de los casos fuimos incapaces de succionar suficiente área de cubierta

cloroplástica dentro del electrodo como para mejorar el sello (al menos la resistencia de

cL
<
cl

250 ms

Fig. 3.4 Registro de la actividad de un canal iónico en Zea

muys. 0 y C corresponden a los estados completamente
abierto y cerrado respectivamente. La flecha indica el estado
de baja conductancia del canal.

fuga y el artefacto capacitivo permanecieron sin cambio durante el pulso de succión).

Finalmente, la aplicación de un pulso de succión muy fuerte provocó el rompimiento de

la cubierta y la lisis del plástido. Sin embargo, en 3 intentos, de entre más de 100,

pudimos detectar actividad de canal único con una baja resistencia de sello (50-100 MR).

En la Fig. 3.4 se muestra un ejemplo del registro hecho a OV. Los resultados sugieren que

estos dos canales tienen conductividad y selectividad similares, pero no pudimos

 60

comprobarlo de manera definitiva pues las corriente iónicas en los cloróplastos de maíz

solo se pudieron estudiar en un rango limitado de voltajes cercanos a cero.

3.3 DISCUSION

El canal catiónico de alta conductancia que se describe en nuestro trabajo tiene un

comportamiento que se asemeja mucho al comportamiento del canal catiónico de 1 nS

(en solución simétrica de 100 mM KCl) encontrado en cloroplastos de N. obtusa

(Pottosin, 1992), aunque con una razón menor de permeabilidad JS+/Cl- (2.8 comparado

con 4.6 para el canal de 1 nS) y una menor conductancia (730 pS en 100/50 mM KCl

comparado con 1016 pS en 100 rnM KCl simétrica), consecuencia probable de la menor

concentración salina. Ambos canales se mantuvieron principalmente en estado abierto

para voltajes negativos (respecto al interior del cloroplasto), mientras que a potenciales

positivos cambian a estados de conductividad menores. En la Figura 3.5 se muestran

simultáneamente las curvas de conductancia promedio en el tiempo como una función del

potencial de membrana para los canales de la cubierta de cloroplastos de N. obtusa

obtenidos por Pottosin (1992) y de Amaranthus según nuestros resultados; se observa un

patrón similar lo que puede implicar que esos canales podrían ser un componente

obligatorio de la cubierta de cloroplastos estudiados in situ. Esto favorecería el influjo de

cationes en el cloroplasto a través del canal el cual estaría localizado en membrana

interna de la cubierta del cloroplasto.

La conductancia del canal catiónico de 730 pS que se describe en este trabajo

tiene una conductancia muy similar al de el canal de 720 pS (100 mM KCl en la fase

acuosa) reportado por Flügge y Benz (1984) en la membrana externa del cloroplasto de
espinaca; resultados obtenidos mediante técnicas de reconstitución en bicapas lípidas. La

conductancia de este canal resultó ser una función de la concentración de KCl (a una
 61

concentración de 10 mM la conductancia fue de 80 PS, mientras que para 1 M fue de

7000 PS), pero no fue completamente descrito por los autores por lo que no se podría

aventurar alguna semejanza más allá de la coincidencia en al conductancia y de que se

encuentra en la misma región de estudio.

Thaler y colaboradores (1992) usando microelectrodos ión-selectivos realizaron

mediciones de la actividad de Cl- y H+ en el citoplasma de células vegetales

(Ermosphaera viridis) obteniendo resultados que mostraron que aproximadamente la

mitad del H+ que entra al cloroplasto cuando la célula fue expuesta a iluminación se
compensa eléctricamente por una entrada de aniones; el resto de la compensación debe

ser realizada por una salida de cationes. Seguramente el canal catiónico descrito en este

trabajo es parte de ese mecanismo de compensación. Schönknecht y colaboradores (1992)

proponen un diagrama del sistema de flujos iónicos que se activa cuando actúan los

mecanismos fotosensibles en la membrana tilacoidea del cloroplasto (ver Figura 3.4a).

Citoplasma
’I /f Lumen
I
I
Tilacoideo [H+] [H+ll
I W-IJ -
: M e m b r a n a [Cat.‘]j, ) [Cat.+ 1 t . [Cat.‘]t
I Tilacoidea
3 r Y
’ Cubierta r
‘lasmalema

Célula Vegetal
Figura 2.4a c’n modelo para los flujos de H’ y Cl- depenaientes de luz. Durante la iluminación el flujo de H’
activado por luz a traves de la membrana tilacoidea es en parte eléctricamente compensado por un flujo paralelo de
Cl a través de un canal de cloro dependiente de voltaje en la membrana tilacoidea. Esto da origen a cambios en la
actividad de W y Cl en el estroma. Las observaciones hechas por los autores (Schönknecht et al, 1992) evidencian
que !a mismp asctividad SC transmite hasta el citoplasma y que es compensada, al menos en parte, por flujos de H’
y Cl a través de la cubierta. El resto del flujo cationico compensatorio se debe probablemente a K+ o Mg*. En la
oscuridad los flujos se invierten.
 62

Como se dijo previamente, el sello logrado en los experimentos reportados en esta

parte del estudio osciló entre 0.5 y 10 GQ similar a los sellos reportados por Pottosin
(1992) que oscilaron entre 3 y 10 Ga en los cloroplastos gigantes estudiados por él. Este

hecho añadido a la similitud entre las características y las conductancias de los canales

descritos por él y por nosotros nos hace suponer que la punta de nuestro electrodo estuvo

registrando un canal localizado en la membrana interna de la cubierta del cloroplasto,

aunque la configuración del sello pudo haber sido el de un sandwich con la membrana
externa en medio; en tal configuración la permeabilidad estaría limitada por la menor

conductancia de la membrana interna.

Como se desprende de los párrafos anteriores, se han reportado resultados de

estudios sobre la estructura de las membranas y sobre la estructura de los canales

realizados utilizando una variedad de técnicas, entre las que se encuentra la reconstitución
de cubiertas de cloroplasto, previamente solubilizadas con detergente, en bicapas lípidas

planas.

Estudios recientes de cubiertas de cloroplasto mediante la técnica mencionada en

el párrafo anterior han revelado canales catiónicos independientes del voltaje con una

conductancia de 120-l 80 pS (Mi et al, 1994). Estas propiedades se asemejan al

comportamiento del subestado de 130 pS del canal catiónico de alta conductancia

registrado por nosotros, y que fue el más frecuente al envejecer la preparación.

Fuks y Homblé (1995) reportan la identificación de un canal amónico

(Pcr/P~=l.6) dependiente de voltaje y de tipo porín en la membrana interna de

cloroplastos de espinaca mediante la técnica de fusión en bicapa lípida ; la conductancia

fue de 525 pS en 150 mM KCl simétricos. Después de agregar anhídrido succínico el

canal se convierte en catiónico. Este canal permanece generalmente cerrado a voltajes

 63

.
negativos y generalmente abierto a voltajes positivos; la probabilidad de apertura se
incrementa despues de agregado el anhídrico succínico; a -50 mV y 60 mV el canal

presenta un subestados de aproximadamente 260 PS. La conductividad del canal es

dependiente de la concentración de KCl, siendo para el caso de 100 mM KCI de

aproximadamente 349 pS (entre AO y +40 mV)

También se ha propuesto que un canal multiestado de gran conductancia (G=l - 1.3

nS) existente en la membrana interna de la mitocondria de y características similares al

l
0

U
0 I I I I
-60 -40 -20 0 20 40 60 so

POTENCIAL DE MEMBRANA, mV

Fig.3.5 Gráfica de las conductancias, promediadas en el tiempo, para

los canales catiónicos en la envoltura de cloroplastos de Nitellopsis
obtusa y Amaranthus hybridus. La conductancia de los canales en
Nitellopsis fue de 1020 pS (1 OO/ 1 OO mM KCl) y de 720 pS (1 lo/50 mM
KCI) en Amaranthus. Cada punto representa la corriente del canal,
promediada a partir de registros de 1 O- 15 s a un potencial dado, tomada
con relación a la amplitud máxima de la corriente de canal al mismo
potencial. los símbolos llenos y los vacíos corresponden a muestras
diferentes. 0, W: Nitellopsis. 0, Cl:: Amaranthus.

subestado de 130 pS reportado en este trabajo; estaría formado por un cierto numero de

poros en la membrana interna y un poro grande en la membrana externa (Kinnally et al,

1992). Esta estructura hipotética implica uu cierto grado de flexibilidad, con una variedad
 64

de niveles de conductancia dependientes de la integridad del sitio de contacto. Un modelo

similar resulta atractivo como una explicación para el patrón de cambios de conductancia
en el canal catiónico tanto en preparaciones avejentadas como en sistemas reconstituidos
 65

CORRIENTES FOTOINDUCIDAS

4.1 RESULTADOS

4.1.1 Resultados generales.

La formación inicial de un contacto con la cubierta del cloroplasto, sello de 50-

100 MQ no necesariamente daba lugar a un incremento posterior de la resistencia en la

forma descrita en la sección de resultados en canales iónicos. En muchos casos la

resistencia decrecía espontáneamente hasta 20-50 Mn. Este cambio iba acompañado por

un incremento en el artefacto capacitivo, fenómeno que interpretamos como indicativo de

Fig. 4.1 Forma en se cree que se accede al interior del cloroplasto y se succiona la membrana tilacoidea,
entrando ésta al interior de la pipeta.
 66

que se daba un rompimiento de la cubierta del cloroplasto y del acceso de la pipeta al

interior del mismo (estroma), como se muestra en la Fig. 4.1. En esta etapa todavía no se
podía registrar ninguna fotocorriente, pero la aplicación de succión adicional producía

una respuesta a la luz con dirección positiva (Figs. 4.2 y 4.3). Posteriormente, se aplicaba

un pulso de succión intenso y corto que causaba una inversión en la polaridad de la

fotocorriente (Fig. 4.2). La magnitud de la corriente disminuía usualmente de 2 a 3 veces

en los primeros minutos de registro, pero se podían registrar de modo típico respuestas de

magnitud similar a las mostradas en la Figs. 4.4 y 4.6A-E por lapsos de tiempo mayores

(30 a 90 min.).

En los cloroplastos de plantas de edad avanzada (8 a 10 semanas), generalmente

se observaron fotocorrientes más estables, pero en ocasiones se dificultaba invertir la

polaridad; se requerían grandes pulsos de voltaje (50-100 mV) acompañados de succión

fuerte para facilitar la inversión. Con cloroplastos de maíz solo se pudieron obtener unos

cuantos registros (Fig. 4.3); las fotocorrientes fueron mucho más pequeñas en magnitud

que las obtenidas con Amaranthus y no pudimos invertir la corriente ni con voltajes altos

ni mediante la aplicación de succión fuerte.

Para el análisis solo se utilizaron fotocorrientes hacia el interior en cloroplastos de

Amaranthus debido a que esta configuración fue la más estable en el tiempo, pues para

corrientes positivas la polaridad se invertía, generalmente, de manera espontánea en los

primeros minutos. En la figura 4.2a se muestran varios registros con los detalles en que se

llevaron a cabo.
 67

Fig. 4.2 Diferentes respuestas al estímulo lumínico para el mismo cloroplasto de Amaranthus hybridus:
(a) y (b) antes, (c) y (d) después del rompimiento de la membrana tilacoide mediante un pulso de
succión corto. (a) y (c) son respuestas a flash saturante, (b) y (d) lo son a luz continua. Las flechas
indican encendido y apagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.
 68

Fig. 4.2a Registros de fotocorrientes. Al pie de cada fotografía se dan detalles de las condiciones
en que fueron efectuados.

i. - Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de -14 mV, provocada por un pulso de
luz regulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 500 mshiiv. y una
escala de corriente de 2OpMdiv.

ii.-Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un pulso de
luz regulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 msIdiv. y una escala
de corriente de 2OpA/div.

iii.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un pulso de
luz regulado por una cámara fotogr@ca, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala
de corriente de 20 pA/div. El registro se tomó de un cloroplasto redondo y pequeño (aproximadamente
7pm). En este registro es clara una inversión de la corriente.
 69

iv- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 5 mV, provocada por un pulso de
luz regulado por una dmara fotográfìca, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala
de corriente de 20 pkfiv. El registro se tomo de un cloroplasto redondo y pequeño (aproximadamente
7wJ.

5 f

v.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por un flash y
registrada con una escala temporal de 100 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div. El registro se
tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente 10~

I
:.
/’ .,>,

vi. - Registro de fotocom’ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, provocada por una serie de
siete Jhshes. Registrados sobreimpuestos en la misma pantalla con una escala temporal de 1 OO ms/div. y
una escala de comente de 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente
IOF
 70

vii.- Registro de fotocom’ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, por un pulso de luz regulado
por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corriente
de 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente IOptn El registro se
realizó después de 13 min de adaptación a la oscuridad

viii.-Registro de fotocom.ente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, por un pulso de luz
regulado por una cámara fotográjica, y registrada con una escala temporal de 500 ms/div. y una escala
de corriente de 2OpAIdiv El registro se tomd de un cloroplasto redondo de aproximadamente IOpm. El
registro se realizó después de 3 min de adaptacih a la oscuridad

ix.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generaso por un pulso de luz
regulado por una cámara fotográfica, y registrada con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de
corriente de 20 pA/div El registro se tomó de un cloroplasto redondo de aproximadamente 1 Oprn
 71

x.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generada por un flash, y
registrada con una escala temporal de 20 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div El registro se tomó de
un cloroplasto redondo, achatado en unpolo, y de aproximada-mente 10,u.m Hubo unintervalo de oscuridad
de 9 minutos entre el primer trazo y los úliimos.

xi.- Registro de fotocorriente tomada con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un flash el
primer trazo y un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica el segundo; y registrada con una escala
temporal de 20 ms/div el primero y 100 m.&div. el segundo, y una escala de corriente de 20 pMdiv. para
ambos.

xii- Registro de fotocotiente con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un pulso de luz
regulado por una cámara fotográfka, y registrado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de
corriente de 20 pA/div
 72

xiii.-Registro de /òtocorriente con un potencial de membrana de 0 mV, generado por un pulso de luz
regulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de .
corriente de IOpA/div. Interesante corte en la cinética al interrumpir el pulso de luz

xiv.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV, generado porjlash y registrado con una
escala temporal de 100 ms/div. y una escala de corriente de 20 pA/div . Después del primer flash pasaron
algunos minutos de incubación y luego se aplicó succión.

xx- Potencial de membrana: 0 mV. El primero y último trazos generados porflash y el ceniralporpulso. Escala
temporal de 1 OO ms/div. y de corriente de 20 pA/div.
 73

xvi.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo 1 fue segundo en el tiempo,
generado por un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de
200 ms/div.; el trazo dos fue el primero en el tiempo y generado por por flash con una escala temporal de 50
ms/div. Para ambos, una escala de corriente de 2OpA/div

xvii.- Registro de fotocom.ente con un potencial de membrana de -10 mV. El trazo 1 fue segundo en el tiempo,
generado por un pulso de luz regulado por una cámara fotográfica, y registrado con una escala temporal de
200 ms/div.; el trazo dos fue el primero en el tiempo y generado por por flash con una escala temporal de 50
ms/div. Para ambos, una escala de corriente de 20 pA/div Es notable la magnitud de la fotocorriente en
respuesta al estimulo controlado por la cámara
 74

xviii.- Registro de fotocom’ente con un potencial de membrana de 0 mV. Ambos trazos fueron generados por
flash, pero para el primero se agregó un filtro x2. La escala temporal fue de 50 ms/ div. Y la escala de
corriente fue de 20 pA/div. Es de notarse que aunque la intensidad de la luz se disminuyó a la mitad, no
sucedió lo mismo con la fotocom’ente

xix.- Registro de fotocom’ente con un potencial de membrana de 0 mV. La fotocorriente fue generada con
flash, habiendo agrado u filtro x2. La escala temporal fue de 50 ms/div. y la escala de corriente de 20
pA/div. Es notable la magnitud de la corriente de respuesta a pesar de la exiktencia delfiltro.
 75

xx- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. Generado por un flash y registrado
con una escala temporal de 50 m.s/div. y una escala de corriente de 2OpA/div. Es de notarse la magnitud
tan grande de la fotocorriente en respuesta alflash.

xxi.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV El trazo 1 fuegenerado por dos
pulso de luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar pero
habiendo dejado transcurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y una
escala de corriente de 2OpAIdiv
 76

xrii.- Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El frazo 1 fue generado por dos pulso
de luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar pero habiendo dejado
transcurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corriente de
2OpA/div Es de notarse que hay una diferencia en la tercer respuesta comparado con el registro xci, teniendo
el mismo protocolo y el mismo cloroplasto. Sin embargo, en el registro xxiii se reproduce el xui (siendo
todavía el mismo cloroplasto.

xxiii.-Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo I fue generado por dos pulso
de luz regulado por una cámara fotográfica, el trazo dos fue generado de forma similar pero habiendo dejado
transcurrir 10 s. El registro fue realizado con una escala temporal de 200 ms/div. y una escala de corriente de
20 pA/div. Se reproduce muy de cerca el resultado mostrado en la figura 21 (se trata del mismo cloroplasto).
 77

xxiv. -Registro de fotocorriente con un potencial de membrana de 0 mV. El trazo 1 fue generado por un flash a
50 muäiv. y 20 pA/div. El trazo dos fue generado por dos pulsos de luz regulados por una cámara fotográfica
a 200 ms/div y 20 pA/div. Se dejaron pasar algunos segundos entre los dos trazos.
 78

4.1.2 Cinética de las fotocorrientes: efecto de los estados previos de iluminación.

La cinética de las fotocorrientes resultó un tanto compleja: una elevación rápida,

solo parcialmente resuelta, debido a la rapidez de la misma; decaimiento bifásico en
presencia de luz hasta un estado estable; y un decaimiento posterior que se observaba en
la etapa de oscuridad. El último decaimiento estaba muy a menudo acompañado de una
pequeña inversión de la corriente, que se observaba mejor en muestras de reciente
preparación, con un decaimiento lento (en el rango de segundos) hasta el nivel inicial en
la oscuridad (Fig. 4.4).

Los parámetros de la cinética de las fotocorrientes se dan en la Tabla 4.1 y se

midieron, tanto en preparaciones adaptadas a la luz como en las adaptadas a la oscuridad,

entre 10 y 50 min después de la inserción del electrodo en el interior del tilacoide.

50 ms

I 20 pA
b ----n

t
200s

Fig. 4.3 Fotocorrientes en Zea muys: (a) respuesta inducida por

flash, (b) respuesta a luz continua. Las flechas indican encendido
y apagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.
 79

En aquellas preparaciones en las que la muestra se mantuvo en-la oscuridad un

minuto o mas, la amplitud del componente rápido (~6 ms) (estimado por el ajuste del
curso temporal a una función de doble exponencial) nunca excedía el 25% de la amplitud

máxima (ver la sección de discusión).

También encontramos que la amplitud del componente lento de la fotocorriente (z

=100 ms) así como la corriente de estado estable decreció con el envejecimiento de la

muestra (decenas de minutos). La amplitud del componente rápido también decrecía,

aunque este cambio era relativamente pequeño; en cambio, se encontró un incremento cIe
la fracción del componente rápido no adaptable -es decir, el componente rápido presente

tanto en preparaciones adaptadas a la luz como en las adaptadas a la oscuridad.

I 20 pA

Fig. 4.4 La compleja cinética de la fotocorriente en Amuranthus: componente rápida (R) y lenta (L) de la
respuesta; (1) inversión de la dirección de la corriente al apagar la luz. Las flechas indican encendido y
apagado de la luz. Duración del pulso de luz: 0.5 s.

El curso temporal de las fotorespuestas inducidas por flash se podía, en la mayor

parte de los casos, ajustar a una función monoexponencial (ver z en Tabla 4.1). Existía
 80

una gran variación en z y en amplitud de muestra a muestra (l-60 ‘ms y 7-300 pA,

respectivamente). En el caso de los flashes la amplitud de la respuesta iba decreciendo

con la serie de los mismos (aplicados entre dos y tres segundos de separación), y se
restablecía en parte cuando la muestra se mantenía algunos minutos en la oscuridad. Sin

embargo, con muestras incubadas por mucho tiempo (decenas de minutos) se observó un
decremento irreversible en amplitud de las respuestas inducidas por flash así como una

aceleración en la cinética de decaimiento (algunas ocasiones multiplicado varias veces).

En consecuencia, para el análisis solo se tomó en cuenta el primer flash de cada

experimento, estimando mediante la ecuación

(4.1)

que la carga promedio equivalente transferida por flash para todos los experimentos

(n=50) fue de (3.84f0.57)xlO -13 C (donde 1 es por corriente registrada).

4.1.3 Efectos de la preiluminación sobre la cinética del transiente de corriente

fotoinducida.

En la Tabla 4.1 se muestra que la magnitud de la corriente inicial de respuesta a

luz continua es diferente en un 64%, en promedio, entre cloroplastos adaptados a la

oscuridad y los preiluminados. Esto se debe a que en las preparaciones adaptadas a la

oscuridad la amplitud del componente rápido es, por lo general, menor.

 81

Tabla 4.1. Cinética de las fotocorrientes

I
Luz CC tinua Flashes
Parámetro Amplitud de corriente de Corriente de estado Transiente Amplitud Tiempo de
pico @A) adaptada a: estable (PA) lumínico (ms) W) decaimiento
luz oscuridad z ráp. z lento (ms)
I I
I
Media 14.6 40.7 7.4 5.5 1 110.9 I 44.9 I 120.0

S.E. 2.1 5.4 0.6 0.7 j 9.5 1 6.7 1 1.8 ’

N. de exp. 18 18 35

l
Dando el segundo pulso a los OS-l.0 s después del primero, se produjo un gran

incremento en la magnitud del componente rápido (Fig. 4.9, pero la amplitud del
componente lento fue menor para el segundo pulso y la recuperación de la magnitud

original requería de varios segundos de adaptación a la oscuridad. Por otro lado, la

amplitud del componente rápido, medido a los 0.5 s del prepulso, en muestras adaptadas a

la oscuridad por lapsos de tiempo pequeños no presentaba variación notable; sin embargo,

para periodos más largos de adaptación (lo-30 s) se observó un decremento abrupto del

componente rápido (Fig. 4.6B-E). En 18 de 25 muestras mantenidas por un lapso de 30 a

60 s en la oscuridad, la amplitud del componente rápido disminuyó a menos del 25% del

máximo, e incluso, en algunos casos, desapareció. El efecto de la adaptación a la

oscuridad se estudió con detenimiento en cuatro muestras (Fig. 4.7A-B). La distribución

temporal de la amplitud mostró una forma sigmoidea, esto es, sin cambio en los primeros
lo-30 s, y una caída abrupta hasta un nivel bajo sostenido (O-20% del máximo) que

permanecía sin cambio hasta 10 min de adaptación a la oscuridad.

 82

La fracción “no adaptable” del transiente rápido creció irreversiblemente para

tiempos muy largos de incubación (> 1 h), por tanto, el experimento se detuvo cuando

este alcanzó un nivel del 30%.

Fig. 4.5 Efecto de la preiluminación en la cinética de la

fotocorriente a 0 mV. Los dos pulsos de luz de 0.25 s
están separados por un intervalo de oscuridad de 0.6 s. La
muestra se mantuvo en la oscuridad por varios minutos
antes del experimento.

Los datos experimentales se ajustan mejor a una función exponencial de potencia,

f = c+(100-C)[1-(l-e-~)“], (4.2)

que a una función monoexponencial,

f =C+(lOO-C)e$ (4.3)

(C es la fracción “no adaptable” del componente rápido máximo, expresado como

porcentaje).
Los valores de mejor ajuste para z y n fueron 16 y 3.1, respectivamente (ver Fig.

4.7A).
 83

A causa de las variaciones de z para cada muestra, la región de transición para la

curva promedio es difusa. Como resultado, ‘t se sobrestima mientras que n se subestima

cuando se compara con muestras particulares. Por ejemplo, para el caso mostrado en la

Fig. 4.7A, la curva de mejor ajuste se obtuvo con n=35, que es mayor que el valor 3.1
promedio, y ~=10 el cual es menor que el valor de 16 s obtenido para el mejor ajuste.

-J
200 ms
20 pA

Fig. 4.4 Efecto de la adaptación a la oscuridad

sobre la amplitud del componente rápido de la
fotocorriente. La duración en segundos del
intervalo de oscuridad que precede al pulso es,
en secuencia: (A) 62, (B) 8, (C) 22, (D) 26, y
(E) 39.
 84

4.1.4 Efecto de la duración del pulso de luz sobre la cinética del transiente de
corriente fotoinducida.

Otra cuestión que surgió al estudiar los efectos de la preiluminación sobre la

cinética del transiente de corriente fotoinducidad fùe la determinación de la duración del

pulso de preiluminación necesario para producir la amplitud máxima del componente

rápido.

Encontramos que un flash saturante corto no era suficiente, al menos cuando el’

pulso de prueba de luz continua se daba entre 200 y 1000 ms después del flash (n=7).

Tampoco los pulsos de luz continua blanca intensa de duración menor a 8 ms fueron

suficientes. Por tanto, se pudo determinar la existencia de un tiempo de retardo en el

desarrollo del transiente rápido, tiempo de retardo que se pudo expresar como una

función del periodo de preiluminación (Fig. 4.8A).

En dos experimentos, de un total de cinco, se analizó más cuidadosamente la

región de transición. Para ello en cada muestra se repitieron, al menos tres veces, todos

los puntos en el intervalo en donde la amplitud del transiente rápido cambió entre 10% y

90% se repitieron al menos tres veces en cada muestra. Esto permitió un ajuste más

preciso de la dependencia observada en una curva modelo. En ambos experimentos la

función monoexponencial ofreció un ajuste insatisfactorio a los puntos, mientras que la

función exponencial de potencia del tipo

f = lOO(l-e?)” (4.4)
 85

0 30 6

Tiempo de adaptación a la oscuridad (s)

Fig. 4.7 (A) Amplitud del componente rapido expresado como porcentaje del control (pulso de
prueba dado a los OS-l.0 s antes) VS. duración del intervalo de oscuridad. La línea discontinua es el
mejor ajuste a los datos por una funcih monoexponencial, ~40 s. La línea sólida es el mejor ajuste
por una función exponencial de potencia, n=35, ~=10 s y C=25%. (B) Resultados de cuatro
experimentos independientes como el de (A). Para la función monoexponencial ~=39 s, y para
función de potencia n=3.1,5=16 s y C=20%. Ver el texto para la explicación de los parámetros.
 86

Duracidn del PrePa0 de luz9 nw

Fig. 4.8 Dependencia de la amplitud del componente rápido respecto de la duración del
prepulso. Se usó un protocolo de tres pulsos: el priemr pulso para una preparación adaptada
a la oscuridad era de duración variable, el segundo y el tercer pulsos fueron de 250 ms cada
uno. El intervalo de oscuridad entre pulsos fue de 0.5 y 1.0 s, en ese orden. La amplitud del
componente rápido medido para el segundo pulso se tomó como una relación con el
obtenido para el tercero en forma de porcentaje. A: Gráfico para un solo experimento; las
barras so el S.E. para tres valores, la línea sólida es el mejor ajuste a una función
exponencial de potencia, n=9.5 y 7=20 ms; la línea punteada es el mejor ajuste a una
función monoexponencial, ~80 ms. B: Gráfico correspondiente a los resultados de cito
experimentos como el de A; el S.E. corresponde a la media a las medias obtenidas en
diferentes experimentos. La interpretación de las líneas es como en Fig. 4.7A. Los valores
de los parámetros para la función exponencial de potencia y para la función
monoexponencial son ~=22 ms, n=1.6, y ~~33 ms, respectivamente. Ver el texto para la
explicación de los parámetros.
 87

se ajustaba muy bien a los datos para n=7.8 (9.8) y T= 12 (20) ms en el primer y (segundo)

experimento, respectivamente. Cuando los datos de los cinco experimentos se juntaron se

encontró un aparente incremento en z (22 ms) y un aparente decremento en n (1.6), lo que

probablemente es el resultado de la dispersión en la región de transición por las

variaciones en las diferentes muestras.
 88

4.2 DISCUSION

4.2.1 Observaciones generales.

Nuestros resultados confirmaron lo habían reportado Bulychev y colaboradores

(1992) en el sentido de que la técnica de “patch-clamp” puede aplicarse al estudio de

corrientes fotoinducidas en membranas fotosintéticas.

Los mismos autores sugieren que la aplicación dé la técnica de “patch clamp”

para la medición de fotocorrientes puede ser muy general, con la posible excepción de los

cloroplastos de células de la vaina en plantas C4 avanzadas (Panicoid grasses), los que no

contienen un sistema tilacoide bien desarrollado (Coombs y Greenwood, 1976; Stahelin,

1986).

Muy de acuerdo con lo anterior, en este estudio solamente pudimos obtener unos

cuantos registros de fotocorrientes (que no pudimos invertir) en cloroplastos de Zea mays,

mientras que con cloroplastos de células de la vaina de la planta dicotiledones C4

Amaranthus hibridus que posee grana bien desarrollados (Fisher y evert, 1982), los

registros se hicieron mucho más fácilmente y de una forma bastante repetible.

Hasta donde sabemos, esta fue la primera vez que se estudiaron plantas C4 por

técnicas electrofisiológicas. Por tanto, resultó interesante encontrar una cinética

cualitativamente similar a la obtenida en los registros de Bulychev y colaboradores (1992)

 89

quienes usaron cloroplastos gigantes de la planta C3 Peperomia metallica. Estos autores

compararon la cinética de las fotocorrientes obtenidas con microelectrodos

convencionales y con la técnica de “patch-clamp”, encontrando que son muy similares.

Sus resultados sugieren que la pipeta de “patch” tiene un acceso de baja resistencia al

lumen tilacoideo, y que es posible medir la transferencia electrogénica a través de la

membrana tilacoidea. Hemos confirmado esa noción verificando la secuencia de pasos,

que finalmente llevan al registro de una corriente dirigida al interior en nuestra

preparación (Fig. 4.2 y Fig. 4.3).

Hemos considerado que una fotocorriente positiva se registra en una

configuración “thylakoid attached”, mientras que lo contrario corresponde a una

configuración “whole thylakoid”. Dado que la amplitud de corriente debe ser proporcional

a la superficie de la membrana en ambas configuraciones, se hace necesario dar una

explicación a la amplitud de corriente relativamente grande registrada en la configuración

“thylakoid attached” comparada con la corriente medida en la configuración “whole

thylakoid” (Fig. 4.2 b, d).

La superficie de la membrana tilacoidea se puede medir inflando el sistema

tilacoideo en un medio hipotónico, lo que produce la formación de vesículas esféricas

grandes (blebs). Nuestros experimentos con Amaranthus mostraron blebs con un diámetro

promedio de 13.5 Pm (k1.2, n=lOO) que corresponde a un área aproximada de 573 pm2.
La fracción de la superficie de membrana jalada al interior de la pipeta se puede estimar
solo indirectamente ya que la membrana tilacoide intacta forma un sistema intensamente

doblado. La distancia entre bicapas vecinas en una pila de tilacoides es de cerca de 0.02 p

m con un diámetro promedio por pila de 0.5 Pm (Junge y Jakson, 1982). El tilacoide se
 90

puede jalar hasta 10 Pm dentro de la pipeta de “patch”, según lo que podemos observar al

microscopio. Por tanto, el área de membrana en la pipeta puede ser de por lo menos 100 ~1

m2, suponiendo una sola pila de grana. Sin embargo, esto puede ser una subestimación

dado que a 10 p,rn de la punta la pipeta se hace suficientemente ancha como para que
quepan varias pilas de grana en paralelo.

Cualquier translocación de carga a través de la membrana debe ser detectada bajo

condiciones de fijación de voltaje. Las reacciones electrogénicas fotoinducidas en la

membrana fotosintética ocurren en los centros de reacción fotosintéticos de los

fotosistemas 1 y II localizados transmembranalmente (Junge y Jakson, 1982). Según el

esquema Z fotosintético simplificado (Witt, 1979; Junge y Jakson, 1982) la transferencia

de electrones fotoinducida en el centro de reacción del PSI1 resulta en la liberación de H’

al interior del lumen tilacoideo y en la reducción de moléculas de plastoquinona (PQ) que

toman H+ desde el exterior y los envían en forma electroneutra

(PQH2,plastohidroquinona) hacia el lado interno de la membrana (Esquema 1). Estos
protones son liberados con la reoxidación de PQH2 en el complejo b6f (paso limitante de

la taza de la reacción) mientras los electrones son transferidos al centro de reacción de

PSI, apoyando, por tanto, su capacidad de transferencia electrónica.

Uno puede obtener una estimación directa de la electrogénesis en los centros de

reacción de PSI y PSI1 durante una sola etapa de funcionamiento midiendo la

transferencia de carga a través de la membrana tilacoidea inducida por flash corto y

saturante de luz. El numero de centros de reacción de PSI y PSI1 es de 1200-1700 y 850-

1300 por Pm2 respectivamente (Stahelin, 1986), lo que implica 1.2-l .7x106 centros de

reacción por cada 572.6 Pm2 de superficie de membrana tilacoidea (un bleb de diámetro

de 13.5 Pm). La carga translocada por etapa de funcionamiento debe ser entonces 1%
 91

2.7x10-13 C, que es un valor cercano al valor 3.9x10-l3 C que medimos aquí (hay que

recordar que estos cálculos son para tamaños promedio, mientras que nosotros escogemos
los cloroplastos de mayor tamaño para nuestros experimentos).

Bajo condiciones de luz continua las reacciones de transferencia electrónica en

PSI y PSII están acopladas al sitio de reoxidación de PQH2 en el complejo bgf, un paso

limitante de las reacciones de transferencia electrónica intersistemica. La taza de esta

reacción disminuye con la acumulacion de H+ en el lumen tilacoideo, con un valor típico

de 15-20 ms a pH neutro y una desaceleración lineal con un factor aproximado de 2 por

unidad de disminución de pH (Junge y Jakson, 1982; Tikhonov et al, 1984; Van Kooten

et al, 1986; Joliot et al, 1992). Suponiendo el número de fotosistemas por membrana
tilacoidea dada antes, la transferencia electrónica transmembranal implica una

fotocorriente en el rango 9.6-17.6 PA. El valor 14.6 pA para preparaciones adaptadas a la

oscuridad que hemos obtenido aquí (Tabla 4.1) se ajusta a estos límites, mientras que el

valor menor de 7.6 pA medido al final del pulso largo de luz puede ser el resultado de la

acumulación de protones en el lumen tilacoideo iluminado. De acuerdo a Junge y Jakson

(1982), tras la inserción del microelectrodo la acidificación del lumen tilacoideo no debe

ser tan elevada como en los tilacoides intactos (3-4 unidades pH). Sin embargo también

se ha medido una disminución de hasta 2 unidades pH tras el empalamiento con el

microelectrodo (RemiS et al, 1986).

4.2.2 Efectos de la Preiluminación Sobre la Cinética del Transiente de Corriente

Fotoinducida

El resultado más intrigante de este estudio fue, sin duda, el efecto de

preiluminación sobre la fotocorriente. La amplitud inicial de la fotocorriente en

cloroplastos preiluminados creció transientemente por un factor de 3 (Tabla 4.1).

 92

Los estudios previos de electrogénesis de PSI y PSII por separado y en serie han
mostrado que el transiente y el crecimiento rápido de la fotocorriente esta determinado

por PSI (Rêmis et al, 1981). Esto es consecuencia de un paso más rapido de
funcionamiento de PSI cuando el suministro de electrones desde el “pool” donador de

PSI, Proteina FeS Rieske, citocromo f y plastocianina (ver Esquema Z en la Fig. 4.9) no

está limitado (Junge y Jakson, 1982). Sin embargo, este “pool” se vacía después de unas

cuantas etapas de funcionamiento a causa de la existencia de un paso limitante de la

transferencia antes que él, y la rapidez de funcionamiento de PSI en estado estable debe
ser limitada por la reoxidación de PQH2. Por tanto, el componente de transiente de la

fotocorriente puede explicarse.

Pero surge la pregunta: ¿Por qué se observa transiente rápido de la fotocorriente

solamente en cloroplastos preiluminados? Las mediciones previas de fotoelectrogénesis

en cloroplastos de Peperomia en condiciones en que la transferencia de electrones entre

fotosistemas fue cortocircuitada por un aceptor de electrones externo mostró la ausencia

de un transiente rápido en cloroplastos adaptados a la oscuridad (RemiS et al, 1981).

Después de que el cloroplasto fue preiluminado el transiente rápido reapareció, siempre

que el intervalo de oscuridad después de la preiluminación fuese corto. Esto se interpretó

como una fotoreducción parcial de los donadores de PSI. Pensamos que el efecto de la

preiluminación sobre las fotocorrientes en los cloroplastos de Amaranthus tiene el mismo

origen.

Los gráficos en Figs. 4 y 5 muestran que la magnitud del transiente rápido

depende tanto del intervalo de oscuridad entre pulsos como de la duración del prepulso de

luz. La dependencia de la duración del prepulso de iluminación correlaciona bien con el

curso temporal de la fotorreducción del “~001” de PQ bajo luz saturante (Joliot et al,
 93

1992). Se ha encontrado que la reoxidación del pool redox intersistémico completo es un

proceso de pseudo-primer orden con un tiempo característico de alrededor de 25 s

(Renger y Schulze, 1985). La dependencia de la amplitud del transiente rápido, como

función de la duración del intervalo de oscuridad se ajustó mediante una función

exponencial de potencia con un tiempo característico de 16 s, cercano al valor anterior

(25s) (Fig. 4). La reducción por PQH2 (plastohidroquinona) de los donadores de PSI es

termodinámicamente favorable y ocurre tanto en presencia de luz como en la oscuridad.

Por lo tanto, la oxidación de los donadores de PSI en la oscuridad debería verse

solamente hasta después de la reoxidación completa de PQH2, lo que explicaría el retraso

observado en el curso temporal presentado en la Fig. 4. Debido a la gran variación en el

valor del parámetro n, de 3 a 35, no podemos hacer ninguna comparación directa sobre el

tamaño del “pool” de PQ. Sin embargo, por lo menos, el valor de 12 equivalentes por PSI1

reportado por otros autores (Joliot et al, 1992) se encuentra en este rango.
 94

Hl HI
1. - - 4

ESTROMA l
‘ADPH

3
&
e'

‘0 7’ LUMEN
2 2

Fig. 4.9 Esquema-Z de la fotosínteis. Los pasos electrogénicos se marcan con flechas huecas (movimiento de cargas f).
PQ/PQH2 es por plastoquinona/plastoquinol. PC es por plastocianina. FeS es por proteina de Rieske. Cyt f es por
citocromo f. Los donantes primarios de PSI y PSII se designan como P,OO y PssO. Fd es ferredoxina y A es un aceptor.
 95

5
CONCLUSIONES

5.1 INTRODUCCIÓN
En este trabajo se estudió el uso de la técnica de “patch clamp” para estudiar dos

aspectos del cloroplasto, a saber, canales iónicos en la cubierta del mismo, y las corrientes

fotoinducidas a través de la membrana tilacoidea. Por claridad las discusiones se

realizaron por separado al reportar los resultado del estudio de cada aspecto en las
secciones correspondientes. En este capítulo se enumeran las conclusiones generales de

este trabajo.

5.2 CONCLUSIONES
l.- Se elaboró una técnica para registro de canales iónicos y corrientes fotoinducidas en

las membranas de cloroplastos de plantas verdes.

2.- Se determinó la existencia de un canal grande en la cubierta del cloroplasto, el cual

parece ser un acompañante obligado en los cloroplastos de plantas verdes.

3.- Con equipo y técnicas de “patch clamp” se mostraron directamente eventos

electrogénicos por el transporte de electrones entre PI y PI1 en membrana tilacoidea.

4.- Se mostró evidencia de regulación del transporte de electrones entre los fotosistemas 1

y II, transporte que es dependiente del estado REDOX del pool de quinona. La existencia
de un pool de quinona reducida inplica la existencia de un componente rápido en la

fotocorriente.
 96

REFERENCIAS .

Auslander, W., y Junge W-(1974). Biochim. Biophys. Acta 357,285298.

Andréasson, L.-E. y Vänngard, T. (1988) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mal. Biol. 39,

379-411.

Andrianov, V.K., Svintitskikh, V.A., Sineshchecov, O.A., y Rubin, A.B. (1982) Doklady

Akademii Nauk U.S.S.R., 266,758-761.

Baler, D., y Latzko E. (1975). Biochim. Biophys. Acta 396, 141-148.

Beck, W.F. y dePaula, J.C. (1989) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 18 25-46.

Brudvig, G.W. (1991) Acc. Chem. Res., 24,311-316.

Bulychev, A.A., Andrianov, V.K., Kurella, G.A., y Litvin, F.F. (1972). Nature 236, 175

177.

Bulychev, A.A., Andrianov, V.K., Kurella, G.A., y Litvin, F.F. (1976). Biochim. Biophys.

Acta 420,336-35 1.

Bulychev, A.A., Vrenderberg, W.J., (1976) Biochi. Biophys. Acta, 449 48-58.

Bulychev, A.A., Andrianov, y V.K, Kurella, G.A. (1980) Biochimica et Biophysica Acta,

590,300-308
 97

Bulychev, A.A., Niyazova, M.M., y Turovetsky, V.B. (1985). Biochim. Biophys. Acta
808, 186-191.

Bulychev A.A., Antonov V.F. y Schevchenko, E.V. (1992). Biochim. Biophys. Acta 1099,

16-24.

Coombs, J. y Greenwood, A.D. (1976). In The Intact Chloroplast: Compartmentation of

the Photosynthesis (J. Barber, ed.), Elsevier, Amsterdam-NY-Oxford, pp. l-52.

Chance, B. Crofts, A.R., Nisimura, N., y Price, B., Europ. J. Biochemi., 13,364, (1970)

Duysens LNM, Sweers HE (1963). Mechanism of the two photochemical reactions in

algae as studied by means offluorescence. In: Studies on microalgae and photosynthetic

bacteria. University of Tokyo Press, Tokuo, pp 353-372.

Fisher, D.G. y Evert, R.F. (1982). Bot. Gazette, 143, 146-155.

Fuks, B. y Homblé, F. (1995). The Journal of Biological Chemistry, 270, 17,9947-9952.

Fhigge, U.I. y Benz, R. (1984). FEBS Lett. 169, 85-89.

Ghirardi, M.L., y Melis A. (1983). Arch. Biochem. Biophys. 224, 19-28.

Green, Beverley R., Pichersky, Eran y Kloppstech, KIaus (1991) Tren& in Biochemical

Sciences 16/5, 181-186.

 98

Heber, U., Neimanis, S., Siebke, K., Schönknecht, G. y Katona, E. (1992) Photosynthesis

Res. 34 436-447.

Heldt, H.W., Werdan, K., Milovancev M., y Geller G. (1973). Biochim. Biophys. Acta

314,224-241.

Hind, G., Nakatami, H.Y. e Izawa, S., (1974) Proc. Natl. Atad. Sci USA 71, 1484-1488.

Holzwarth, Alfred R. (1993). Biophys. J 64, 1280- 128 1.

Izawa, S., y Hind, G. (1967) Biochim. Biophys. Acta., 143,377.

Joliot, P., Lavergne, J., y Beal, D. (1992). Biochim. Biophys. Acta 1101, 1-12.

Junge, W., y Jakson, B. (1982). En Photosynthesis: Energy Conversion by Plants and

Bacteria. Vol. 1: The development of electrochemical potential gradients across

photosynthetic membranes. (Govindjee, ed.), Academic Press, NY, pp. 589-646.

Kautsky H., Appel W., Amann H. (1960). Biochem Z. 332,277-292.

Keller, B. U., Hedrich, R., Vaz, W.L.C., y Criado, M. (1988). PjZuegers Arch. 411, 94-

100.

Kinnally, K.W., Antonenko, Yu. N., y Zorov, D.B. (1992). J. Bionerg. Biomembr. 24, 99-

110.

Knoetzel, J., Svendsen, 1. y Simpson, D.J. (1992) Eur. J. Biochem. 206,209-215.

 99

Krause, G.H. y Weis, E.. (1991) Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42,313-349

Kiihlbrandt, Werner, Wang, Da Neng y Fujiyoshi, Yoshinori (1994) Nature 367,6 14-62 1.

Laza, R., Bergman, B., y Vergara, B. (1993) Journal of Experimental Botany 441268,

1643-1648.

Mi, F., Peters, S.J., y Berkowitz, G.A. (1994) Plant Physiol. 105, 955-964.

Mitchel, P., (1961), Nature, 191, 144-148.

Mitchel, P., (1966), Biol. Rev., 41,445-502.

Mitchel, P. (1968) Bodmin Glinn. Res.

Muñiz, J.J, Pottosin, 1.1. y Sandoval L. (1995) Journal of Bioenergetics and

Biomembranes 27/2,249-258.

Neher, E. y Sakmann, B. (1992) Scietzjic Ameritan 26613 28-35.

Pottosin, 1.1. (1992). FEBS Lett. 308, 87-90.

Pottosin, 1.1. (1993). FEBS Lett. 330,2 1 l-2 14.

Pottosin, 1.1. y Schönknecht, G. (1996) J. Membrane Biol. 152,223-233.

Renger, G., y Schulze, A. (1985). Photochem. Photobiophys. 9,79-87.

 100

RemiS, D., Bulychev, A.A., y Kurella, G.A. (1981). J. Exp. Bot. 32, 979-987.

RemiS, D., Bulychev, A.A., y Kurella, G.A. (1986). Biochim. Biophys. Acta 852, 68-73.

Svintitskikh, V.A., Andrianov, V.K. y Bulychev, A.A. (1985) Journal of Experimenthal

Botany, 36/170 1414-l 429.

Schönknecht, G., Hedrich, R., Junge, W. y Raschke, K. (1988). Nature 336, 589-592.

Schönkecht, G. , (1990). Ionenströme in Thylakoiden Tesis Doctoral, Facultad de

Biología/Química de la Universidad de Osnabrück, Alemania

Schönkecht, G., Thaler, M., Simonis, W. (1992). Light-dependent H’ fluxes are

compensated by Cl- fluxes. En Research in Phtosynthesis (N. Mm-ata, ed.). Kluwer

Academic Publishers, Netherlands, Vol. III, pp. 777-780.

Schuurmans, J.J., Casey, R.P., y Kraayenhof, R. (1978). FEBS Lett. 94,405-409.

Staehelin, L.A. (1986). Chloroplast structure and supramolecular organization of

photosynthetic membranes. En Encyclopedia of Plant Physiology, v. 19 (L.A. Staehelin y

C.J. Arntzen, eds), Springer, Berlin-Heidelberg- NY-Tokyo, pp. l-84.

Tester, M. y Blatt, M.R., (1989) Plant Physiology 91,249-252

Tikhonov, A.N., Khomutov, G.B. y Ruuge, E.K. (1984). Photobiophys. 8,26 l-269.

Thaler, M., Simonis, W., y Schönknecht, G. (1992). Plant Physiology 99, 103-l 10.
 101

Schönknecht, G., Thaler, M., y Simonis (1992). Light Dependent H+ Fluxes are

Compensated by Cl- Fluxes. En N. Mm-ata (ed.) Research in Photosynthesys, Vol. II,

777-780.

Trissl, H.-W., Gao, Y., y Wulf, K. (1992), Biophys. J 64,974-988.

Van Kooten, O., Snel, J.F.H., y Vredenberg, W.J. (1986). Photosynth. Res. 9,21 l-227.

Vredenberg, W.J. (1976). En The Intact Chloroplast (J. Barber, ed.), Elsevier,
Amsterdam-NY-Oxford, pp. 53-88.

Vredenberg, Wim, Bulychev Alexander, Dassen, Hans, Jan Snel y Voorthusen, Tijmen

van (1995) Biochimica et Biophysica Acta 1230,77-80.

Walker, David, Energy, Plants and Man, Editorial Oxigraphics, 1979, segunda edición,

1992.

Wang, Xue-Chen; Berkowitz, Gerald A.; Peters, Jeanne S. (1993). Proc. Natl. Atad Sci.

USA 90,4981-4985.

Weis, E., Ball, J.T., y Berry, J. (1987) en Progress in Photosynthesis research, Ed.
Biggins, J. pp. II. ll .553-B. 11.556.

Witt, H.T. (1979). Biochim. Biophys. Acta 505, 355-427.

 Journal of Bioenergetics and Biomembranes, Vol. 27, No. 2, 1995

Patch-Clamp Study of Vascular Plant Chloroplasts:

Ion Channels and Photocurrents

J. Jesus Muñiz,’ Igor 1. Pottosin,2 and Leandro Sandoval’

Received March 23, 1994; accepied December 12, 1994

This article presents direct measurements of large-conductance cation channel (G = 730 pS in

100/50mM KCl; PK+/Pcl- = 2.8) and light-induced current (photocurrent) in chloroplasts
from C4 plants, Amaranthus hybridus and Zea muys, using the conventional patch-clamp
technique. It was shown that preillumination of chloroplast gave rise to a fast decaying
transient (7 z 6ms) in the light-induced current for the second and following light pulses.
This transient increase of photocurrent was interpreted as a consequence of photoreducing
of the redox pool between photosystems.
KEY WORDS: Chloroplast; patch-clamp; ion channel; light-induced current; Amaranfhus hybridus, Zea
mays.

INTRODUCTION allowed direct recordings using microelectrode tech-

Light-driven electron transfer in photosynthetic
membrane causes active H’-pumping into the thyla-
koid lumen. The pH gradient built up across the
thylakoid membrane is used by vectorial proton-
translocating ATPase for ATP synthesis, while
stroma alkalinization is necessary for the activation
of key enzymes in the COZ fixation cycle (Junge and
Jakson, 1982; Heldt et al., 1973; Baler and Latzko,
1975).
The formation of electrochemical gradient for
protons across the thylakoid membrane in light has
been previously explored by a set of indirect methods
including measurements with pH- and potential-sen-
sitive dyes (Auslander and Junge, 1974; Schuurmans
et al., 1978) monitoring of electrochromic absorbance
changes of photosynthetic pigments at 5 15 nm (Junge
and Jakson, 1982) and measurements of delayed
fluorescente intensity (Bulychev et al., 1985). Only
two plant species, Peperomia metallica and Antho-
ceros sp., which have abnormally large chloroplasts,
’ Biomedical Research Center, University of Colima, Apdo. Postal
199, 28000 Colima, Col., Mexico.
2 Laboratory of Membrane Biophysics, Institute of Cell Biophysics,
Russian Academy of Sciences, Pushchino 142292, Russia.
niques (Bulychev et al., 1972; 1976, 1985; Vredenberg,
1976; RemiS et al., 1986). Recently, Bulychev et al.
(1992) showed the applicability of standard patch-
clamp technique for measurements of light-induced
current across the photosynthetic membrane of
P. metallica. The advantage of the patch-clamp
method is the possibility to work with smaller
objects, say of a few micrometer in size. Accordingly,
the patch-clamp technique has been successfully
applied to study the ion channels in the intact envelope
of chloroplasts from Charophyte alga Nitellopsis
obtusa (Pottosin, 1992, 1993), although the activity of
the chloroplasts envelope channels was also investi-
gated in different reconstituted systems (Flügge and
Benze, 1984; Keller et al., 1988; Schwarz and Wagner,
1992; Mi et al., 1994).
In this paper we describe the procedure of appli-
cation of the patch-clamp technique to study the ion
channels in the envelope as well as the photocurrents
in the thylakoid membranes with intact chloroplasts
from two C4 plants. We found a significant difference
of photocurrents in dark- and light-adapted prepara-
tions. Its possible origin is discussed in relation to
the function of the photosynthetic electron transfer
chain.

249
0145-479X/95/0400-0249$07 SO/0 0 1995 Plenum Publishing Corporation
250
MATERIALS AND METHODS
Leaves were collected from the field-grown plants
early in the morning and kept at 4°C during the day o f
the experiment to avoid starch formation. Chloro-
plasts were obtained mechanically as described in
Bulychev et al. (1972). Briefly, the pieces of the leaf
were placed in a solution containing (mM): KC 5 0
Sorbitol, 250; EGTA, 0.5; and HEPES-KOH 5 (pH
= 7.2). Cuticle was gently removed using a sharp razor
I-J=&L. Then one tissue was scraped so the leaf cells
were broken and chloroplasts were released in the
medium. t h e preparation was filtered to remove ceI1
debris, and an aliquot containing chloroplasts was
transferred into the experimental chamber filled with
the same solution. For the patch-clamp measure-
ments, intact unbroken chloroplasts of 10-15 µm
size from Amaranthus hybridus and 6-8µm from
Zea mays were selected. Microscopic analysis of leaf
sectrons QbflVl&+&& t!nese were approximately twice
as large as compared to the average size chloroplasts
and were ~&&~~~&$- UY 1 l=d~eh ‘m tne bundle sheath
cells. Microelectrode were made from soft or hard
glass, hematocrit or 7052 AM-system, respectively
by two-step pulling. Soft glass electrodes required
further intensive heat polishing to decrease the tip
diameter. Patch pipettes were filled with a solution
filtered through 0.2pm filter and containing (mM).
KCl, 100; EGTA, 0.5; CaCl,; 1 5. and HEPES:
KGH, 5 (P H = 7.2). After insertion ‘of the patch elec
trode into the solution, the electrode offset
Potential was corrected by electronic means via the
patch-clamp amplifier we were using, and tested by
patch disruption at the end of the experiment (drift
less than f2mV). The successful recordings (n = 142)
were obtained with an electrode resistance of ll MR
aS an average. soft glass in most cases showed better
adhesion to the envelope membrane (82% of total
successful recordings). The standard patch-clamp
technique in attached and inside-out modes was
used for ion channel recording. Sequential disruption
of envelope and thylakoid membranes gave access to
the thylakoid lumen, and it was possible to measure
light-induced current across the thylakoid membrane.
This recording configuration was considered similar
to whole-cell recording. The amplifier was a home-
made one designed according to F. J. Sigworth
“Electronic Design at the Patch Clamp” (in Single
Channel Recording, B. Sackmann and E. Neher,
eds., Plenum Press, New York, 1983).
Photocurrents were induced by short flashes
Muñiz, Pottosin, and Sandoval
(maximal light intensity measured at the sample posi-
tion, E = 1388 W/m2; full-width at half-height of
1 ms) or long pulses of white light (E = 8.2 W/m2).
T h e duration of continuous light stimulus (1-
1000 ms) was controlled by means of the exposure
controller and the shutter of a Minolta XG-1 cam-
era. Flash and light intensity could be decreased by
a series of neutral dark filters (ND2 and ND4). The
response to the flash was 90% of maximum when the
fl-=&.G~t~~Gf~y was reduced to 6.5% of maximal inten-
sity (S.E. = 1.3%, n = 3).
Voltages given throughout are in reference to the
intrachloroplast side, and negative currents are the
movement of positive charges into the chloroplast.
Records were filtered at 1 kHz, digitized and stored
in hard disc, and/or displayed and photographed
from the oscilloscope screen. Analyses were carried
out in part using p-Clamp 5.1 acquisition software
and Plot50, as well as - ~mfiiü2iíy.
-
Blebs (swollen thylakoids) were obtained by a
procedure si-m&% +c, l L’m; ene hescfibed in Schon-
knecht et al. (1988). Chloroplasts isolated in a solu-
tion containing (mM) KCI, 20 Trizma, 10 Mgcl 5
(7.2pH), as described abobe, were oimotica;ly
shocked to rupture the envelope. After a while
(- 15 min) blebs started to appear; measurement of
diameters began approximately 15min after the first
blebs appeared.
RESULTS
General Observations
The tight seals usually were formed in two steps.
First, after the application of light suction the resis-
tance increased up to 50-100 MR. Then it sponta-
neously increased further up to 0.5-10 Gh reaching
the sustained level. However, in many cases ;he appli-
cation ofpositive holding potential (around 30 mV) or
pulsed suction was helpful in improving the resistance
at the second stage. The percentage of successful
recordings of single-channel activity in the intact
envelopes of chloroplast obtained from 4-5 weeks oid
Amaranthus plants was around 20%. No signincant
changes in the channel activity were observed upon
the patch excision, and the inside-out patches were
usually stable unless large (> 30mv) negative steps
of potential were applied.
An example of single-channel recording at different
Potentials obtained with Amaranthus hybridus
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents 251

0 mV

40 mV

30
c
20 mV F--

0 mV : -10
2

Q
a
0
c

0-L-
-20 mV
IL -40

-20 0

VOLTAGE. m V

2 5 0 ms

F i g . 1 . Single-channel currents in the chloroplast envelope membrane. A and B: Records

of ion channel activity in chloroplasts of Amaranthus hybridus and Zea mays, respectively.
0 and C correspond to completely open and close states, respectively. Arrows indicate the
channel low-conductance states. C: Z/V plot for the open state of Amaranthus channel.
Means obtained by averaging data collected from 10 samples, bars are S.E. Solid line is
low-order polynomial fitted to the data. 100 mM KCl in patch pipette and 50 mM KCI in
the bath. Nernst potential for K’ was +17mV in these ion conditions. The reversa1
potential was +7.8 mV, indicating a weak K+ over Cl- selectivity. The sign of the voltage
defined as positive corresponds to intrachloroplast side made more positive; the current
corresponds to the influx of cations into the chloroplast.

chloroplast is presented in Fig. 1A. Besides the fully
open state, substates of smaller current amplitude
were detected. With long incubation, the occurrence
of the fully open state diminished irreversibly, while a
substate with a conductance of around 130 pS in lOO/
50mM KCl was stable in time. Similar kinetic beha-
vior (i.e., closure to substate) was observed when the
potential was stepped up to large positive values
(> 40mV), with a slow (within seconds) recovery of
the kinetics when the voltage was returned to lower
values. Steps to negative potentials had a generally
smaller effect on channel’s kinetics, but the increase
of current noise (flickering) in the open state was
recorded at these potentials (Fig. 1A).
The current-voltage (III’) relationships of the
channel in t h e o p e n state were analyzed in lOO/
50mM KCl gradient to access the channel selectivity
(Fig. 1C). The reversa1 potential of the Z/ I/ curve, V,,
was 7.8 f 1.4mV (n = lo), which implied slight
selectivity for K+ over Cll, PK+/Pclm = 2.8 as calcu-
lated using the Goldmann-Hodgkin-Katz equation.
Slight inward rectification of the Z/V curve was ob-
served, which probably dealt with the larger cation
flux from the side with higher salt concentration.
Linear regression of the Z/V curve (not shown)
gave a chord conductance of 730 f 40 pS for the fully
open state in these ion conditions.
With maize chloroplasts we never obtained a sea1
resistance > 100 MR. These chloroplasts generally
showed much worse adhesion to the patch pipette,
and we were unable, in most cases, to suck a sufti-
cient envelope area inside the electrode to improve
the seal; at least the leak resistance and capacitance
artifact remained unchanged during the suction pulse.
Finally, the apphcation of strong suction led to the
breakdown of the envelope and lysis of plastid. In
three out of more than 100 attempts, however, we
were able to detect the single-channel activity with
252 Muñiz, Pottosin, and Sandoval

B
t
a l - - - - - -
5oma
t

, I 2opA
b - - - -
t +iL

Fig. 2. Different types of photocurrent responses in chloroplasts. Holding poten-

tial is OmV, ionic composition of solutions as in Fig. 1. A: Different recording
configurations for the same chloroplast of Amarunfhus hybridus; (a) and (b) be-
fore, (c) and (d) after disruption of thylakoid membrane by short suction pulse;
(a. c) and (b, d) are responses to short saturative flash and pulse of continuous light,
respectively. B: Photocurrents in Zea muys chloroplast; (a) flash induced response,
(b) response to continuous light. C: Complex kinetics of photocurrent in Amar-
unthus: fast (F) and slow (S) components of the light transient, (U) upstroke of
current on the offset of illumination. Arrows indicate onset and offset of light.
Light pulse duration was 0.5 s.

low-resistance seals (50-100 MR). An exaniple of
such a recording made at zero voltage is present in
Fig. 1B. The direction and magnitude of the single-
channel current were close to that obtained with
Amaranthus chloroplasts at 0 mV. Therefore, these
two channels probably have similar conductance
and selectivity, although we were unable to prove
this as the ion currents in maize chloroplasts could
be studied only in a narrow range of potentials close
to zero.
Forming of the initial 50-100 MR contact of the
patch pipette with the chloroplast envelop did not
necessarily give rise to a further increase of resis-
tance. Instead, in many cases, the resistance sponta-
neously decreased to 20-50MR. This change was
accompanied by the increase of capacitance artifact,
which likely reflects the breakdown of envelope and
access of pipette to the chloroplast interior. No photo-
response was registered during this step. However,
additional short suction usually produced a posi-
tively directed response to the light (Fig. 2A, B).
Then, a short and intense suction pulse was applied
which caused inversion of the photocurrent polarity.
The magnitude of the photocurrents usually dimin-
ished 2- to 3-fold in the first few minutes of record-
ing, but responses of magnitude as in Fig. 2C and Fig.
4A-E could be typically recorded for a longer time
(up to 30-90min).
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents
Table 1. Kinetics of
Continuous light
Peak current amplitude (PA)
Steady-state
Parameter Dark adapted Preilluminated current (PA)
Mean 14.6 40.7
S.E. 2.1 5.4
Number o fexperiments 18 18
Chloroplasts from older plants (S- 10 weeks) gen-
erally gave more stable photocurrents. However, with
these chloroplasts it was in some cases difficult to
invert the current; large voltage pulses (50-100mV)
accompanied by strong suction were helpful in this
case. Only a few recordings were obtained with
maize chloroplasts (example in Fig. 2B); the
responses were much smaller in magnitude as com-
pared to the photocurrents measured in Amaranthus,
and we were unable to invert the photocurrent by
applying large voltage and strong suction pulses.
Only inwardly directed photocurrents in Amar-
anthus were used for further analysis. The reason for
doing so was that this recording configuration was
more stable in time, while for positive currents the
polarity was usually spontaneously inverted in the
first few minutes even without additional suction
pulse. The kinetics of photocurrent was complex: (1)
partly resolved rapid rise, (2) biphasic decay in the
light to a steady-state level, and (3) further decay in
the dark. The latter was often accompanied by a small
upstroke of current better seen with a freshly prepared
sample, with a slow decay (in a time scale of seconds)
to the initial dark leve1 (Fig. 2C).
The kinetic parameters of the photocurrents are
given in Table 1. Those parameters for light- and dark-
adapted preparations are measured lo-50 min after
electrode insertion into a thylakoid; for those prepara-
tions for which the sample was kept in the dark over
1 min or more, the amplitude of the fast component
(7 r 6 ms) of the light transient, as estimated by fitting
the decay time course by a double exponential func-
tion, did not exceed 25% of maximal (see next sec-
tion). It was found that the amplitudes of the slow
component of the photocurrent (7 2 IOOms) as well
as the steady-state current decreased upon sample
aging (in severa1 10min intervals). The amplitude of
the fast component also decreased, although this
change was relatively small. However, in addition,
the increase of the nondadaptable fraction of the
253
photocurrents
Flashes
Light transient (ms)
Amplitude Decay time
7 fast 7 slow (P A) @sI
7.4 5.5 110.9 44.9 120.0
0.6 0.7 9.5 6.7 1.60
35 18 35 50 50
fast transient (i.e., the fast component present both
in the light- and dark-adapted preparation) was
found under these conditions.
The time course of flash-induced photoresponse
could in most cases be fitted by a monoexponential
function (see T in Table 1). The amplitudes and r
varied greatly from sample to sample (7-300pA and
l-60ms, respectively). The amplitude of flash-
induced response decreased during the flash series
(flashes were given 2-3 s apart, not shown), and the
amplitude of the response was partly restored when
the sample was kept over a few minutes in the dark.
However, at very long incubation times (severa1 lo-
min intervals) an irreversible decrease of the ampli-
tude of the flash-induced response and an accelera-
tion of its decay kinetics (in some cases, severalfold)
were observed. Hence, only the first flash in each
experiment was taken into account, and the average
equivalent charge transferred per flash for ali experi-
ments (n = 50) was calculated as
q = T x Ipeak = (3.84 f 0.57) x lo-l3 C
Effect of Pre-illumination on the Kinetices of Light-
Induced Curren t Transien t
As shown in Table 1, the magnitude of the initial
current response to continuous light differs, on aver-
age, by 64% in dark-adapted and preilluminated
chloroplasts. This occurred because in t h e dark-
adapted preparation the amplitude of the fast compo-
nent was usually small; the second pulse given 0.5- 1 .O s
apart produced a large increase of the fast component
‘-06
200 ms
Fig. 3 . Effect of preillumination on the kinetics of photocurrent at
OmV. Two 0.25-s light pulses are separated by 0.6-s dark interval.
Before the experiment sample was kept in the dark for severa1
minutes. The ionic composition of solutions is as in Fig. 1.
254 Muñiz, Pottosin, and Sandoval

30 60 90 120

Dark odaptation time (s)

Fig. 4. Effect of dark adaptation on the amplitude of fast component of photocurrent transient. The
duration of dark interval preceding the pulse in sequence was (in seconds): (A) 62, (B) 8, (C) 22, (D) 26,
and (E) 39. F: The amplitude of fast component expressed in percentage of control (test pulse given 0.5-
1 .O s apart preceding one) VS. dark interval duration. Dashed line is best fit to the data by monoexpo-
nential fimction, r = 80s. Solid line is best fit for exponential power function, n = 35, r = los, and
C = 25%. G: Summary of four individual experiments as the one in (F), lines as in (F). For monoexpo-
nential function T = 39 s, and for power function n = 3.1, T = 16 s, and C = 20%. See text for explana-
tion of parameters. Other experimental conditions are as in Fig. 3.

amplitude (Fig. 3). In contrast, the amplitude of the
slow component was smaller for the second pulse,
while a complete restoration of the slow-
component amplitude required severa1 seconds of
dark adaption. At the same time, the fast-component
amplitudes measured in 0.5 s and after a few seconds
in the dark were usually the same. For longer adapta-
tion times (10-30s) however, an abrupt decrease
of the fast-component amplitude was observed (Fig.
4B-E). With 18 out of 25 samples the fast-component
amplitudes diminished to less than 25% of maximal or
were even completely abolished by keeping the sample
in the dark for 30-60 s. The effect of dark adaptation
on the fast component amplitude was studied in detail
with four samples (Fig. 4F-G). The time coursed
showed a sigmoid shape, i.e., no change of the
amplitude for the first lo-30 s, and an abrupt fa11 to a
low sustained leve1 (O-20% of maximum) which re-
mained unchanged up to 10min of dark adaptation.
For very long incubation (> 1 hr) the fraction of
“nonadaptable” fast transient increased irreversibly;
thus, the experiment was stopped when it approached
a 30% level.
The pooled points from al1 experiments were
better fitted by the exponential power function
f=c+(100-C)(1 -(l -&)“)
rather than by the monoexponential function. Here, C
is the fraction of the nonadaptable fast component, in
percent. The best fitted values of r and n were 16 s and
3.1, respectively.
Because of variations in r with different samples,
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents 255

the transition region for the average curve is smeared. l A

As a result, r was overestimated, while n was under-
estimated, as compared to individual samples. As an
example, in Fig. 4F, the best fit was obtained with
n=35andr= 10s.
The other objective of this study was to estimate
the duration of preillumination pulse necessary to
produce the maximum amplitude of the fast compo-
nent. We found out that the short saturative flash was
not sufficient in al1 cases, at least when the test pulse of
continuous light was given 200-1000 ms after the
flash (n = 7). Strong white light of variable duration
was insufficient unless prepulses longer than 8 ms were 0 30 60 90 120 150 500 1000

used. Thus, a time delay in the development of the fast B

transient as a function of the preillumination period
was observed (Fig. 5A). In two out of five experiments
the transition region was analyzed more carefully (i.e.,
all the time points in the interval where the amplitude
of fast transient changed from 10 to 90% were re-
peated at least three times with each sample). This
allowed an accurate fitting of the observed depen-
dente by a model curve. In both cases the monoexpo-
nential function gave poor fit to the points, while the
exponential power function
f = lOO(1 - e-“7)”
provided good fit to the data with n = 7.8 (9.5) and
7 = 12 (20)ms for the first and second samples,
respectively. When the data of five individual experi-
ments were pooled, an apparent increase of 7 (22 ms)
and a decrease of n (1.6) were found, which is likely a
result of smearing of the transition region due to the
variation of 7 for different samples.
DISCUSSION
General Observations
The large-conductance cation channel described
in this paper closely resembles the 1-nS (in symmetri-
cal 100mM KCI) cation channel found in N. obtusa
chloroplast envelop (Pottosin, 1992), with a minor
difference in the K+/Cl- permeability ratio and a
slightly smaller conductance (730 pS in lOO/ mM
KCl), which is likely to be a consequence of lower
salt concentration. Both channels were mainly in the
fully open state at negative (chloroplast inside) poten-
tials, while at positive potentials they switched to
lower conductance states. The plot of time-average
conductance as a function of membrane potential
(Fig. 6) for N. obtusa and Amaranthus envelope
$ o.--r./.b 1 10 100 1000
Duratíon o f l i g h t prepulse. ms
Fig. 5. Dependence of fast component amplitude on the prepulse
duration. A three-pulse protocol was used: first pulse for dark
adapted preparation was of variable duration, second and third of
250ms each. Dark interval between pulses in sequence was 0.5-
1.0s. The amplitude of fast component measured for the second
pulse was taken relative to the one obtained for the third pulse (in
percent). A: Plot of single experiment; bars are S.E. for three values,
solid line is best fit with exponential power function, n = 9.5 and
T = 20ms; dashed line is best fit with a monoexponential power
function, r = 80 ms. B: Summary of five experiments as the one in
(A); S.E. are for means obtained in different experiments. Lines as in
(F). Parameter values for exponential power function and mono-
exponential function are 7 = 22 ms, n = 1.6, and r = 33 ms, respec-
tively. See text for explanation of parameters. Other experimental
conditions as in Fig. 3.
channels shows a similar pattern that implies that
these channels might be an obligatory component of
the chloroplast envelope studied in situ. This would
favor the influx of cations in chloroplast through the
channel.
Recent examination of detergent-solubilized
chloroplast envelopes reoconstituted into a planar
lipid bilayer revealed voltage-independent cation
channels with a conductance of 120- 180 pS
(Schwarz and Wagner, 1992; Mi et al, 1994). These
256
I / I / I I
- 0’ u O
0
n O0
0’ I I
- 6 0 -40 -20 0 20 40
M E M B R A N E P O T E N T I A L , mV
Fig. 6. Plot of time-averaged conductance for large cation chan-
nels in Nitellopsis obtusa and Amaranthus hybridus chloroplast
envelopes. The conductance was 1020~s (lOO/lOOmM KCI) for
Nitellopsis and 720 pS (1 lo/50 mM KCl) for Amaranthus channels,
respectively. Each point represents the channel current averaged
over lo-15 s of successful recording at given potential taken rela-
tive to maximal amplitude of single channel current at the same
potential. Filled and hollow symbols are for different samples. 0,
n : Nitellopsis. 0, 0: Amaranthus.
properties are reminiscent of the behavior of the 130-
pS substate of the large-cation channel recorded here,
which was the most prominent upon preparation
aging. A similar large-conductance multistate chan-
nel (G = l-l.3 nS) in the inner membrane of mito-
chondria was proposed to be formed by a number
of pores in the inner membrane and a large pore in
the outer one (Kinnally et al., 1992). This hypothetical
structure implied a certain degree of flexibility, with a
variety of conductance levels observed to be depen-
dent on the integrity of a contact site. A similar model
may serve as an attractive explanation for the changes
of the conductance pattern in the chloroplast cation
channel both upon aging and upon reconstitution in
artificial systems.
Our results confirmed the recent finding of Buly-
chev et al. (1992) that the standard patch-clamp tech-
nique could be applied to study light-induced currents
in photosynthetic membranes. The application of this
technique for measurements of photocurrents may be
very general, with the possible exception of bundle-
sheath chloroplasts in advanced C4 plants (Panicoid
grasses) which do not contain a well-developed thyla-
koid system (Coombs and Greenwood, 1976; Staehelin,
Muñiz, Pottosin, and Sandoval
1986). Accordingly, in this study we obtained only a
few recordings of photocurrents with chloroplasts of
Zea mays, while with bundle-sheath chloroplasts of a
dicotyledon C4 plant Amaranthus possessing well-
developed grana (Fisher and Evert, 1982) t h e
recordings were made more readily and in a highly
reproducible manner.
To our knowledge, the chloroplasts of C4 plants
have been examined by means of electrophysiological
techniques only for the first time. Thus, it was inter-
esting to find a qualitatively similar kinetics of photo-
currents as compared with patch-clamp recordings
obtained by Bulychev et al. (1992) who used giant
chloroplasts from the C3 plant Peperomia metallica.
T h e s e a u t h o r s compared the kinetics of photo-
60 80
currents obtained with conventional microelectrode
and patch-clamp techniques as well as in current-
and voltage-clamp modes, and found them to be
very similar. Their results suggested that the patch-
pipette had a low-resistance access to a thylakoid
lumen, and the electrogenic transfer across the thyla-
koid membrane could be measured. We confirmed
this notion by verifying the sequence of steps that
finally led to the registration of an inwardly directed
photocurrent in our preparation (Fig. 2). A positively
directed photocurrent was considered to be recorded
in the thylakoid-attached configuration, and a nega-
tive one in the whole-thylakoid mode. As the current
amplitude in both modes should be proportional to
the membrane surface, the relatively large current
measured in the thylakoid-attached mode as com-
pared to the current measured from the whole-
thylakoid configuration (Fig. 2A: b and d) needs to be
explained. The thylakoid surface could be measured
by swelling thylakoids in hypotonic medium, which
results in formation of large spherical vesicles
(blebs). Our experiments with Amaranthus revealed
blebs with an average diameter of 13.1 Pm (1L1.2,
n = 55) or a membrane surface of around 540pm2.
The fraction of membrane surface pulled into the pip-
ette could be estimated only indirectly as intact thyla-
koid membrane forms an intensively folded system. The
distance between neighboring bilayers in the thylakoid
stack is around 0.02pm while the average diameter of
the stack is 0.5 Pm (Junge and Jakson, 1982). The thy-
lakoids could be pulled as far as 10 Pm inside the patch-
pipette, as it could be seen in the light microscope. Thus,
the membrane area in the pipette could be at least
100 pm2, providing a single string of stacks. This
should be an underestimate, however, while at a dis-
tance of 10pm from the tip the pipette becomes
Vascular Plant Chloroplasts: Ion Channels and Photocurrents
STROMA
II+ H+
LUMEN
Scheme 1
substantially wider and severa1 stacks could be placed
in parallel.
Under voltage-clamp conditions any charge
translocation across the membrane should be de-
tected. The light-induced electrogenic reactions in
the photosynthetic membrane take place in trans-
membranously located complexes of photosynthetic
reaction centers of photosystems 1 and II (Junge and
Jakson, 1982). According to the simplified Z-scheme
of photosynthesis (Witt, 1979; Junge and Jakson,
1982), the light-induced electron transfer in the reac-
tion center of PSI1 results in the release of H+ into
the thylakoid lumen and reduction of plastoquinone
molecule (PQ) which takes H+ from the outside and
delivers them in electroneutral form (PQH2) to the
inner side of the membrane (Scheme 1). These pro-
tons are released upon PQHZ reoxidation in bóf com-
plex (a rate-limiting step), while electrons are
transferred to the reaction center of PSI, thus support-
ing its electron transfer capacity.
By measurement of charge transfer across the
thylakoid membrane induced by a short saturative
flash of light, one would obtain a direct estimate of
electrogenesis in the reaction centers of PSI and II
during a single turnover. The number of reaction
centers of PSI and PSI1 is 1200-1700 and 850-l 300
per Pm’, respectively (Staehelin, 1986), which trans-
forms to 1.2-1.7 x lo6 reaction centers for a 572.6-
Pm2 thylakoid membrane surface. The charge trans-
located at a single turnover should then be
1.8-2.7 x lo-l3 C, which is close to the value of
3.9 x lo-l3 C measured here.
Under continuous light the electron-transfer re-
actions in PSI and II are coupled at the site of PQH2
257
reoxidation in b6f complex, which is a rate-limiting
step in the intersystem electron transfer. The rate of
this reaction is slowed down upon accumulation of
H+ in the thylakoid lumen, with a typical value of
15-20 ms at neutral pH and a linear deceleration
with a factor of approximately 2 per pH decrease by
one unit (Junge and Jakson, 1982; Tikhonov et al.,
1984; Van Kooten et al., 1986; Joliot et al., 1992).
With the number of photosystems in the thylakoid
membrane given above, the transmembrane electron
transfer will result in a photocurrent in the range of
9-18 pA. The value of 14.6 pA for the dark-adapted
preparation obtained here (Table 1) fits these limits,
while the smaller value of 7.6 pA measured at the end
of the long light pulse could be a result of the “back-
pressure” effect of protons accumulated in the
thylakoid lumen at light. Upon microelectrode inser-
tion the acidification of the thylakoid lumen should
not be as large as in intact thylakoids (by 3-4pH
units, Junge and Jakson, 1982). However, a decrease
of pH by up to 2pH units was measured also after
microelectrode impalement (Remi et al., 1986).
Effect of Preillumination on the Light-Induced Current
Kinetics
The most intriguing finding of this study was the
effect of preillumination on the photocurrent. The
amplitude of the photocurrent in preilluminated
chloroplasts transiently increased by a factor of 3
(Table 1). Previous studies of electrogenesis by PSI
and PSI1 separately and in series showed that the
transient and fast increase of photoresponse is deter-
mined by PSI (Remid et al., 1981). This is a conse-
quence of faster turnover of the PSI reaction center,
providing the electron supply by the PSI donor pool
(FeS Rieske protein, cytochrome f and plastocyanin,
Scheme 1) is not limited (Junge and Jakson, 1982).
However, this pool becomes empty after a few turn-
overs because of the existense of the rate-limiting
transfer step before it, and the turnover rate of PSI
at a steady state should be limited by PQH2 reoxida-
tion. Thus, the transient component of the photo-
current can be explained by answering the following
question: why is the fast transient of the photo-
current observed only in preilluminated chloroplasts?
Previous measurements of photoelectrogenesis in
Peperomia chloroplasts under conditions where the
electron transfer between photosytems was shunted
by an externa1 electron acceptor showed the absence
of a fast transient in dark-adapted chloroplasts
258
(RemiS et al., 1981). After preillumination of the
chloroplast the fast transient reappeared, providing
the dark interval after preillumination was short.
This was interpreted as patial photoreduction of PSI
donors. We think that the effect of preillumination on
photocurrent in Amaranthus chloroplasts has the
same origin. The plots in Figs. 4 and 5 show that
the magnitude of the fast transient depends both on
the dark interval between pulses and on the duration
of the light prepulse. The dependence on light pre-
pulse duration correlates with the time course of
photoreduction of the PQ pool under saturative
light (Joliot et al., 1992). The re-oxidation of the
total intersystem redox pool was found to be a
pseudo-first order process with a characteristic time
of around 25s (Renger and Schulze, 1985). The de-
pendence of the fast transient amplitude on the dark
interval was fitted by an exponential power function
with a characteristic time of 16s, close to the above
value (Fig. 4). The reduction of PSI donors by PQH2
is thermodynamically favorable and takes place both
in the light and in the dark. Therefore, the oxidation
of PSI donors in the dark should be seen only after
complete re-oxidation of PHQ;?, which could explain
the observed delay in the time course presented in Fig.
4. Because of the large variation of the parameter n
from 3 to 35, no direct comparison with the size of the
PQ pool could be made here. However, the value of 12
equivalents per PSI1 reported by other authors (Joliot
et al., 1992) is at least in this range.
ACKNOWLEDGMENTS
We wish to thank Dr A. Bulychev (Moscow Uni-
versity), Dr A. Mulkidjanian (University of Osna-
brück), and Dr G. Schönknecht (University of
Würzburg) for stimulating discussions. I.I.P. was
partly s u p p o r t e d b y C O N A C Y T g r a n t N o .
A128CCOE-930101 (CN-2).
REFERENCES
Auslander, W., and Junge, W. (1974). Biochim. Biophys. Acta 357,
285-298.
Muñiz, Pottosin, and Sandoval
Baler, D., and Latzko, E. (1975). Biochim. Biophys. Acta 396, 141-
148.
Bulychev, A. A., Andrianov, V. K., Kurella, G. A., and Litvin, F. F.
(1972). Nature (London) 236, 175-177.
Bulychev, A. A., Andrianov, V. K., Kurella, G. A., and Litvin, F. F.
(1976). Biochim. Biophys. Acta 420, 336-351.
Bulychev, A. A., Niyazova, M. M., and Turovetsky, V. B. (1985).
Biochim. Biophys. Acta 808, 186- 19 1.
Bulychev, A. A., Antonov, V. F., and Schevchenko, E. V. (1992).
Biochim. Biophys. Acta 1099, 16-24.
Coombs, J., and Greenwood, A. D. (1976). In The Intact Chhwo-
plast: Compartmentation of the Photosynthesis. Barber, J., ed.),
Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. l-52.
Fisher, D. G., and Evert, R. F. (1982). Bot. Gaz. 143, 146-155.
Fliigge, U. I., and Benz, R. (1984). FEBS Lett. 169,85-89.
Heldt, H. W., Werdan, K., Milovancev, M., and Geller, G. (1973).
Biochim. Biophys. Acta 314, 224-241.
Joliot, P., Lavergne, J., and Beal, D. (1992). Biochim. Biophys. Acta
1101, l-12.
Junee. W.. and Jakson. B. (1982). In Photosvnthesis: Enerzv Con-
-versioi by Plants ‘and ‘Bactiria. Val. I:’ The Developient of
Electrochemical Potential Gradients across Photosynthetic
Membranes (Govindjee, ed.), Academic Press, New York, pp.
589-646.
Keller, B. U., Hedrich, R., Vaz, W. L. C., and Criado, M. (1988).
PJuegers Arch. 411, 94-100.
Kinnally, K. W., Antonenko, Yu, N., and Zorov, D. B. (1992).
J. Bionerg. Biomember. 24, 99-100.
Mi, F., Peters, S. J., and Berkowitz, G. A. (1994). Plant Physiol. 105,
955-964.
Pottosin, 1. 1. (1992). FEBS Lett. 308, 87-90.
Pottosin, 1. 1. (1993). FEBS Lett. 330, 211-214.
RemiS, D., Bulychev, A. A., and Kurella, G. A. (198 1). J. Exp. Bot.
32,979-981.
RemiS, D., Bulychev, A. A., and Kurella, G. A. (1986). Biochim.
Biophys. Acta 852, 68-73.
Renger, G., and Schulze, A. (1985). Photochem. Photobiophys. 9,
79-87.
Schönknecht, G., Hedrich, R., Junge, W., and Raschke, K. (1988).
Nature (London) 336, 589-592.
Schuurmans, J. J., Casey, R. P., and Kraayenhof, R. (1978). FEBS
Lett. 94, 405-409.
Schwarz, M., and Wagner, R. (1992). In Book ofdbstracts “9th Int.
Workshop on Plant Membrane Biology”Monterrey, California,
July 19-24 1992, p. 159.
Staehelin, L. A. (1986). Chloroplast structure and supramolecular
organization of photosynthetic membranes. In Encylopedia of
Plant Physiology Vol. 19 (Staehelin, L. A., and Arntzen, C. J.,
eds), Springer, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, pp. l-
84.
Tikhonov, A. N., Khomutov, G. B., and Ruuge, E. K. (1984).
Photochem. Photobiophys. 8, 261-269.
Van Kooten, O., Snel, J. F. H., and Vredenberg, W. J. (1986).
Photosynth. Res. 9, 21 l-227.
Vredenberg, W. J. (1976). In the Intact Chloroplast (Barber, J., ed.),
Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 53-88.
Witt, H. T. (1979). Biochim. Biophys. Acta 505, 355-427.