Sie sind auf Seite 1von 12

ESCUELA POLITCNICA NACIONAL

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA Y AGROINDUSTRIA


LABORATORIO DE MIGROBIOLOGA
Prctica N2
CONTAJE TOTAL DE MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS
ALIMENTICIOS
Boada Daniela, Nevrez Mara Cristina, Valencia Kimberly
1. Resumen
La finalidad de esta experimentacin fue adquirir destreza en las tcnicas de anlisis
microbiolgico de productos alimenticios: lcteos y crnicos. Para esto se emplearon muestras de
carne molida, queso, leche, helado y yogur, las mismas que fueron separadas para almacenarse
por un da, una cantidad a temperatura ambiente y otra en refrigeracin. Con las muestras listas
para el anlisis se procedi a la realizacin de las diluciones indicadas, 10-4, 10-5, y 10-6para helado,
yogur y leche; mientras que 10-5, 10-6, y 10-7tanto para queso como para carne molida.
Posteriormente se prepararon las cajas Petri con 1 mL de cada dilucin y con agar como medio
para incubarse por 48 horas a 32 C. Al cabo de las 48 horas se efectu el contaje por observacin
de las colonias presentes en cada caja Petri con lo que se pudo determinar el recuento total de
microorganismos en cada una, lo que report que el queso tuvo el mayor recuento tanto en el
caso de la muestra a temperatura ambiente (2,07E+09 ufc/g) como la expuesta en refrigeracin
(2,00E+08 ufc/g), seguido de la carne refrigerada (1,02E+08 ufc/g) y a temperatura ambiente
(1,80E+08 ufc/g) y el yogur en refrigeracin (2,44E+07 ufc/g) y sin refrigerar (2,58E+08ufc/g);
ubicndose al final el helado y la leche. Con lo que se evidenci el efecto de la temperatura en el
crecimiento microbiano, adems la influencia de factores como la actividad de agua, pH, Eh y la
carencia de barreras biolgicas en los productos.
2. Revisin Bibliogrfica
Contaminacin de alimentos por microorganismos:
Los microorganismos viven de las sustancias presentes en el medio. Para el crecimiento de ellos,
se requieren ciertas condiciones, las cuales deben ser adecuadas para su desarrollo. Estas son:
temperatura, la cual debe ser la ptima de crecimiento; presencia o no de oxgeno en el medio,
dependiendo del microorganismo; y agua (Cantoni, 2009, p. 40).
Productos lcteos:
Son importantes dentro de la dieta de los seres humanos.
Leche
Producto integro, no alterado ni adulterado y calostros del ordeo higinico, regular, completo e
ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas.
Caldern y Pascual (2000) comentan que la leche es un alimento completo producto de la
secrecin de las glndulas mamarias de algunos mamferos, los seres humanos la obtienen
1

mediante el proceso de ordeo de algunos animales domsticos, como es el caso de la vaca. Antes
del ordeo la leche es un producto estril, despus de este puede producirse una contaminacin
resultado de una manipulacin inadecuada, convirtindola en un producto perecedero, vehculo
de bacterias patgenas para el hombre.
Composicin media:
Por el alto grado de humedad, gran concentracin de nutrientes y un pH que se encuentra entre
6,5 y 6,7, la leche es un excelente medio para el crecimiento de microorganismos, como son
bacterias, mohos y levaduras.
La composicin vara con algunos factores como son la alimentacin y raza del animal, as como
tambin la estacin del ao en que se est.
Contiene alrededor 87 % de agua, 3,5 % de protenas, entre 3,5 % y 4 % de lpidos, 5,1 % de
glcidos, 0,7 % de sales minerales; adems estn presentes vitaminas hidrosolubles, vitaminas
liposolubles y enzimas (p. 281).
Los microorganismos que se desarrollan en la leche se clasifican en tres grupos:

Causantes de descomposicin.
Originadores de infecciones en el ser humano (patgenos).
Benefactores, necesarios para la elaboracin de productos derivados como son el yogur y
el queso (p. 5).

Yogur
Es un producto de la leche coagulada, tiene un pH igual o menor a 4,6, se obtiene por el proceso
de fermentacin lctica empleando microorganismos: Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus
thermophilus (Caldern y Pascual, 2000, p. 285).
Queso
Es un alimento que contiene los mismos nutrientes presentes en la leche cruda. Existe gran
variedad de quesos que se clasifican segn sus propiedades y caractersticas. Para obtenerlo se
coagula la leche, empleando variados mtodos que influirn en las caractersticas finales del
producto, y se retira el suero (Aguhob y Astell, 1998, p. 7).
Helado
Tambin es un producto elaborado con leche. Dentro de la produccin de helado resulta difcil el
control de seguridad microbiolgica (Aguhob y Astell, 1998, p. 7).
Productos crnicos:
Existe riesgo de contaminacin microbiana desde que se sacrifica al animal hasta el consumo del
producto final.
Carne molida

La carne es un medio excelente para el desarrollo de microorganismos, debido a que no tiene


barreras biolgicas, a su pH, a la actividad de agua (aw), al potencial de xido-reduccin y los
nutrientes presentes en ella (Caldern y Pascual, 2000, p. 219).
La contaminacin inicial de productos crnicos es muy alta, debido a los procesos de molienda los
que se llevan a cabo a temperaturas ambientales permitiendo as la multiplicacin de
microorganismo.
Al inicio la carne est cubierta por la piel y vainas musculares del animal, mientras ms se expone
la carne al corte, picado, molienda, etc ms superficie existe para que los microorganismos
crezcan con facilidad. La zona de peligro de desarrollo microbiano se encuentra entre 4 C y 60 C,
por ello el corte de la carne y productos crnicos debe realizarse a no ms de 12 C, mientras ms
alta sea la temperatura ser ms fcil el crecimiento microbiano. Los microorganismos que causan
alteraciones en la carne crecen a pH altos, por lo que se debe evitar esta condicin (Ranken, p. 86).
3. Materiales, Reactivos y Equipos
Materiales
4 Frascos de dilucin de 99 mL.
4 Tubos de dilucin de 9 mL.
10 pipetas estriles
12 cajas Petri
1 Propipeta
Alimentos y sustratos:

Plate Count agar


Leche
Carne molida
Yogur
Helado
Queso

Equipos

Estufa

4. Trabajo Experimental
3.1. Metodologa
En la realizacin de la prctica se tuvo a disposicin material esterilizado: esptulas, pipetas y
cajas Petri, adems de los correspondientes frascos y tubos de agua de dilucin, propipetas,
balanza analtica, y un mechero para el desarrollo efectivo de la prctica,
El contaje de microrganismos se lo realiz en productos alimenticios como: leche, yogur,
helado, carne molida y queso. En el caso de productos slidos se procedi a pesar 11 gramos
de muestra con el uso de una esptula estril y se los coloc en un frasco de 99mL de agua de
3

dilucin (agua de peptona), se agit vigorosamente, obteniendo la dilucin 10-1. En el caso de


la preparacin de diluciones para productos lquidos como es el caso de la leche, se midi 1mL
de leche con el uso de una pipeta estril y se lo deposit en un frasco de 99mL de agua
dilucin, se agit y como resultado se obtuvo la solucin 10-2.
En el caso de la leche para preparar las diluciones de 10-4, 10-5, y 10-6, se tom 1mL de la
dilucin 10-2 empleando una nueva pipeta estril y se coloc en un frasco de 99mL de agua de
dilucin, obteniendo as la dilucin 10-4, con una nueva pipeta estril se tom 1mL de la
dilucin 10-4 y se deposit en un tubo de 10mL de agua de dilucin, se agit y se obtuvo la
dilucin 10-5 . Con la misma pipeta se sembr a profundidad dos cajas Petri con un 1mL de la
dilucin 10-4.
Empleando una nueva pipeta estril se desempe el mismo proceso antes mencionado para
lograr la siembra de dos cajas Petri con un 1mL de la dilucin 10-5 y formar la dilucin 10-6. Se
us una ltima pipeta estril para realizar la siembra en profundidad de dos cajas Petri con un
1mL de la dilucin 10-6.
Cada toma de muestra se la realiz de forma asptica, junto a un mechero Bunsen, de tal
manera que se abri el contenedor de las pipetas esterilizadas, se flame la tapa y se coloc
sobre la mesa de trabajo, la cual fue limpiada con alcohol previamente. Se tom la pipeta y se
la mantuvo cerca al mechero, se flame una vez ms la tapa del contenedor de pipetas y se
cerr dicho contenedor, el mismo proceso mencionado se realiz para sacar las cajas Petri a
utilizar en cada dilucin.
La siembra de microorganismos se ejecut con la siguiente secuencia: se abri el frasco de la
dilucin a trabajar y se flame la boca de este, se tom 1mL de la dilucin cerca al mechero y
se procedi a depositar en la caja Petri, para ello se abri la caja Petri de tal manera que se
pudo depositar la muestra en el centro de la misma y colocar el agar aproximadamente hasta
la mitad de la caja. Se cerr la caja y se la agit en forma de ocho sobre la mesa, finalmente se
dej reposar hasta que solidifique el agar.
Cada caja Petri fue adecuadamente rotulada, con informacin especfica como: producto, mL
de dilucin, medio, grupo y fecha, en los bordes de cada caja y como paso final se incubaron
las cajas a una temperatura de 32C por 48 horas.
Una vez cumplido el tiempo de incubacin se procedi a realizar el contaje total de
microorganismos presentes en cada siembra a profundidad para los diferentes productos
alimenticios.
3.2. Datos Experimentales
Tabla 3.2.1. Unidades formadoras de colonias para muestra de helado.

Dilucin
10-4
10-5
10-6

Helado Sin Refrigerar


Plato 1
Plato 2
300
300
171
193
11
11

Helado Refrigerado
Plato 1
Plato 2
72
134
18
14
Contaminado
4

Tabla 3.2.2. Unidades formadoras de colonias para muestra de leche


Leche Sin Refrigerar
Plato 1
Plato 2
Contaminado Contaminado
300
300
300
205

Dilucin
10-4
10-5
10-6

Leche Refrigerada
Plato 1
Plato 2
121
115
13
4
Contaminado

Tabla 3.2.3. Unidades formadoras de colonias para la muestra de carne.

Dilucin
10-5
10-6
10-7

Carne Sin Refrigerar


Plato 1
Plato 2
300
300
190
170
56
Contaminado

Carne Refrigerada
Plato 1
Plato 2
300
300
98
105
34
28

Tabla 3.2.4. Unidades formadoras de colonias para la muestra de yogur.

Dilucin
10-4
10-5
10-6

Yogur Sin Refrigerar


Plato 1
Plato 2
Contaminado Contaminado
Contaminado Contaminado
Contaminado Contaminado

Yogur Refrigerado
Plato 1
Plato 2
300
300
225
263
72
46

Tabla 3.2.5. Unidades formadoras de colonias para la muestra de queso.

Dilucin
10-5
10-6
10-7

Queso Sin Refrigerar


Plato 1
Plato 2
300
300
300
300
Contaminado Contaminado

Queso Refrigerado
Plato 1
Plato 2
300
Contaminada
300
300
126
184

Tabla 3.2.6. Caractersticas de los productos alimenticios


MUESTRA

LUGAR

FECHA

Leche cruda

Guayllabamba

11 de marzo
de 2014

Yogur
artesanal de
coco

Quito
(Amazonas y
Veintimilla)

11 de marzo
de 2014 a las
10:00

CARACTERISTICAS
Cremosa, viscosa
Color: Blanco amarillento
Sin refrigerar: olor fuerte caracterstico
Refrigerada: olor leve caracterstico
Caractersticas sin refrigeracin*: color
blanco, olor a coco poco intenso
Caractersticas con refrigeracin*: color
blanco, olor a coco
5

Tabla 3.2.6. Continuacin

Helado
artesanal de
crema (sabor
vainilla)

Quito

11 de marzo
de 2014 a las
11:30

Valle de los
Queso fresco
Chillos,
11 de marzo
artesanal
Mercado
de 2014
Sangolqu
Tercena
Tercena
Cotocollao
Cotocollao
10 de marzo
(cerca
(cerca
de 2014
mercado la
mercado la
Ofelia)
Ofelia)
*Caractersticas al momento de la siembra

Caractersticas con refrigeracin*:


Consistencia semilquido con presencia
de grumos, olor caracterstico,
totalmente amarillo.
Caractersticas sin refrigeracin*:
Consistencia lquida, sin presencia de
olor, separacin de fases, fase cremosa
de color amarillo intenso.
Refrigerado: olor fuerte, presencia de
suero, slido, blanco
Sin refrigerar: olor intenso y textura
cremosa, color blanco amarillento
Sin refrigerar: color vino, olor rancio y
desagradable
Refrigerada: color rojo brillante, olor
caracterstico

5. Resultados y Discusin

Tabla 5.1. Valores calculados a partir de los datos experimentales


Muestra
Helado sin refrigeracin
Helado con refrigeracin
Leche sin refrigeracin
Leche con refrigeracin
Yogur sin refrigeracin
Yogur con refrigeracin
Carne sin refrigeracin
Carne con refrigeracin
Queso sin refrigeracin
Queso con refrigeracin

Plato 1

(ufc)
Plato 2 (ufc)
(ufc)
( g muestra o mL muestra)
171
193
182
1,00E-05
72
134
103
1,00E-04
225
173
199
1,00E-05
121
115
118
1,00E-04
247
268
257,5
1,00E-06
225
263
244
1,00E-05
190
170
180
1,00E-06
98
105
101,5
1,00E-06
214
200
207
1,00E-07
196
203
199,5
1,00E-06

Tabla 5.2. Resultados totales del contaje de microorganismos en productos alimenticios


RTm (ufc/g muestra o ufc/mL muestra)
Refrigerada
Sin Refrigerar
1,03E+06
1,82E+07
1,18E+06
1,99E+07
2,44E+07
2,58E+08
1,02E+08
1,80E+08
2,00E+08
2,07E+09

Muestra
Helado
Leche
Yogur
Carne
Queso

RTm (ufc/g muestra o ufc/mL muestra)


2,20E+09
1,70E+09
1,20E+09
7,00E+08
2,00E+08
-3,00E+08

Helado

Leche
Refrigerado

Yougurt

Carne

Queso

Sin refrigerar

Figura 5.1. RTm para los diferentes productos alimenticios


Los resultados obtenidos en la experimentacin como se los indica en la Tabla 5.2, se los considera
poco confiables, pues en el contaje de los microorganismos se pudo observar contaminacin en
varios de los platos, adems que el nmero de unidades formadores de colonias superaba el rango
estndar de 30 a 300 colonias por plato, esto conllev a no disponer de los datos necesarios para
realizar el anlisis respectivo, recurriendo a emplear los valores entregados por el ayudante de
laboratorio. Los errores cometidos se los puede atribuir a la poca experiencia de los operadores
en el cultivo de microorganismos adems de no trabajar en un lugar aislado en el que se evite la
contaminacin del medio por varias personas.
Se puede tener una mejor perspectiva de los resultados obtenidos en la Tabla 5.2, al observar la
Figura 5.1, en donde se puede visualizar claramente la diferencia del recuento total de
microorganismos en los diferentes productos alimenticios y a las condiciones de refrigeracin y
sin refrigeracin.
Con claridad se puede observar que la temperatura es uno de los principales factores extrnsecos
que influencia el crecimiento de microorganismos, para todos los casos analizados existe mayor
cantidad de carga microbiana en los alimentos expuestos a temperatura ambiente (21C), esto se
7

puede explicar ya que la mayora de microorganismos patgenos (crifilos, psicrotrofos, mesfilos,


termfilos) se desarrollan adecuada y rpidamente en un rango de temperatura de 4 a 60C,
siendo los microorganismos mesfilos los ms abundantes en las muestras ya que crecen
adecuadamente en un rango de 10 a 45C.
En el caso de los alimentos expuestos a refrigeracin (-4.2 a 4C), se pudo tambin observar el
crecimiento de microorganismos pero en una menor proporcin que los antes mencionados, y
esto debido a la fase de adaptacin de los microorganismos, la cual aumenta disminuyendo su
velocidad de crecimiento y aumentando su tiempo de duplicacin lo cual indica que los
microorganismos no mueren en refrigeracin sino que crecen lentamente.
Otros de los factores intrnsecos que pudieron permitir el crecimiento de microorganismos es la
ausencia de barreras biolgicas en los productos alimenticios analizados, as como la ausencia de
sustancias antimicrobianas que impidan el crecimiento de los mismos, pues en productos como la
carne al ser faenada pierden su piel (barrera biolgica) quedando expuesta al ataque microbiano.
En el caso de la leche se puede observar una baja carga microbiana y esto se lo puede atribuir a
sustancias antimicrobianas que posee la leche como es el sistema lactoperoxidasa que se
encuentra activa por pocos das al ser extrada de las ubres de la vaca (Ponce C., Armenteros A,
Villoch C., Montes de Oca N., Carreras J., 2005). Efectivamente esto concuerda con la informacin
presente en la Tabla 3.2.6, en la que indica el da en la que se consigui esta.
Otro de los factores que favorece el crecimiento de microorganismos es la actividad de agua (aw),
en la mayora de alimentos empleados en la experimentacin esta se encuentra en rangos de 0,95
y 0,99 , en el caso del queso este pudo haber sido uno de los factores que ayudaron al rpido
crecimiento de los microorganismos ya que disponan de gran cantidad de agua a ser captada y
utilizada por los microorganismos como se informa en las caractersticas presentes en la Tabla
3.2.6, sin embargo el queso en refrigeracin presenta incluso suero, lo que implica valores de a w
altos cercanos al 100% y sin importar esto su carga microbiana es menor que el queso a
temperatura ambiente, lo que permite observar que la influencia de la temperatura es ms
determinante que el aw para el crecimiento de microrganismos.

En cuanto a otros factores intrnsecos como lo es el potencial xido-reduccin (Eh), debido a que
se trabaj en presencia de oxgeno se esperara que el Eh para cada muestra sea positivo,
favoreciendo el crecimiento de microorganismos aerobios. En cuanto al pH, los productos
alimenticios presentan valores de pH diferentes cada uno como son: leche 6,4, queso 5,5, yogur 4
y carne 5,5, sin embargo aunque este es un factor importante para el crecimiento de
microorganismos, ya que cada uno crece a un pH especfico, no es uno de los parmetros
determinantes para afirmar que la carga microbiana aumenta o no.
El anlisis de composicin nutricional del producto alimenticio es fundamental ya que este ser el
alimento de los microorganismos, as, este se exponga a condiciones no favorables, puede
extender sus rangos de tolerancia.
Se esperara que el producto con mayor carga microbiana fuese la carne por su composicin
nutricional completa, ya que contiene gran cantidad de protenas, minerales y vitaminas
importantes para el crecimiento de microorganismos, sin embargo el producto que present
8

mayor carga de microorganismos fue el queso a temperatura ambiente y esto se lo puede atribuir
a la historia del alimento, ya que este pudo haber sido producido varios das antes de su uso, y
como se explic en el caso de la leche es posible que el sistema lactoperoxidasa ya no se haya
encontrado activo en el producto favoreciendo an ms el crecimiento de los microorganismos,
adems de la higiene que se haya mantenido en el proceso de elaboracin del mismo.
En cuanto al helado se obtuvo un RTm bajo, parecido al de la leche y se lo puede atribuir a su
composicin nutricional, que no es variada como el de la carne, adems de la temperatura a la que
este se encontraba antes de su uso experimental; ya que a bajas temperaturas el crecimiento de
microorganismos es ms lento y adems que al contar con una alta composicin de azcar
provoca reduccin en el aw haciendo que el agua sea de difcil consumo para los microorganismos.
El yogur present un RTm superior al helado y leche pero inferior al queso y se lo puede atribuir a
su composicin nutricional, y su proceso de elaboracin en el que se introducen microorganismos
para obtener el producto deseado.

6. Conclusiones y Recomendaciones
6.1. Conclusiones
-

Se determin que entre los productos analizados: leche, carne molida, helado, yogur y
queso, este ltimo present mayor recuento total de microorganismos tanto para la
muestra sometida a refrigeracin como para aquella expuesta a temperatura ambiente;
esto debido a su contenido nutricional y su actividad de agua, a ms de las condiciones de
procesamiento desconocidas (por ser un producto artesanal).
Se conoci que dentro de las condiciones de almacenamiento de los alimentos, la
temperatura es un factor determinante ya que se evidenci que el crecimiento de los
microorganismos se dio en mayor magnitud en las muestras expuestas a temperatura
ambiente que en las sometidas a refrigeracin; ya que en refrigeracin la fase de
adaptacin de los microorganismos aumenta y la velocidad de crecimiento disminuye.
La efectiva presencia de microorganismos en las muestras analizadas, mostraron que la
carencia de barreras biolgicas favoreci el crecimiento microbiano.

6.2. Recomendaciones
-

Colocar el matraz que contiene el medio con mucha precaucin en el bao termosttico y
retirar agua del mismo con la finalidad de evitar que el matraz caiga y se contamine el
medio.
Establecer una secuencia en el uso de las pipetas para evitar contaminacin en cada
dilucin.

7. Bibliografa:

Aguhob, S. y Astell, B. (1998). Procesamiento de lcteos: libro de consulta sobre tecnologas


aplicadas al ciclo alimentario. (1ra. ed.). Lima, Per: ITDG.
Caldern, V y Pascual, A. (2000). Microbiologa Alimentaria: metodologa analtica para alimentos y
bebidas. (2da. ed.). Madrid, Espaa: Daz de Santos, S.A.
Cantoni, N. (2009). Alimentos: Gua prctica para una alimentacin sana. (1ra. ed.). Buenos Aires,
Argentina: Editorial Albatros.
Ponce C. P., Armenteros A. M., Villoch C., Montes de Oca N., Carreras J., 2005, Evaluacin de
riesgos microbiolgicos y qumicos de la activacin del sistema lactoperoxidasa en leche cruda,
Recuperado de: http://www.bvs.sld.cu/uats/rtv_files/2005/rtv0505.pdf, (Marzo, 2014).
Ranken,
M.D.
Manual
de
industrias
de
la
carne.
Recuperado
de:
http://books.google.com.ec/books?id=F8H7vWOwkuAC&pg=PA85&dq=presencia+de+microor
ganismos+en+productos+c%C3%A1rnicos&hl=es&sa=X&ei=SlAuU6vIBMGS7Aar8IEI&ved=0CDA
Q6AEwAQ#v=onepage&q=presencia%20de%20microorganismos%20en%20productos%20c%C3
%A1rnicos&f=false (Marzo, 2014).

10

8. Anexos
Tablas de datos para los clculos de leche y yogur sin refrigerar y queso en ambos casos:
refrigerado y sin refrigerar.
Tabla A.1. Unidades formadoras de colonias para la muestra de yogur
Yogur Sin Refrigerar
Plato 1
Plato 2
300
300
Contaminado
300
247
268

Dilucin
10-4
10-5
10-6

Tabla A.2. Unidades formadoras de colonias para la muestra de leche


Leche Sin Refrigerar
Plato 1
Plato 2
300
300
225
173
22
36

Dilucin
10-4
10-5
10-6

Tabla A.3. Unidades formadoras de colonias para la muestra de queso

Dilucin
10-5
10-6
10-7

Queso Sin Refrigerar


Plato 1
Plato 2
300
300
300
Contaminado
214
200

Queso Refrigerado
Plato 1
Plato 2
300
Contaminada
196
203
28
37

Clculo del factor de unidades Formadoras de colonias

Para este clculo se eligi el par de platos que contengan valores de ufc entre el intervalo de
30 y 300 ufc.
Para el caso de la leche refrigerada.
=

121 + 115
= 118
2

Determinacin del factor de dilucin


11

Para el caso de la leche refrigerada, considerando que todas las siembras se realizaron a
profundidad.

1
(1 + 99agua de dilucin ) 1

1 1
(11 + 99agua de dilucin ) 2

= 104

Clculo del recuento total de microorganismos RTm

118

= 4
= 1,99 107

10

12