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tras la activacin
de receptores: va de
las MAP quinasas
FERNANDO PICATOSTE
ENRIQUE CLARO
a estimulacin de la mayor parte de los receptores de membrana conduce, de una manera ms o menos directa, a la activacin de
protena quinasas y la fosforilacin de protenas diana como parte del mecanismo de regulacin de procesos celulares por agonistas. En captulos anteriores se han descrito las rutas que conducen a la activacin de diversas protena
quinasas activadas por segundos mensajeros, como las dependientes de AMP
cclico (PKA), de calcio y calmodulina (CaMK) o de calcio y fosfolpidos
(PKC). Tambin se ha hecho referencia a otro grupo de protena quinasas,
conocidas con el nombre genrico de MAP quinasas (mitogen activated protein
kinases, MAPK), que forman parte de un importante grupo de vas de transmisin de seales extracelulares, cuyas caractersticas y papeles funcionales
son el objeto de este captulo.
Las vas de las MAPK son activadas por estmulos extracelulares que
incluyen hormonas, mitgenos, factores trficos y de crecimiento, citoquinas
inflamatorias y diversas formas de estrs celular (osmtico, redox, radiacin,
etc.), y participan en el control de la expresin gnica por receptores de membrana, regulando procesos tan importantes como proliferacin, diferenciacin
y transformacin celulares, desarrollo, apoptosis e inflamacin crnica. Estas
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Hormonas,
factores de
crecimiento
Levadura
Estrs, citoquinas
inflamatorias
Feromonas de
apareamiento
GPCR
Protena G
Ras
Subunidades Gbg
Ste 20
MAPKKK
Raf, etc.
MAPKK
MEK 1,2
MKK4,7
MKK3,6
Ste 7
MAPK
ERK 1,2
JNK1-3
p38a-d
Fus 3
Respuesta
Figura 1
Proliferacin,
diferenciacin,
desarrollo,
apoptosis
Inflamacin,
apoptosis,
desarrollo,
proliferacin
Ste 11
Detencin del
ciclo celular
en G1
En mamferos se conocen varios mdulos de este tipo, de los que los tres
mejor caracterizados corresponden a las MAPK denominadas ERK (de extracellular signal regulated kinase), JNK (de N-terminal c-Jun kinase) y p38 (fig.
1). Las ERK fueron inicialmente caracterizadas como las quinasas que fosforilan MAP2 y la protena bsica de mielina y fueron las primeras en ser clonadas
a principio de los aos noventa. Las ERK1,2 son fosforiladas por MEK1,2 (de
MAPK/ERK kinases), y stas por MAPKKK de la familia Raf entre otras, las
cuales son activadas por la protena G monomrica Ras en respuesta a hormonas y factores de crecimiento. Como veremos ms adelante, la activacin de
las ERK estimula la puesta en marcha del ciclo celular, por lo que median respuestas proliferativas entre otras.
El segundo subgrupo de MAPK, las JNK, fue descrito como protena
quinasas activadas por cicloheximida que fosforilan serinas en la zona N-terminal de c-Jun en respuesta a la luz UV, mientras que el subgrupo p38 fue
caracterizado inicialmente como una protena quinasa inducida por lipopolisacrido. Puesto que tanto las JNK como las p38 son activadas por citoquinas
inflamatorias y por diversas formas de estrs, tambin se las denomina SAPK
(de stress activated protein kinases). En la activacin de ambos grupos existe
menor especificidad que en la de las ERK a nivel de la activacin de las
correspondientes MAPKK (denominadas MKK4,7 las que activan JNK y
MKK3,6 las que fosforilan p38) por diversas MAPKKK y se ha descrito la
participacin de protenas G monomricas de la familia Rho, desconocindose an los detalles de la activacin de stas por citoquinas y estrs.
PI3K
PLCg
Shc/Grb2
Receptores de citoquinas
JAK
FAK-Src
Integrinas
STAT
MAPK
Shc/Grb2
PLCb
Ga
GPCR
Akt
PKC
Gbg
Ga / a G
PKC
Shc/Grb2
Adenilil ciclasas
AMPc
PKA
Figura 2 Receptores que activan las vas de las MAP quinasas. RTK: receptores con actividad tirosina quinasa. GPCR: receptores acoplados a protenas G
las cuales actan como factores de transcripcin. Existen evidencias que indican que algunas JAK pueden activar las MAPK estimulando la MAPKKK Raf1. Por su parte, las integrinas se unen a ligandos de clulas adyacentes o de la
matriz extracelular, lo que conduce a su agrupacin y a la estimulacin de la
actividad tirosina quinasa de FAK (de focal adhesion kinase) y Src. El aumento de fosfotirosinas en FAK y la fosforilacin por FAK y Src de la protena
adaptadora Shc promueve la unin de Grb2 lo que conecta con la activacin
de Ras/MAPK. Finalmente, los receptores acoplados a protenas G (GPCR)
tambin pueden regular las vas de las MAPK a travs de diversos mecanismos
en los que pueden participar subunidades de las protenas G, segundos mensajeros, protena quinasas e incluso receptores de factores de crecimiento, como
se describir con ms detalle en el ltimo apartado de este captulo.
Veremos a continuacin las distintas etapas de la sealizacin va
MAPK en el caso de su activacin por RTK, cuyo esquema se indica en la figura 3, y revisaremos las caractersticas de los diversos componentes implicados.
Figura 3 Etapas de
la va de la MAPK activada por un receptor
con actividad tirosina
quinasa. EGF: factor de
crecimiento epidrmico
presentes en la protena Sos. En algunos casos, como en la activacin por factor de crecimiento epidrmico (EGF), Shc no participa y Grb2 se une directamente a fosfotirosinas del receptor. La protena Sos tiene un dominio con actividad Ras-GEF (de guanine nucleotide exchange factor) que cataliza el
intercambio de GDP por GTP en la protena G monomrica Ras, por lo que,
tras la estimulacin del receptor, Sos es reclutada por Grb2 a la proximidad
de la membrana plasmtica donde se encuentra Ras y la activa (fig. 4).
La protena Ras, de 21 kDa, se presenta en mamferos en tres isoformas
muy semejantes (H-Ras, K-Ras y N-Ras) que forman parte, junto con las protenas Rap y Ral, de una familia llamada tambin Ras. Esta familia est implicada en procesos proliferativos y de endocitosisexocitosis, y est, a su vez,
englobada en la superfamilia llamada, una vez ms, Ras, a la que tambin
pertenecen las familias Rho, Ran, Rab y Arf. Todas ellas son protenas G
monomricas que modulan efectores, poseen actividad GTPasa y necesitan
protenas con actividad GEF para su activacin y otras con actividad GAP (de
GTPase activating protein) para su inactivacin por hidrlisis del GTP.
Estructuralmente, Ras es semejante al dominio de interaccin con nucletidos
de guanina de las subunidades G de las protenas G heterotrimricas, presentando tambin dos zonas switch llamadas I y II que estn implicadas en su
interaccin con otras protenas, entre ellas Sos. Su unin a la membrana es
consecuencia de la palmitoilacin o prenilacin de una cistena prxima al
extremo C-terminal.
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Ras
P
GTP
Ras
Sos
SH2
SH3
GTP GDP
Grb2
Figura 4
GTP
Raf/MEK/ERK
MAPKKK
El siguiente paso de la va es la activacin por Ras-GTP de Raf-1. Se
trata de una serina/treonina quinasa de 74 kDa que, junto con A-Raf y B-Raf,
forma una de las familias de MAPKKK en mamferos. Raf-1 posee dos dominios, uno cataltico en la zona C-terminal y otro regulador en la N-terminal,
de modo que, al igual que sucede en el caso de la PKC, el dominio regulador
acta inhibiendo al cataltico, por que la quinasa se activa por desinhibicin.
El dominio regulador tiene un lugar de unin de Ras (RBD, de Ras binding
domain), una zona rica en cistenas (CRD, de cysteine rich domain) y otra rica
en serinas y treoninas que pueden fosforilarse.
En su forma inactiva, Raf-1 se halla en el citosol asociada a otras protenas formando un complejo de ms de 300 kDa. stas incluyen algunas
chaperonas como hsp 90 y la protena 14-3-3, que tiene dominios de unin de
fosfoserinas y forma dmeros, de modo que puede conectar entre s protenas
que contienen los citados grupos. En la Raf-1 citoslica la protena 14-3-3 une
dos fosfoserinas, una en cada dominio, contribuyendo a estabilizar la forma
inactiva. Cuando Ras une GTP y se activa, promueve la translocacin de Raf-1
a la membrana de modo que sta, adems de con Ras, interacciona tambin
con fosfolpidos, como el cido fosfatdico, que pueden contribuir al proceso
de activacin. Las secuencias switch I y II de Ras interaccionan con las zonas
RBD y CRD, induciendo un cambio conformacional que libera el dominio
cataltico de Ras de la inhibicin ejercida por el dominio regulador. Las zonas
RBD y CRD de Raf-1 son tambin reconocidas por otra protena de la familia Ras, Rap1, que no induce activacin, por lo que acta como inhibidor competitivo de Ras. El mecanismo de activacin requiere, no obstante, la participacin de ms factores. Al translocarse Raf-1 a la membrana, la protena
14-3-3 libera la fosfoserina que una en el dominio regulador, la cual es desfosforilada por la fosfoprotena fosfatasa PP2A. Adems, se han de fosforilar
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algunas serinas por PKC o por una MAPKKK llamada PAK3, as como algunas tirosinas por Src o JAK, de modo que estas quinasas tambin contribuyen
a la activacin. Se ha indicado que la protena 14-3-3 puede tener un papel importante en la asociacin de Raf-1 con las citadas quinasas, as como con la
protena KSR (de kinase supressor of Ras), que acta como protena de anclaje
en el complejo de Raf-1 activada. Asimismo se ha descrito activacin de Raf1 en ausencia de Ras, mediante la intervencin de protena quinasas como Src
y PKC. Una vez en su forma activa, Raf-1 fosforila especficamente MEK1 y
MEK2, pues stas tienen una secuencia rica en prolinas que no tienen las dems MAPKK.
La protena A-Raf se activa por un mecanismo semejante, pero no as
la B-Raf. Esta quinasa, que es abundante en tejido nervioso, slo requiere RasGTP para su activacin y puede ser tambin estimulada por Rap1, protena G
monomrica de la familia Ras que es activada por AMP cclico va Rap1-GEF.
Es interesante indicar que la fosforilacin de Raf-1 por PKA produce su
inactivacin, por lo que el mismo segundo mensajero, AMP cclico, puede bloquear la activacin de Raf-1 y promover la de B-Raf. Ambas quinasas pueden
ser activadas de forma selectiva por distintos receptores en un mismo tejido.
As, en clulas PC12 se ha descrito activacin transitoria de Ras/Raf-1 por
EGF dando lugar a proliferacin celular y activacin prolongada de Rap/B-Raf
por el factor de crecimiento nervioso produciendo diferenciacin.
Adems de las del grupo Raf, existen otras MAPKKK que actan sobre
todo en los procesos de activacin de JNK y p38, si bien nuestro conocimiento de sus rutas y mecanismos de estimulacin es ms limitado. La tabla 1
muestra un lista de las MAPKKK de mamferos y los sustratos que fosforilan.
Tabla 1
Sustratos (MAPKK)
MEK1,2
MKK4,7
MEK1, MKK4
MEK1, MKK3,4,6
MKK3,4,6
MKK4,7
MKK3,7
Nomenclatura de MAPKKK: ASK1, apoptosis signal-regulating kinase 1; DLK, dual leucine-zipper-bearing kinase; MEKK, MEK kinase; MLK, mixed lineage kinase; TAK1, transforming growth factor b?activated kinase 1;
Tpl2, tumor progression locus 2
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MAPKK
Las MAPKK son protena quinasas de doble especificidad que fosforilan
a la vez un residuo de treonina y otro de tirosina situados en secuencias del
tipo TxY en el lazo de activacin de las MAPK. Se han caracterizado siete
MAPKK que se agrupan por la especificidad de sustrato, determinada por la
identidad del aminocido situado entre la treonina y la tirosina. As, las MEK1
y 2 fosforilan las secuencias TEY presentes en ERK1 y 2, las conocidas como
MKK4 y 7 fosforilan las secuencias TPY de las JNK, las denominadas MKK3
y 6 fosforilan TGY en las p38, y la MKK5 fosforila la secuencia TEY de la
MAPK ERK5.
MAPK
Existen al menos una docena de MAPK que se agrupan segn la secuencia del lazo de activacin. Adems de los ya mencionados grupos formados
por las ERK1,2, las JNK1-3 y las p38-, se han descrito otras tres denominadas ERK5, ERK7 y ERK3. Las dos primeras tienen la secuencia TEY en el
lazo de activacin y activan la proliferacin celular, formando parte de vas de
sealizacin an poco caracterizadas. Por su parte, la protena ERK3 tiene
serina y glicina en lugar de treonina y tirosina en el lazo de activacin y no se
le conocen sustratos.
Las MAPK poseen pesos moleculares entre 38 y 55 kDa y presentan dos
dominios, uno cataltico en C-terminal con alto contenido en hlice y el otro,
en N-terminal, con alto porcentaje de conformacin . Entre ambos se sita
el lazo de activacin que contiene la secuencia fosforilada por MAPKK. Las
380
Figura 5 Regulacin
del ciclo celular por ERK.
PRB: protena de retinoblastoma; HDAC: histona
desacetilasa
381
Protenas de anclaje
Todos los componentes de un mdulo en las vas de las MAPK pueden
interaccionar fsicamente con los que les anteceden o los que les siguen en la
ruta de transmisin de la seal. No obstante, la especificidad de la interaccin
no es estricta, particularmente a nivel de las MAPKKK, lo que permite a distintas vas compartir componentes comunes. Siendo esto conveniente desde el
punto de vista de la flexibilidad para responder a distintos estmulos, plantea
la cuestin de cmo se garantiza la especificidad de cada seal. Por lo que
sabemos hasta ahora, la especificidad se garantiza, en parte, por la asociacin
de los componentes de una va a alguna protena de anclaje, de modo que
382
Fosfatasas
Puesto que la activacin de las vas de las MAPK implica una cascada
de fosforilaciones por protena quinasas, su desactivacin se produce por
desfosforilacin tanto de las serinas/treoninas como de las tirosinas que haban
sido fosforiladas previamente. La desfosforilacin de fosfoserinas y fosfotreoninas corre a cargo de fosfatasas de las familias PP1, PP2A-C, PP4 y PP5,
como ocurre en el caso de MEK y de la fosfotreonina de ERK, que son
desfosforiladas por PP2A. Por su parte, la desfosforilacin de fosfotirosinas es
catalizada por varias fosfatasas como CD45, SHP1, que desfosforila varios
RTK, y SHP2, que hace lo propio con protenas citoslicas. En algunos casos
la accin de las fosfatasas tiene efectos activadores, como en el ya mencionado caso de la desfosforilacin de una fosfoserina por PP2A como parte del
proceso de activacin de Raf-1, o el de la desfosforilacin por SHP2 de una
fosfotirosina de Src, desobstruyendo un dominio SH2 necesario para su actividad.
383
Ga
RTK
GPCR
Gbg
PLC
Pyk2/Src
Grb2/Sos
Pyk2/Src
Ga
AMPc
2+
DAG, Ca
PKC
RasGRF
RasGRP
Ras
PKA
Raf-1
Rap1
MEK
B-Raf
Raf-1GEF
ERK
Figura 6 Rutas de activacin de la va Ras/ERK por GPCR. La figura esquematiza algunas de las
rutas propuestas. Los detalles se indican en el texto
y que es fosforilada por sta ltima, lo que permite la unin de las protenas
adaptadoras Grb2/Sos y la activacin de la va Ras/MAPK.
Un segundo grupo de factores que intervienen son las subunidades de las
protenas G heterotrimricas. Se ha descrito que las subunidades Gi y Go
pueden tener efectos contrarios sobre Rap1, ya que estimulan o secuestran,
respectivamente, factores con actividad Rap1-GAP que estimula la actividad
GTPasa de esta protena G monomrica. Adems, existen datos que indican
que las subunidades G12,13 activan, por mecanismos an no esclarecidos,
factores Rho-GEF que, al activar protenas G de la familia Rho, ponen en
marcha rutas de activacin de JNK y p38. Por su parte, las subunidades G
tambin pueden ejercer un papel importante. Se ha descrito que median la
estimulacin por LPA de la PI3K que estimula PKC, la cual activa MEK de
forma independiente de Ras. Finalmente, las subunidades G pueden activar
tirosina quinasas citoslicas similares a Src y poner en marcha la ruta Ras/
MAPK por la va Pyk2-Src-Grb2/Sos mencionada en el prrafo anterior.
Un tercer mecanismo se basa en la capacidad de los GPCR para formar
complejos de sealizacin como los generados por integrinas. De modo seme385
jante a lo que ocurre tras la unin de stas con sus ligandos, la estimulacin
de algunos GPCR, como los de LPA o los de vasopresina en fibroblastos, induce la autofosforilacin y activacin de la quinasa p125FAK, cuyas fosfotirosinas reclutan Src, Grb2/Sos y complejos Ras-GEF iniciando la activacin
de la va MAPK. Este proceso es independiente de Ca2+ o PKC, pero requiere
adhesin celular e integridad del citoesqueleto. En otros tipos celulares este
proceso es mediado por otra FAK, Pyk2, para cuya activacin, en este caso,
se requiere movilizacin de Ca2+ y activacin de PKC. Por otra parte, un mecanismo diferente se ha descrito para la activacin de ERK asociada a la
desensibilizacin de receptores adrenrgicos, observada en sistemas heterlogos de expresin. En el proceso, la -arrestina acta como protena
adaptadora reclutando Src y dirigiendo a sta y al receptor fosforilado a cavidades revestidas de clatrina, siendo ambas cosas requeridas para la activacin
de ERK.
Finalmente, la activacin de GPCR puede dar lugar a la fosforilacin y
activacin de algunos RTK, como los receptores de EGF (EGFR), PDGF e
IGF-1 en ausencia de sus agonistas, lo que inicia la activacin de la va Ras/
MAPK. Este proceso es conocido como transactivacin y su mecanismo es
todava poco conocido. Por una parte, se ha observado que la transmisin de
la seal desde el RTK fosforilado a Ras requiere la participacin de Src. Adems, se ha descrito activacin de quinasas de la familia Src por GPCR e inhibicin por la quinasa inhibidora de Src, Csk, de la transactivacin del EGFR
por LPA y agonistas adrenrgicos 2, de modo que Src o quinasas semejantes
pueden ser las responsables de la fosforilacin del RTK. Por otra parte, en
algunos tipos celulares, la sobreexpresin de subunidades G basta para incrementar la fosforilacin del EGFR. Finalmente, la transactivacin del EGFR
por angiotensina II en msculo liso ha mostrado ser dependiente de Ca2+,
mientras que el mismo proceso activado por agonistas muscarnicos es bloqueado por inhibidores de PKC. De acuerdo con estos datos, se han propuesto modelos en los que las subunidades G, Src, Ca2+ o PKC desempean, en
diferentes sistemas, un papel importante. No obstante, hace falta reunir ms
informacin en diferentes sistemas celulares para comprender los mecanismos
implicados en la transactivacin de RTK por la estimulacin de GPCR.
Bibliografa
CAMPS M., A. NICHOLS Y S. ARKINSTALE: Dual specificity phosphatases: a gene family for
control of MAP kinase function, FASEB J 2000; 14: 6-16.
C HANG L. Y M. KARIN: Mammalian MAP kinase signalling cascades, Nature 2001;
410: 37-40.
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