Diagnstico Molecular de Virus

Patgenos al ser Humano

Olga R. Torres, M. Sc.

Laboratorios de Microbiologa y Virologa
Dr. Leonardo Mata, INCAP

Objetivos de esta charla

Describir las tecnologas moleculares
actuales
La aplicacin de las mismas
Lista de mtodos aprobados por el FDA
como pruebas diagnsticas en
enfermedades infecciosas
El futuro del diagnstico viral molecular

Por qu diagnstico Molecular?

Deteccin y Diagnstico
De agentes no cultivables o difciles de cultivar
Necesidad de un resultado rpido
Mtodos bioqumicos inadecuados

Pronstico y tratamiento
Necesidad de informacin cuantitativa (carga
viral)

Deteccin de genes de resistencia

pruebas de susceptibilidad (resistencia a
drogas) sin cultivo

Infeccin por Hepatitis A

Anti-HAV Total

Sntomas

Titulo

VHA
Anti-HAV

IgM

12

Semanas post-exposicin

Infeccin Aguda se diagnostica por la deteccin de

IgM anti-HAV en suero por EIA.
Infeccin Pasada, i.e., inmunidad, se diagnostica
por la deteccin de anti- HAV-IgG por EIA.

Examen directo
1. Deteccin antignica

inmunofluorescencia, ELISA etc.

2. Microscopa Electrnica

morfologa viral
inmuno-microscopa electrnica

3. Microscopia de luz

apariencia histolgica
cuerpos de inclusin

4. Mtodos moleculares

hibridizacin con sondas

especficas
Reaccin en cadena de polimerasa
(PCR)

Mtodos moleculares: utilidad

Diagnstico Inicial
Pronstico de la Enfermedad
Monitorear la respuesta teraputica
Nuevos mtodos moleculares
complementan ms que sustituyen a los
mtodos diagnsticos convencionales:
incrementan significativamente los
costos para el presupuesto del
laboratorio

El mayor impacto del uso de los

mtodos moleculares ha sido en:
Virologa Clnica
Patgenos previamente no reconocidos
o no cultivables

Patgenos identificados por mtodos

moleculares
Virus de hepatitis C (Hepatitis No-A, noB hepatitis)
Sndrome pulmonar por Hantavirus: el
virus Sin nombre
Sarcoma de Kaposi: Herpesvirus
humano 8
SARS: coronavirus detectado por
microarrays en Stanford University

Nuevos Estndares de Oro

Pruebas basadas en cidos nucleicos
Hepatitis C
Meningitis por Enterovirus
Bordetella pertussis
Encefalitis por virus Herpes simplex
Infecciones genitales con C. trachomatis

Qu requieren los mtodos

moleculares?
Procesamiento de la muestra
Amplificacin de cidos nucleicos
Hybridizacin de cidos nucleicos
Deteccin del producto

Recoleccin y manejo de la muestra

Tiempo de recoleccin de la muestra en
relacin al status de la enfermedad y
transporte apropiado de la muestra
Deteccin de virus dengue requiere que la
muestra se tome durante los primeros tres
das de iniciado el proceso febril, y que se
maneje en cadena de fro

Anticoagulante apropiado, uso de

medios de transporte, temperatura de
almacenaje

Procesamiento de la Muestra
Extraccin de cidos Nucleicos
ADN
ARN
mARN

Inhibidores de los mtodos

Moleculares

Hemoglobina
Cristales
Gonadotropina corinica humana
Nitratos
Heparina

Sondas de Acidos nucleicos no

amplificadas (Hibridizacin)
Las sondas de cidos nucleicos son
segmentos de ADN ARN marcados
con radioistopos, enzimas, o molculas
reportero (quimioluminiscentes) que se
unen a secuencias complementarias del
cido nucleico blanco

Hibridizacin de Sondas
El ADN de doble hebra (DS AND) se
desnaturaliza en hebras simples (SS
ADN)
El ADN blanco de hebra simple puede
unirse formando puentes de hidrgeno
con una sonda complementaria

Ensayo de Proteccin de Hibridizacin

Seleccin/Deteccin

Sonda Hibridizada

Sonda No Hibridizada

La reaccin
en cadena de
Polimerasa
(PCR)

Componentes del PCR (Master Mix)

Primers o iniciadores: Par de olignoucletidos
sintticos (en conc. excesiva) que flanquean la regin
blanco a ser amplficiada
Buffer
Mg2+
dNTPs, (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
DNA (Taq) polymerasa o similar
Aditivos: +/- aceite mineral, hot start PCR, etc.

Agregar el ADN blanco a la mezcla maestra

Mtodos con amplificacin gentica (1)

Seal
Sondas de ADN ramificadas (bDNA)
Sistema de amplificacin Sondas de ADN
ramificadas
Blanco de cido nucleico ADN y ARN
VIH-1, ADN VHB, VHC ARN

Captura Hbrida
Digene
Sistema de amplificacin Anti-ADN-ARN
anticueropo hbrido
Blancos de Acido Nucleico DNA y RNA
VHB, VPH, CMV

Mtodos con amplificacin gentica (2)

Molcula blanco
Reaccin de polimerasa en cadena (PCR)
Nucleic acid sequence-based amplification
(NASBA)
Transcription-mediated amplification (TMA)
Strand Displacement Amplification (SDA)

PCR (1)
RT-PCR
PCR de transcriptasa Reversa desarrollado
para amplificar el ARN blanco
cDNA producido del blanco, amplificado
Dos enzimas
Transcriptasa reversa termolbil
AND polimerasa termoestable (Thermus
thermaophilus)

ARN de VHC, cuantificacin de VIH-1 y

ARN de VHC

PCR (2)
PCR anidados
Dos pares de primers de amplificacin

PCR Multiplex
Dos o ms sets de primers se disean para
amplificar diferentes blancos
Dengue virus 1, 2, 3 y 4

PCR de tiempo real

La amplificacin del blanco y los pasos de
deteccin ocurren simultneamente en el
mismo tubo de reaccin

Deteccin del Producto (post-amplificacin)

Anlisis en Gel
Sistemas de placa Colorimtricos
PCR de tiempo real
Secuenciacin directa
Microarrays de ADN

Electroforesis en gel: Bromuro de Etidio tie y

con transiluminacin UV para visualizar los
fragmentos
Ctrl

Hay una relacin logartmica

entre el tamao del fragmento
del AND y la distancia que
migra en un gel, con esto se
puede construir una curva
estndar y calcular el tamao
de las molculas.

Pronstico de la Enfermedad (1)

Carga viral es un mejor predictor de la
progresin del VIH que el nmero de
linfocitos CD4+
Subtipificacin de ciertos virus por
mtodos moleculares tiene valor
pronstico
VPH tipos 16 y 18 asociado con alto riesgo
de progresin a neoplasia

Pronstico de la Enfermedad (2)

La carga viral de CMV
es til para decidir cundo iniciar
tratamiento en pacientes receptores de
transplante de rganos
Sirve para distinguir entre enfermedad
activa y latente

Respuesta a Terapia
Predice la respuesta a terapia antiviral
Carga Viral (HBV y HCV)
Genotipificacin (mutaciones droga R en
HIV-a RT y proteasas)
Pruebas cuantitativas para ARN de HIV-1
Prctica estndar para guiar a los clnicos en el
inicio, monitoreo y cambio de terapia
antiretroviral

Pruebas diagnsticas aprobadas por

FDA para Enfermedades Infecciosas (1)
Deteccin de VHC
RT-PCR/Roche

Cuantificacin de VIH (Standard y

ultrasensible)
RT-PCR/Roche; NASBA/BioMrieux

Pruebas diagnsticas aprobadas por

FDA para Enfermedades Infecciosas (2)
Genotipificacin de R de VIH
Secuenciacin CLIP /Gentica Visible

Deteccin de VPH
Captura hbrida/Digene

Deteccin de M. tuberculosis
TMA/Gen-Probe; PCR/Roche

Pruebas diagnsticas aprobadas por

FDA para Enfermedades Infecciosas (3)
Deteccin de Gardnerella, Trichomonas,
y Candida
Hybridizacin/Becton Dickinson

Deteccin de CMV
Captura hbrida/Digene; NASBA/
BioMrieux

Ausentes de la lista aprobada por FDA

Pruebas que en pases desarrollados se
han convertido en estndares del
cuidado
Encefalitis por HSV
Meningitis por Enterovirus
Pertussis

Control de Calidad
% Contaminacin
Definir limitaciones
Desempeo en diversos especmenes
con varias sustancias interferentes.
No interferencia con PCR de tiempo real
que difiere de la PCR tradicional
(fluorescencia en lnea base y
condiciones de ciclos)

Otros aspectos a verificar

Utilidad Clnica
Acuerdo con estado de
enfermedad
Sensibilidad/Especificidad
Facilidad de uso
Costo/beneficio
Competencia del Operador

Microarrays: diferentes
plataformas

Microarrays de virus
Control

Experimento

mARN
celular

Preparacin del
microarray

RT PCR,
fluorescencia con
Cy3 (verde) y
Cy5 (rojo)

Se hibrida con el
microarray

cDNA microarray

Scan

Micro Arrays de Virus: Introduccin

Para tener un tratamiento viral efectivo,
se necesita identificar y caracterizar al
patgeno
El diagnstico por microarrays ofrece un
mtodo sencillo, no muy exigente y
potencialmente til para detectar varios
virus en paralelo (a diferencia del PCR)

Diseo de Oligonucletidos para microarrays

Los oligos sonda (70-mer) deben
dirigirse a las regiones conservadas en
familias

La familia picornaviridae fue dividida en gneros porque es

muy grande y abarca algunos de los virus ms prevalentes

Probando el microarray
Los autores infectaron clulas HeLa con
Adeno12, Parainfluenza 3, RSV, Polio 1,
o Rhino 2 para probar si el cDNA
derivado de las clulas infectadas
hibridizaba con el array

El futuro: qu significa lo anterior?

Se concibe un sistema similar al cdigo
de barras para correlacionar patrones
de hibridacin a virus especficos

El futuro: Cun til es el microarray viral?

El 23 de marzo de 2003, virlogos del
Centers for Disease Control and
Prevention dieron a DeRisi (autores del
virus microarray) un cultivo del virus
desconocido que pareca estar
causando SARS.
A las 24 horas siguientes, el lab DeRisi
haba clasificado al virus como un
Corona Virus.