Hexenoilo GRF Esp

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato
3.2.S.4.3 Documento 1 Validacin del Anlisis de Aminocidos

FORMATO DE APROBACIN DE LA VALIDACIN
Documento de Validacin Nmero: P04-051
X Protocolo de Validacin
Autor(es):
Fecha:
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Nmero de Revisin de la Validacin: 1.0
___ Reporte Parcial de Validacin
___Reporte Final de Validacin
Aramis Shannari
10/21/2004
Sujeto de Validacin:
Producto(s): Hexenoilo GRF (1-44) Acetato

___ Equipo IQ/OQ
___ Proceso
___ Limpieza
___ Herramienta
___ Instalaciones
___ Software
___ Mtodo de Prueba
Estado de la Validacin _X_ Proceso
___ Revalidacin
Ttulo del Documento:

Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y Determinacin del Contenido de Pptidos en
Hexenoilo GRF (1-44) Acetato.
Aprobaciones
Nombre Impreso
Firma
Fecha
Autor:
Produccin:
Operaciones/Instalacin:
Control de Calidad:
Aseguramiento de
Calidad:
Otro:
Fecha de Aprob. Final:
Mdulo 3, Parte Abierta
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BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Protocolo de Validacin
P04-051
Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y Determinacin
del Contenido de Pptidos en Hexenoilo GRF (1-44), Acetato
Bachem California, Inc.

Torrance, CA
Nmero de
Revisin
Fecha
Efectiva
Cambios en la Revisin
1.0
Ver Formato
de
Aprobacin
Ninguno (primera revisin)
-ii-
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Tabla de Contenidos
BACHEM, Inc.
1.0
Propsito
2.0
Alcance
3.0
Responsabilidades
4.0
Equipo de Prueba y Materiales
5.0
Procedimiento
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
2
3
4
5
6
7
8
Idoneidad del Sistema

Especificidad
Precisin (Repetitividad)
Precisin Intermedia (Robustez)
Linealidad
Exactitud
Rango
Versin 1.0
6.0
Criterios de Aceptacin
7.0
Referencias
10
8.0
Desviaciones
10
APNDICE A: Preparacin de la Solucin de Muestra
11
APNDICE B: Secuencia de Inyeccin
12
APNDICE C: Frmulas
14
-iii-
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BACHEM, Inc.
Versin 1.0
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Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y
Determinacin del Contenido de Pptidos en Hexenoilo GRF (1-44), Acetato
1.0
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
Propsito
1.1 El propsito de este protocolo es demostrar la especificidad, precisin (repetitividad), la

precisin intermedia (robustez), linealidad, exactitud y rango del mtodo de prueba utilizado para
determinar la recuperacin de aminocidos de [N-trans-3- Hexenoilo] GRF (1-44), Acetato
(tambin conocido como Hexenoilo GRF). El mtodo determinar el contenido de pptidos en
Hexenoilo GRF. El peso molecular de Hexenoilo GRF es de 5135.9 g/mol y la secuencia se
muestra a continuacin:
1.2 Especificaciones:
Las especificaciones para las recuperaciones de aminocidos son las siguientes:
(FHEXGRF/v06)
2.0
Alcance
2.1 Este protocolo aplica para las instalaciones de Bachem Califonia en Torrance.
2.2 Este proceso aplica a la
TM630.HEXGRF, revisin 1.0
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validacin del mtodo de prueba

Validacin del Mtodo de Prueba
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Anlisis de Aminocidos y Determinacin del Contenido de Pptidos en Hexenoilo GRF (144), usado para determinar las recuperaciones de aminocido y contenido de pptidos en
Hexenoilo GRF.
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3.0
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
Responsabilidades
3.1 El personal de Control de Calidad (CQ) es responsable de seguir el protocolo y llevar a cabo
las pruebas, documentacin, reporte y revisin de resultados. Es responsabilidad del personal de
CQ escribir un reporte final.
3.2 El rea de Aseguramiento de Calidad es responsable de revisar el protocolo, los datos y el
reporte final, y de verificar la consistencia segn las especificaciones y criterios de aceptacin.
4.0
4.1 Refirase al mtodo de prueba TM630.HEXGRF, revisin 1.0 para ver el equipo, materiales y
preparacin apropiados para los qumicos y reagentes usados para las pruebas.
4.2 Hexenoilo GRF, lote actual, aproximadamente 110 mg.
4.3 Factor Liberador de Crecimiento [GRF] (1-29), lote actual, aproximadamente ~1.5 mg.
5.0
Procedimiento
Nota: Refirase al mtodo de prueba TM630.HEXGRF para las condiciones de prueba y

procedimientos especficos. Las frmulas utilizadas para calcular la media, desviacin estndar,
RSD, la lnea de regresin y el coeficiente de determinacin estn disponibles en el Apndice C.
5.1 Idoneidad del Sistema
5.1.1 Descripcin:
La prueba para la idoneidad del sistema descrita en la Tabla 1 debe realizarse para cada
secuencia de inyeccin ejecutada en el analizador de aminocidos. Una secuencia de inyeccin
incluir un conjunto de muestras para anlisis categorizadas de acuerdo con un estndar de
calibracin, estandarizadas como desconocidas y precedidas por dos inyecciones en blanco.
5.1.2 Evaluacin de datos y Estadsticas:
Se debe demostrar la correcta identificacin de picos de aminocidos en los estndares y
muestras. Los requerimientos para la idoneidad del sistema deben cumplirse tal y como se
describen en la Tabla 1. Estos requerimientos aplican a todas la secciones pertinentes en este
protocolo.
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Revisin 1.0
5.1.3 Criterio de Aceptacin:

Refirase a la Tabla 1 para consultar los criterios de idoneidad del sistema.
Tabla 1.
Parmetro
Thr y Ser 0.9
Tyr y Phe 0.9
Resolucin de CAL o Estndar ICL

Estndar final (Des) para Recuperaciones de
Aminocidos [mol/mL]
Presencia de picos que interfieren en el blanco de
Na220 (2 inyeccin)
Resolucin entre todos los aminocidos despus de Phe
0.2375 0.2625*
5% (comparacin con el pico de rea
correspondiente en el estndar de calibracin)
Picos del valor basal resueltos
*(Aplica a aquellos aminocidos encontrados en la muestra).
5.2 Especificidad
5.2.1 Descripcin:
Analizar una muestra (de 0.7 a 1.3 mg) de GRF (1-29) y determinar las recuperaciones de
aminocidos usando el mtodo normal de hidrlisis.
Determinar la suma de las concentraciones (mol/mL) de aminocidos estables (excluyendo Thr y
Ser) en GRF (1-29).
Usar la frmulas siguiente para calculara e factor, el cual es requerido para calcular las
recuperaciones de aminocidos.
Factor = Concentraciones (mol/mL) Residuos (Tericos)
Donde Residuos (Tericos) = 25
Comparar las recuperaciones de aminocidos obtenidas con las recuperaciones de aminocidos de
una muestra de Hexenoilo GRF (primera muestra usada para la determinacin de la precisin en
proceso, seccin 5.3. Refirase a la Tabla 2 para consultar los aminocidos investigados.
5.2.3 Criterios de Aceptacin:
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Debe ser evidente la existencia de una diferencia en las recuperaciones de aminocidos de
acuerdo con las especificaciones de Hexenolio GRF y el anlogo GRF (1-29).
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Revisin 1.0
Tabla 2. Especificidad, Recuperacin de Aminocidos (Hidrlisis normal)

Aminocidos
Hexenoilo GRF
GRF (1-29)
5.3 Precisin (Repetitividad)

5.3.1 Descripcin:
Los estudios de precisin sern desarrollados usando seis muestras separadas de Hexenoilo GRF. Sern hidrolizadas
y analizadas para comprobar la precisin utilizando el mtodo de hidrlisis normal. Usando una microbscula de
Cahn, pesar seis muestras separadas de 3.7 a 4.3 mg en tubos de ensayo e hidrolizar empleando el estndar interno,
de acuerdo con el mtodo TM630.HEGRF. Aadir 2.0 mL de sol. amortiguadora de Na220 para hacer una solucin
de 0.5 mg/mL, aproximadamente. Realizar una sola inyeccin para cada alcuota. Refirase a la Tabla 7 Apndice B
para la secuencia de inyeccin durante el estudio de precisin.
5.3.2 Evaluacin de Datos y Estadsticas:
Calcular las recuperaciones de aminocidos para cada preparacin de muestra.
Determinar la repetitividad de cada aminocido para las seis muestras separadas, calculando la media, desviacin
estndar y la desviacin estndar relativa (RSD).
Determinar la media de contenido de pptidos, desviacin estndar y la desviacin estndar relativa (RSD) para las
seis muestras tras sus hidrlisis normal.
Las recuperaciones de aminocidos para la muestras analizadas deben cumplir con el requerimiento de RSD (n = 6)
5.0%. El contenido de pptidos debe cumplir con el requerimiento de RSD (n = 6) 5.0%.
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
5.4 Precisin Intermedia (Robustez)

5.4.1 Descripcin:
La precisin intermedia del mtodo ser investigada usando el formato de precisin descrito en la
Tabla 7 del Apndice A. EL estudio de robustez demostrar estadsticamente que ciertas
variables, en este caso, da y analista no afectan significativamente la reproducibilidad de los
resultados de la prueba. Se har prueba al Hexenoilo GRF, observando estas variables como una
sola entidad. La prueba de robustez se llevar a cabo siguiendo el procedimiento en la Seccin
5.3, pero con otro analista, en un da distinto y con una muestra diferente y un estndar AAA,
preparado con el mismo proceso. Se utilizarn la misma columna y el mismo instrumento durante
todo el estudio. Refirase a la Tabla 8 del Apndice B para el estudio de la precisin en la
secuencia de inyeccin.
5.4.2 Evaluacin de los Datos y Estadsticas:
Calcular las recuperaciones de aminocidos para cada aminocido presente.
Calcular la recuperacin de aminocido, desviacin estndar y RSD para las seis muestras de
hidrlisis normal.
Combinar los resultados de las pruebas de aminocidos del estudio de precisin con los
resultados de robustez para determinar la RSD (n = 12) para doce muestras de hidrlisis normal.
Determinar la media de contenido de pptidos, la desviacin estndar y la RSD para las seis
muestras de hidrlisis normal. Combinar los resultados de contenido de pptidos del estudio de
precisin con los resultados de robustez para determinar la RSD (n = 12) para doce muestras de
hidrlisis normal.
Las recuperaciones de aminocidos para los resultados de robustez deben cumplir los
requerimientos de RSD (n = 6) 5.0% y RSD (n = 12) 10.0%.
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Versin 1.0
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Revisin 1.0
5.5 Linealidad
5.5.1 Descripcin:
El estudio de linealidad se llevar a cabo mediante la hidrolizacin de dos muestras de Hexenoilo
GRF y diluyendo las muestras de solucin diluida en cinco concentraciones distintas: 0.2, 0.4,
0.5, 0.6 y 0.8 mg/mL, Se realizarn inyecciones por duplicado y se determinar la media de
recuperacin de aminocidos para cada nivel de concentracin en la solucin de muestra. El
procedimiento se llevar a cabo mediante hidrlisis normal usando el estndar interno.
Pesar una muestra en el rango de 4.950 mg a 5.050 mg en un tubo de 10mL. Aadir 1.2 mL de
6N HCl para disolverla, luego agregar 0.8 mL de solucin Estndar Interna. Aadir 20 L de
fenol licuado. Mezclar completamente. Hidrolizar la muestra y secar en horno en un tubo de 10
mL. Luego de secar la muestra, agregar 1 mL de Na220 y mezclar bien. Transferir la solucin de
muestra a un frasco volumtrico de 5 mL. Enjuagar el tubo con dos alcuotas de 1 mL de Na220 y
transferir con cuidado al frasco volumtrico de 5mL. QS hasta la marca con Na220. La
concentracin de esta solucin de reserva ser de 1.0 mg/mL, la cual ser usada para preparar
cinco diluciones.
Preparar las diluciones de muestra (0.2 0.8 mg/mL) a partir de la solucin muestra de 1 mg/mL
usando recipientes Kimble cuando sea necesario. Refirase a la Tabla 4 del Apndice A para la
tabla de dilucin y la Tabla 7 del Apndice B para la secuencia de inyeccin del estudio de
linealidad.
Calcular la media (n = 2) de las recuperaciones de aminocidos (mol/mL) para cada nivel de
concentracin en la preparacin con hidrlisis normal de muestras para linealidad. Calcular la
diferencia porcentual de la media del valor de recuperacin de aminocidos para cada conjunto
de anlisis duplicados.
Graficar una regresin lineal de la solucin muestra Concentracin de Muestra (eje X, mg/mL)
contra Media de Recuperacin de Aminocido (eje Y, mol/mL). Analizar estadsticamente los
datos utilizando la frmula Y = (m)X + b, donde b es el punto de interseccin con Y en tanto que
m es la pendiente de la regresin lineal.
Determinar el coeficiente de correlacin (r), el cual se define como la medida de la fuerza de la
relacin lineal entre dos conjuntos de variables Concentracin de Muestra y Recuperacin de
Aminocido. A partir del anlisis de la regresin lineal determinar la pendiente y la interseccin
y.
El coeficiente de correlacin debe ser r 0.997 para cada aminocido.
La diferencia porcentual de la media para cada recuperacin de aminocido debe ser 5.0%.
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5.6 Exactitud
5.6.1 Descripcin:
Se realizar un estudio de picos y recuperacin de aminocidos en Hexonoilo GRF mediante el
enriquecimiento de una muestra de pptidos en varias concentraciones (0.125, 0.25 y 0.5
mol/mL), el estndar AAA de anlisis de aminocidos.
Pesar cuatro muestras en el rango de 3.950 mg a 4.050 mg. Hidrolizar y secar todas las muestras
de acuerdo con el mtodo de prueba TM603.HEXGRF (hidrlisis normal). Preparar una solucin
de muestra sin enriquecer (tres alcuotas) a 0.5 mg/mL usando solucin amortiguadora Na220.
Preparar tres soluciones enriquecidas (tres alcuotas de cada una) de acuerdo con la Tabla 6 y la
Tabla 7 del Apndice A, diluyendo las muestras hasta las concentraciones requeridas con el
estndar AAA (refirase a la Tabla 5 para ver la preparacin de solucin enriquecida estndar
AAA). Realizar la secuencia de inyeccin de exactitud de acuerdo con lo mencionado en la Tabla
7 del Apndice B.
Calcular la media de las reas pico para los aminocidos presentes en las inyecciones triples de
Hexenoilo GRF sin enriquecer. Determinar la media para las reas de pico de los aminocidos en
las inyecciones triplicadas del estndar de exactitud AAA, calculando slo los aminocidos que
estn presentes en la muestra sin enriquecer de Hexenoilo GRF.
Determinar la media de las reas de pico para los aminocidos en las inyecciones triplicadas de
las muestras enriquecidas de Hexenoilo GRF en las tres concentraciones distintas. Slo calcular
las medias de los aminocidos que estn presentes en el Hexenoilo GRF sin enriquecer.
rea de la muestra enriquecida
____________________________________________
rea del estndar + rea de la Muestra sin Enriquecer
Concentracin de la Muestra sin Enriquecer

X ___________________________________ X 100
Concentracin de la muestra enriquecida
Calcular la recuperacin de pico (por aminocido) usando la siguiente ecuacin:

% de Recuperacin =
Los aminocidos deben demostrar recuperaciones entre 80 120% para la concentraciones de
muestra (0.125 mg/mL, 0.250 mg/mL y 0.5 mg/mL).
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5.7 Rango
5.7.1 Descripcin:
El rango del mtodo analtico es el intervalo entre la concentracin superior y la inferior de la
sustancia analizada en la muestra, para la cual se ha demostrado que el procedimiento analtico
tiene un nivel de precisin, exactitud y linealidad adecuados, como se les define en los criterios
de aceptacin de este protocolo.

Refirase a las secciones de precisin, linealidad y exactitud para evaluacin de datos y las
estadsticas apropiadas.

El rango correspondiente a la precisin, linealidad y exactitud deben cumplir con un mnimo de
80% 120% para la concentraciones de prueba.
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6.0 Criterios de Aceptacin

Refirase a la Tabla 3 para un resumen de los criterios de aceptacin.
Tabla 3. Resumen de Criterios de Aceptacin
Parmetro de
Validacin
Determinacin Analtica

Especificidad
Criterio de Aceptacin
Referirse a Tabla 1
Deber ser evidente una diferencia en las
recuperaciones de aminocidos de acuerdo con las
especificaciones de Hexenoilo GRF y GRF (1-29)
Por confirmar
Recuperacin de aminocido: RSD (n = 6) de la media
5.0%
Contenido de Pptidos: RSD (n = 6)
5.0%
Recuperacin de aminocidos: RSD (n = 6) de la media
5.0%
Recuperacin de aminocidos: RSD (n = 12) de la media
10.0%
Contenido de Pptidos: RSD (n = 6) de la media
5.0%
Contenido de Pptidos: RSD (n = 12) de la media
10.0%
Precisin Intermedia
Exactitud
Linealidad
Rango
Recuperacin de aminocidos enriquecidos
80% - 120%
Coeficiente de relacin (r) para cada aminocido
0.997
Diferencia porcentual de la media para cada

recuperacin de aminocido
5.0%
80% a 120% de la concentracin de prueba
Reportar
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Revisin 1.0
7.0 Referencias
7.1 TM630.HEXGRF, Rev 1.0 Anlisis de Aminocidos y Determinacin de Contenido de
Pptidos en Hexenoilo GRF.
7.2 SOP QC-630, Rev. 1.0 Anlisis de Aminocidos (Dionex).
7.3 SOP RQA-400, Rev 4.0 Procedimiento de Validacin.
7.4 SOP RQA-350, Rev. 7.0 Reporte de Desviacin.
8.0 Desviaciones
8.1 Documentar las desviaciones de acuerdo con el SOP RQA-350 Reporte de Desviacin.
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Apndice A: Preparacin de la Solucin de Muestra

Tabla 4. Preparacin de la Dilucin para Linealidad
Solucin
(%)
Concentracin
(mg/mL)
Solucin de Inventario
Aadida (mL)
Na220 Aadida
(mL)
160
0.8
0.8
0.2
120
0.6
0.6
0.4
100
0.5
0.5
0.5
80
0.4
0.4
0.6
40
0.2
0.2
0.8
Tabla 5. Preparacin de la Solucin AAA Enriquecida Estndar

Solucin AAA Enriquecida Estndar
Preparacin
Estndar A
0.5 mol/mL
Transferir 5 mL de estndar Beckman AAA (2.5 mol/mL) a

un vaso volumtrico de 25 mL. QS hasta la marca con Na220.
Estndar B
0.25 mol/mL
Transferir 12.5 mL de estndar A a un vaso volumtrico de 25

mL. QS hasta la marca con Na220.
Estndar C
0.125 mol/mL
Transferir 12.5 mL de estndar B a un vaso volumtrico de 25

Tabla 6. Preparacin de Muestra para Exactitud (Hidrlisis Normal)

Solucin AAA Enriquecida
Estndar (mol/mL)
Muestra de Hexenoilo
GRF (mg)
Solucin Diluyente
Sin enriquecer
3.950 4.050
Aadir suficiente sol. amortiguadora de Na220

para hacer 0.5 mg/mL.
0.125
3.950 4.050
Aadir suficiente estndar AAA a 0.125

mol/mL para hacer 0.5 mg/mL.
0.25
3.950 4.050

0.5
3.950 4.050

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Apndice B: Secuencia de Inyeccin

Tabla 7. Secuencia de Inyeccin
Propsito
Precisin
(Hidrlisis Normal)
Linealidad
(Hidrlisis Normal)
Exactitud
(Hidrlisis Normal)
Tipo de Muestra
Muestra
No. de Inyecciones
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA
Desconocido
Muestra de Precisin 1
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Estndar AAA
Desconocido
Blanco Na220
ICL
Estndar AAA
Desconocido
Linealidad 0.2 mg/mL
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Estndar AAA
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA(0.25 mol/mL)
Desconocido
Sin enriquecer (0.5 mg/mL) Hexenoilo GRF
Desconocido
Enriquecida Nivel 1: Estndar AAA

(0.125 mol/mL)
Desconocido
Estndar 1: Estndar AAA

(0.125 mol/mL)
Desconocido

(0.25 mol/mL)
Desconocido

(0.25 mol/mL)
Desconocido

(0.5 mol/mL)
Desconocido

(0.5 mol/mL)
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Desconocido
Estndar AAA
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1
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Apndice B: Secuencia de Inyeccin (cont.)

Tabla 8. Secuencia de Inyeccin (Precisin Intermedia)
Propsito
Precisin Intermedia
(Robustez)
(Hidrlisis Normal)
Tipo de Muestra
Muestra
No. de Inyecciones
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA
Desconocido
Muestra de Robustez 1
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Estndar AAA
Desconocido
*Una inyeccin por alcuota.
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Apndice C: Frmulas
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Addendum al Protocolo de Validacin P04-051

Documento de Validacin Nmero: P04-051 Addendum
X Protocolo de Validacin
Autor(es):
Fecha:
___Reporte Final de Validacin
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03/09/2005
Producto(s): Hexenoilo GRF (1-44) Acetato

___ Equipo IQ/OQ
___ Proceso
___ Limpieza
___ Herramienta
___ Instalaciones
___ Software
_X_ Mtodo de Prueba
Estado de la Validacin _X_ Validacin Inicial
__X 3/8/05_ Revalidacin

Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y Determinacin del Contenido de Pptidos del
Hexenoilo GRF (1-44) Acetato.
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P04-051

Torrance, CA
Nmero de
Revisin
Fecha
Efectiva
1.0
Ver Formato
de
Aprobacin
-ii-
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BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Tabla de Contenidos
1.0
Propsito
2.0
Alcance
3.0
Responsabilidades
4.0
5.0
Procedimiento
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
2
3
3
4
5
5

Linealidad
Exactitud
Rango
6.0
7.0
Referencias
8.0
Desviaciones
APNDICE A: Preparacin de la Solucin de Muestra
APNDICE B: Secuencia de Inyeccin
APNDICE C: Frmulas
10
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1.0
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
Propsito
1.1 El propsito de este protocolo es demostrar la precisin (repetitividad), la precisin

intermedia (robustez), linealidad, exactitud y rango del Mtodo de Prueba TM630-HEXGRF,
revisin 2.0. El mtodo de prueba ser utilizado para determinar la recuperacin del aminocido
metionina en [N-trans-3- Hexenoilo] GRF (1-44), Acetato (tambin conocido como Hexenoilo
GRF). Bajo condiciones de hidrlisis normal la metionina no se oxida completamente en
metionina sulfona. Para mejorar el anlisis de aminocidos del residuo de metionina, se revis el
Mtodo de Prueba TM630.GRF, revisin 1.0, para incluir un mtodo nuevo que completara la
oxidacin de metionina en metionina sulfona. La oxidacin de metionina se llevar a cabo
utilizando cido perfrmico antes de la hidrolizacin. Se han realizado estudios de validacin
anteriores (refirase al Protocolo P04-051, revisin 1.0) para los siguientes aminocidos presentes
en Hexenoilo GRF: Asx, Glx, Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Lys y Arg. El peso molecular de
Hexenoilo GRF es de 5135.9 g/mol y la secuencia se muestra a continuacin:
1.2 Especificaciones:
Las especificaciones para las recuperaciones de aminocidos son las siguientes:
(FHEXGRF/v06)
Met
2.0
0.85 1.15
Alcance
2.1 Este protocolo aplica para las instalaciones de Bachem Califonia en Torrance.
2.2 Este proceso aplica a la validacin del Mtodo de Prueba TM630.HEXGRF, revisin 2.0
Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y Determinacin del Contenido de
Pptidos en Hexenoilo GRF, usado para determinar las recuperaciones de metionina en el
pptido Hexenoilo GRF.
3.0
Responsabilidades
3.1 El personal de Control de Calidad (CQ) es responsable de seguir el protocolo y llevar a cabo
las pruebas, documentacin,
reporte y revisin de resultados.
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Es responsabilidad del personal
de CQ escribir un reporte final.
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3.2 El rea de Aseguramiento de Calidad es responsable de revisar el protocolo, los datos y el

reporte final, y de verificar la consistencia segn las especificaciones y criterios de aceptacin.
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Versin 1.0

4.0
Docto. Nm.: P04-051

Revisin 1.0
4.1 Refirase al mtodo de prueba TM630.HEXGRF, revisin 1.0 para ver el equipo, materiales y
preparacin apropiados para los qumicos y reagentes usados para las pruebas.
4.2 Hexenoilo GRF, lote actual, aproximadamente 30 mg.
5.0
Procedimiento
Nota: Refirase al mtodo de prueba TM630.HEXGRF para las condiciones de prueba y

procedimientos especficos. Las frmulas utilizadas para calcular la media, desviacin estndar,
RSD, la lnea de regresin y el coeficiente de determinacin estn disponibles en el Apndice C.
5.1.1 Descripcin:
La prueba para la idoneidad del sistema descrita en la Tabla 1 debe realizarse para cada
secuencia de inyeccin ejecutada en el analizador de aminocidos. Una secuencia de inyeccin
incluir un conjunto de muestras para anlisis categorizadas de acuerdo con un estndar de
calibracin, estandarizadas como desconocidas y precedidas por dos inyecciones en blanco.
Se debe demostrar la correcta identificacin de picos de aminocidos en los estndares y
muestras. Los requerimientos para la idoneidad del sistema deben cumplirse tal y como se
describen en la Tabla 1. Estos requerimientos aplican a todas la secciones pertinentes en este
protocolo.
5.1.3 Criterio de Aceptacin:
Refirase a la Tabla 1 para consultar los criterios de idoneidad del sistema.
Tabla 1. Criterios de Aceptacin SST

Parmetro
Resolucin de CAL o Estndar ICL
Estndar final (Des) para Recuperaciones de
Aminocidos [mol/mL]
Presencia de picos que interfieren en el blanco de
Na220 (2 inyeccin)
Thr y Ser 0.9
Tyr y Phe 0.9
0.2375 0.2625*
5% (comparacin con el pico de rea
correspondiente en el estndar de calibracin)
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Resolucin entre todos los aminocidos despus de Phe
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Picos del valor basal resueltos
*(Aplica a aquellos aminocidos encontrados en la muestra).
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5.2.1 Descripcin:
Los estudios de precisin sern desarrollados usando seis muestras separadas de Hexenoilo GRF. Sern
hidrolizadas y analizadas para comprobar la precisin utilizando el mtodo de hidrlisis para oxidacin de
metionina. Pesar seis muestras separadas de 0.700 a 1.3000 mg en tubos de ensayo y realizar la oxidacin
de metionina. Luego de aproximadamente 30 minutos de oxidacin a temperatura ambiente, secar la
muestra en un horno de vaco a 50C y 25 - 30 pulgadas de HG. Hidrolizar la muestras de acuerdo con el
Mtodo de Prueba TM630.HEXGRF, revisin 2.0. Aadir 2.0 mL de sol. amortiguadora de Na220 para
hacer una solucin de 0.5 mg/mL, aproximadamente. Realizar una sola inyeccin para cada solucin de
muestra. Refirase a la Tabla 7 Apndice B para la secuencia de inyeccin durante el estudio de
precisin.
5.2.2 Evaluacin de Datos y Estadsticas:

Calcular las recuperaciones del aminocido metionina para cada preparacin de muestra.
Determinar la repetitividad de la metionina para las seis muestras separadas, calculando la media,
desviacin estndar y la desviacin estndar relativa (RSD).

Las recuperaciones del aminocido metionina para la muestras analizadas deben cumplir con el
requerimiento de RSD (n = 6) 5.0%.

5.3.1 Descripcin:
La precisin intermedia del mtodo ser investigada usando el formato de precisin descrito en la Tabla 7
del Apndice A. EL estudio de robustez demostrar estadsticamente que ciertas variables, en este caso,
da y analista no afectan significativamente la reproducibilidad de los resultados de la prueba. Se har
prueba al Hexenoilo GRF, observando estas variables como una sola entidad. La prueba de robustez se
llevar a cabo siguiendo el procedimiento en la Seccin 5.3, pero con otro analista, en un da distinto y
con una muestra diferente y un estndar AAA, preparado con el mismo proceso. Se utilizarn la misma
columna y el mismo instrumento durante todo el estudio. Refirase a la Tabla 8 del Apndice B para el
estudio de la precisin en la secuencia de inyeccin.

Calcular las recuperaciones del aminocido metionina para cada muestra.
Calcular la media de recuperacin de metionina, desviacin estndar y RSD para las seis muestras de
oxidacin de metionina hidrolizada.
Combinar los resultados de las pruebas de metionina del estudio de precisin con los resultados de
robustez para determinar la RSD (n = 12) para doce muestras de oxidacin de metionina hidrolizada.
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Las recuperacin del aminocido metionina para los resultados de robustez deben cumplir los
requerimientos de RSD (n = 6) 5.0% y RSD (n = 12) 10.0%.
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5.4 Linealidad
5.4.1 Descripcin:
El estudio de linealidad se llevar a cabo mediante la oxidacin de metionina y despus la
hidrolizacin de una muestra de Hexenoilo GRF. La muestra de solucin preparada ser diluida
en cinco concentraciones distintas: 0.2, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.8 mg/mL, Se realizarn inyecciones por
duplicado y se determinar la media de recuperacin de aminocido para cada nivel de
concentracin en la solucin de muestra.
Pesar una muestra en el rango de 4.950 mg a 5.050 mg con una aproximacin de 0.001 mg en un
tubo de 10mL. Disolver en 1 mL de cido frmico (88%) y despus agregar 1 mL de solucin de
cido perfrmico. Despus de aproximadamente 30 minutos de oxidacin a temperatura
ambiente, secar la muestra en un horno de vaco. Agregar 1 mL de 6N cido clorhdrico y 20 L
de fenol licuado al tubo. Mezclar bien. Hidrolizar y secar en horno la muestra en un recipiente de
10 mL. Luego de secar la muestra, aadir aproximadamente 5 mL de Na220 y mezclar bien.. La
concentracin de esta solucin de reserva ser de 1.0 mg/mL, la cual ser usada para preparar
cinco diluciones.
Preparar las diluciones de muestra (0.2 0.8 mg/mL) a partir de la solucin muestra de 1 mg/mL
usando recipientes Kimble cuando sea necesario. Refirase a la Tabla 4 del Apndice A para la
tabla de dilucin y la Tabla 7 del Apndice B para la secuencia de inyeccin del estudio de
linealidad.
Calcular la media (n = 2) de la recuperacin de metionina (mol/mL) para cada nivel de
concentracin.
Calcular la diferencia porcentual de la media del valor de recuperacin de metionina para cada
conjunto de anlisis duplicados.
Graficar una regresin lineal de la solucin muestra Concentracin de Muestra (eje X, mg/mL)
contra Media de Recuperacin de Aminocido (eje Y, mol/mL). Analizar estadsticamente los
datos utilizando la frmula Y = (m)X + b, donde b es el punto de interseccin con Y en tanto que
m es la pendiente de la regresin lineal.
Determinar el coeficiente de correlacin (r), el cual se define como la medida de la fuerza de la
relacin lineal entre dos conjuntos de variables Concentracin de Muestra y Recuperacin de
Aminocido. A partir del anlisis de la regresin lineal determinar la pendiente y la interseccin
y.
El coeficiente de correlacin debe ser r 0.997 para el aminocido metionina.
La diferencia porcentual de la media para cada recuperacin de metionina debe ser 5.0%.
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5.5 Exactitud
5.5.1 Descripcin:
Se realizar un estudio de enriquecimiento y recuperacin de aminocidos en Hexonoilo GRF mediante el
enriquecimiento de una muestra de pptido en varias concentraciones (0.125, 0.25 y 0.5 mol/mL), el estndar AAA
de anlisis de aminocidos.
Pesar cuatro muestras en el rango de 0.700 mg a 1.300 mg. Realizar la oxidacin de metionina, hidrolizar y secar
todas las muestras de acuerdo con el mtodo de prueba TM603.HEXGRF (oxidacin e hidrlisis de metionina).
Preparar una solucin de muestra sin enriquecer a 0.5 mg/mL usando solucin amortiguadora Na220. Preparar tres
soluciones enriquecidas de acuerdo con la Tabla 5 y la Tabla 6 del Apndice A, diluyendo las muestras hasta las
concentraciones requeridas segn el estndar AAA (refirase a la Tabla 5 para ver la preparacin de solucin
enriquecida estndar AAA). Realizar la secuencia de inyeccin de exactitud de acuerdo con lo mencionado en la
Tabla 7 del Apndice B.

Calcular la media de las reas pico para el aminocido metionina presente en las inyecciones triples de Hexenoilo
GRF sin enriquecer. Determinar la media para las reas de pico del aminocido metionina en las inyecciones
triplicadas del estndar de exactitud AAA.
Determinar la media de las reas de pico para el aminocido metionina en las inyecciones triplicadas de las muestras
enriquecidas de Hexenoilo GRF en las tres concentraciones distintas.
rea de la muestra enriquecida

____________________________________________
rea del estndar + rea de la Muestra sin Enriquecer
Concentracin de la Muestra sin Enriquecer

X ___________________________________ X 100
Concentracin de la muestra enriquecida
Calcular la recuperacin de pico (por

aminocido) usando la siguiente ecuacin:
% de Recuperacin =

Las recuperaciones del aminocido metionina deben estar entre 80 120%.
5.6 Rango
5.7.1 Descripcin:
El rango del mtodo analtico es el intervalo entre la concentracin superior y la inferior de la sustancia analizada en
la muestra, para la cual se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel de precisin, exactitud y
linealidad adecuados, como se les define en los criterios de aceptacin de este protocolo.

Refirase a las secciones de precisin, linealidad y exactitud para evaluacin de datos y las estadsticas apropiadas.

El rango correspondiente a la precisin, linealidad y exactitud deben cumplir con un mnimo de 80% 120% para la
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concentraciones de prueba.
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6.0 Criterios de Aceptacin

Refirase a la Tabla 3 para un resumen de los criterios de aceptacin.
Tabla 3. Resumen de Criterios de Aceptacin
Parmetro de
Validacin
Referirse a Tabla 1
Precisin (Repetitividad) Recuperacin de metionina: RSD (n = 6) de la media

Precisin Intermedia
Exactitud
Linealidad
Rango
5.0%
Recuperacin de metionina: RSD (n = 6) de la media
5.0%
Recuperacin de metionina: RSD (n = 12) de la media
10.0%
Recuperacin de metionina enriquecida

(Para niveles enriquecidos de 0.125 mg/mL, 0.25
mg/mL y 0.5 mg/mL)
80% - 120%
Coeficiente de relacin (r) para metionina.
0.997
Diferencia porcentual de la media para cada

recuperacin de metionina
5.0%
80% a 120% de la concentracin de prueba
Reportar
7.0 Referencias
7.1 TM630.HEXGRF, Rev 1.0 Anlisis de Aminocidos y Determinacin de Contenido de
Pptidos en Hexenoilo GRF.
7.2 SOP QC-630, Rev. 1.0 Anlisis de Aminocidos (Dionex).
7.3 SOP RQA-400, Rev 4.0 Procedimiento de Validacin.
7.4 SOP RQA-350, Rev. 7.0 Reporte de Desviacin.
7.5 Protocolo P04-051, revisin 1.0, validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos
y Contenido de Pptidos en Hexenoilo GRF.
8.0 Desviaciones
8.1 Documentar las desviaciones de acuerdo con el SOP RQA-350 Reporte de Desviacin.
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Apndice A: Preparacin de la Solucin de Muestra

Tabla 4. Preparacin de la Dilucin para Linealidad
Solucin
(%)
Concentracin
(mg/mL)
Solucin de Inventario
Aadida (mL)
Na220 Aadida
(mL)
160
0.8
0.8
0.2
120
0.6
0.6
0.4
100
0.5
0.5
0.5
80
0.4
0.4
0.6
40
0.2
0.2
0.8
Tabla 5. Preparacin de la Solucin AAA Enriquecida Estndar

Solucin AAA Enriquecida Estndar
Preparacin
Estndar A
0.5 mol/mL
Transferir 5 mL de estndar Beckman AAA (2.5 mol/mL) a

un vaso volumtrico de 25 mL. QS hasta la marca con Na220.
Estndar B
0.25 mol/mL
Transferir 12.5 mL de estndar A a un vaso volumtrico de 25

Estndar C
0.125 mol/mL
Transferir 12.5 mL de estndar B a un vaso volumtrico de 25

Tabla 6. Preparacin de Muestra para Exactitud (Hidrlisis Normal)

Solucin AAA Enriquecida
Estndar (mol/mL)
GRF (mg)
Solucin Diluyente
Sin enriquecer
0.700 1.300
Aadir suficiente sol. amortiguadora de Na220

para hacer 0.5 mg/mL.
0.125
0.700 1.300

0.25
0.700 1.300

0.5
0.700 1.300

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Apndice B: Secuencia de Inyeccin

Tabla 7. Secuencia de Inyeccin
Propsito
Precisin
Linealidad
Exactitud
Tipo de Muestra
Muestra
No. de Inyecciones
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
3*
Desconocido
Estndar AAA
Desconocido
Blanco Na220
ICL
Estndar AAA
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Estndar AAA
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA(0.25 mol/mL)
Desconocido
Sin enriquecer (0.5 mg/mL) Hexenoilo GRF
Desconocido

(0.125 mol/mL)
3*
Desconocido

(0.125 mol/mL)
Desconocido

(0.25 mol/mL)
3*
Desconocido

(0.25 mol/mL)
Desconocido

(0.5 mol/mL)
3*
Desconocido

(0.5 mol/mL)
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Desconocido
Estndar AAA
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Tabla 8. Secuencia de Inyeccin (Precisin Intermedia)

Propsito
Precisin Intermedia
(Robustez)
Tipo de Muestra
Muestra
No. de Inyecciones
Desconocido
Blanco Na220
Calibracin (ICL)
Estndar AAA
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Desconocido
Estndar AAA
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Apndice C: Frmulas
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Documento de Validacin Nmero: P04-051
___ Protocolo de Validacin
Autor(es):
Fecha:
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
X Reporte Final de Validacin
Aramis Shannari
12/13/04
Producto(s): Hexenoilo GRF

___ Equipo IQ/OQ
___ Proceso
___ Limpieza
___ Herramienta
___ Instalaciones
___ Software
_X_ Mtodo de Prueba
___ Revalidacin

Hexenoilo GRF (1-44), Acetato.
-i-
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Torrance, CA
Nmero de
Revisin
1.0
Fecha
Efectiva
Ver Formato
de
Aprobacin
-ii-
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Tabla de Contenidos
1.0
Nmero de Protocolo
2.0
Antecedentes
3.0
Resumen de Resultados de Validacin
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
1
3
4
6
9
10
11

Especificidad
Linealidad
Exactitud
Rango
4.0
Resumen de Resultados y Criterios de Aceptacin
12
5.0
Desviaciones
13
6.0
Conclusin
13
7.0
Referencias
13
APNDICE A: Cromatograma de Calibracin Estndar SST
14
APNDICE B: Cromatogramas de Especificidad
15
APNDICE C: Grficas de Linealidad
17
-iii-
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Revisin 1.0
1.0 Nmero de Protocolo

1.1 La validacin se realiz siguiendo el Protocolo P04-051, revisin 1.0.
2.0 Antecedentes
2.1 El mtodo de validacin se realiz en el Laboratorio de Control de Calidad de Bachem de Noviembre
9 a Noviembre 16, 2004. El laboratorio est localizado en el 3152 Kashiwa St., Torrance, California. El
instrumento Dionex BioLC para anlisis de aminocidos (AAA) #01185 fue usado durante todo el estudio
de validacin. Dicho estudio se llev a cabo usando Hexenoilo GRF, lote FHEXGRF9801A. El estudio se
condujo para validar el mtodo de prueba TM630.HEXGRF, revisin 1.0 el cual es empleado para
determinar las tasas de aminocidos y contenido de pptidos en Hexenoilo GRF. La especificidad,
precisin (repetitividad), precisin intermedia (robustez), linealidad, exactitud y rango de este mtodo de
prueba fueron realizados . El mtodo de prueba TM630.HEXGRF no haba sido validado con anterioridad.
2.2 La especificacin (FHEXGRF/v06) para las recuperaciones de aminocidos en Hexnoilo GRF es:
Asx 3.40 a 4.60

Thr 0.85 a 1.15
Ser 2.80 a 4.40
Glx 5.95 a 8.05
Gly 2.55 a 3.45
Ala 4.25 a 5.75
Val 0.80 a 1.20
Met 0.85 a 1.15

Ile 1.70 a 2.30
Leu 4.25 a 5.75
Tyr 1.70 a 2.30
Phe 0.85 a 1.15
Lys 1.70 a 2.30
Arg 5.40 a 6.60
2.3 La especificacin para contenido de pptidos en Hexenoilo GRF es 80%

3.1.1 Descripcin:
La idoneidad del sistema fue determinada para cada conjunto de anlisis llevados a cabo en el analizador
de aminocidos. Los anlisis de las muestras fueron categorizados mediante un estndar de calibracin y
estandarizados como desconocidos, precedidos por dos inyecciones e blanco. El segundo blanco fue usado
para determinar la presencia de picos que pudiesen interferir.
3.1.2 Resultados:
Los resultados de idoneidad del sistema se presentan en la Tabla 1. Referirse al Figura 1, Apndice A para
un cromatograma representativo de la calibracin estndar.
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Revisin 1.0
Tabla 1. Resultados de la Idoneidad del Sistema
Prueba
Especificidad
Precisin
(Hidrlisis normal)
Precisin Intermedia
(Hidrlisis normal)
Linealidad
(Hidrlisis normal)
Exactitud
(Hidrlisis normal)
Criterios de
Aceptacin
Recuperaciones*
de Aminocidos
[mol/mL] del
Estndar Final
(Desc.)
0.2496 0.2543
0.2511 0.2578
0.2381 0.2558
0.2442 0.2617
0.2424 0.2623
0.2375 0.2625
Resolucin de
ICL o Estndar
CAL
Thr y Ser: 1.46
Tyr y Phe: 0.96
Thr y Ser: 1.52
Tyr y Phe: 0.99
Thr y Ser: 1.48
Tyr y Phe: 0.98
Thr y Ser: 1.56
Tyr y Phe: 1.01
Thr y Ser: 1.40
Tyr y Phe: 1.00
Thr y Ser 0.9
Tyr y Phe 0.9
Presencia de
picos que
interfieran en el
blanco Na220 (2
inyeccin)
Resolucin entre
todos los
aminocidos
despus de Phe
Ninguno detectado
Resuelto
Ninguno detectado
Resuelto
Ninguno detectado
Resuelto
Ninguno detectado
Resuelto
Ninguno detectado
Resuelto
5%
Picos del valor basal

resueltos
*Para aquellos aminocidos presentes en Hexenoilo GRF.

3.1.3 Conclusin:
Todos los criterios de aceptacin para determinara la idoneidad del sistema, se cumplieron en cada
secuencia de prueba. Pro lo tanto, todos los datos se juzgaron como vlidos y aceptables para su uso en el
estudio de validacin.
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3.2 Especificidad
3.2.1 Descripcin:
Una muestra de GRF (1-29), lote FGRF1299601, fue analizada para determinar las recuperaciones de
aminocidos. La frmula del Protocolo P04-051, seccin 5.2.2, fue usada para calcular el factor para
determinar los residuos de aminocidos.
3.2.2 Resultados:
Utilizando cido asprtico de los aminocidos, cido glutmico, glicina, alanina, valina, metionina,
isoleucina, leucina, tirosina, fenilamina, lisina y arginina, el factor se calcul como de 0.1122. Refirase a
la Tabla 2 para ver una comparacin de las tasas de aminocidos entre las muestras Hexenoilo GRF y GRF
(1-29). Refirase a la Figura 2 y Figura 3, Apndice B (correccin autgrafa) para consultar los
cromatogramas de especificidad y precisin de las soluciones de muestra. (autgrafo fechado 7/18/05).
Tabla 2. Resultados de Especificidad, Comparacin de Recuperacin de aminocidos
Recuperacin de
Aminocidos en
Hexenoilo GRF
Aminocido
(Especificacin)**
GRF*
Asx
4.02
3.40 4.60
Thr
0.94
0.85 1.15
Ser
3.49
2.80 4.40
Glx
7.07
5.95 8.05
Gly
2.99
2.55 3.45
Ala
4.99
4.25 5.75
Val
1.02
0.80 1.20
Met
0.91
0.85 1.15
Ile
1.91
1.70 2.30
Leu
5.19
4.25 5.75
Tyr
2.02
1.70 2.30
Phe
0.98
0.85 1.15
Lys
1.96
1.70 2.30
Arg
5.93
5.40 6.60
*Primera muestra en la determinacin del estudio de precisin.
**Refirase a FHEXGRF/v06.
GRF (1-29)
(Residuos
Tericos)
Recuperacin de
Aminocidos en
Muestra GRF (1-29)
2.4 3.6
0.8 1.2
2.1 3.3
1.6 2.4
0.8 1.2
2.4 3.6
0.8 1.2
2.4 3.6
0.8 1.2
0.8 1.2
1.6 2.4
0.8 1.2
1.6 2.4
2.4 3.6
3.06
0.96
2.68
2.04
0.99
2.99
0.97
0.88
1.91
4.16
2.01
0.97
2.01
3.00
3.2.3 Conclusin:
Como se observo parir de los datos, las diferencias en las recuperaciones de aminocidos eran evidentes
para el Hexenoilo GRF y el anlogo GRF (1-29), de acuerdo con las especificaciones. Qued establecido
como claramente significativo para los aminocidos cido asprtico, serina, cidos glutmico, glicina,
alanina, leucina y arginina. Por lo tanto, el mtodo de prueba TM630.HEXGRF es especfico para
determinar las recuperaciones de aminocidos a partir de dos pptidos distintos con composiciones de
aminocidos distintas.
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3.3.1 Descripcin:
El estudio de precisin se realiz mediante la determinacin de la repetitividad en seis muestras de
Hexenoilo GRF, lote FHEXGRF9801A, las cuales fueron hidrolizadas y analizadas en sus recuperaciones
de aminocidos. Se pesaron seis muestras separadas de 3.7 a 4.3 mg, y se transfirieron a tubos de ensayo,
hidrolizndolas empleando el estndar interno de acuerdo con el mtodo de prueba TM630-HEXGRF,
revisin 1.0. Despus de que las muestras fueron secadas, se aadi una solucin amortiguadora de Na220
para hacer una nueva solucin de 0.5 mg/mL.
Para cada aminocido presente en el Hexenoilo GRF, se determinaron las medias para la tasa de
aminocidos, desviacin estndar (STD) y desviacin estndar relativa (RSD). Tambin se calcularon las
medias del contenidos de pptidos, desviacin estndar (STD) y desviacin estndar relativa (RSD) para
seis muestras consecutivas de Hexenoilo GRF.
3.3.2 Resultados:
Refirase a la Tabla 3 para ver un resumen de las recuperaciones de aminocidos en seis muestras,
realizadas bajo condiciones de hidrlisis normal por el Analista 1.
Tabla 3. Resumen de Recuperaciones de Aminocidos bajo Hidrlisis Normal (Repetitividad)
Aminocido
Muestra
1
Asx
Thr
Ser
Glx
Gly
Ala
Val
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Lys
Arg
4.02
0.94
3.49
7.07
2.99
4.99
1.02
0.91
1.91
5.19
2.02
0.98
1.96
5.93
Recuperacin de Aminocidos
Muestra Muestra Muestra Muestra
2
3
4
5
Muestra
6
4.02
4.05
4.03
4.03
0.93
0.95
0.94
0.94
3.42
3.51
3.49
3.44
7.06
7.12
7.06
7.07
2.99
3.00
2.99
2.99
5.00
5.02
4.99
4.99
1.02
1.02
1.02
1.00
0.87
0.87
0.95
0.91
1.92
1.91
1.91
1.92
5.19
5.20
5.17
5.17
2.02
1.98
2.00
2.00
1.00
0.97
0.98
0.95
1.95
1.94
1.96
1.96
5.95
5.93
5.98
5.98
Criterio de Aceptacin [% RSD (n = 6)]
3.99
0.95
3.54
7.05
3.00
5.00
1.00
0.91
1.90
5.18
2.02
0.98
1.97
6.05
% RSD
(n = 6)
Media
STD
4.02
0.94
3.48
7.07
2.99
5.00
1.02
0.90
1.91
5.18
2.01
0.98
1.96
5.97
0.0199
0.0061
0.0429
0.239
0.0039
0.0107
0.0081
0.0307
0.0077
0.164
0.0171
0.0170
0.0086
0.0446
0.50%
0.65%
1.23%
0.34%
0.13%
0.21%
0.79
3.41%
0.40%
0.32%
0.85%
1.73%
0.44%
0.75%
5.0%
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Docto. Nm.: P04-051
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Refirase a la Tabla 4 para un resumen de los contenidos de pptidos realizadas por el Analista 1 para las
seis muestras bajo condiciones de hidrolizacin normal.
Tabla 4. Resumen de Contenidos de Pptidos bajo Condiciones de Hidrolizacin Normal
Muestra de Hexenoilo GRF
Contenido de Pptido (%)*
85.75
87.36
85.57
85.43
88.77
87.31
Media del Contenido de Pptidos
86.70
STD
1.3316
%RSD (n = 6)
1.54%
Criterio de Aceptacin [%RSD (n = 6)]
5.0%
*Corregido utilizando el estndar interno Nle.

3.3.3 Conclusin:
Los %RSD (n = 6) para la media de recuperacin de aminocidos para las hidrolizaciones normales,
estuvieron en el rango de 1.0% - 3.4%. Estor resultados cumplieron con los criterios de aceptacin
descrito en el Protocolo P04-051, seccin 5.3.3, donde RSD 5.0%. El %RSD (n = 6) de la media de
contenido de pptidos (corregido usando el estndar interno Nle) en seis muestras, bajo condiciones de
hidrlisis normal, fue de 1.5%. Esto cumpli con el criterio de aceptacin de 5.0%. Por lo tanto, los
resultados indican que el mtodo de prueba TM630.HEXGRF es preciso.
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3.4.1 Descripcin:
La precisin intermedia del mtodo fue investigada usando el formato de precisin descrito en el
Protocolo P04-051, revisin 1.0, seccin 5.3. El estudio de robustez demuestra estadsticamente que
ciertas variables, en este caso da y analista, no afectan significativamente la reproducibilidad de los
resultados de prueba. El Hexenoilo GRF, lote FHEXGRF9801A fue probado observando estas variables
como una entidad nica. La prueba de robustez fue realizada siguiendo el procedimiento provisto en la
seccin 3.3, pero con otro analista en un da distinto y con nuevas preparaciones de muestra. Durante todo
el estudio se utilizaron la misma columna e instrumento.
Por cada aminocido presente en Hexenoilo GRF, se determinaron la media para la tasa de aminocidos, la
STD y la RSD. Los resultados de las pruebas de aminocidos para repetitividad y el estudio de robustez se
combinaron para determinar la RSD (n = 12) de la media para el contenido de pptidos.
3.4.2 Resultados:
Refirase a la Tabla 5 para consultar la media de las recuperaciones de aminocidos, STD y RSD de los
seis anlisis realizados bajo condiciones de hidrlisis normal.
Tabla 5. Resumen de Recuperaciones de Aminocidos bajo Hidrlisis Normal (Robustez, n = 6)
Recuperacin de Aminocidos
Muestra Muestra Muestra Muestra
2
3
4
5
Muestra
6
Media
STD
% RSD
(n = 6)
3.87
3.87
3.87
0.0054
0.14%
0.92
0.91
0.91
0.92
0.0050
0.54%
3.39
3.39
3.39
3.39
3.41
0.0322
0.94%
7.06
7.12
7.06
7.07
7.05
7.07
0.0088
0.13%
3.04
3.03
3.00
2.99
2.99
3.00
2.99
0.0053
0.17%
Ala
5.04
5.04
5.05
5.03
5.04
5.03
5.40
0.0054
0.11%
Val
1.01
1.00
1.02
1.01
1.01
1.01
1.01
0.0046
0.46
Met
0.90
0.88
0.92
0.92
0.92
0.92
0.91
0.0185
2.03%
Ile
1.97
1.96
1.97
1.95
1.95
1.97
1.96
0.0092
0.47%
Leu
5.15
5.15
5.15
5.17
5.16
5.14
5.15
0.0096
0.19%
Tyr
2.06
2.06
2.04
2.05
2.04
2.04
2.05
0.0090
0.44%
Phe
0.97
0.97
0.99
0.98
0.98
0.99
0.98
0.0090
0.92%
Lys
2.00
2.01
2.01
2.00
2.00
2.01
2.00
0.0058
0.29%
Arg
6.05
6.06
6.03
6.04
6.05
6.06
6.05
0.0114
0.19%
Aminocido
Muestra
1
Asx
3.87
3.88
3.87
3.88
Thr
0.92
0.93
0.92
Ser
3.44
3.46
Glx
6.95
Gly

(1) Refirase a la Desviacin D04-508
5.0%
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
Refirase a la Tabla 6 para un resumen de las recuperaciones de aminocidos para los resultados
combinados de repetitividad (n = 6) y precisin intermedia (n = 6).
Aminocido
Media (n = 12) de la Recuperacin de

Aminocido
STD
% RSD (n = 12)
Asx
3.95
0.0801
2.03%
Thr
0.93
0.0134
1.44%
Ser
3.45
0.0526
1.52%
Glx
7.01
0.0657
0.94%
Gly
3.01
0.0184
0.61%
Ala
5.02
0.0229
0.46%
Val
1.01
0.0068
0.67
Met
0.90
0.0244
2.71%
Ile
1.94
0.0265
1.37%
Leu
5.17
0.0194
0.38%
Tyr
2.03
0.0246
1.21%
Phe
0.98
0.0127
1.30%
Lys
1.98
0.0262
1.32%
Arg
6.01
0.0507
0.84%
10.0%
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
Refirase a la Tabla 7 para un consultar el contenido de pptidos, STD y RSD para los seis anlisis
(hidrolizaciones normales) y el resultado combinado con los estudios de repetitividad.
Tabla 7. Resumen del Contenido de Pptidos
Prueba
Muestra de Hexenoilo GRF
1
2
Precisin Inmediata
3
Analista 2: NB
4
Fecha: 11/12/04
5
6
STD
% RSD (n =6)
1
2
Precisin Inmediata
3
Analista 2: AG
4
Fecha: 11/08/04
5
6
STD
% RSD (n = 12)
Contenido de Pptidos (%)

83.16
82.55
82.51
82.58
81.62
82.20
82.44
0.5069
0.61%
5.0%
85.76
87.36
85.57
85.43
88.77
87.31
84.57
2.4249
2.98%
10.0%
3.4.3 Conclusin:
Los %RSDs (n =6) para la media de recuperacin de aminocidos estuvieron en el rango de 0.1% 2.0%
lo que cumpli con los criterios de aceptacin establecidos en el Protocolo P04-051, seccin 5.4.3 (donde
RSD 10%). El %RSD de la media en el contenido de pptidos (corregido) de las seis muestras bajo
condiciones de hidrlisis normal fue de 0.6%, lo que cumpli con el criterio de aceptacin de 5.0%.
Los %RSD (n =12) para la media de recuperacin de aminocidos estuvieron en el rango de 0.4% - 2.7%,
los que cumpli con el criterio de aceptacin delineado en el Protocolo P04-051, seccin 5.4.3 (donde
RSD 10.0%). Los %RSD (n = 12) de la media para el contenido de pptidos (corregido) en las doce
muestras bajo condiciones de hidrolizacin normal fueron de 2.9%, lo que cumpli con el criterio de
aceptacin de 10.0%. Por lo tanto, los resultados indican que el mtodo de prueba TM630.HEXGRF es
robusto.
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3.5 Linealidad
3.5.1 Descripcin:
El estudio de linealidad fue llevado a cabo mediante a hidrolizacin del pptido Hexenoilo GRF, lote
FHEXGRF9801A, y diluyendo las soluciones de muestra preparadas con cinco concentraciones diferentes
(0.2, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.8 mg/mL). Cada concentracin fue analizada por duplicado y se determin la
linealidad de cada aminocido.
Una muestra en un rango de entre 4.950 mg y 5.050 mg fue transferida a una mpula Kontes para secado
de 10mL e hidrolizada de acuerdo con Mtodo de Prueba TM630.HEXGRF (hidrlisis normal). La sol.
amortiguadora de Na220 fue aadida para hacer 1.0 mg/mL. La concentracin de esta solucin de reserva
fue utilizada para preparar las cinco diluciones.
Se calcul la media de las recuperaciones de aminocidos (n = 2) para cada nivel de dilucin. Se
graficaron los resultados de las muestras segn Concentracin (eje X, mg/mL) versus Media de
Recuperacin de Aminocido (eje Y, mol/mL) para cada aminocido. Los datos se analizaron
estadsticamente utilizando la frmula lineal Y = m(X) + b, donde b es el punto de interseccin con el eje
Y y m es la pendiente de la regresin lineal. El coeficiente de correlacin (r) fue determinado para cada
aminocido.
3.5.2 Resultados:
Refirase a las Figuras 4 a 17, Apndice C, para las grficas de aminocidos Concentracin (eje X,
mg/mL) versus Media de Recuperacin de Aminocido (eje Y, mol/mL). Refirase a la Tabla 8 para
consultar un resumen de los coeficientes de correlacin de cada aminocido.
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Revisin 1.0

Aminocido
Pendiente
Punto de Interseccin
con eje Y
Coeficiente de
Correlacin (r)
Diferencia Porcentual
Absoluta de la Media
Asx
0.6957
-0.0323
0.9989
0.0% - 1.2%
Thr
0.1604
0.0134
0.9988
0.1% - 1.9%
Ser
0.5851
0.0526
0.9986
0.4% - 1.7%
Glx
1.2270
0.0657
0.9991
0.6% - 5.1%
Gly
0.5181
0.0184
0.9995
0.1% - 2.1%
Ala
0.8592
0.0229
0.9994
0.1% - 2.7%
Val
0.1659
0.0068
0.9994
0.5% - 2.6%
Met
0.1589
0.0244
0.9995
0.5% - 2.6%
Ile
0.3248
0.0265
0.9992
0.4% - 2.6%
Leu
0.8792
0.0194
0.9992
0.2% - 2.5%
Tyr
0.3403
0.0246
0.9991
0.2% - 3.9%
Phe
0.1652
0.0127
0.9994
0.0% - 3.3%
Lys
0.3329
0.0262
0.9994
0.3% - 3.8%
Arg
1.0188
0.0507
0.9992
0.0% - 1.6%
0.997
5%
3.5.3 Conclusin:
El rango era determinado para el coeficiente de correlacin (r) fue de 0.999 a 1.000, lo cual cumpli el
criterio de aceptacin de r 0.997. El porcentaje de diferencia absoluta de la media para cada aminocido
estaba en el rango de 0% - 5%, lo cual cumpli con el criterio de aceptacin de 5%. Por lo tanto, el
mtodo de prueba TM630.HEXGRF usado para el anlisis de aminocidos en Hexenoilo GRF es linear.
3.6 Exactitud
3.6.1 Descripcin:
La exactitud fue evaluada por medio de un estudio de enriquecimiento y recuperacin. Se pesaron cuatro
muestras de Hexenoilo GRF, lote FHEXGRF9801A (3.950 4.050 mg) e hidrolizada de acuerdo con el
mtodo TM630.HEXGRF. Se prepararon tres soluciones enriquecidas para cada mtodo de hidrolizacin
por medio del enriquecimiento de la muestra de pptido en concentraciones de 0.125, 0.25 y 0.5 mol/mL,
con el estndar para anlisis de aminocidos (AAA). La cuarta muestra no fue enriquecida. Los datos del
cromatgrafo fueron usados para calcular la recuperacin de los aminocidos enriquecidos.
Se calcularon la media del rea de pico de los aminocidos presentes en las inyecciones triplicadas de
Hexenoilo GRF sin enriquecer, y la media de reas de pico de los aminocidos en las inyecciones
triplicadas para las muestras de Hexenoilo GRF enriquecidas en tres concentraciones distintas.
Posteriormente se calcularon las
recuperaciones enriquecida para
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cada aminocido.
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3.6.2 Resultados:
Refirase a las Tabla 9 para las recuperaciones enriquecidas de cada aminocido.
Tabla 9. Resultados de Exactitud para la Recuperacin de Aminocidos
% de Recuperacin
Aminocido
Concentracin Enriquecida
0.125 mol/mL
Concentracin
Enriquecida 0.25 mol/mL
Concentracin
Enriquecida 0.5 mol/mL
Asx
106.77%
105.91%
107.99%
Thr
104.89%
104.44%
101.27%
Ser
106.62%
108.39%
107.43%
Glx
105.93%
109.95%
109.10%
Gly
107.16%
103.62%
105.95%
Ala
110.75%
106.11%
107.52%
Val
104.71%
98.77%
101.55%
Met
101.59%
97.17%
98.54%
Ile
106.27%
107.21%
103.24%
Leu
106.95%
107.19%
106.79%
Tyr
106.13%
102.58%
101.22%
Phe
103.10%
102.67%
100.96%
Lys
104.57%
107.62%
106.52%
Arg
106.36%
105.85%
107.94%
80% - 120% (Hidrlisis Normal)
3.6.3 Conclusin:
Las recuperaciones enriquecidas para los aminocidos estuvieron en el rango de 97% - 111% para los
niveles de concentracin enriquecida 0.125, 0.25 y 0.5 mol/mL. Esto cumpli el criterio de aceptacin de
80% 120%; por lo tanto, el mtodo de prueba TM630.HEXGRF ha demostrado su exactitud.
3.7 Rango
3.7.1 Descripcin:
El intervalo entre las concentraciones superior e inferior de la sustancia analizada, para el cual el proceso
analtico ha demostrado un nivel idneo de precisin, linealidad y exactitud.
3.7.2 Resultados:
Refirase a las secciones de precisin, linealidad y exactitud para consultar los datos apropiados.
3.7.3 Conclusin:
El rango para Hexenoilo GRF probado en los estudios de precisin, linealidad y exactitud fue de 0.2
mg/mL - 0.8 mg/mL, lo que demuestra precisin y exactitud para la concentracin nominal de 0.5 mg/mL.
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4.0 Resumen de Resultados y Criterios de Aceptacin

4.1 Un resumen de los criterios de aceptacin para la validacin y resultados, se presenta en la tabla 10 a
continuacin.
Tabla 10. Resumen de Resultados
Parmetro de
validacin
Idoneidad del
Sistema
Especificidad
Precisin
(Repetitividad)
Una diferencia en las recuperaciones de aminocidos debe

ser evidente de acuerdo con las especificaciones de
Por Confirmar
Hexenoilo GRF y el anlogo GRF (1-29).
Rango
Confirmado
Recuperacin de Aminocidos: SRD (n = 6)
5.0%
0.1% 3.4%
5.0%
1.5%
Recuperacin de Aminocidos: SRD (n = 6)
5.0%
0.1% 2.0%
10.0%
0.4% 2.7%
5.0%
0.6%
10.0%
2.9%
80% a 120%
97% a 111%
0.997
0.999 1.000
5%
0% 5%
Linealidad
Resultado o
Rango
Refirase a la Tabla 1
Precisin Intermedia Recuperacin de Aminocidos: SRD (n = 12)

(Robustez)
Exactitud
Criterios de
Aceptacin
Recuperacin de aminocidos enriquecidos

(para niveles enriquecidos 0.125 mol/mL, 0.25 mol/mL
y 0.5 mol/mL) 7/18/05
Coeficiente de correlacin (r) para cada aminocido
Diferencia porcentual de la media para cada aminocido
80% 120% de la concentracin de prueba
Reportar
0.2 mg/m
0.8 mg/mL
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Versin 1.0
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
5.0 Desviacin
5.1 La desviacin D04-508: el estudio de robustez requera de una preparacin AAA estndar interna
distinta. Sin embargo, se llev a cabo usando el mismo nmero de lote que el utilizado con el estudio de
repetitividad.
6.0 Conclusin
6.1 Los estudios de validacin han demostrado que el mtodo de prueba TM630.HEXGRF pude detectar y
cuantificar todos los aminocidos y determinar el contenido de pptidos de manera efectiva, con la
especificidad, precisin, robustez, linealidad y exactitud adecuadas para el Hexenoilo GRF. El mtodo de
prueba qued validado con un rango de muestras de 0.2 mg/mL a 0.8 mg/mL. Por lo tanto, el mtodo de
prueba TM630.HEXGRF se considera validado y aceptable para la determinacin del anlisis de
aminocidos y contenido de pptidos en Hexemoilo GRF. Las desviacin mostrada en la seccin 5.0 de
este reporte ha quedado justificada y aprobada por el departamento de Aseguramiento de Calidad y no
impacta de manera adversa el estudio de validacin.
7.0 Referencias
7.1 TM630.HEXGRF, revisin 1.0, Anlisis de Aminocidos y Determinacin del Contenido de Pptidos
en Hexenoilo GRF.
7.2 SOP RQA-400, revisin 4.0, Procedimiento de Validacin.
7.3 SOP RQA-350, revisin 7.0, Reportes de Desviacin.
7.4 Libreta de Laboratorio QC: AG-1 [123, 124], NB-2-[16]
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
APNDICE A: Cromatograma del Estndar de Calibracin SST

Figura 1. Cromatograma representativo del estndar de calibracin.
Operador: agorbatov. Tiempo base: AAA.
Secuencia: PRECISIN
110804 Pgina 1-2
11/11/204 9:15 AM
VALIDACIN DEL MTODO DE PRUEBA TM630.HEXGRF, ANLISIS DE AMINOCIDOS Y

DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE PPTIDOS EN HEXGRF
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Cromatograma a Escala
Completa

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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
APNDICE B: Cromatogramas de Especificidad

Figura 2. Cromatograma de especificidad de la solucin muestra [RGF (129)]
Secuencia:
ESPECIFICIDAD 111204
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11/15/2004 5:14 PM

P04-051 rev. # 1.0
Completa
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APNDICE B: Cromatogramas de Especificidad (cont.)

Figura 3. Cromatograma de precisin de la solucin muestra (1 inyeccin, Hexenoilo GRF)
Secuencia: PRECISIN
11/11/2004 9:50 AM
111804
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Completa
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Docto. Nm.: P04-051
Revisin 1.0
APNDICE B: Grficas de Linealidad

Figura 4. Grfica de linealidad para cido Asprtico
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VALIDACIN DEL MTODO DE PRUEBA TM630.HEXGRF, ANLISIS DE
AMINOCIDOS Y DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE PPTIDOS EN
HEXGRF
ESTUDIO DE LINEALIDAD
AMINOCIDO:
cido Asprtico
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Revisin 1.0
APNDICE B: Grficas de Linealidad (cont.)

Figura 5. Grfica de linealidad para Treonina
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AMINOCIDOS Y DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE PPTIDOS EN HEXGRF
AMINOCIDO:
Treonina
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Figura 6. Grfica de linealidad para Serina
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AMINOCIDO:
Serina
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Figura 7. Grfica de linealidad para cido Glutmico
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
cido Glutmico
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Figura 8. Grfica de linealidad para Glicina
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Glicina
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Figura 9. Grfica de linealidad para Alanina
HEXGRF
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AMINOCIDO:
Alanina
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Figura 10. Grfica de linealidad para Valina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Valina
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Versin 1.0
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BACHEM, Inc.
Versin 1.0

Figura 11. Grfica de linealidad para Metionina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Metionina
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Versin 1.0

Figura 12. Grfica de linealidad para Isoleucina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Isoleucina
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Figura 13. Grfica de linealidad para Leucina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Leucina
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Versin 1.0

Figura 14. Grfica de linealidad para Tirosina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Tirosina
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Versin 1.0
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Versin 1.0

Figura 15. Grfica de linealidad para Fenilalanina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Fenilalanina
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Versin 1.0
Pgina 91

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Versin 1.0

Figura 16. Grfica de linealidad para Lisina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Lisina
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BACHEM, Inc.
Versin 1.0

Figura 17. Grfica de linealidad para Arginina
HEXGRF
P04-051 rev. # 1.0
AMINOCIDO:
Arginina
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Documento de Validacin Nmero: P04-051 Addendum
___ Protocolo de Validacin
Autor(es):
Fecha:
BACHEM, Inc.
Versin 1.0
X Reporte Final de Validacin
Aramis Shannari
12/13/04
Producto(s): Hexenoilo GRF

___ Equipo IQ/OQ
___ Proceso
___ Limpieza
___ Herramienta
___ Instalaciones
___ Software
_X_ Mtodo de Prueba
___ Revalidacin

Hexenoilo GRF (1-44), Acetato.
-i-
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Versin 1.0
Reporte de Validacin
P04-051 Addendum

Torrance, CA
Nmero de
Revisin
1.0
Fecha
Efectiva
Ver Formato
de
Aprobacin
-ii-
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Versin 1.0
Tabla de Contenidos
1.0
Nmero de Protocolo
2.0
Antecedentes
3.0
Resumen de Resultados de Validacin
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
1
2
3
5
6
7

Linealidad
Exactitud
Rango
4.0
Resumen de Resultados y Criterios de Aceptacin
5.0
Desviaciones
6.0
Conclusin
7.0
Referencias
APNDICE A: Cromatograma de Calibracin Estndar para Idoneidad del Sist.
APNDICE B: Cromatograma Representativo de la Muestra de Precisin (1. Iny.)
10
APNDICE C: Grfica de Linealidad
11
-iii-
Pgina 96

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Versin 1.0
Docto. Nm.: P04-051 Addendum
Revisin 1.0

1.1 La validacin se realiz de acuerdo con el Protocolo P04-051 Addendum, revisin 1.0.
2.0 Antecedentes
2.1 El mtodo de validacin se realiz en el Laboratorio de Control de Calidad de Bachem de Marzo 16 a
Marzo 21, 2005. El laboratorio est localizado en el 3152 Kashiwa St., Torrance, California. El instrumento
Dionex BioLC para anlisis de aminocidos (AAA) #01185, fue usado durante todo el estudio de
validacin. Dicho estudio se llev a cabo utilizando Hexenoilo GRF (1-44), lote FHEXGRF9801A. El
estudio se condujo para validar el mtodo de prueba TM630.HEXGRF, revisin 2.0, especficamente
empleado para determinar la recuperacin de aminocido Metionina en Hexenoilo GRF (1-44). La
precisin (repetitividad), precisin intermedia (robustez), linealidad, exactitud y rango de este mtodo de
prueba fueron verificadas . El mtodo de prueba TM630.HEXGRF, revisin 1.0 haba sido validado con
anterioridad para los aminocidos: Asx, Glx, Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Lys y Arg.
2.2 La especificacin (FHEXGRF/v06) para la recuperacin de metionina en Hexnoilo GRF (1-44) es:
Met
0.85 a 1.15
3.0 Resumen de Resultados de Validacin

3.1.1 Descripcin:
La idoneidad del sistema fue determinada para cada conjunto de anlisis llevados a cabo en el analizador de
aminocidos. Los anlisis de las muestras fueron categorizados mediante un estndar de calibracin* y
estandarizados como desconocidos, precedidos por dos inyecciones e blanco. El segundo blanco fue usado
para determinar la presencia de picos que pudiesen interferir.
3.1.2 Resultados:
Los resultados de idoneidad del sistema se presentan en la Tabla 1. Referirse al Figura 1, Apndice A para
un cromatograma representativo de la calibracin estndar.
* Refirase a Desviacin D05-166
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DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

3.2.S.4.3 Documento 1 Validacin del Anlisis de Aminocidos

Nmero de Revisin de la Validacin: 1.0

___ Reporte Parcial de Validacin

___Reporte Final de Validacin

Producto(s): Hexenoilo GRF (1-44) Acetato

Estado de la Validacin _X_ Proceso

Ttulo del Documento:

Fecha de Aprob. Final:

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Bachem California, Inc.

Ninguno (primera revisin)

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Equipo de Prueba y Materiales

Idoneidad del Sistema

APNDICE A: Preparacin de la Solucin de Muestra

APNDICE B: Secuencia de Inyeccin

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

1.1 El propsito de este protocolo es demostrar la especificidad, precisin (repetitividad), la

validacin del mtodo de prueba

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Equipo de Prueba y Materiales

Nota: Refirase al mtodo de prueba TM630.HEXGRF para las condiciones de prueba y

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y

Docto. Nm.: P04-051

5.1.3 Criterio de Aceptacin:

Resolucin de CAL o Estndar ICL

*(Aplica a aquellos aminocidos encontrados en la muestra).

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Validacin del Mtodo de Prueba Anlisis de Aminocidos y

Docto. Nm.: P04-051

Tabla 2. Especificidad, Recuperacin de Aminocidos (Hidrlisis normal)

5.3 Precisin (Repetitividad)

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

5.4 Precisin Intermedia (Robustez)

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Concentracin de la Muestra sin Enriquecer

Calcular la recuperacin de pico (por aminocido) usando la siguiente ecuacin:

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato

5.7.2 Evaluacin de los Datos y Estadsticas:

5.7.3 Criterios de Aceptacin:

Mdulo 3, Parte Abierta

DOSSIER DMF HexGRF (1-44), Acetato