Qai Uv Visible Fluo Valid 2010 S

Espectroscopa
UV--Visible
UV
ESPECTROSCOPIAULTRAVIOLETAYVISIBLE
TRANSMITANCIAYABSORBANCIA
T=P/P0
A= logT=log(P0 /P)
LEYDELAMBERTYBEER.ABSORTIVIDAD
A=k.b.c
Absortividad(a):
Absorbanciadeunasolucinde1gporlitro,medidaenunaceldadepasoptico1cm.
a =A/cb
Unidades:Lg1cm1.
Coeficientedeextincinespecfica[E(1%,1cm)]:
Absorbanciadeunasolucinde1%(1g/100mL),medidaenunaceldadepaso
ptico1cm.
E(1%,1cm) =A/cb=10a
Unidades:g%1cm1.
Absortividadmolar():
Absorbanciadeunasolucinde1molporlitro,medidaenunaceldadepasoptico
1cm.Productodelaabsortividadporelpesomolecular(PM)delanalito.
=a PM
Unidades:M1 cm1.
2
Los valores de a, E (1 %, 1 cm) y , a una longitud de

onda especfica y en un solvente determinado, son
caractersticos del analito.
CALIBRACINDEUNESPECTROFOTMETRO
1.Elnivel0%detransmitancia con
elobturadordelinstrumento
cerrado
2.Elniveldelinstrumentoal100%
detransmitancia (cerode
absorbancia)BLANCO
LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER

Desviacindelalinealidadentreabsorbanciayconcentracincuandoelpaso
ptico(b)esconstante.
Desviacionesreales
Provienende:
a) Concentraciones elevadas delanalito (>0,01M).
b) Concentraciones elevadas deelectrolitos.
c) Loscambiosenelndicederefraccindelsistemaanaltico,puescomoa
dependedelndicederefraccindelamuestra:
Aconcentraciones0,01Momenores,elndicederefraccinesesencialmente
constante.
Desviacionesinstrumentales
a) Radiacin policromtica
LadeduccindelaleydeBeersuponeradiacinmonocromticaylos
monocromadoresenrealidadproporcionanunabandadelongitudesdeonda.
A = log [( P0' + P0 '' ...) / ( P0 '10a'bc + P0 ''10a''bc...)]

Cuandoa' =a''...,estaecuacinsesimplificaaA= a'bcysecumplelaleyde
Beer.
b) Radiacin esprea
Son reflexiones procedentes de componentes pticos y del monocromador.
llegan al detector debido a la dispersin por partculas de polvo y a las reflexiones
en las superficies interiores, pudiendo no haber atravesado la muestra.
Posen longitudes de onda que son muy diferentes de las de la banda de luz
principal
i i l utilizada.
tili d
A =log
=log(P
(P0 +Ps)
(P+Ps)
Ps eslapotenciadela
radiacinespreano
absorbida
Desviacionesqumicas
Soncausadasporequilibriosensolucinqueinvolucranala
especieabsorbenteyalteransuconcentracinoriginando
desviaciones positivas o negativas ya que dan lugar a un
desviacionespositivasonegativas,yaquedanlugaraun
productoquepresentaunespectrodeabsorcindiferenteal
delanalito.
Ejemplos:
Reaccionesdeasociacindisociacin,
reacciones cido base

reaccionescidobase,
reaccionesdepolimerizacin,
reaccionesdeformacindecomplejosy
reaccionesconelsolvente.
8
APLICACIONES
ANLISIS CUALITATIVO
Se utiliza su barrido espectral o espectro de absorcin. Consiste en la comparacin
del espectro obtenido de la muestra que contiene la especie absorbente y el
espectro de un estndar de dicha especie.
Requiere para ello
ll un proceso de
d aislamiento
l
o purificacin
f
de
d las
l especies
absorbentes contenidas en la muestra.
El anlisis del espectro UVVisible no se utiliza como criterio nico de identificacin,
sino como anlisis complementario.
ANLISIS CUANTITATIVO
Amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgnicos como inorgnicos

Sensibilidades de 104 a 105 M (ampliable a 106 a 107 M con ciertas
modificaciones)
De moderada a alta selectividad
Buena precisin
Fcil y adecuada adquisicin de datos
9
ProcedimientosparaelAnlisisEspectrofotomtrico
1. Seleccindelalongituddeonda
2. Determinacindelarelacinentreabsorbanciayconcentracin
a) Mtodosinlaadicindeestndar
b) Mtodoconlaadicindeestndar:
tilparacontrarrestarlosefectosdematrizdelamuestra.
A1 = b Vx Cx
Vt
A2 = b Vx Cx + b Vs Cs
Vt
Vt
Donde A1 y A2 son las absorbancias de la muestra diluda y de la muestra diluda
ms estndar
10
Algunasutilidadesdelaespectrofotometra:
DETERMINACINDEELEMENTOSPORMEDIODEAGENTESCOMPLEJANTES
9 Los complejos de ciertos elementos presentan en muchos casos 104 M1cm1 y
absorben fuertemente en el visible.
9 Debido a los altos coeficientes de absortividad molar de muchos de estos
complejos es posible la determinacin de concentraciones del orden de mg / L o
partes por milln, siendo aplicables en las determinaciones de especies qumicas a
nivel de trazas .
2,2 Dipiridilo
1,10fenantrolina
Difenilcarbazona
11
DETERMINACIN DE CONSTANTES DE DISOCIACIN DE INDICADORES CIDOBASE

H In + H2O
Forma cida
Especie absorbente a a
H3O+ + InForma bsica

Especie absorbente a b
Cuyaconstantedeequilibriooconstantedeacidez,sera:
Ka = [ In- ]eq [ H+ ]eq .

[ H In ]eq
YcuyopKa,sera:
pKa = - log [ In- ]eq [ H+ ]eq . = pH log [ In- ]eq .
[ H In ]eq
[ H In ]eq
12
Procedimiento
(1)Determinarlalongituddeondademximaabsorcinparacadaunade
lasdosformas(In yInH).
InH : 520 nm
In-: 430 nm
13
(2)VerificarlaleydeLambertyBeerparaambasformasdelindicador.
Abs 520nm
InH
Abs 520nm
In-
Abs 430 nm
Abs 430 nm
0.6
1.4
1.2
R2 = 1
1.00
00
y = 73.00x + 0.00
R2 = 1.00
1 00
0.4
0.8
Abs
Abs
0.5
y = 150.50x + 0.02
0.6
0.3
0.2
0.4
y = 9.81x + 0.01
y = 10.10x + 0.02
2
0.2
R2 = 0.96
0.1
R = 0.99
0
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
cc (g/ L)
0.002
0.004
0.006
0.008
cc (g/ L)
Absortividad de InH a 520 nm (a520 InH)

150,50 L g-1cm-1
Absortividad de In- a 520 nm (a520 In-)

9,81 L g-1cm-1
Absortividad de InH a 430 nm (a430 InH)

10,10 L g-1cm-1
Absortividad de In- a 430 nm (a430 In-)

73,00 L g-1cm-1
14
(3)DeterminacindelaconcentracindeambasformasInHyIn
(3)DeterminacindelaconcentracindeambasformasInHyIn a
distintospHcercanosalpKa.
Solucin de Rojo
j de
Metilo 0,01 %
10,00 mL
10,00 mL
10,00 mL
10,00 mL
AcNa 0,04 F
AcH 0,02 F
25,00 mL
50,00 mL
25,00 mL
25,00 mL
25,00 mL
10,00 mL
25,00 mL
5,00 mL
Agua destilada c.s.p.
100,00 mL
100,00 mL
100,00 mL
100,00 mL
pH
Abs a 520 nm
Abs a 430 nm
4,70
5,05
5,45
5,90
1,097
0,356
0,796
0,432
0,456
0,585
0,276
0,658
Abs520 nm = a520InH.b.(cc InH) + a520In-.b.(cc In-)

Abs430 nm = a430In-.b.(cc In-) + a430InH.b.(cc InH)
15
Cc InH = . (a430In- . Abs520) (a520In- . Abs430) .

(a520InH . a430In-) (a520In- . a430InH)
Cc In- = . (a520InH . Abs430) (a430InH . Abs520) .
((a520InH . a430In-) ((a520In- . a430InH))
pH
Cc. InH (g/L)
Cc. In- (g/L)
pKa
Ka
4,70
0.007034574
0.003903436
4.955790781
1.10716 x 10-5
5,05
0.004947885
0.005233238
5.025649132
9.42651 x 10-6
5,45
0.002530314
0.007663614
4.968740821
1.07463 x 10-5
5,90
0.001257633
0.008839697
5.053116441
8.84878 x 10-6
Kamedia=1,0023x105
pKa=5,00
16
Espectroscopa de
Fluorescencia
17
Fluorescencia
9
La fluorescencia
fluorescencia,, fosforescencia y quimioluminiscencia
quimioluminiscencia,, son procesos
fotoluminiscentes, en donde las molculas de analito se excitan para
fotoluminiscentes,
p
dar una especie, cuyo espectro de emisin suministra informacin
para el anlisis cualitativo y cuantitativo.
Tienen un lmite de deteccin del orden de partes por billn y un

amplio rango lineal permitiendo la determinacin cuantitativa de un
importante conjunto de especies orgnicas e inorgnicas, a niveles de
trazas.
Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como mtodo de

deteccin en HPLC y electroforesis capilar.
Su utilidad est limitada, por el hecho de que pocas especies

presentan fotoluminiscencia.
18
Teora de la fluorescencia y
fosforescencia
1)
Estados excitados
El p
principio
p de exclusin de Pauli establece qque en un tomo no
puede haber dos electrones con los cuatro nmeros cunticos
iguales..
iguales
Estado Singulete
Singulete:: Dos electrones en un orbital con estados de spn
opuestos (apareados). La mayora de las molculas no presentan un
campo magntico neto (molculas diamagnticas
diamagnticas)) por lo que no
son atradas ni repelidas
p
p
por un campo
p magntico
g
p
permanente.
Estado doblete : es el estado fundamental de un radical libre, tiene

electrones desapareados, donde el electrn impar puede tomar dos
orientaciones en un campo magntico, lo que otorga ligeras
diferencias de energa al sistema. Estas molculas son
paramagnticas y son atradas por campos magnticos.
19
Teora de la fluorescencia y
fosforescencia
Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado

a un nivel de energa superior, se forma un estado
singulete o triplete
triplete..
En el estado singulete excitado, el espn del electrn
promocionado contina apareado con el del estado
fundamental, sin embargo en el estado triplete los espines
de los dos electrones estn desapareados (paralelos).
Las propiedades de una molcula en estado triplete

excitado difieren significativamente de las del estado
singulete excitado.
excitado.
j p , una molcula es p
paramagntica
g
en el estado
Por ejemplo,
triplete y diamagntica en el estado singulete
singulete..
Una transicin singuletesingulete-triplete, es un suceso
significativamente menos probable que la transicin
singulete--singulete.
singulete
singulete.
Estado singulete
excitado
Estado triplete
excitado
Estado singulete
fundamental
20
10
2. Procesos de desactivacin (a)
Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental

mediante una combinacin de varios mecanismos:
dos de ellas son la fluorescencia y la fosforescencia que conllevan la

emisin de un fotn de radiacin.
Las otras etapas de desactivacin indicadas por flechas onduladas, son

procesos no radiantes.
El camino ms propicio hacia el estado fundamental es aquel que

minimiza el tiempo de vida del estado excitado.
La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente

pequeo de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y
ambientales que hacen que las velocidades de los procesos de
relajacin o desactivacin no radiantes se demore hasta el punto en
el que la reaccin de emisin puede competir cinticamente con
ellos.
21
Esquema de procesos de excitacin y

desexcitacin
22
11
Procesos de desactivacin (b)

1)
Relajacinvibracional:
Relajacinvibracional
:
endisolucinelexcesodeenergavibracional sepierdemediantecolisionesentrelas
molculasdelasespeciesexcitadasylasdeldisolvente.Esteprocesoesmuyeficaz
(t1/2=1012 seg).
2)
Conversininterna:
sonprocesosintermolecularesporloscualeslamolculapasaaunestadoelectrnicode
menorenergasinemisinderadiacin.Esmseficazcuandodosnivelesdeenerga
i
i i d
di i
fi
d d
i l d
electrnicosestnlosuficientementecercacomoparaquehayasolapamientodelos
nivelesdeenergavibracional.
Algunasveceslaconversininternapuededarlugarapredisociacin,dondeunelectrnpasadeun
estadoelectrnicoaltoaunestadovibracional altodeunestadoelectrnicomsbajoyseproducela
rupturadeunenlacedebidoalaelevadaenergavibracional.
3)
Conversinexternaoamortiguacin
Conversinexternaoamortiguacincolisional
colisional::
ocurreporinteraccinytransferenciadeenergaentrelaespecieexcitadayeldisolvente
uotrossolutos.Todaslascondicionesquetiendenareducirelnmerodecolisionesentre
partculas(bajastemperaturasyelevadaviscosidad)desfavorecenestemecanismoy
tienden,generalmente,aaumentarlafluorescencia.
4)
Cruceentresistemas:
enesteprocesoseinvierteelespndeunelectrnexcitadoydacomoresultadoun
cambioenlamultiplicidaddelamolcula.
Laprobabilidaddeestatransicinaumentacuandolosnivelesvibracionales delosdos
estadossesolapan.
Esmasfrecuenteenmolculascontomospesados,comobromoyyodo,dondeel
acoplamientoespnorbitalsehacegrande,favoreciendouncambioenelespn.
Lapresenciadeespeciesparamagnticasenladisolucin,comoeloxgenomolecular,
favorecenesteprocesoydisminuyenlafluorescencia.
23
Fluorescencia y Fosforescencia
Enamboscasosladesexcitacinimplicareemisin
p
delaradiacinquehasidoabsorbida.
Lafosforescenciacomprendeladesactivacindesde
unestadotripleteexcitado,luegodeuncruce
intersistemas.
Lafluorescenciaimplicaunatransicindesdeel
menornivelvibracionaldeunsinguleteexcitado
hacialosnivelesvibracionalesdelestadobasal.
24
12
Fluorescencia y Fosforescencia
VARIACION DE STOKES.
Debido a la alta eficiencia de la

relajacin vibracional
vibracional,, la
desactivacin ocurre desde el menor
nivel vibracional del estado excitado
hacia un estado vibracional del
estado basal, producindose un
corrimiento de la banda de emisin
con respecto a la de absorcin, hacia
mayores y menores .
Como el triplete tiene menor energa que el singulete excitado, la banda de la fosforescencia emitida al
desactivarse desde un triplete ser de mayor que la observada por la desactivacin fluorescente desde un
singulete excitado.
Como la fluorescencia no involucra cambios en el espn electrnico, su vida media es de 10-5 segundos. En
la fosforescencia en cambio, al rotar el espn para generar el estado triplete, se produce un incremento en el
tiempo de vida, siendo de 10-4 a varios segundos.
25
Variables que afectan a la fluorescencia y

fosforescencia
1)
Rendimiento cuntico o eficiencia cuntica

Es la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto al
nmero total de molculas excitadas.
Para molculas altamente fluorescentes como la fluorescena, la eficacia cuntica es cercana a la
unidad.
Las especies qumicas que no presentan fluorescencia apreciable tienen eficacias que se acercan a
cero.
El rendimiento cuntico de fluorescencia de un compuesto, puede calcularse a partir

de las constantes de velocidad relativas de los procesos por los cuales el estado
singulete excitado mas bajo se desactiva.
kf : fluorescencia
kces : cruce entre sistemas
kf
kce : conversin externa
=
kci : conversin interna
kf + k ces + k ce + k ci + k pd + k d
kpd : predisociacin
kd : disociacin
kf, kpd y kd dependen principalmente de la estructura qumica del compuesto, mientras que el resto de
las constantes estn fuertemente influenciadas por el entorno y en menor medida por la estructura. 26
13
Variablesqueafectanalafluorescenciay
fosforescencia
Rendimiento cuntico o eficiencia cuntica:
nn de molculas que fluorescen

kf
=
n de molculas excitadas
kf + kces + kce + kci + kpd + kd
Estructura
Temperatura
p
Fluorescencia
g
estructural
Rigidez
Solvente
Viscosidad
pH
27
2. Factores estructurales (a)
La fluorescencia ms intensa la presentan los compuestos que tienen grupos

funcionales aromticos con transiciones * de baja energa.
Tambin pueden presentar fluorescencia, compuestos que contienen grupos carbonilo

en estructuras alifticas y alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente
conjugados,, aunque su nmero es mucho menor.
conjugados
La mayora de los compuestos aromticos no sustituidos son fluorescentes en solucin

y su eficiencia cuntica aumenta con el nmero de anillos y grado de condensacin
condensacin..
En los hidrocarburos aromticos, los sustituyentes dadores de electrones como los

OH, F, OCH3 y NH2 , incrementan la fluorescencia al aumentar la probabilidad del
pasaje del estado excitado al basal, al contribuir con la deslocalizacin de los electrones
; ocurriendo lo contrario con los grupos atractores de electrones.
La falta de rigidez en la molcula, favorece la desactivacin no radiante a travs de la

conversin interna.
Ciertos agentes quelantes orgnicos, fluorescen mas intensamente al estar complejados

con un ion metlico no paramagntico, debido al aumento de rigidez de la estructura.
Se puede incrementar la fluorescencia adsorbiendo la molcula a un soporte slido.

28
14
3. Influencia de la temperatura
Alaumentarlatemperaturadisminuyelaeficaciacunticade
fluorescencia,debidoaqueaumentanlascolisionesentrelas
molculas y por lo tanto aumenta la probabilidad de
molculasyporlotantoaumentalaprobabilidadde
desactivacinporconversinexterna.
4. Influencia del solvente
Unadisminucinenlaviscosidaddelsolventeaumentalaprobabilidaddela
conversinexternayproduceelmismoefectoqueelaumentode
temperatura.
p
Tambindisminuyelafluorescenciaensolventesquetienentomospesados.
Cuandosedeseaexaltarlafosforescenciaseincorporanalosdisolventes
compuestosquecontienentomospesados,yaqueenestascondiciones
aumentalavelocidaddeformacindeltriplete.
29
5. Efecto del pH
La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos
en el anillo depende normalmente del pH.
Tanto la de absorcin como la de emisin, difieren entre la forma ionizada y la
no ionizada.
ionizada Esto se debe al distinto nmero de especies resonantes asociadas con
las formas cidas y bsicas de las molculas.
Cuanto mayor es el nmero de formas resonantes, mayor es la estabilidad del
estado excitado y la consecuencia es una fluorescencia en la regin ultravioleta.
Esto sugiere que los procedimientos analticos basados en la medida de
fluorescencia requieren un control del pH.
6. Efecto del oxigeno disuelto
El oxigeno suele disminuir la intensidad de fluorescencia.

Esto puede deberse a una oxidacin de la sustancia o a las propiedades paramagnticas del
oxigeno molecular, que favorece el cruce entre sistemas y la conversin de las molculas
excitadas al estado triplete.
Otras especies paramagnticas tienden a disminuir la fluorescencia.
30
15
7. Efecto de la concentracin
1)
La potencia de emisin fluorescente F es proporcional

a la potencia radiante del haz de excitacin absorbido
por el sistema.
F = K ((P0 P )
2)
P0 es la potencia que incide sobre la muestra y P es la

que sale luego de atravesar una longitud b del medio.
K depende de la eficacia cuntica del proceso.
Para relacionar F con la concentracin de la especie
fluorescente, se escribe la ley de Beer
Beer..
P
= 10 bc
P0
3)
es la absortividad molar de las molculas

fluorescentes y bc es la absorbancia.
Reemplazando en (1).
F = K P0 (1 10bc )
4)
El trmino exponencial puede desarrollarse como

una serie de Maclaurin.
2
3
2,303bc 2,303
F = K P0 2,303bc.
+
...
2!
3!
5)
Si bc es pequeo solo el primer trmino del polinomio es

significativo y la ecuacin se convierte en:
F = K P0 2,303bc
Si Po y b son constantes
t t = F = K.C
KC
Laecuacinestableceunarelacinlinealentrela
concentracinylaintensidaddefluorescencia.
9 A concentraciones superiores, los trminos no pueden ser
despreciados y se pierde la linealidad
linealidad..
9 Otros factores responsables de las desviaciones negativas
a concentraciones elevadas:
elevadas:
a. Laautoaniquilacino
La autoaniquilacin o autoquenching eslaprdida
Laautoaniquilacinoautoquenching
es la prdida
deenerganoradianteporcolisionesentrelas
molculasexcitadas.
Cuandounalongituddeondadeemisinsesolapa
conunalongituddeondadeabsorcin,seproduce
undisminucindelafluorescenciaamedidaquela
radiacinemitidaatraviesalasolucin;
(autoabsorcin)
autoabsorcin)..
31
Sensibilidad y especificidad
La alta sensibilidad se debe a que el poder de fluorescencia se puede medir

independientemente del poder de la lmpara P0. En cambio en
espectrofotometra la medicin requiere evaluar ambos parmetros P y P0, ya
espectrofotometra,
que la absorbancia es proporcional a la relacin entre ambas intensidades.
Esto es fcil de comprender si visualizamos que es ms fcil detectar una
pequea seal que una pequea diferencia entre dos grandes seales.
Para aumentar la sensibilidad se puede aumentar la potencia de la lmpara o
amplificar la seal fluorescente.
Su especificidad resulta de la necesidad de conjugar dos espectros: el de

excitacin
it i y ell de
d emisin.
i i Es
E poco probable
b bl que ddos compuestos
t ttengan la
l
misma longitud de onda de excitacin y de emisin de fluorescencia, por esto
es que el mtodo tiene alta especificidad.
32
16
Absorbancia
Fluorescencia
17
Fluorescencias vs Absorcin
Fluorescencia
Absorcin
M sensible
Ms
ibl
M
Menos
sensible
ibl
F=2,3.K..b.c.Po
F=2,3.K
T=P/Po=10-bc
Se mide F
A >Po>S
Se mide T
A > Po = S
(aumento
(
t proporcional
i l de
d P)
Menos selectiva
Ms selectiva
35
Instrumentos de medida
(1) fluormetro o espectrofluormetro
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Casi todos los instrumentos de

fluorescencia utilizan pticas de doble haz,
para compensar las fluctuaciones en la
potencia
t
i de
d la
l fuente.
f
t
El haz proveniente de la fuente atraviesa un
filtro o monocromador de excitacin que
transmite la radiacin y excluye la de
emisin.
La fluorescencia es emitida en todas las
direcciones, pero la mejor manera de
observarla es en un ngulo de 90 con
respecto al haz de excitacin; a otros
ngulos, la dispersin por la solucin y las
paredes de la cubeta, puede causar grandes
errores en la medida de la intensidad.
La radiacin emitida llega al detector
fotoelctrico luego de atravesar el filtro o
monocromador de emisin.
El haz de referencia pasa por un atenuador,
que reduce su poder aproximadamente 100
veces.
Ambos rayos llegan a un amplificador
diferencial y de all al registrador.
(2)
(1)
(3)
(5)
(4)
(6)
Figura 5. Esquema de un fluormetro o

espectrofluormetro.
36
18
Instrumentos de medida
1. Fluormetros
Son anlogos
g a los fotmetros de absorcin
donde se utilizan filtros para seleccionar las
longitudes de onda de excitacin y emisin.
2. Espectrofluormetros
Hay de dos tipos, los que tienen un filtro para

seleccionar la longitud de onda de excitacin y
un monocromador de red o prisma para la
seleccin
l i dde lla llongitud
it d de
d onda
d de
d emisin.
i i El
otro tipo, son los verdaderos
espectrofluormetros, que tienen dos
monocromadores; uno de ellos permite variar la
longitud de onda de excitacin y el otro permite
obtener el espectro de emisin.
37
Componentes de los equipos

1. Fuentes
Lmpara de vapor de Mercurio de baja presin con ventana de slica, que provee lneas
intensas a 254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm.
Lmpara
dde arco dde alta

l presin
i dde Xenn.
Es tilil ya que su espectro es continuo
i
entre 300 y 1330 nm
Lser. Para deteccin de ultratrazas por fluorescencia.
2. Filtros y monocromadores
Los filtros pueden ser de interferencia o absorcin y los monocromadores por lo
general son de red.
3. Detectores
Las seales de fluorescencia suelen ser de baja
j intensidad, p
por eso se requiere
q
de
fotomultiplicadores o arreglos de diodos.
4. Cubetas y compartimentos para cubetas
Se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares de vidrio o slice. Se debe tener
cuidado en el diseo del compartimento de las cubetas, para reducir la cantidad de luz
dispersada que llega hasta el detector. Con este fin se suelen introducir deflectores en
el compartimento.
38
19
Aplicaciones
1. Determinacin de especies inorgnicas
Existen dos tipos de mtodos:

Los directos donde se forma un quelato fluorescente y se mide
su emisin;
y los indirectos, donde se mide la disminucin de emisin que se
debe a la accin atenuadora de la sustancia que se quiere
determinar. Este ltimo mtodo es ms utilizado en la
determinacin de aniones.
2. Determinacin de especies orgnicas
Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos,

productos naturales, esteroides y vitaminas. Siendo til en el
anlisis de productos alimentarios, farmacuticos, muestras
clnicas y productos naturales.
39
Validacin de Mtodos
Analticos
40
20
INTRODUCCIN (1)
Un producto farmacutico puede comercializarse

si cumple una serie de requisitos,
Estos se verifican a travs de ensayos qumicos,
fsicos y microbiolgicos.
Mediante ensayos descriptos en un Mtodo
Analtico se comprueba que el producto cumple
con las especificaciones exigidas.
41
INTRODUCCIN (2)
Un Mtodo Analtico consta de un conjunto de

ensayos, necesarios para efectuar el anlisis
completo
p
de una sustancia
sustancia..
Existen 3 tipos fundamentales de ensayo:
ensayo:
Ensayos de Identificacin:
Identificacin: se verifica la identidad del
producto analizado.
analizado.
Ensayos de Valoracin:
Valoracin: se verifica la concentracin y
pureza del principio activo en la forma farmacutica en
ensayo..
ensayo
Ensayos de disolucin:
disolucin: se evala la liberacin de los
principios
activos
contenidos
en
el
producto
farmacutico..
farmacutico
42
21
INTRODUCCIN (3)
Tipos de Mtodos Analticos
Analticos::
Mtodos estndar (de refencia)

refencia):
desarrollados por organizaciones de prestigio internacional.
Mtodos oficiales:
oficiales:
exigidos por organismos de regulacin gubernamentales.
Mtodos de revistas cientficas:
cientficas:
usados con especial atencin y requieren previa validacin.
Mtodos del propio laboratorio:
laboratorio:
siempre documentados y previamente validados.
Se validan:
1.
Mtodos Analticos.
2.
Mtodos de control de limpieza.
3.
Equipos e instalaciones, Procesos, Software, Personal, etc.

43
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS
Validar significa demostrar que un mtodo es

adecuado para el propsito que fue diseado.
(Segn ICH).
ICH)
Mediante una validacin se demuestra que los resultados
obtenidos a partir del mtodo analtico son confiables.
Se valida debido a que:
1.
Disminuye los costos debido a que no sern necesarias las

repeticiones de ensayos, disminuyendo el gasto de materiales y
tiempo de trabajo.
2.
Permite un conocimiento profundo de las caractersticas del

mtodo analtico.
3.
Constituye un requisito regulatorio.

(ICH:The International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
44
22
Los mtodos descriptos en Farmacopeas se

consideran validados
Sin embargo la validez de estos mtodos es
discutible, debido a diferencias en los excipientes
empleados y en la calidad de las materias primas
segn su origen.
Resulta necesario validar el mtodo analtico para
cada producto.
Todos los Mtodos Analticos desarrollados en el
laboratorio o publicados en revistas cientficas
deben ser validados.
45

Tipos de Validacin:
Validacin Prospectiva:
Para mtodos nuevos.
Validacin Retrospectiva:
Para mtodos repetidamente utilizados, no validados
anteriormente y de los que se tiene documentacin
suficiente para probar la bondad del mtodo.
Revalidacin:
Repeticin parcial o total de una validacin debido a
cambios efectuados que pueden afectar la bondad del
mtodo validado.
46
23

1)
Protocolo de Validacin:
2)
Realizacin de la Validacin y Evaluacin de los resultados analticos:
3)
Informes Tcnicos:
Redaccin de un protocolo de validacin consistente en un plan experimental

diseado para documentar que el sistema ha sido validado.
Todos los datos deben ser archivados en los cuadernos de laboratorio. Una vez
realizada la validacin, se evaluarn los resultados obtenidos y si difieren de los
esperados se agregar un anexo explicando los cambios introducidos respecto al
protocolo original y las razones que lo justifican.
La descripcin por escrito del procedimiento para la determinacin de cada uno
de los parmetros a evaluar.
Los resultados de las determinaciones de cada parmetro incluyendo esquemas,
copias originales de los espectros
espectros, cromatogramas,
cromatogramas curvas de valoracin
valoracin, etc
etc.
Conclusiones: se aceptar o no la validacin del mtodo analtico.
4)
Certificado de la Validacin:
Documento formal de aprobacin firmado por las personas responsables.
47

Los parmetros a considerar en una validacin:
9
9
9
9
9
9
Selectividad/Especificidad (*)
Linealidad y rango
Precisin
Sistema
Repetibilidad
Intermedia
Reproducibilidad
Exactitud
R b t
Robustez
LOD/LOQ
Mtodo
(*) Preferentemente se realizan durante el desarrollo del mtodo

analtico.
48
24

9 Especificidad
/ Selectividad:
El mtodo desarrollado debe ser capaz de resolver el analito de la

matriz de sus productos de degradacin y de sustancias relacionadas.
relacionadas
9
Este parmetro se refiere a la propiedad del mtodo analtico de

producir una seal medible debida slo a la presencia del analito y
que no corresponda a la interferencia de otros componentes de la
muestra. Estos componentes pueden ser excipientes, productos de
degradacin, impurezas de sntesis.
En ell caso de
d que los
l interferentes
i
f
sean desconocidos,
d
id
se siguen
i
los
l
siguientes pasos:
Se analiza la estructura qumica del analito y se proponen las posibles
degradaciones y mtodos de degradacin.
Se realizan los llamados degradados intencionales.
49

Para evaluar la Selectividad:
En la materia prima:
prima: Se realizan Degradaciones Forzadas:
1)
Degradaciones cidas
2)
Degradaciones Alcalinas
3)
Degradaciones Reductoras
4)
Degradaciones Oxidante Fuerte
5)
Degradaciones Oxidante Dbil
6)
Degradaciones Hidroltica
7)
Degradacin Termoltica
8)
Degradacin Fotoltica
Fotoltica::
50
25
LINEALIDAD:
Se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin del
analito y su respuesta.
Adems se determina el rango lineal, es decir el intervalo de
concentraciones de analito para el cual el mtodo ha sido
probado, dentro de ese rango se pueden realizar
interpolaciones en una curva estndar.
51
PRECISIN:
Est relacionada con la dispersin de las medidas alrededor
de su valor medio y corresponde al grado de concordancia
entre ensayos individuales cuando el mtodo se aplica
repetidamente a mltiples muestras.
La precisin se expresa matemticamente como desviacin
estndar relativa (RSD) o coeficiente de variacin (CV).
s 100
RSD =
X
n
X=X
i=1 i
2
n
X i X
s = i=1
n 1
52
26

La precisin de un mtodo analtico se estudia sobre:
El sistema: evaluando la dispersin de al menos 10

inyecciones del estndar
El mtodo: evaluando la dispersin de varias
preparaciones (generalmente en un nmeros de 6)
de la muestra preparada segn se indica en el
mtodo.
53

Dentro de la PRECISIN del mtodo se pueden distinguir tres tipos de
estudios:
Repetibilidad:
Mismo
mtodo
muestra
Mismo Laboratorio
Mismo analista que lleva a cabo la validacin
Mismo equipo
En un corto intervalo de tiempo
Reproducibilidad::
Precisin Intermedia::
Mismo mtodo
Mismo mtodo
Misma muestra
Misma muestra
Distinto
i ti t Laboratorio
b
t i
Mismo Laboratorio
Diferente
analista
Diferente analista
Diferente equipo
Diferente equipo
Largos intervalos de tiempo
Mayores intervalos de tiempo
Misma
54
27
EXACTITUD:
La exactitud indica la capacidad del mtodo analtico para
proporcionar resultados lo ms cerca posible del valor verdadero.
verdadero.
Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequea, la

exactitud es buena.
No deben confundirse exactitud y precisin.
La precisin est relacionada con la dispersin de una serie de mediciones,
pero no da ninguna
p
g
indicacin de lo cerca que
q
estn del valor verdadero.
Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo,
para que un mtodo sea exacto se requiere un cierto grado de precisin.
55

Como se determina la Exactitud?
% Recuperacin =
(C1 C2)
C3
x 100
C1: Concentracin de la muestra fortificada

C2: Concentracin de la muestra sin fortificar
C3: Concentracin de fortificacin
56
28
ROBUSTEZ:
Capacidad de un mtodo analtico para que los resultados no se
vean afectados por variaciones en los parmetros del
procedimiento.
Es la resistencia de un mtodo a cambiar los resultados cuando se
realizan desviaciones en las condiciones experimentales descriptas
en el procedimiento.
Ejemplos:
Diferente columna
Cambiar la temperatura
Caudal
pH de la Fase mvil
Cambiar el % de SV orgnico en la FM, etc.
57
LMITES DE DETECCIN Y CUANTIFICACIN:

El propsito es evaluar el mtodo analtico a bajas
concentraciones de analito.
LMITE
DE DETECCIN:
DETECCIN:
Menor concentracin de analito que puede ser detectada pero
no necesariamente cuantificada.
LMITE
DE CUANTIFICACIN:
CUANTIFICACIN:
Menor concentracin de analito que puede ser cuantificada con
una precisin y exactitud adecuada.
58
29
LMITE DE DETECCIN (LoD

(LoD)):
XLoD= Xbl + 3.SDbl
LoD = XLoD - Xbl
LMITE DE CUANTIFICACIN (LoQ

(LoQ)):
XLoQ= Xbl + 10.SDbl
LoQ = XLoQ - Xbl
S
59

Bibliografa disponible en internet:
www.iupac.org
www.iso.org
www.ich.org ( Q2 (R1) Validacin de mtodos
analticos).
www.eurachem.ul.pt
www.fda.gov
www fda gov
www.usp.org (Captulo <1225>).
60
30
ANLISIS POR
INYECCIN EN
FLUJO: FIA
61
Anlisis automticos
La automatizacin es utilizada para reducir los

costos de las operaciones en el laboratorio.
laboratorio.
Permite analizar un mayor nmero de muestras en

cortos intervalos de tiempo
tiempo..
til para todas aquellas situaciones con riesgo de

exposicin (ej
(ej.. muestras radioactivas)
radioactivas)..
Anlisis por Inyeccin en Flujo (Flow Injection

Analysis o FIA) es una tcnica utilizada en
automatizacin..
automatizacin
62
31
Sistemas de Flujo
Sistemas de flujos segmentados:

segmentados:
Las muestras se transportan a travs del sistema hasta el detector por medio de un
flujo acuoso, que contiene burbujas de aire prximas entre s.
Las burbujas de aire evitan la dispersin excesiva de la muestra,
muestra promueven la
mezcla de las muestras y reactivos, y limpian las paredes del tubo (evitando la
contaminacin mutua entre muestras sucesivas).
Un sistema de este tipo para que sea reproducible requiere:

Control estricto en las burbujas de aire, medir las seales cuando la reaccin haya
alcanzado el estado estacionario y tiempos largos de estabilizacin del sistema.
Las burbujas de aire son compresibles, sus tamaos son difciles de calcular con
exactitud, lo que introduce irreproducibilidad en el sistema.
63
Sistemas de flujos no segmentados:
Es el mtodo de flujo continuo que ms se aplica en la actualidad.
Se lo denomina mtodo de inyeccin en flujo continuo no segmentado, (FIA

directamente).
Surge de la eliminacin de las burbujas de aire de los sistemas anteriores.
La ausencia de burbujas proporciona ventajas importantes como son:
Ser un sistema reproducible, ya que no contiene componentes que introducen

variabilidad en la medida, a diferencia de los flujos segmentados que contienen las
burbujas de aire.
En FIA se observa una conveccin reproducible, lo que nos da idnticas condiciones

fsicas y qumicas. Y siempre que el sistema no cambie, no se necesita alcanzar el
estado estacionario de la reaccin para hacer la medicin de la misma.
Velocidades ms rpidas de anlisis (100

(100--300 muestras/hora)
Mejores tiempos de respuesta (menor a un minuto entra la inyeccin y la respuesta del

detector)
Tiempos de puesta en marcha y parada mucho ms rpidos (menos de 5 minutos para

cada uno)
Componentes ms verstiles y sencillos, exceptuando el sistema de inyeccin.

64
32
Componentes:
9 Solucin Carrier: generalmente un buffer.
9 Solucin de reactivo.
9 Bomba peristltica: dispositivo en el que se presiona un fluido (lquido o gas) en el interior de un tubo
plstico mediante unos rodillos.
9 Vlvula
l l tipo T:
T donde
d d se introduce
d
l muestra all flujo
la
fl del
d l carrier.
9 Helicoide de reaccin: el reactivo se difunde dentro del bolo de la muestra originando el producto de
reaccin.
9 Los inyectores y detectores empleados en FIA son similares a los utilizados en HPLC.
9 Los tamaos de muestra en FIA van desde 5 a 200 l (en general 10 a 30l).
9 Es clave la inyeccin rpida de la muestra (como una pulsacin). Las inyecciones no deben perturbar el
flujo de la corriente transportadora.
9 La deteccin en FIA se realiza con instrumentos de absorcin y emisin atmicas,
atmicas fluormetros,
fluormetros
sistemas electroqumicos, refractmetros, espectrofotmetros y fotmetros (ms comunes).
65
Fundamentos:
Despus de la inyeccin de la muestra, la zona de la misma tiene un perfil de concentracin rectangular (a).
Al moverse en el interior del tubo, tiene lugar un ensanchamiento de la banda o dispersin
dispersin..
El perfil de la zona resultante viene determinado por dos fenmenos:
Distribucin en el
tubo
Respuesta en
funcin del
tiempo
1)) Conveccin: resulta del flujo

j laminar qque en el centro del fluido se mueve ms rpido
p qque en el lquido
q
adyacente a las paredes (b).
2) Difusin
Difusin:: dos tipos de difusin: la radial
radial,, o perpendicular a la direccin del flujo, y longitudinal
longitudinal,, o paralela
al flujo. sta ltima no es significativa en tubos estrechos.
3) FIA se suele realizar en condiciones donde la dispersin se produce por conveccin y por difusin radial
(C). La difusin radial desde las paredes hacia el centro deja libres las paredes, eliminando la contaminacin
mutua entre muestras.
66
33
Dispersin
La dispersin D se define como: D = Co / C

Co = concentracin de analito de la muestra inyectada
C = concentracin del pico en el detector.
Se mide inyectando una solucin de colorante de concentracin

conocida Co y luego midiendo la absorbancia en la celda de flujo
continuo.
Mediante una calibracin con patrones del colorante, se calcula C

a partir de la ley de Beer
Beer..
El coeficiente de dispersin
p
es muyy til ya
y que
q permite
p
comparar
p
diferentes sistemas de FIA. Adems permite monitorear el grado
de dilucin que sufre la muestra al hacer algn cambio en el
sistema.
67
Dispersin
La dispersin est influenciada por tres variables interrelacionadas y controlables,

denominadas volumen de muestra, longitud del tubo y velocidad de bombeo.
bombeo.
Para volmenes grandes de muestra, la dispersin llega a la unidad, ya que no

h dil
hay
dilucin
i del
d l analito
lit en ell carrier.
rri r E
En FIA se tr
trabaja
b j con valores
l r dde
dispersin mayores a 1, que permiten el mezclado entre muestra, carrier y
reactivo.
En b se analiza el efecto de la
longitud del tubo. A mayor longitud de
tubo mayor Dispersin.
las variaciones en las velocidades de
bombeo en el sistema, no influyen en la
dispersin.
68
34

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Espectroscopa

Los valores de a, E (1 %, 1 cm) y , a una longitud de

LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER

A = log [( P0' + P0 '' ...) / ( P0 '10a'bc + P0 ''10a''bc...)]

reacciones cido base

Amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgnicos como inorgnicos

DETERMINACIN DE CONSTANTES DE DISOCIACIN DE INDICADORES CIDOBASE

H3O+ + InForma bsica

Ka = [ In- ]eq [ H+ ]eq .

Absortividad de InH a 520 nm (a520 InH)

Absortividad de In- a 520 nm (a520 In-)

Absortividad de InH a 430 nm (a430 InH)

Absortividad de In- a 430 nm (a430 In-)

Agua destilada c.s.p.

Abs520 nm = a520InH.b.(cc InH) + a520In-.b.(cc In-)

Cc InH = . (a430In- . Abs520) (a520In- . Abs430) .

Cc. InH (g/L)

Cc. In- (g/L)

Tienen un lmite de deteccin del orden de partes por billn y un

Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como mtodo de

Su utilidad est limitada, por el hecho de que pocas especies

Estado doblete : es el estado fundamental de un radical libre, tiene

Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado

Las propiedades de una molcula en estado triplete

2. Procesos de desactivacin (a)

Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental

dos de ellas son la fluorescencia y la fosforescencia que conllevan la

Las otras etapas de desactivacin indicadas por flechas onduladas, son

El camino ms propicio hacia el estado fundamental es aquel que

La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente

Esquema de procesos de excitacin y

Procesos de desactivacin (b)

Debido a la alta eficiencia de la

Variables que afectan a la fluorescencia y

Rendimiento cuntico o eficiencia cuntica

El rendimiento cuntico de fluorescencia de un compuesto, puede calcularse a partir

nn de molculas que fluorescen

2. Factores estructurales (a)

La fluorescencia ms intensa la presentan los compuestos que tienen grupos

Tambin pueden presentar fluorescencia, compuestos que contienen grupos carbonilo

La mayora de los compuestos aromticos no sustituidos son fluorescentes en solucin

En los hidrocarburos aromticos, los sustituyentes dadores de electrones como los

La falta de rigidez en la molcula, favorece la desactivacin no radiante a travs de la

Ciertos agentes quelantes orgnicos, fluorescen mas intensamente al estar complejados

Se puede incrementar la fluorescencia adsorbiendo la molcula a un soporte slido.

4. Influencia del solvente

6. Efecto del oxigeno disuelto

El oxigeno suele disminuir la intensidad de fluorescencia.

La potencia de emisin fluorescente F es proporcional

P0 es la potencia que incide sobre la muestra y P es la

es la absortividad molar de las molculas

El trmino exponencial puede desarrollarse como

Si bc es pequeo solo el primer trmino del polinomio es

La alta sensibilidad se debe a que el poder de fluorescencia se puede medir

Su especificidad resulta de la necesidad de conjugar dos espectros: el de

Casi todos los instrumentos de

Figura 5. Esquema de un fluormetro o

Hay de dos tipos, los que tienen un filtro para

Componentes de los equipos

dde arco dde alta

Existen dos tipos de mtodos:

2. Determinacin de especies orgnicas

Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos,