BIOLOGA

MOLECUL
AR

EXTRACCIN DE ADN EN
CELULAS VEGETALES
PROTOCOLO CTAB

2X

MODIFICADO

Rodriguez Delfin

Prof. Dr. Luis

Lambayeque, Septiembre del 2013

INTEGRANTES:
De la Cruz Piscoya Fatima
Diaz Cajusol Kevin
Espiche Huamn Willy Jhonson
Gmez Saavedra Nthaly C.
Gonzales Torres Renso
Hernndez Cueva Liz
Lorena Hernndez Cueva
Ordinola Burga Luis

INTRODUCCIN
Las tcnicas de biologa molecular son normalmente laboriosas, con alto
requerimiento de tiempo y dinero, siendo esto particularmente cierto cuando se
trata de la extraccin de ADN. El anlisis de ADN genmico de plantas es
realizado frecuentemente a travs de aplicaciones de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), reduciendo la necesidad del aislamiento de grandes
cantidades de ADN.
Numerosos mtodos, entre otros los descritos por Dellaporta et al. (1983),
Guillemaut y Marechal (1992), Honeycutt et al (1992), Hoisington et al. (1994),
Harvey y Botha (1996), Aljanabi y Martnez (1997) y Chen y Ronald (1999) han
sido desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayora
requieren una alta inversin de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen
bajo rendimiento de ADN.
Cuando se trabaja con un gran nmero de plantas como es el caso de los bancos
de germoplasma se requiere un mtodo rpido y eficiente de extraccin que
produzcan ADN de alta calidad.
En este trabajo se describe un protocolo modificado de extraccin de ADN
relativamente sencillo, econmico, que produce alta cantidad de ADN de buena
calidad en Phasoelus vulgaris .
I.

OBJETIVOS:

Utilizar un protocolo de extraccin de ADN estandarizado para

clulas vegetales.

Realizar clculos qumicos para la elaboracin de un Buffer de lisis

modificado.

Obtener la precipitacin y resuspencin del ADN genmico de plantas

jvenes.

II.

MARCO TEORICO

El cido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo

gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o
unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su
cdigo gentico.
Muchas de las tcnicas de biologa molecular incluyen algn tipo de
manipulacin del material gentico. Estos procedimientos han logrado
adelantar hasta tal grado el conocimiento del cdigo gentico, que ya es posible
clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y
podan pasar varios das antes de saber con certeza que se haba logrado obtener
DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Adems algunos
de los reactivos usados para estos procesos son txicos y mutagnicos. Hoy da
podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas.
Las clulas de las plantas tienen tres juegos diferentes de ADN: por un lado la
clula tiene su propio genoma en su ncleo, por otro las mitocondrias tienen su
propio genoma y por otro los cloroplastos tienen su propio genoma.
Las mitocondrias y los cloroplastos se reproducen dentro de la clula, y cuando
la clula que los alberga se divide, algunos se van para una de las hijas y otros
para la otra, de forma que nunca quede una clula sin mitocondrias ni
cloroplastos.
El ncleo de las clulas de las plantas contiene genoma de tipo eucariota: al
igual que en los animales, el ADN est ordenado en cromosomas, cada
cromosoma es una sola molcula de ADN lineal, empaquetada. En cambio, las
mitocondrias y los cloroplastos tienen genoma de tipo bacteriano: poseen una
molcula de
ADN circular por plstido, al igual que sus ancestros que eran bacterias.
El tamao del ADN es mucho mayor en el ncleo que en los orgnulos: en el
ncleo es tan grande que se mide en "mega bases", en las mitocondrias en
cambio, es de unas 200 a 2.500 kilo bases, en los cloroplastos es de unas 130 a
160 kbases (una kbases es igual a mil bases, o mil "peldaos de la escalera").

La forma de heredar el ADN tambin difiere en el ncleo y los orgnulos:

mientras que el ADN ncleo se hereda de forma biparental (como el ADN del
ncleo de los animales), el ADN de las mitocondrias y el de los cloroplastos se
hereda por parte de uno solo de los padres, en general por parte de la madre (al
igual que las mitocondrias de los animales). Esto es debido a que en general los
orgnulos que sern transmitidas a la generacin siguiente son las que estn
albergadas en el vulo.
El ADN que se encuentra en los genes es un componente de todas las clulas.
Una vez rotas las clulas, todo el material celular queda libre y, en presencia de
detergente, se separan los componentes en base a su solubilidad. El ADN se
precipita con alcohol y se separa del resto de los componentes.
III.

MATERIALES:

Instrumentos y equipos

1 micropipeta de 0.5 10 l
1 micropipeta de 10-100 l
Puntas de 10 l , de 100 l y de 1000 l
Eppendorf de 1.5 ml y de 0.6 ml
Bao mara de 10 100 C
Estufa de 20 70C
Refrigeradora 20C
Microcentrifuga 100 15000 RPM

Reactivos

Buffer de lisis CTAB 2x modificado

NaCl
FCIA(Feno:Cloroformo:Alcohol Isoamilico/25:24:1)
Isopropanol helado
Etanol 70% con T.E.
T.E. 20:5
Etanol absoluto helado
EDTA 20mM, PVP4%, B-mercaptoetanol 0.6%

Tijera
Mortero
Estilete
Marcador indeleble

Muestra Biolgica
Phaseolus vulgaris

IV.

PROCEDIMIENTOS:
1.- Se prepar la muestra (hojas jvenes de Phasoelus vulgaris)

2.- Se adicion Nitrogeno lquido en cantidad suficiente para que fuera

cubierto los tejidos que seran triturados.

3.- Trituramos el tejido con mortero hasta pulverizar todo el tejido.

4.- Se traslad la muestra triturada a tubos Eppendorf.

5.- Se le adicion 700 l de tampn de extraccin 2x CTAB.

6.- Los tubos con las muestras, fueron llevados a bao mara a 65C durante
1 hora, los cuales casa 5 minutos se debi agitar los tubos para homogenizar
la suspensin.

7.- Se le agreg 600 l de FCIA, agitndolo durante 5 minutos , para obtener

emulsin homognea.

8.- Los tubos fueron llevados a la

microcentrifuga a velocidad de

13000RPM durante 5 minutos.

9.-Luego el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo.
10.- Se le adicion aproximadamente 200 l de Isopropanol helado. Luego
es llevado a la centrifuga a 10000 RPM durante 5 minutos.

11.- Se descart el sobrenadante sin perder el precipitado (Pellet)

12.- Se lavo el pellet con 300 l de Etanol 70 %. Luego fue centrifugado a
8000 x 5minutos, una segunda vez sucedi lo mismo pero con 200 l y a
10000 RPM x 2 minutos.

13.- Al ADN se le

agreg 100 l

de TE(20:5)

14.- Por ltimo el Pellet fue lavado con 75 l de etanol al 95% o con etanol
absoluto helado. Y fue centrigugado a 10 000 RPM x 2 minutos. Luego se
descart el sobrenadante.

15.- Por ltima vez se le aade 100 l de TE(20:5)

V.

RESULTADOS

Con la experiencia realizada se logr obtener el ADN de las clulas vegetales

Despus de la aplicacin de todo el protocolo el resultado final se observa,
cuando habiendo invertido el tubo en que se contiene la sustancia precipitada
esta no caa, lo cual se est indicando

la presencia de ADN purificado

(PELLET).

VI.

EXPLICACION CIENTIFICA
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El ADN es un polmero

de doble cadena,

constituido

por cuatro

desoxinucleotidos (adenina, guanina, timina y citosina) ligados por uniones

fosfodiester en orden especifico, a menudo con un mensaje codificado.
La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad
posible del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y
otros inhibidores de enzimas.
Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de
cidos nucleicos, aqu se trabajara especficamente con la extraccin de ADN
vegetal por el mtodo CTAB (Doyle y Doyle, 1987, modificado por Harris, 1996)
y se visualizara mediante electroforesis en gel de agarosa.
En plantas, la pared celular es la primera barrera para la extraccin, es
necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos
fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin.
Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y
soluciones de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en el
buffer.
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para
separarlos de los cidos nucleicos se pueden emplear mayor cantidad de buffer
de etraccin o sustancias como CTAB (cetil trimetil amonio) que colabora en la
precipitacin del ADN.

VII. CONCLUSIONES
La pared celular se lisa con PVP y la membrana con CTAB.
El ADN VEGETAL Se encuentra en el NCLEO celular, especficamente
dentro de los CROMOSOMAS, pero tambin se encuentra en los
CLOROPLASTOS, ya que este organelos presenta una molcula de ADN
CIRCULAR y arrollada de tipo procarionte y eso le da cierta autonoma
parcial con respecto al Ncleo, es decir puede realizar sus propias sntesis de
Protenas. El ADN de las clulas vegetal se encuentra dentro del ncleo,
11

pero adems tienen dos orgnulos con su propio material gentico: las
mitocondrias y los cloroplastos, ambos tienen una molcula circular de ADN
El nitrgeno lquido fue empleado para la rotura de las clulas o tejidos para
obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada se
encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin.
El mtodo CTAB es uno de los mtodos de extraccin de ADN ms
utilizados por su fcil implementacin, baja toxicidad de los reactivos y
permite la visualizacin del ADN pero el sacar una buena muestra depende
de los reactivos, el material biolgico y que el proceso se realice lo ms
cuidadosamente posible.
Este mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para
eliminar los polisacridos y los compuestos polofenlicos, que, de otro
modo, alteran la pureza del ADN y, por lo tanto, su calidad.

VIII. RECOMENDACIONES

Al momento de centrifugar es necesario colocar los tubos balanceados para

evitar la descompensacin de los pesos.

Asegurar bien los tubos con sus tapas, para evitar que estos se suelten y

perder las muestras.

Se tiene que tener mucho cuidado con la manipulacin del nitrgeno lquido

ya que causar quemaduras.

Asegurarse de separar el sobrenadante, ya que solo en el encontraremos el
ADN requerido y necesario para observar

IX.

PREGUNTAS

1. Cul es la actividad ltica del PVP o Polivinilpirrol?

PVP (polivinil pirrolidona) Detergente Elimina compuestos fenlicos que
pueden inhibir la actividad de enzimas.
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2. Explique el procedimiento de lisis celular en clulas vegetales

El objetivo principal en un experimento de extraccin de ADN es obtener una
preparacin de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la
posibilidad de almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su
estructura y propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la
reproduciblidad en experimentos posteriores. La cantidad, por su parte, es un
concepto relativo que depende, entre otros, del nmero y estado de las clulas
propias del tejido a estudiar. Por lo tanto, como regla general, un buen mtodo
de extraccin debe mantener la integridad

fsica y bioqumica del ADN e

incrementar sus rangos de pureza y concentracin.

Ruptura de tejidos y paredes celulares. Este paso consiste en pulverizar el
material vegetal a bajas temperaturas, generalmente empleando nitrgeno
lquido o hielo seco Tambin existe la pulverizacin en seco, un proceso en el
cual los tejidos se deshidratan por secado en un horno o con silicagel. Sin
embargo, este procedimiento no es de aplicacin general y en palma de aceite,
por ejemplo, el tratamiento de secado no permite recuperar ADN de buena
calidad. Para degradar paredes celulares se pueden utilizar, adems, enzimas
tipo celulasas
Ruptura de membranas. Una vez el tejido es disgregado en clulas, se hace
necesario romper las membranas celulares para liberar el ADN.
Esto puede ser llevado a cabo qumicamente con detergentes (SDS, Triton o
detergentes comerciales). Tambin se emplean mtodos fsicos, como aquellos
basados en ultrasonido
3.

Describir las fuentes de ADN de las clulas vegetales, y el tipo

de ADN que se obtiene

El ADN que ha sido extrado de un tejido debe ser cuantificado y su calidad

verificada. El mtodo ms empleado para la determinacin simultnea de estas
caractersticas es la electroforesis en gel de agarosa .

Esta tcnica se

fundamenta en la migracin de las molculas de ADN, a travs de una matriz

gelatinosa, debida a la aplicacin de un campo elctrico. La deteccin visual del
ADN se lleva a cabo utilizando una sustancia sensible a la luz ultravioleta, el
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bromuro de etidio (Sambrook et al. 2002). Este compuesto es un agente

carcinognico que actua intercalndose dentro de la doble hlice del ADN.
La cuantificacin tambin se puede realizar empleando un espectrofotmetro, el
cual detecta la radiacin emitida por las bases nitrogenadas presentes en el ADN
luego de ser excitadas con luz de 260 nm. De igual manera se puede emplear un
fluormetro, el cual cuantifica la emisin de energa de los compuestos qumicos
(fluorocromos) que se intercalan dentro del ADN .
4. Qu diferencia existe entre el uso del Isopropanol y el etanol
absoluto?
Isopropanol: Disolventes para aceites, gomas, alcaloides y resinas
elaboran soluciones de jabn acetonas y antispticos .
Etanol: Disolventes de productos como la laca, pinturas, barnices, cola y
frmacos y explosivos tambin como base para la elaboracin de productos
de elevado peso molecular

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X.

LINKOGRAFA

ADN en vegetales, Articulo disponible en:

http://sian.inia.gob.ve/repositorio/revistas_ci/Agronomia
%20Tropical/at5202/art/zambrano_a_nota.htm
Extraccin

de

ADN

en

vegetales,

disponible

en:

http://www.elmisionero.com.ec/index.php?
option=com_content&view=article&id=1229:extraccion-del-adn-envegetales&catid=847:opiniones
Watson J., T. Baker, S. Bell, A. Gann, M. Levine y R. Losick. (2006) Biologa
Molecular del Gen. 5 Edicin. Editorial Mdica Panamericana.

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