1 PDF

UNIVERSIT MOHAMMED V AGDAL
FACULT DES SCIENCES

Rabat
N dordre : 2298
THSE DE DOCTORAT
Prsente par
Ibtissam EL-HILALI
Discipline : Biologie
Spcialit : Microbiologie et Biologie Molculaire
LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LUPIN :
BIODIVERSIT DES MICROSYMBIOTES
ET MISE EN EVIDENCE DUNE MULTI-INFECTION
NODULAIRE chez LUPINUS LUTEUS
Soutenue le 25 / 03 / 2006
Devant le jury :
Mr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF
Prsident
Professeur, Facult des Sciences, Rabat

Mme Fatiha BRHADA
Mr. Bernard DREYFUS
Directeur de recherche, IRD, Montpellier, France
Mme Imane THAMI-ALAMI
Directeur de recherche, INRA, Rabat
Mr. Chaouki AL FAIZ
Examinateurs
UNIVERSIT MOHAMMED V AGDAL

FACULT DES SCIENCES
Rabat
THSE DE DOCTORAT
Prsente par
Ibtissam EL-HILALI
Discipline : Biologie
UFR : SV 02/98
Responsable de lUFR : Professeur Abdelkarim Filali Maltouf
Priode daccrditation : 1998/2006
Titre de la thse : La symbiose Rhizobium Lupin : Biodiversit des
Microsymbiotes et mise en vidence dune Multi-Infection Nodulaire chez Lupinus
luteus
RESUME
Ce travail a t ralis afin dvaluer la diversit gntique et phnotypique qui existe au
sein dune collection de cent cinquante neuf symbiotes isols partir des nodosits de six
espces de lupin issues de diffrentes rgions du Maroc.
La PCR/REP a rvl un grand niveau de polymorphisme molculaire entre les isolats.
Cette technique nous a permis de mettre en vidence la possibilit dune infection multiple
chez Lupinus luteus.
Toutes les souches sont infectives vis--vis de L. luteus. Lefficience relative, comprise
entre 60% et 80%, sest rvle plus importante avec les symbiotes isols des espces
sauvages.
La croissance rapide des souches ainsi que lassimilation des substrats carbons a rvl des
profils comparables ceux du Rhizobium. A loppos, elles se sont rvles, comme les
Bradyrhizobium, trs rsistantes aux mtaux lourds et aux antibiotiques.
Une large tolrance au NaCl, au pH et la temprature a t note pour lensemble de la
collection. La moiti des souches ont pu hydrolyser lure et rduire le nitrate.
LARDRA a rvl une grande diversit entre les souches et a confirm la distinction du
genre Bradyrhizobium.
Nous avons pu reprer, sur la base du potentiel fixateur dazote et la tolrance lalcalinit,
des candidats trs performants qui ont t utiliss pour des inoculations au champ.
Mots-clefs : Lupinus rhizobium Biodiversit REP ARDRA
N dordre : 2298
UNIVERSITE MOHAMMED V AGDAL

FACULTE DES SCIENCES
RABAT
THESE
Prsente par :
Ibtissam EL-HILALI
Pour lobtention du DOCTORAT
LA SYMBIOSE RHIZOBIUM-LUPIN :
BIODIVERSIT DES MICROSYMBIOTES
ET MISE EN EVIDENCE DUNE MULTI-INFECTION
NODULAIRE chez LUPINUS LUTEUS
Soutenue le 25 / 03 / 2006
Devant la commission dexamen :
Mr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF
Prsident

Mme Fatiha BRHADA
Mr. Bernard DREYFUS
Directeur de recherche, IRD, Montpellier, France
Mme Imane THAMI-ALAMI
Mr. Chaouki AL FAIZ
Examinateurs
PREAMBULE
Le travail prsent ici a t ralis dans le laboratoire de Microbiologie et Biologie
Molculaire la Facult des Sciences, Universit Mohammed V - Agdal Rabat, en
collaboration avec lunit de recherche Amlioration, Conservation et Valorisation
des Ressources Gntiques lINRA de Rabat.
Ce travail a bnfici du soutien financier dans le cadre du :
- Projet PROTARS N P5T2/13 (Valorisation de le culture du lupin dans les
sols calco-alcalins du Maroc par lexploitation du potentiel fixateur dazote de
la symbiose Bradyrhizobium lupin).
- Projet AIRE dveloppement/I.R.D. 01-2-MAR-28-1.
Il a t prim lors de manifestations scientifiques nationale et internationale.
Publications
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2003.
Characterization of Lupinus rhizobia isolated from Moroccan soils. In Lupin-high protein plant of
XXI century, Sciences Academy of Wroclaw, Pologne N 495.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. Etude de la

variabilit molculaire et phnotypique de rhizobia isols dun mme amas nodulaire de Lupinus
luteus. Proceedings of the Symposium Applications Biotechnologiques de la Fixation
Symbiotique de lAzote, Hammamet, Tunisie, Dcembre 2002 INRST -Tunisie (sous press).

Evidence of the presence of genetically different rhizobial strains in one root nodule of lupine.
Journal of Agronomy (Soumis).
Communications orales
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. Analyse
physiologique et molculaire des symbiotes du lupin. 3me Congrs National de Biologie et
Biologie Molculaire. Tanger, Maroc, 18-20 Dcembre 2003.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A.
Caractrisation phnotypique et molculaire des rhizobia nodulant le lupin au Maroc. 1re
Rencontre du Ple de Comptence MiSoBioP. Fs, Maroc, 10-11 Dcembre 2004.
Communications dans les Collogues, Seminaires et Congrs

A lchelle internationale

Characterization of rhizobia from one nodule obtained from Lupinus luteus cultivated in north
Morocco. Presented in the 5th European Nitrogen Fixation Conference, organised by Norwich
University, Norwich, Angleterre.

Caractrisation phnotypique et molculaire de souches de Bradyrhizobium nodulant le lupin au
Maroc, prsent aux 8mes Journes Scientifiques du Rseau Biotechnologies, Amlioration des
plantes et Scurit Alimentaire, organises par lAgence Universitaire de la Francophonie,
Octobre 2002, Marrakech.

Characterization of Lupinus rhizobia isolated from Moroccan soils, presented in the Conference
Lupin-high protein plant of XXI century., organised by the Polish Lupine Association, KudowaZdroj, Pologne.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004. Diversity

of indigenous rhizobia nodulating Lupinus spp. in Morocco, Presented in the 6th European
Nitrogen Fixation Conference, Toulouse, France.
A lchelle nationale
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2003. Etude de

la diversit gntique et phnotypique dune collection marocaine de rhizobium nodulant le lupin
3me Congrs National de Gntique et Biologie Molculaire. Dcembre 2003, Tanger.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004.

Caractrisation phnotypique et molculaire de rhizobia nodulant le lupin au Maroc. Projet
fdrateur - Axe lupin. Premire rencontre Nationale du Ple de Comptences en Microbiologie
des Sols et Biotechnologie des Plantes, Communication orale, Dcembre 2004, Fs.
EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004.

Sminaire International : le dveloppement des cultures fourragres : une ncessit pour
amliorer les productions animales et attnuer la dgradation des ressources naturelles, Mars
2004, INRA, Rabat.
Prix reus
Prix du meilleur poster. 5th European Nitrogen Fixation Congress. Norwich, Angleterre, 6 - 10
Septembre 2002.
Prix du meilleur poster et de communication orale. 3me Congrs National de Biologie et
Biologie Molculaire. Tanger, Maroc, 18 - 20 Dcembre 2003.
AVANT-PROPOS
Les travaux prsents dans cette thse ont t raliss dans le Laboratoire de Microbiologie et
Biologie Molculaire la Facult des Sciences, Universit Mohammed V - Agdal Rabat.
Au terme de ce travail, jaimerai exprimer mon profond remerciement mon professeur Fatiha
Brhada, Professeur la Facult des sciences de Rabat, pour le grand honneur quelle ma fait en
acceptant de diriger ce travail, pour ses recommandations et ses discussions perspicaces ainsi que
pour ses conseils qui ont beaucoup enrichi non seulement ma recherche au sein du laboratoire
mais galement diffrents aspects de ma vie.
Mon apprciation et ma gratitude vont aussi mon professeur Abdelkarim Filali-Maltouf, Chef
du Laboratoire de Microbiologie et Biologie Molculaire la Facult des sciences de Rabat,
pour avoir accept de prsider ce jury mais surtout pour mavoir accept au sein de son
laboratoire, pour avoir cru en moi, pour ses encouragements et pour son implication et les
conseils scientifiques quil ma accords.
Ma gratitude va Mme Imane Thami-Alami, Directeur de recherche et Chef du Centre Rgional
de la Recherche Agronomique Rabat, pour avoir accept de juger ce travail, pour ces vifs
encouragements et pour son amiti.
Ma gratitude va Mr Chaouki El Faiz, Directeur de recherche et Coordinateur de lUnit de
Recherche Amlioration, Conservation et Valorisation des Ressources Gntiques lInstitut
National de Recherche Agronomique de Rabat, pour avoir accept de participer au jury de cette
thse et pour son amabilit.
Je suis trs reconnaissante Mr Bernard Dreyfus, Directeur de recherche (DR 1) et Directeur
dUMR lInstitut National de Recherche pour le Dveloppement (IRD) Montpellier, France,
pour avoir accept aimablement de juger ce travail et de participer au jury de cette thse.
Je tiens remercier galement les professeurs El Bekkay Berraho, Jamal Aurag, Bouchra
Belkadi, Ilham Bouhmouch et Jamila Matallah pour leur sympathie et leurs encouragements,
ainsi que toutes les amies au sein du laboratoire LMBM et toutes celles que jy ai rencontr :
Najlae Elafi, Farah Ait Ouhmane, Salwa Moussaid, Loubna Temsamani, Nargisse Bennani,
Siham Brhada, Bouchra Mouhcine, Nezha Mlaiji, Amina Sorouri, Laila Medraoui, Leila Sbabou
et Fatiha El Maghi.
Je remercie galement tous (es) les amis (es) que jai rencontr lINRA de Rabat et au
CNESTEN.
Mes vifs remerciements reviennent Jamaleddine El Jamali et Ibrahim Konat pour tre de trs
bons amis et pour avoir t l chaque fois que javais besoin deux.
Mes trs spciaux remerciements reviennent mes trs chres amies : Lamiae Filali, Amal
Berkia, Amine Bradley et Emane Michle Majdoline pour tous les moments partags ensemble,
pour leurs soutien et leurs mots encourageants et pour leur amiti sincre.
Finalement, mon plus grand merci revient ma mre Amina Jad et mon pre Houssine El Hilali
et toute ma grande famille pour le pouvoir de leur amour sur moi, pour tre leur fiert, et pour
me faire sentir dtre si spciale pour eux.
LISTE DES ABREVIATIONS

ADN
AFLP
Ap-PCR
ARDRA
ARNt
BSA
BTB
bv
CEC
DAF
dNTP
DO
EDTA
EPS
ER
ERIC
FAME
G+C
H2SO4
HCl
HgCl2
hsn
IGS
ITCF
ITS
K2O
KCl
KNO3
LCO
LPS
LSU
M
MES
MgCl2
min.
MLEE
mm cm - m
MO
N2
NaCl
NaOH
NH3
nod
P2O5
Acide deoxyribonuclique
Amplified fragment length polymorphism
Arbitrarily primed PCR
Amplified ribosomal DNA restriction analysis
ARN de transfert
Srum Albumine Bovine
Bleu de bromothymol
Biovar
Capacit dchange cationique
DNA amplification fingerprinting
Dsoxyribonuclotides triphosphate
Densit optique
Acide thylnediaminottraactique
Exopolysaccharides
Efficience relative
Enteric Repetitive Intergenic Consensus
Fatty Acid Methyl Electrophoresis
Guanine + Cytosine
Acide sulfurique
Acide chlorhydrique
Chlorure mercurique
Gnes de la spcificit de lhte
Espace intergnique
Institut Technique des Crales et des Fourrages
Espace intergnique transcrit
Oxyde de potassium
Chlorure de potassium
Nitrate de potassium
oligosaccharide de Lipo-chitine
Lipopolysaccharide
Grande sous unit
Molaire
2- (N-morpholino)-ethanesulfonic acid
Chlorure de Magnsium
Minutes
Multilocus enzyme electrophoresis
Millimtre centimtre mtre
Matire organique
Nitrogne
Chlorure de sodium
Hydroxyde de sodium
Nitrate
Gnes de nodulation
Super oxyde de phosphore
pb
PCR
PFGE
ppm
pSym
RAPD
REP
RFLP
RNA
SDS
SDS-PAGE
SSU
TBE
TY
UPGMA
USDA
v/v
w/v
YEM
Paire de base
Raction en chane par polymrase
Pulsed field gel electrophoresis
Partie pour millions
Plasmide symbiotique
ADN amplifi de manire alatoire
Squence rptitive extragnique palindromique
Polymorphisme de la longueur des fragments de restriction
Acide ribonuclique
Sodium Dodecyl Sulfate
Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrilamide gel electrophoresis
Petite sous unit
Tris Acide borique EDTA
Tryptone Yeast Extract
Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean
United States Department of Agriculture
Volume par volume
Poids par volume
Yeast Extract Mannitol
LISTE DES FIGURES

Figure 1 :
Rduction de lazote molculaire et conversion du NH3 en formes dacides 14

amins assimils par la plante
Figure 2 :
Organisation de lopron de lADN ribosomique observ chez les 34

procaryotes
Figure 3 :
Rsolution taxonomique des diffrentes techniques utilises pour ltude 41

de la diversit des rhizobiums
Figure 4 :
Arbre phylogntique des rhizobiums et des espces apparentes 44

construite par la mthode du neighbor joining partir de la squence
complte de lADNr 16S
Figure 5 :
Position gographique des zones de prospection
58
Figure 6 :
Extraction de lADN gnomique par la mthode de la lyse alcaline
69
Figure 7 :
Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP de quelques souches 69

nodulant le lupin
Figure 8 :
Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des souches nodulant 71

le lupin
Figure 9 :
Coupe longitudinale de lamas nodulaire
74
Figure 10 : Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP des souches de 76

lamas nodulaire
Figure 11 : Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des 14 souches de 76
lamas nodulaire
Figure 12 : Photo indiquant des plantes de Lupinus luteus inocules compares au 83
control ngatif et au control fertilis par du KNO3
Figure 13 : Forme de nodosits obtenues sur Lupinus luteus inocul par la souche 85
MSMC 5419 (A) et la souche INRA L23 (B)
Figure 14 : Infectivit des souches nodulant le lupin value sur L. luteus
86
Figure 15 : Efficience relative des souches nodulant le lupin value huit semaines 86
aprs linoculation des plantes
Figure 16 : Croissance des souches nodulant le lupin value dans le milieu YEM
91
Figure 17 : Assimilation de diffrents substrats carbons par les souches nodulant le 94

lupin
Figure 18 : Dendrogramme indiquant les affinits dassimilation entre les souches 97
nodulant le lupin
Figure 19 : Effet des antibiotiques sur la croissance des souches nodulant le lupin
102
Figure 20 : Effet des mtaux lourds sur la croissance des souches nodulant le lupin
108
Figure 21 : Tolrance des souches de lupin diffrentes concentrations en NaCl
112
Figure 22 : Tolrance aux pH des souches nodulant le lupin
119
Figure 23 : Tolrance des souches nodulant le lupin diffrentes tempratures
122
Figure 24 : Phnogramme indiquant les similarits phnotypiques entre les souches 127
nodulant le lupin issues de diffrentes rgions du Maroc sur la base de
lanalyse numrique
Figure 25 : Profil de la bande de lADNr 16S de quelques souches nodulant le lupin
138
Figure 26 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S 138

obtenus pour quelques souches de rfrences aprs la digestion par les
endonuclases HhaI (A), MspI (B), HinfI (C) et TaqI (D)
obtenus pour quelques souches de lamas nodulaire aprs la digestion par
les endonuclases HhaI (A), MspI (B), HinfI (C) et TaqI (D)
obtenus pour quelques souches nodulant le lupin aprs la digestion par les
endonuclases HhaI (A), MspI (B), HinfI (C) et TaqI (D)
Figure 29 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position 147
phylogntique des souches de rfrences utilises sur la base de la
PCR/RFLP de lADNr 16S
Figure 30 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position 149
phylogntique des souches nodulant le lupin et des souches de rfrences
sur la base de la PCR/RFLP de lADNr 16S
LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 :
Classification actuelle des diffrentes espces de rhizobia
47
Tableau 2 :
Liste des diffrents sites gographiques de prlvement
58
Tableau 3 :
Analyse minrale et granulomtrique des sols collects
59
Tableau 4 :
Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin et dans 62

chaque site
Tableau 5 :
Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin selon les 63
prospections menes par lINRA de Rabat
Tableau 6 :
Liste des souches slectionnes partir des diffrents clusters dlimits 73

par lanalyse PCR/REP
Tableau 7 :
Temps de gnration des souches nodulant le lupin et pH final du milieu 89

de culture
Tableau 8 :
Raction des souches nodulant le lupin sur le milieu YEM+BTB
Tableau 9 :
Pourcentage dassimilation de diffrents types de carbohydrates par les 95

souches nodulant le lupin
Tableau 10:
Hydrolyse de lure et rduction du nitrate par les souches nodulant le 99

lupin
Tableau 11 :
Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin diffrents types 103

dantibiotiques
Tableau 12 :
Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin aux mtaux lourds
Tableau 13 :
Marge de tolrance des rhizobia nodulant le lupin au NaCl, au pH et la 113

temprature
Tableau 14 :
Souches slectionnes pour les inoculations
Tableau 15 :
Rsultats des tests phnotypiques diffrenciant entre les souches 125

nodulant le lupin des diffrents clusters forms par lanalyse UPGMA
Tableau 16 :
Liste des souches de rfrences utilises
Tableau 17 :
Squences des deux amorces utilises pour lamplification de lADNr 135

16S
93
106
123
132
Tableau 18 :
Tableau indiquant le site de clivage de la squence nuclotidique 137

spcifique reconnue par les quatre enzymes de restriction utilises
Tableau 19 :
Groupes de ribotypes des souches de rfrences utilises dtermins par 143

lanalyse PCR/RFLP du gne de lADNr 16S
Tableau 20 :
Groupes ribotypes des souches nodulant le lupin dtermins par 144

lanalyse PCR/RFLP du gne de lADNr 16S
Tableau 21 :
Groupes de souches nodulant le lupin formant les diffrents clusters 150

dlimits par la PCR/RFLP du gne de lADNr 16S par rapport la
plante et la rgion dorigine.
LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 :
Paramtres climatiques des sites chantillonns
190
Annexe 2 :
Composition du milieu YEM
191
Annexe 3 :
Coloration de Gram
191
Annexe 4 :
Composition du milieu TY
192
Annexe 5 :
Prparation des solutions du tampon de lyse
192
Annexe 6 :
Composition du tampon TE
192
Annexe 7 :
Composition du tampon de charge
193
Annexe 8 :
Composition du tampon TBE
193
Annexe 9 :
Prparation du Bromure dEthidium
193
Annexe 10 :
Composition de la solution nutritive sans azote
194
Annexe 11 :
Prparation de la solution du BTB
194
Annexe 12 :
Mthode de prparation des solutions dantibiotiques et leur mode

daction
195
Annexe 13 :
Profil dassimilation de 49 substrats carbons par les souches nodulant 196

le lupin
Annexe 14 :
Tolrance des rhizobia nodulant le lupin diffrentes concentrations

du NaCl.
202
RESUME
Ce travail a t ralis afin dvaluer la diversit gntique et phnotypique qui existe au sein
dune collection de cent cinquante neuf symbiotes isols partir des nodosits de six espces de
lupin issues de diffrentes rgions du Maroc.
La PCR/REP a rvl un grand niveau de polymorphisme molculaire entre les isolats. Cette
technique nous a permis de mettre en vidence la possibilit dune infection multiple chez
Lupinus luteus.
Toutes les souches sont infectives vis--vis de L. luteus. Lefficience relative, comprise entre
60% et 80%, sest rvle plus importante avec les symbiotes isols des espces sauvages.
La croissance rapide des souches ainsi que lassimilation des substrats carbons a rvl des
profils comparables ceux du Rhizobium. A loppos, elles se sont rvles, comme les
Bradyrhizobium, trs rsistantes aux mtaux lourds et aux antibiotiques.
Une large tolrance au NaCl, au pH et la temprature a t note pour lensemble de la
collection. La moiti des souches ont pu hydrolyser lure et rduire le nitrate.
LARDRA a rvl une grande diversit entre les souches et a confirm la distinction du genre
Bradyrhizobium.
Nous avons pu reprer, sur la base du potentiel fixateur dazote et la tolrance lalcalinit, des
candidats trs performants qui ont t utiliss pour des inoculations au champ.
Mots cls: Lupinus rhizobium Biodiversit REP ARDRA
SUMMARY
This study was made to assess the genetical and phenotypical diversity of one hundred and fifty
nine symbiotes isolated from six Lupinus species harvested in different geographical regions of
Morocco.
The REP/PCR method revealed a high polymorphism among the isolates. It helped to identify a
multiple infection process of Lupinus luteus.
Symbiotic data indicated that all strains were infective with L. luteus. Relative efficiency ranging
between 60% and 80% was higher with symbiotes isolated from the wild species.
The fast growth rate of the strains and their carbohydrates assimilation results showed profiles
similar to those of Rhizobium. However, they were highly resistant to heavy metals and
antibiotics like Bradyrhizobium.
The whole bacterial collection showed a wide range of tolerance to NaCl, pH and temperature.
Half of the strains were scored to have a positive reaction for urea hydrolysis and nitrate
reduction.
ARDRA analyses indicated a great diversity among the strains and confirmed that they were
distinct from the genus Bradyrhizobium.
We were able, on the basis of the nitrogen fixing potential and the tolerance to alkalinity, to
recover useful candidates for field inoculations.
Keywords: Lupinus rhizobium Biodiversity REP ARDRA
Sommaire
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 - REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1 APERU GENERAL SUR LE PROCESSUS DE LA 9

SYMBIOSE
1. 1 Mcanismes et spcificit de la reconnaissance 9
symbiotique
1. 2 Initiation et dveloppement nodulaire
12
2- SYMBIOSE LUPIN - RHIZOBIUM
16
2.1 Aperu gnral sur la Plante
16
2. 1. 1- Taxonomie et caractristiques du genre Lupinus
16
2. 1. 2- Le lupin au Maroc
18
2. 1. 2. 1- Caractristiques botaniques
18
2. 1. 2. 2- Ecologie
18
2. 1. 2. 3- Exploitation
19
2. 2 - Aperu gnral sur le partenaire microbien
20
3 - BIODIVERSITE DES RHIZOBIUMS
21
3. 1 Mthodes dtude de la diversit
22
3. 1. 1 Les marqueurs phnotypiques
22
3. 1. 1. 1 - La croissance
22
3. 1. 1. 2 - Les critres symbiotiques
23
3. 1. 1. 3 - Utilisation des sources de carbone
24
3. 1. 1. 4 - Tolrance la salinit
25
3. 1. 1. 5 - Tolrance au pH
26
3. 1. 1. 6 - Tolrance la temprature
27
3. 1. 1. 7 - Rsistance intrinsque aux antibiotiques
28
Sommaire
2
.
3. 1. 1. 8 - Rsistance intrinsque aux mtaux lourds
29
3. 1. 2 - Les marqueurs molculaires
30
3. 1. 2. 1 Le pourcentage en nuclotides G+C
30
3. 1. 2. 2 Le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (RFLP)
30
3. 1. 2. 3 Llectrophorse en champ puls (PFGE)
31
3. 1. 2. 4 Mthodes utilisant des amorces alatoires (RAPD AP-PCR DAF)
31
3. 1. 2. 5 Le polymorphisme de la longueur des fragments amplifis (AFLP)
32
3. 1. 2. 6 - Les squences rptitives (REP, ERIC et BOX)
32
3. 1. 2. 7 - Les gnes ribosomiques
33
3. 1. 2. 8 - Les gnes symbiotiques
35
3. 1. 2. 8. 1 - Les gnes nif
35
3. 1. 2. 8. 2 - Les gnes nod
35
3. 1. 2. 9 - Le squenage
36
3. 1. 2. 10 - Lhybridation des acides nucliques
37
3. 1. 2. 11 - Les plasmides
37
3. 1. 3 - Autres marqueurs
38
3. 1. 3. 1 - Analyse des protines cellulaires totales par SDS-PAGE
38
3. 1. 3. 2 Le polymorphisme enzymatique (MLEE)
38
3. 1. 3. 3 - Analyse des acides gras
39
3. 1. 3. 4 - La srologie
39
3. 1. 4 Etude polyphasique
40
4 TAXONOMIE ET PHYLOGENIE DES RHIZOBIUMS
40
4. 1 Taxonomie ou systmatique des rhizobiums
40
4. 2 Phylognie des rhizobiums
43
4. 3 Classification actuelle des rhizobiums
46
4. 3. 1 Allorhizobium
46
Sommaire
3
.
4. 3. 2 Azorhizobium
46
4. 3. 3 Bradyrhizobium
49
4. 3. 4 Msorhizobium
50
4. 3. 5 Rhizobium
51
4. 3. 6 Sinorhizobium
52
4. 3. 7 Cas particulier du genre Agrobacterium
53
4. 4 Taxonomie des souches nodulant le genre Lupinus
54
CHAPITRE 2 - CONSTITUTION DUNE COLLECTION DE 56

RHIZOBIA NODULANT LE LUPIN ET EVALUATION DE SA
DIVERSITE GENETIQUE PAR PCR/REP
1 - Introduction
56
2 - Constitution dune collection de rhizobia nodulant le lupin
57
2. 1 Site de collecte et analyse des chantillons de sol
57
2. 2 Constitution dune collection de rhizobia
61
2. 2. 1 Isolement et purification des rhizobia
61
2. 2. 2 Authentification des isolats
64
2. 2. 2. 1 Germination aseptique des graines
64
2. 2. 2. 2 Culture et inoculation des plantules de lupin
65
2. 2. 3 Stockage et nomenclature des isolats
65
3 Evaluation de la diversit gntique des souches de la 66

collection par PCR/REP
3. 1 Matriels et mthodes
66
3. 1. 1 Souches bactriennes et milieu de culture
66
3. 1. 2 Extraction de lADN gnomique
66
3. 1. 3 Amplification par PCR des squences rptitives
67
3. 1. 4 Analyse des donnes
68
Sommaire
4
.
3. 2 Rsultats et discussion
68
3. 2. 1 Qualit de lADN
68
3. 2. 2 Diversit gntique rvle par PCR/REP
68
3. 2. 3 Cas particulier de lamas nodulaire
72
CHAPITRE 3 CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES 78

RHIZOBIA NODULANT LE LUPIN
1 - INTRODUCTION
78
2 - MATERIELS ET METHODES
79
2. 1 Evaluation des paramtres symbiotiques
79
2. 2 Temps de gnration sur YEM liquide
80
2. 3 Test du bleu de bromothymol (BTB)
80
2. 4 Utilisation des substrats carbons
80
2. 5 Hydrolyse de lure
81
2. 6 Rduction du nitrate
81
2. 7 Rsistance intrinsque aux antibiotiques
81
2. 8 Rsistance intrinsque aux mtaux lourds
82
2. 9 Tolrance la salinit
82
2. 10 Tolrance au pH
82
2. 11 Tolrance la temprature
84
2. 12 Analyse des donnes
84
3 Rsultats et discussion
84
3. 1 Caractrisation Symbiotique
84
3. 2 Croissance sur le milieu YEM
90
92
96
Sommaire
5
.
3. 5 Hydrolyse de lure et rduction du nitrate
100
101
105
111
3. 9 Tolrance au pH
117
120
3. 11 Analyse numrique
124
CHAPITRE 4 CARACTERISATION MOLECULAIRE DES 131

SOUCHES PAR PCR/RFLP DE LADNr 16S
1 - INTRODUCTION
131
2 - MATERIELS ET METHODES
133
2. 1 Souches bactriennes et milieu de culture
133
2. 2 Mthodes dextraction de lADN
133
2. 3 Amplification par PCR de lADNr 16S
134
2. 4 Digestion des produits de lamplification par les enzymes de 135

restriction
136
3 RESULTATS
137
3. 1 Amplification par PCR de lADNr 16S
137
3. 2 Analyse par PCR / RFLP de lADNr 16S
137
3. 3 Ribotypes dtermins par PCR / RFLP de lADNr 16S
142
3. 4 Etudes des groupements phyltiques tablis par lanalyse UPGMA
146
4 DISCUSSION
151
CONCLUSION GENERALE et PERSPECTIVES
153
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
158
ANNEXES
190
INTRODUCTION
GENERALE
Introduction gnrale
6
.
Le sol constitue un support pour diffrents cycles dchanges dnergie et de transfert de

substances entre les diffrentes entits qui labritent. Un des cycles les plus importants est le
cycle de lazote. La fixation biologique de lazote (N2) sest gnralement concentre sur le
systme symbiotique entre les lgumineuses et les rhizobiums, parce que ces associations ont
le plus grand impact quantitatif sur ce cycle. Il existe approximativement 700 genres et 13000
espces de lgumineuses mais seule une portion de 20% qui constitue les lgumineuses
dimportance agricole a t tudie.
En plus du rle que les lgumineuses jouent dans lagriculture, lconomie et dans les
balances alimentaires de nombreuses populations humaines, elles sont aussi trs importantes
cologiquement vu quelles sont responsables pour une partie substantielle de la conversion
du flux global de lazote atmosphrique en forme fixe tel que lazote ammoniacal qui est
son tour converti en composs organiques assimilables. La rduction de lazote est ralise
gnralement au niveau des racines des plantes dans des organes spcialiss appeles
nodosits. Le processus de la fixation symbiotique dazote aide la plante survivre et
rivaliser efficacement sur les sols pauvres en azote. En retour, les bactries tirent profit de
linteraction symbiotique en obtenant des hydrates de carbone produits par la plante pendant
la photosynthse.
Dans linteraction plante rhizobium, on note un haut degr de spcificit. Une lgumineuse
entre en symbiose avec un nombre limit despces de rhizobium. En revanche, certains
microsymbiotes sassocient avec plusieurs partenaires alors que dautres ont une gamme
dhtes troite. Cette spcificit est base sur une communication molculaire entre les deux
partenaires symbiotiques (Pawlowski et Bisseling, 1996). De ce fait, lintroduction
dinoculums na souvent t daucun effet sur laugmentation du rendement de certaines
cultures de lgumineuses cause de la grande comptitivit avec les souches des rhizobia
indignes. Ces derniers reprsentent donc un rservoir important dans un environnement
donn grce la rsistance quils ont dvelopp au fil du temps pour survivre et persister.
Ainsi, lexploitation effective de la fixation symbiotique de lazote pour lamlioration de la
production agricole exige non seulement la slection du meilleur cultivar hte mais exige
galement que la population des rhizobia natifs soit correctement et suffisamment
caractrise.
Introduction gnrale
7
.
Sur le plan pratique, la slection dun couple plante hte et son rhizobium appropri dpend
galement du milieu daphique. Ce dernier subit une srie dirrgularits selon lintensit et la
nature des cultures, lenvironnement gographique et les conditions du sol. Les contraintes
environnementales les plus importantes sont les suivantes : la salinit, les pH extrmes, le
taux de nitrate dans le sol et lhumidit insuffisante ou excessive du sol.
Dautres facteurs peuvent influencer la fixation symbiotique dune faon bien marque telles
que les composantes biotiques du milieu (biocide, photosynthse inadquate de la plante
hte), la pression humaine (augmentation de la charge ionique des sols par lapport dengrais
dans les systmes dagriculture intense) et les facteurs climatiques. Il savre donc ncessaire
dvaluer les facteurs environnementaux afin que le couple symbiotique slectionn possde
les aptitudes ncessaires qui lui permettent de stablir dans un type de sol donn et de
rpondre aux exigences dfinies.
Des facteurs climatiques dfavorables, une utilisation intensive des terres ainsi que des
pratiques agricoles inadquates peuvent aboutir la dgradation des cosystmes naturels et
laccroissement des terres marginales. Les associations rhizobiumslgumineuses ont une
application potentielle dans la restauration des terres dgrades en rgnrant et en maintenant
leur fertilit. De ce fait et pour limiter galement lrosion gntique massive dun certain
nombre despces et/ou dcotypes, des stratgies de protection des plantes spontanes et des
bactries associes doivent tre entreprises via des programmes de conservation in- et ex situ. Lexploitation de la diversit naturelle des lgumineuses et la constitution de collections
de souches de rhizobia indignes pourraient donc contribuer la revalorisation de la culture
de ces lgumineuses et la rinstallation par la suite du couvert vgtal sur des sols dgrads.
Les lupins sont des lgumineuses fourragres utilises communment comme engrais vert
naturel. Ils sont galement utiliss pour lalimentation humaine et animale. En fait, les lupins
possdent un taux lev en protines de lordre de 40% contre 36% pour le soja (Guillemand,
1999). Les plantes ainsi que les graines sont dune grande richesse en matires azotes. La
teneur en matires azotes digestibles (MAD) de lupin est value 299g par kilogramme de
matire sche de plantes et la teneur en matires azotes totales (MAT) est value 340g/Kg
(Pointereau, 2001). Les lupins jouent aussi un rle important dans lamlioration de la fertilit
du sol. Le potentiel de fixation dazote valu pour L. luteus varie de 145 208 kg ha-1 anne1
et le taux dazote rsiduel dans le sol aprs la culture est valu entre 40 75 kg ha-1 anne-1
(Annon.).
Introduction gnrale
8
.
Il a t rapport que la culture du lupin fut introduite au Maroc vers les annes trente (Foury,
1954). Cependant, ce nest que rcemment que des tudes prcises ont t tablies pour
valuer la biodiversit des diffrents cotypes spontans ou introduits (Thami Alami et
Bounejmate, 1997 ; El Mzouri et Thami Alami, 2000 ; Thami Alami et al., 2004). Cette
biodiversit est dautant plus importante que les ressources naturelles sont indispensables pour
lamlioration potentielle des plantes cultives. Cependant, ltude de la biodiversit des
populations des micro-organismes symbiotiques autochtones reste ncessaire pour toute
slection de couples symbiotiques performants ou de leur introduction dans un nouvel
environnement.
La prsente tude porte en priorit sur lvaluation de la biodiversit des micro-organismes
symbiotiques nodulant les lupins au Maroc. Le programme fait partie dun projet de
coopration technique entre la facult des sciences et lINRA de Rabat. Lobjectif du projet
consiste en la conservation des diffrentes espces de lupin rencontres au Maroc via le
stockage des semences et des bactries fixatrices dazote existant au niveau des nodosits
racinaires et dans la rhizosphre, ltude de la biodiversit des deux partenaires symbiotiques
et la slection de souches bactriennes et de plantes adaptes aux conditions
environnementales prdominantes dans les rgions "candidates" pour sa culture.
Ainsi, dans le cadre du travail relatif ce mmoire, nous nous sommes fixs les objectifs
suivants :
- La prospection de diffrents sites localiss dans les aires de rpartition gographique des
diffrentes espces de lupin existantes au Maroc, et ralisation de collecte de plantes nodules
afin de pouvoir constituer une collection de symbiontes indignes nodulant le lupin.
- La caractrisation molculaire et phnotypique des souches de la collection afin dvaluer
leur diversit gntique et fonctionnelle en prenant en compte lhtrognit entre les
espces et les variations lies aux diffrents types de sol et en vue de slectionner les souches
les plus performantes pour des applications potentielles.
- Lvaluation de la position taxonomique et caractrisation phylogntique des diffrentes
souches de la collection.
CHAPITRE I
REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE
Revue bibliographique
.9
1 APERU GENERAL SUR LE PROCESSUS DE LA SYMBIOSE

Le processus dune symbiose fixatrice dazote se traduit par la capacit des rhizobiums
induire la formation de nodosits au niveau des racines ou des tiges dune plante hte
particulire. La prsence de nodosits chez les lgumineuses tait historiquement bien
connue, mais leur origine tait controverse. Woronin (1866) fut le premier signaler
lobservation des microorganismes ressemblant aux bactries dans les nodosits de Lupinus
mutabilis. Hellriegel et Wilfarth (1888) ont montr que la formation des nodosits est le
rsultat dune infection externe chez les espces Lupinus, Phaseolus, Ornithopus, Vicia, et
Trifolium. Cependant, ctait Beyerinck qui a fourni la premire preuve que les bactries sont
lorigine de la formation des nodosits, en prparant des cultures pures dorganismes
provenant des nodosits de Vicia faba et en infectant avec ces mmes cultures des plants de
fve cultives sur un sol strile (Beyerinck, 1888, 1890).
En fait, la formation de nodosits survient quand les rhizobiums pntrent leurs htes dune
manire strictement coordonne et contrle. Les exigences gntiques de la reconnaissance
spcifique sont partages entre le rhizobium et la plante hte. Chacun des deux partenaires
possde des gnes qui ne sont exprims que dans la prsence de lautre (Djordjevic et al.,
1987).
La formation dune nodosit suit en gnral les tapes de dveloppement qui suivent :
- Chimiotactisme et attachement des rhizobiums aux racines de lhte,
- Dformation des poils absorbants,
- Invasion du cytoplasme des cellules corticales par les bactries travers les cordons
dinfection,
- Division des cellules du cortex aboutissant la formation dun primordium nodulaire,
- Diffrentiation des bactries en bactroides et du primordium nodulaire en nodosit.
1. 1 Mcanismes et spcificit de la reconnaissance symbiotique

Les interactions entre les lgumineuses et les rhizobiums se produisent dans la rhizosphre
suite la libration de molcules carbones (sucres, acides organiques, hormones, vitamines
et substances phnoliques) par exsudation, scrtion, ou autolyse des vieilles cellules de la
racine. Beaucoup des substances organiques libres par les racines ont un faible poids
. 10
molculaire et sont donc facilement dcomposables par les micro-organismes. Cela conduit
lexistence dune grande population microbienne autour de la racine. Dautres composs
trouvs dans les exsudats racinaires exercent des pressions slectives sur la communaut
microbienne. Les (iso) flavonoides, stachydrines et acides aldoniques sont les plus importants
de point de vue symbiotique (Ara Begum et al., 2001). Ils constituent les premiers signaux de
lhte qui dclenchent chez la bactrie lexpression du gne de rgulation de la nodulation
nod D et induisent le mcanisme du chimiotactisme des rhizobiums (Petes et Verma, 1990).
Une lgumineuse peut scrter diffrents (iso) flavonoides. De mme, la prsence de plus
dun gne de nod D a t rapporte (cas de S. meliloti et R. leguminosarum) (Davis et
Johnston, 1990).
Dautres molcules originaires de la plante telles que les lectines jouent un rle important
dans le processus de linfection. Les proprits et la squence en acides amins dune lectine
isole chez la lgumineuse Dolichos biflorus (Etzler et al., 1999) ont montr quil sagit dune
metalloprotine qui prsente une grande affinit pour le facteur Nod. Diffrents analogues de
cette lectine sont connus pour stimuler ladsorption des rhizobiums (Lodeiro et al., 2000). Ils
constituent de ce fait une entit spcifique parmi les rcepteurs oprationnels au niveau
membranaire (Bhagwat et al., 1996, Hirsch, 1999).
Les gnes de rhizobium essentiels pour linfection et la nodulation incluent les gnes nod
(nod, nol, noe), les gnes hsn (gnes de nodulation spcifique de lhte) et dautres gnes qui
codent pour lexpression et la synthse des molcules de structure de la surface bactrienne
tels que les gnes ndv responsables de la synthse des -glucans, les gnes exo responsables
de la synthse des exopolysaccharides, et les gnes lps responsables de la synthse des
lipopolysaccharides (Broughton et al., 2000 ; Spaink, 2000, 1999).
En ce qui concerne les gnes de nodulation, les gnes nod ne sont exprims que par laction
dun activateur de transcription, le Nod D. Le gne nod D est exprim de manire constitutive
(Geurts et Bisseling, 2002), il est activ par des molcules produites par les plantes telles que
les flavonoides (Spaink, 1987 ; Zuanazzi et al., 1998). Les gnes nod ABCIJ sont des gnes
communs trs conservs chez les diffrentes espces de rhizobia.
Les facteurs Nod sont des lipo-chito-oligosaccharides (LCOs) produits par les diffrents
gnes nod, nol et noe. Les LCOs sont forms par 3 5 rsidus N-actyl-glucosamine lis en
configuration ,1-4. Un acide gras est li la partie non rductrice du sucre terminal. La
. 11
longueur et la saturation de la chane de lacide gras ainsi que les diffrents substituants
greffs sur le squelette du LCO jouent un rle crucial dans la spcificit entre la bactrie et la
plante (Perret et al., 2000).
Les facteurs Nod chez Azorhizobium et Sinorhizobium sont trs similaires (Lorquin et al.,
1997), cela suggre lacquisition des gnes qui dterminent la structure des LCOs par transfert
latral (Suominen, 2000). La plupart des gnes symbiotiques sont localiss sur de grands
plasmides. Cet emplacement renforce lide que ces gnes ont la possibilit dtre transfrs
horizontalement. Bien que les grands plasmides ne soient pas transmissibles, ils sont en
rapport avec dautres plasmides trs transmissibles (Hirsch et al., 2001). Le mcanisme de
lexcision et de lintgration de ces rgions dans le chromosome bactrien a t galement
dmontr (Sullivan et Ronson, 1998).
En ce qui concerne les composants de la surface cellulaire cods par les gnes ndv, exo et lps
on trouve les -glucans, les exopolysaccharides et les lipopolysaccharides qui sont considrs
comme dimportants facteurs dans lefficacit symbiotique (Breedveld et Miller, 1998),
Les -glucans sont majoritairement des molcules du priplasme qui permettent la croissance
des bactries sous des conditions hypoosmotiques (Pfeffer et al., 1994). Ils ont galement un
rle spcifique dans linteraction symbiotique (Breedveld et Miller, 1998). Daprs Bhagwat
et al. (1996), ces molcules jouent un rle important dans la suppression du dclenchement du
mcanisme de dfense par les phytoalexines chez lhte.
Les exopolysaccharides (EPS) sont forms par des units rptitives de sucres avec une
chane latrale substitutions variables. Deux EPS sont connus, le EPS I de type
succinoglucan et le EPS II de type galactoglucan. Gonzalez et al. (1996) ont montr que ces
molcules fonctionnent comme des messagers pendant linfection.
Les lipopolysaccharides (LPS) sont forms par trois constituants (Forsberg et Carlson, 1998),
le lipide A, partie hydrophobe du LPS localise dans la partie externe de la double couche
membranaire, le core, un oligosaccharide dont la structure de base est similaire chez plusieurs
rhizobiums, et lantigne O, partie hydrophile qui constitue le composant le plus variable du
LPS (Niehaus et al., 1998). La prsence ou labsence de ce dernier composant engendre
respectivement lapparence de colonies bactriennes lisses S-LPS (smoot LPS) ou rugueuses
R-LPS (rough LPS) (Lerouge et al., 2001).
. 12
Chez les rhizobia, les mutants dfectifs en la synthse ou faible production de LPS nont pas
la capacit dinduire la formation de cordons dinfection, perdent leur capacit comptitive ou
forment des nodosits incompltement dveloppes (Lagares et al., 1992). Il a t rcemment
dcouvert que les rhizobiums adaptent des structures diffrentes de LPS (composition en
sucres, type et degr de modifications par actylation et mthylation) en rponse aux
conditions de lenvironnement (Kannenberg et Carlson, 2001 ; Noel et al., 2000, Berkia,
2004).
Les associations entre la lgumineuse et le rhizobium sont gnralement slectives. Par
exemple, Sinorhizobium meliloti peut sassocier efficacement avec les genres Medicago,
Melilotus et Trigonella, alors que Bradyrhizobium japonicum ne nodule que Glycine max. A
loppos, ces associations peuvent tre moins strictes. Ainsi, la souche Sinorhizobium sp.
NGR 234 peut noduler 353 espces de lgumineuses appartenant 112 genres diffrents et
elle peut mme noduler une plante non lgumineuse, Parasponia andersonii (Pueppke et
Broughton, 1999).
1. 2 Initiation et dveloppement nodulaire

Linfection dbute juste aprs que le rhizobium sadsorbe par chimiotactisme au poil
racinaire. Le poil se recourbe et forme une sorte de boucle tout autour de la bactrie.
Lhydrolyse de la paroi cellulaire du poil absorbant permet la pntration du rhizobium par
invagination de la membrane plasmique. Celle-ci forme alors une structure tubulaire connue
sous le nom de cordon dinfection (Hirsch, 1992). Paralllement, les cellules du cortex
racinaires subissent des divisions rapides pour la formation dun primordium nodulaire
(Vance et al., 1998). Ces divisions paraissent tre arrtes la phase G2 de la mitose
(Stougaard, 2000). Les cordons dinfection atteignent le primordium nodulaire et y relchent
les bactries par le phnomne dentocytose (Bassett et al., 1977). Les bactries se trouvent
alors entoures par une membrane qui drive de lhte, la membrane pribactroidale qui
protge les bactries des molcules de dfenses de lhte. Dans ces units fermes appels
symbiosomes (Roth et Stacey, 1989), les bactries commencent se diffrencier en
bactroides.
Le cordon dinfection continue pntrer travers les couches cellulaires dans la zone
mristmatique active jusquaux cellules les plus internes. Lapparition continue de bactries
dans les cellules saccompagne de laugmentation de la dimension de lbauche nodulaire
. 13
(Beringer et al., 1979). Dans ce processus de dveloppement, les bactries subissent des
changements morphologiques et physiologiques qui mnent la formation de bactroides
(Irigoyen et al., 1990).
La fixation de lazote atmosphrique est assure par la nitrognase. Mais, les bactroides ne
sont pas capables de fixer lazote tant que loxygne dsactive la nitrognase et bloque la
transcription du gne de cet enzyme. Ce dernier est alors protg par la leghemoglobine,
protine scrte par la plante et qui joue un rle dans le transport de loxygne en maintenant
une forte pression du O2 dans le cytoplasme des cellules racinaires de la plante pour la
phosphorylation oxydative et en fournissant un niveau bas soutenu doxygne aux bactroides
(Verma et Long, 1983). Latmosphre dans lenvironnent nodulaire tant alors favorable, la
nitrognase devient active et catalyse la rduction du N2 en NH4+.
La production de nodulines (tardives) est particulirement intressante au dveloppement
nodulaire. Elles activent entre autres, lexpression des gnes nif, fix, etc. qui codent pour la
synthse de diffrents enzymes de la fixation comme la nitrognase, luricase, le glutamate
dshydrognase, la glutamine synthtase, etc. Ainsi, le N2 fix est converti en glutamate,
glutamine, aspartate, asparagine etc. qui seront transports dans la sve du xylme de la plante
(figure 1). Une abondance de composs carbons est fournie en retour aux bactroides.
Le type de nodosit dveloppe est dtermin par la plante hte :
-
Nodosits croissance indtermine o lactivit mristmatique se maintient (cas de la

vigne, du pois, la vesce et la luzerne). De nouvelles cellules apicales sont continuellement
infectes. Cela rsulte en une forme cylindrique de la nodosit.
Nodosits croissance dtermine o lactivit mristmatique cesse tt (cas du soja, de

lharicot et larachide). Les cellules infectes engendrent dautres cellules infectes et la
nodosit en grandissant par expansion acquiert une forme sphrique. Ce type de nodosit
existe seulement chez les lgumineuses (Hirsch et al., 2001).
Un troisime type intermdiaire a t identifi chez le genre Lupinus et Sesbania rostrata.

Les divisions cellulaires se font soit dans le cortex externe soit dans le cortex interne,
conduisant la formation de nodosits soit dtermines soit indtermines (Hirsch, 1992,
Hirsch et al., 2001).
. 14
N2
NH3
Glutamate
Asparagine
Glutamine
Aspartate
Glutamine
Oxaloglutarate
Glutamate
Xylem de la Plante
Aspartate
Oxaloacetate
Glutamate
Figure 1. Rduction de lazote molculaire et conversion du NH3 en formes dacides amins

assimils par la plante.
-
. 15
Deux autres types ont t signals chez Arachis hypogeae (Ndoye et al., 1994) et chez
Mimosa scabrella (de Faria et al., 1988). Pour ces espces, le mode dinfection est un cas
particulier. Les rhizobiums pntrent directement dans les cellules du cortex entre les
cellules pidermiques dans le premier cas et travers les jonctions des cellules
pidermiques dans le second cas.
Un mcanisme exceptionnel dinfection pidermique directe a t rcemment rapport

chez le lupin blanc (Gonzlez-Sama et al., 2004). Par lusage des techniques bases sur la
microscopie lectronique, ces auteurs ont montr que les espces Bradyrhizobium sp.
(Lupinus) et Mesorhizobium loti peuvent pntrer dans la racine au niveau de la jonction
situe entre la base du poil racinaire et les cellules pidermiques adjacentes, ce qui
entrane la formation de nodosits indtermines typiques.
Selon Corby (1988), le lupin est distingu par des nodosits dites de type lupinoid. Celles-ci
peuvent se dvelopper soit sur les racines latrales sous forme de nodosits individuelles,
arrondies et rugueuses, soit sur la racine principale sous forme de clusters de nodosits ou
damas nodulaires en forme de cne de pin. Chaque nodosit de lamas possde son propre
point dattachement au niveau de la racine et peut crotre par diffusion latrale couvrant ainsi
la surface de la racine existant tout autour de son point dattachement. La couche des cellules
corticales qui protgent la nodosit progresse et spaissie avec llargissement de la nodosit.
Les nodosits indtermines de type lupinoid caractrisent le genre Lupinus. Cependant,
lauteur a signal leur prsence galement chez le genre Lotononis.
Selon le mme auteur, les amas nodulaires chez le lupin peuvent tre trs volumineuses. La
taille dun amas peut atteindre un diamtre de 16 mm dans le cas de Lupinus mutabilis, voire
mme celle dune pomme de terre moyenne (Frank, 1980, cit par Corby, 1988).
La prsence dune autre forme de nodosit dite de type crotalaroid a t rapporte chez les
plantes de lupin (Erikson, 1873, cit par Corby, 1988). Ces nodosits possdent gnralement
une forme en ventail plus ou moins aplatie avec plusieurs lobes qui mergent partir dun
seul point dattachement au niveau de la racine et progressent par diffusion latrale des
mristmes apicales. Mais dans le cas du lupin, les diffrents lobes restent souds et
progressent par un moulage circulaire autour de la racine.
. 16
2 SYMBIOSE LUPIN-RHIZOBIUM
2. 1 Aperu gnral sur la plante
2. 1. 1 - Taxonomie et caractristiques du genre Lupinus
Le genre Lupinus comprend plus de 300 espces (Cowling et al., 1998). Laire de rpartition
gographique de ces espces comprend la rgion mditerranenne, lAsie et le continent
amricain (Gladstones, 1998). Au sicle dernier, diffrentes espces de lupin ont t
introduites en Afrique du Sud ainsi quen Australie (Kass et Wink, 1997).
En 1974, Gladstones a propos une distinction taxonomique des lupins sur la base de laspect
des graines : un groupe despces graines rugueuses et un autre groupe graines lisses.
Les lupins ont t communment considrs comme des herbes annuelles, mais lexistence
despces vivaces, arbrisseaux et sous-arbrisseaux dans le continent amricain a permis la
rpartition des espces en 1984 en deux grands groupes gographiquement spars :
- Les espces du monde ancien, au nombre de douze espces, toutes annuelles et larges
graines (Plitman and Heyn, 1984).
- Les espces du nouveau monde qui stendent de lAlaska jusquen Argentine et qui
comprennent des plantes annuelles et vivaces petites graines (Dunn, 1984).
Dans la mme anne, il a t propos quune espce feuille simple originaire du Brsil
pourrait tre un anctre primitif des lupins, mais cette proposition a t rejete par Monteiro et
Gibbs (1986).
Une nouvelle espce : L. anatolicus a t rcemment propose par Swiecicki et al. (1996).
Toutefois, Clements et al. (1996) ont montr quil sagit dune nouvelle accession de L.
pilosus graines lisses.
La classification initiale du lupin subdivisait le genre en deux sous genre Eulupinus et
Platycarpos (Ascherson et Graebner, 1907). Jusqu nos jours, la rpartition tablie en 1984
est retenue, avec cependant une subdivision du genre en deux nouveaux sous genres : Le
premier est dorigine mditerranenne (Subgenus Lupinus) et le second est natif de
lAmrique (Subgenus Platycarpos) (Kurlovick et al., 1995 cit par Cowling et al., 1998).
. 17
Parmi toutes les espces de lupin, quatre seulement sont actuellement cultives : L. luteus, L.
albus, L. angustifolius et L. mutabilis (Gladstones, 1998).
Les lupins sont classs de point de vue taxonomique dans le genre Lupinus, la tribu des
Gnistes, la sous Famille des Papilionaces, la famille des lgumineuses (ou Fabaceae),
lordre des Fabales (anciennement Rosales), la sous-classe des Rosidae, la classe des
Dicotyldones,
le
sous
embranchement
des
Angiospermes,
lembranchement
des
Spermaphytes, le phylum des Trachophytes, le sous rgne des Trachobiontes et le rgne du

Plantae.
Le genre Lupinus est distingu des autres genres de Papilionaces par la forme des feuilles.
Celles-ci sont composes habituellement de feuillets velus qui rayonnent pour former une
feuille palme ou digite disposition en forme dventail.
Plusieurs espces de lupin sont riches en diffrents types dalcalodes toxiques (lupanine,
hydroxylupanine, sparteine, etc.) donnant un got amer aux graines et au fourrage (Wink,
1993). Mais on dispose actuellement de varits slectionnes, dhiver ou de printemps,
dpourvues ou faible teneur en alcalodes quon nomme les lupins doux.
Depuis les temps anciens le lupin a t utilis pour enrichir le sol et dans les cultures en
rotation avec dautres lgumineuses ou crales (Gladstones, 1998). Les romains ont cultiv
le lupin annuel (principalement L. albus) comme nourriture pour les humains et les animaux.
De nos jours, les graines hautement protiques de quelques espces sont utilises pour la
consommation humaine (lupin en conserve, lupin rtis, etc.).
Le lupin est aussi utilis comme fleur de jardin, plante ornementale (Gladstones, 1998) et
comme plante de couvert pour lamlioration et la conservation de la stabilit du sol
(Williams, 1993).
Daprs le rapport du Fvrier (2000) de lUnion Nationale Interprofessionnelle des plantes
riches en Protines (UNIP), le premier producteur mondial de lupin est lAustralie qui assure
86% de la production mondiale (1786000 tonnes). LAustralie est aussi le premier exportateur
mondial de lupin. En Europe, le premier producteur de lupin est lAllemagne avec 71% de la
production europenne (108000 tonnes).
. 18
2. 1. 2 - Le lupin au Maroc
2. 1. 2. 1 - Caractristiques botaniques
Le genre lupinus est reprsent au Maroc par six espces : L. luteus, L. albus, L. angustifolius,
L. atlanticus et L. cosentinii. Toutes les espces sont annuelles avec un systme racinaire trs
robuste et une hauteur comprise entre 30 et 70 cm, cette dernire peut atteindre les 150 cm de
long dans le cas de L. albus. Les fleurs sont unicolores et la dure de vgtation est de
lordre de cent trente cent cinquante jours (Birouk, 1990 ; Gladstones, 1998).
2. 1. 2. 2 - Ecologie
Les lupins exigent des sols ars et se dveloppent mieux sur les sols grossiers ou
moyennement grossiers de texture sableuse ou de type terreux et peu fertiles. Ils sont ainsi
dnomms les plantes dor des sables . Au Maroc, ces plantes sont rencontres ltat
spontan principalement sur les terrains accidents secs, les falaises ou sur les sables ctiers.
La plupart des espces sont sensibles aux sels solubles. La temprature optimale de la
croissance est denviron 20 25C (Dracup, 1993).
La distribution spontane des six espces est variable et dpend principalement de laltitude,
la pluviomtrie et des caractristiques lies au sol telles que la nature de la roche mre et le
pH (Gladstones, 1973 ; 1980).
- L. luteus est adapte aux basses altitudes (< 500 m), aux terres sablonneuses acides et aux
pluviomtries variant de 300 1000 mm. Lespce est sensible au froid et la floraison est
influence par la photopriode.
- L. albus est adapte aux sites de basse altitude, aux sols sablonneux ou sablo - limoneux
acides ou voisins de la neutralit. Lespce existe dans des rgions pluviomtrie allant de
400 1200 mm.
- L. angustifolius est lespce la plus prcoce et la plus rsistante au froid. Laire de
rpartition est plus large. Elle abonde dans les zones littorales ainsi quen hautes altitudes
mais reste toutefois limite dans la rgion Nord du pays. Elle peut sinstaller sur des sols
pauvres et peu fertiles sous des pluviomtries comprises entre 100 et 1400 mm.
. 19
- L. atlanticus qui est une espce endmique du Maroc, est adapte aux altitudes leves des
chanes de lAtlas, aux sols lourds et alcalins et aux pluviomtries variant de 100 700 mm.
- L. pilosus est adapte aux altitudes leves, aux sols alcalins texture fine et aux
pluviomtries variant de 300 2000 mm.

- L. cosentinii abonde surtout dans les zones littorales dans des sites sableux. Toutefois, on
peut rencontrer des populations isoles dans les chanes de lAtlas des altitudes denviron
1000 m et pluviomtrie abondante.
2. 1. 2. 3 - Exploitation
Au Maroc, deux espces sont actuellement exploites : L. albus ou le lupin blanc avec la
varit douce et prcoce Multolupa et L. luteus ou le lupin jaune avec une population
ancienne du Gharb. Ces espces sont principalement utilises comme fourrage, comme
engrais vert et pour la production des graines (Thami-Alami et Bounejmate, 1997).
Selon une tude tablie sur une vingtaine dannes dans la rgion du Gharb par lOffice
Rgional de la Mise en Valeur du Gharb (ORMVAG) (1999), on peut noter que la superficie
de la culture de lupin est passe dun chiffre de 120 ha en 1982/83 pour atteindre un
maximum de 3225 ha en 1991/92 puis 676 ha en 1997/98. Toutefois, la superficie note
pour 2000/2005 est de lordre de 4000 ha (MADR, 2005 DPV).
Le lupin est essentiellement exploit en culture dans la zone ctire du Gharb avec une
superficie de 700 ha, la rgion de Khmisset (500 ha), le Loukkos (464 ha), la rgion de
Rabat-Sal (250 ha) et enfin la rgion de Benslimane (12 ha) (DPV-DREF, 2000). Cependant,
la production du lupin au titre de la campagne 1999/2000 (DPV-DREF, 2000) ne dpassait
gure les 31.9 milliers de tonnes de matire verte. Selon lorganisation mondiale FAO (Food
& Agricultural Organization), la production marocaine en lupin pour la campagne 2003/2004
est de lordre de 14000 tonnes.
La rduction notable de la superficie de culture et de la production du lupin tait due au dficit
hydrique, au retard des pluies qua connu le pays durant les dernires annes, mais
essentiellement la non disponibilit des semences slectionnes et la politique qui
favorisait dautres cultures cralires et fourragres notamment la luzerne, le trfle
dAlexandrie et le mas fourrager.
. 20
Lintroduction de la culture du lupin dans dautres zones sableuses et marginalises du pays

pourrait avoir un effet bnfique sur le plan agricole vu la contribution de cette lgumineuse
dans lapprovisionnement du sol en azote ainsi que le dveloppement de llevage. Mais la
qualit du rendement dune espce donne de lupin dpend de la varit utilise, des
conditions de lenvironnement et surtout de la formation de nodosits par des souches
indignes spcifiques appartenant au groupe des rhizobia qui assurent la nutrition azote de la
plante hte (Birouk, 1990).
2. 2 Aperu gnral sur le partenaire microbien

Les microsymbiotes de lupin ont fait lobjet de plusieurs tudes au cours des dernires annes.
Ces tudes ont permis de noter la prsence de souches autochtones de rhizobia nodulant
diffrentes espces de lupin aux Etats-Unis dAmrique (Bottomley et al., 1994, Robinson,
2000), en Nouvelle Zlande, en Europe (Amarger et al., 1977 ; Hoeflich et al., 1994) et au
Mexique (Barrera et al., 1997).
Dautres recherches ont port plus dattention sur laugmentation du rendement de la plante
hte par le biais de linoculation avec des souches performantes de lupin. De telles tudes ont
t principalement rapportes en Australie o le lupin ainsi que son microsymbiote ont t
tous les deux introduits au pays (Gault et al., 1986).
Quelques tudes ont t ralises pour dterminer la capacit des symbiotes de lupin noduler
dautres plantes lgumineuses (Jensen et Hansen, 1968) et pour valuer leur efficience
symbiotique (Amager et al., 1977). La slection de souches performantes sous diffrentes
conditions a t galement aborde (Hoeflich et al., 1994 ; Robinson, 1997 ; Abdallah, 1999).
Dautres tudes incluent la dtermination de la densit bactrienne appliquer aux graines
ainsi que ltude de la survie et la multiplication de ces bactries dans le sol et dans la
rhizosphre (Roughley et al., 1993 ; Robinson et al., 2000) et ltude des mcanismes
dadsorption et dinfection (Wiesniewski et Delmote, 1996 ; Gagnon et Ibrahim, 1998). En
fait, des techniques de mesure plus prcises ont permis de mettre en vidence les particularits
de la structure et des mcanismes dadaptation des flagelles des rhizobia de lupin (CohenKrausz et Trachtenberg, 1998 ; Scharf et al., 2001). Novikova et Gordienko (2001) ont
montr, en utilisant la microscopie lectronique, que mme la structure des cordons
. 21
dinfection visualiss dans les racines du lupin est bien diffrente par rapport celle des
cordons dinfection chez une dizaine dautres espces de lgumineuses.
Sur le plan gntique, la caractrisation des rhizobia de lupin a t initialement rapporte par
Heumann (1979). De nombreux rhizobia indignes caractriss ont t attribus au genre
Bradyrhizobium (Jensen, 1967 ; Jordan, 1984 ; Legocki et al., 1997). Jusqu nos jours,
ltude de la diversit gntique des souches de lupin sest porte essentiellement sur
lanalyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction du gne de lADNr
16S amplifi par PCR (Laguerre et al., 1994 ; 1997 ; Xu et al., 1995) et sur lanalyse de la
squence de ce gne (Scholla et al., 1990 ; Barrera et al., 1997).
Au Maroc, le lupin est spontanment nodul par des rhizobia dans son aire naturelle et dans
les sols o il a t introduit (Birouk, 1990). Trs peu dtudes ont t menes pour la
caractrisation du microsymbiote par rapport la plante hte (Guedira, 2002). Cependant,
aucune tude na t jusqu lors tablie pour tudier la diversit gntique des rhizobia
indignes.
3 BIODIVERSITE DES RHIZOBIA

Les rhizobiums sont connus comme des bactries fixatrices dazote ayant la facult dtablir
des relations symbiotiques avec plusieurs espces de la famille des fabaces. Toutefois, une
large population de rhizobiums non symbiotiques peut exister dans le sol ou dans la
rhizosphre des plantes lgumineuses (Segovia et al., 1991 ; Sullivan et al., 1996). Ils peuvent
galement exister comme des cellules viables dans leau o ils sont capables dinfecter et de
noduler des lgumineuses aquatiques telles que Aechynomene spp. et Sesbania spp.
(Chaintreuil et al., 2000 ; Wang et Martinez-Romero, 2000). Rcemment, les rhizobiums ont
t galement identifis comme endophytes de plusieurs non lgumineuses telles que le mais,
le riz et le bl (Ueda et al., 1995 ; Engelhard et al., 2000).
Dune manire gnrale, la biodiversit des rhizobiums ou de tout autre organisme peut tre
dfinie comme suit " La diversit biologique, ou biodiversit, est la varit et la variabilit de
tous les organismes vivants. Ceci inclut la variabilit gntique l'intrieur des espces et de
leurs populations, la variabilit des espces et de leurs formes de vie, la diversit des
complexes d'espces associes et de leurs interactions, et celle des processus cologiques
. 22
qu'ils influencent ou dont ils sont les acteurs " daprs la XVIIIme Assemble Gnrale de
l'Union Internationale pour la Nature (UICN) tenue Costa Rica (1988).
3. 1 Mthodes dtude de la diversit

Plusieurs techniques ont t utilises par les microbiologistes pour valuer la diversit des
rhizobiums. Ces techniques ont permis lanalyse de diffrents traits phnotypiques et
gntiques qui sont devenus par la suite une base de dfinition du concept de lespce.
3. 1. 1 Les marqueurs phnotypiques

La caractrisation phnotypique classique des rhizobia se base sur des critres
morphologiques, symbiotiques, biochimiques, et physiologiques (Graham et al., 1991).
Les critres morphologiques regroupent les caractristiques de la cellule bactrienne (forme,
nombre et type de flagelles, coloration Gram, prsence dendospores) et les caractristiques
de la colonie (couleur, dimension, forme).
Les critres symbiotiques indiquent la capacit infective, effective et comptitive dune
souche donne.
Les critres biochimiques valuent la prsence et/ou lactivit de diffrents enzymes tels que
la glutamate dshydrognase, la glucose 6-phosphate dshydrognase, lindole- phnol
oxydase, la nitrate rductase, lurase, ladnylate kinase ainsi que dautres enzymes
impliqus dans les voies mtaboliques dassimilation des substrats carbons.
Les critres physiologiques regroupent le taux de croissance de la bactrie sur le milieu YEM
(Yeast Extract Mannitol) (Vincent, 1970), la capacit dutiliser diffrents carbohydrates et
diffrentes sources dacides amins comme seule source de nitrogne, la croissance
diffrentes tempratures, la tolrance aux variations du pH et diffrentes concentrations en
sels, la rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds.
3. 1. 1. 1 La croissance
La croissance dans le milieu YEM figure parmi les critres phnotypiques les plus importants
dans la caractrisation des rhizobia (Vincent, 1970).
. 23
La premire classification des bactries symbiotiques fixatrices dazote en deux genres

Rhizobium et Bradyrhizobium stait base sur ce critre (Jordan, 1982, 1984). En fait, les
souches croissance rapide du genre Rhizobium possdent un taux de gnration infrieur 4
heures et forment des colonies circulaires convexes gnralement translucides avec un
diamtre de 2 4 mm aprs 3 5 jours sous des conditions optimales dincubation. En
revanche, les souches croissance lente du genre Bradyrhizobium possdent un taux de
gnration de 6 8 heures et forment des colonies circulaires convexes et rarement
translucides avec un diamtre de 1 2 mm aprs 5 7 jours dincubation.
Des souches qui prsentent un temps de gnration intermdiaire ont t rapportes par Jarvis
et al. (1997). Ces souches ont t assignes un nouveau genre Mesorhizobium. Dautres
souches prsentant un temps de gnration extrmement lent pouvant atteindre les 39 heures
ont t galement identifies (Xu et al., 1995). Ces souches restent toutefois groupes avec les
bradyrhizobiums.
3. 1. 1. 2 Les critres symbiotiques
Linfectivit des rhizobia exprime le pouvoir de la bactrie noduler une ou plusieurs
lgumineuses htes. Elle peut tre facilement value par le dnombrement des nodosits
formes.
Lefficience est la capacit de rduire efficacement lazote atmosphrique en ammonium.
Diffrentes techniques destimation de lefficience sont disponibles. Trois sont les plus
utilises, la mthode Kjeldahl qui permet de mesurer lazote total de la partie vgtative de la
plante, la mthode de lactivit rductrice de lactylne (ARA) qui permet dvaluer
lactivit de la nitrognase par lapport de lactylne comme substrat et par la mesure de
lthylne dgag comme produit de rduction final, la troisime mthode consiste
dterminer le poids sec de la partie vgtative des plantes inocules par la souche et recevant
tous les lments nutritifs essentiels la plante sauf lazote par rapport celui de deux
tmoins, lun non inocul et lautre galement non inocul mais recevant de lazote sous
forme minrale. La diffrence entre les poids enregistrs permet dvaluer indirectement
lapport de lazote fourni par la souche la plante. La diversit de la capacit fixatrice de
diffrentes souches nodulant le lupin a t value par plusieurs auteurs (Ayisi et al., 1992 ;
Kurlovick et al., 1997 ; Howieson et al., 1998). En fait, ltude de la diversit de lefficience
des souches est un critre de base dun grand intrt aussi bien sur le plan pratique que dans la
caractrisation des rhizobia.
. 24
La comptitivit reprsente la rsistance de la souche bactrienne considre aux microorganismes antagonistes et la concurrence avec les souches indignes pour la nodulation.
3. 1. 1. 3 - Utilisation des sources de carbone
Les rhizobiums sont des bactries htrotrophes. Ils ont besoin de composs organiques dj
synthtiss par les plantes quils utilisent pour la synthse de leurs propres molcules
organiques (Lynch et Wipps, 1990).
Dans la rhizosphre, les rhizobia sont fortement stimuls par les exsudats racinaires et par les
dbris cellulaires qui contiennent diffrents hydrates de carbone. La concentration des
substrats carbons a un effet stimulant sur la croissance et la survie de nombreuses espces de
rhizobium (Whipps, 1990). En symbiose, ces substrats fournissent lnergie ncessaire pour le
dveloppement des bactroides et pour le bon fonctionnement des diffrentes tapes de la
rduction de lazote atmosphrique.
Toutefois, les rhizobiums diffrent dans leur aptitude assimiler les variables sources de
carbone (Allen et allen, 1950).
Selon Graham (1964), les bactries croissance rapide prsentent un spectre dassimilation
trs large vis--vis des substrats carbons par rapport aux bactries croissance lente.
Plusieurs tudes ultrieures ont indiqu que les rhizobiums montrent une bonne croissance par
lutilisation prfrentielle des disaccharides. Cet aspect a permis Jordan (1984) de faire la
distinction entre les deux genres tablis lpoque, Rhizobium et Bradyrhizobium.
Ltude de lassimilation de diverses sources de carbone par diffrentes souches a indiqu que
les bactries du genre Rhizobium ont une grande aptitude assimiler les mono- et les
disaccharides, et dune manire restreinte les trisaccharides et les polyalcools. A loppos, les
bactries du genre Bradyrhizobium ont une aptitude variable pour lassimilation des
monosaccharides, moindre pour les disaccharides et rare pour les trisaccharides (Stowers,
1985).
La description de nouveaux genres de rhizobiums sest accompagne par la rvlation dune
grande diversit des profils dutilisation de sources de carbone (Zhang et al., 1991 ; de
Lajudie et al., 1994 ; Stowers et Elkan, 1984 ; Odee et al.,1997).
. 25
3. 1. 1. 4 - Tolrance la salinit
Parmi les facteurs environmentaux, la salinit constitue la contrainte majeure limitant le
dveloppement et la productivit des plantes cultives. Environ 40% de la surface terrestre
prsente des problmes potentiels de salinit (Cordovilla et al., 1994). Les zones problmes
se localisent essentiellement dans les rgions tropicales et mditerranennes (FAO, 1988). Le
facteur causal de la salinisation des sols est principalement lirrigation (Szabolcs, 1986).
Laugmentation de la teneur en sel est galement lie au lessivage des cations,
lvapotranspiration, aux conditions climatiques et la nature du sol.
Le stress salin affecte dune manire dltre la croissance et la persistance des souches
rhizobiennes dans le sol. La croissance des rhizobiums sous des conditions salines varie dune
espce lautre et dun type de sel lautre (El Sheikh et Wood, 1989).
La plupart des rhizobiums sont inhibs par des concentrations de 100 mM NaCl (Singleton et
al., 1982). Diffrentes souches de Bradyrhizobium sont compltement inhibes entre 50 et 90
mM NaCl. Cependant, il existe des souches trs tolrantes au NaCl, par exemple
Sinorhizobium meliloti peut crotre des concentrations variant de 300 700 mM NaCl, des
souches de Bradyrhizobium nodulant le soja et de Mesorhizobium nodulant le pois chiche
peuvent tolrer 340 mM NaCl. Il a t rapport que chez la mme espce Rhizobium
leguminosarum, il existe des souches dont la croissance est inhibe par 150 mM NaCl (Rai,
1983) et dautres qui supportent 350 mM NaCl (Breedveld et al., 1993). Zahran et al. (1994)
ont rapport lexistence de souches hautement tolrantes chez le lupin qui peuvent survivre
une concentration aussi leve que 1700 mM NaCl.
Concernant le type de sel, il a t rapport que les chlorures sont plus toxiques que les sulfates
(El Sheikh et Wood, 1989). La croissance de Sinorhizobium meliloti a t svrement affecte
par les chlorures associs aux ions de magnsium que par les ions de sodium et de potassium
(Jian et al., 1993).
Les cellules de rhizobia exposes aux concentrations leves de sel accumulent souvent des
osmolytes organiques protecteurs tels que des acides amins comme la proline, la btaine (et
drivs), lectone et le glutamate ou des carbohydrates comme le trhalose, le saccharose et
autres afin de maintenir la turgescence de la cellule et de limiter les dgts causs par le sel
(Boncompagni et al., 1999 ; Botsford et Lewis, 1990 ; Brhada et al., 1997 ; Gouffi et al.,
1999).
. 26
La slection des souches osmotolrantes haut potentiel fixateur dazote doit tre intgre
dans toute slection de lgumineuses pour des rgions prsentant des problmes de salinit.
3. 1. 1. 5 - Tolrance au pH
Les pH extrmes affectent les deux partenaires symbiotiques. La majorit des lgumineuses
ncessitent des pH neutres ou lgrement acides pour stablir dans le sol (Bordeleau et
Prvost, 1994). Cependant, dans les sols acides, les fortes teneurs en manganse et surtout en
aluminium inhibent la croissance racinaire, le nombre des nodosits diminue et lactivit de la
nitrognase ainsi que lultrastructure nodulaire se trouvent trs affectes.
Le pH du sol a une grande influence sur la survie et la multiplication des rhizobiums. Le pH
optimal pour les diverses phases de la croissance des rhizobiums peut varier, mais en gnral
ce sont des bactries neutrophiles. Graham et Parker (1964) ont montr que le pH bas critique
pour la croissance de Rhizobium japonicum et de Rhizobium lupini est compris entre 4 et 6.
Des tudes ultrieures ont indiqu que les rhizobiums prsentent des rponses varies face
aux variations du pH (Jordan, 1984 ; Glenn et Dilworth, 1994).
Lacidit est beaucoup plus rpandue que lalcalinit dans plusieurs rgions du monde. A
loppos, les sols acides sont rares au Maroc. Le pH le plus bas enregistr pour diffrentes
rgions du pays est de lordre de 5 units (Aurag et Sasson, 1992).
Face lacidit, les souches de rhizobium varient largement dans leur tolrance.
Sinorhizobium meliloti a t rapport tre sensible au pH acide (Brockwell et al., 1991). Une
souche appartenant cette espce a t rcemment caractrise par une tolrance satisfaisante
dans un champ de sol pH 5.0 (Howieson et al., 1998). Rhizobium tropici et Mesorhizobium
loti sont considrs comme des souches trs tolrantes lacidit (Graham et al., 1994 ; Wood
et al., 1988). Certaines souches rhizobiennes peuvent mme supporter et survivre dans un pH
trs bas de lordre de 3,5 (Yadav et Vyas, 1973).
Les mcanismes dadaptation physiologiques et biochimiques des rhizobiums sous les
conditions acides sont nombreux (OHara et Glenn, 1994 ; Graham et al.,1994). Ces
mcanismes incluent entre autres lexclusion et lexpulsion des protons H+ (Chen et al.,
1993a), la forte teneur en potassium et en glutamate du cytoplasme des cellules stresses
(Aaron et Graham, 1991), le changement de la composition du LPS (Chen et al., 1993b), et
laccumulation de polyamines (Fujihara et Yoneyama, 1993).
. 27
Lalcalinit est moins nfaste sur la survie des rhizobiums. Jordan (1984) a montr que la
majorit de ces bactries peuvent tolrer des pH allant jusqu 9. Le mme rsultat a t
retrouv chez des souches nodulant lacacia (Zerhari et al., 2000) et le pois chiche (Matallah
et al., 2002). Cependant, leffet ngatif que reprsente le pH alcalin du sol est lindisponibilit
des minraux indispensables autant pour le rhizobium que pour la plante hte tel que le fer et
le manganse (Bordeleau and Prvost, 1994).
La slection des souches tolrantes aux pH extrmes peut constituer un moyen prometteur
pour une augmentation symbiotique potentielle dans les zones problmes.
3. 1. 1. 6 - Tolrance la temprature
La temprature joue un rle important sur les quilibres microbiens du sol. Linfluence de la
temprature sur la croissance est en fait une mesure de linfluence de la temprature sur la
turgescence et sur laction des enzymes de la cellule. Les tempratures leves engendrent la
dshydratation et la dgradation des enzymes de la voie mtabolique des bactries. Par contre,
les basses tempratures entranent la glification de leau cellulaire et linactivation parfois
irrversible des enzymes. Le stress thermique (non extrme) induit gnralement lexpression
de protines de stress thermique HcP (Heat shock proteins), qui assurent la protection des
enzymes clefs de la physiologie microbienne (Cloutier et al., 1992).
Leffet des basses tempratures sur les rhizobiums est moins rapport par rapport aux
tempratures leves (Prvost et al., 1987 ; Lynch et Smith, 1993 ; Roughley, 1970). En
gnral, ces bactries sont tolrantes aux basses tempratures de lordre de 4C et 5C. Cest
le cas courant chez les souches isoles des rgions arctiques (Bordeleau and Prvost, 1994).
Hume et Shelp (1990) ont montr que la souche Bradyrhizobium japonicum 532C, isole au
Canada, a t plus performante dans des tests dinoculation de plantes de soja sous les
conditions canadiennes que les souches USDA 110 et USDA 142 isoles aux Etats Unis.
Il a t rapport que les tempratures basses extrmes inhibent lexpression des gnes nod et
donc linfection et la nodulation (Zhang et al., 1996). A loppos, la temprature leve
affecte la diffrenciation des rhizobia en bactroides ainsi que le fonctionnement de la
nodosit (Zahran, 1999). Piha et Munns (1987) ont rapport que les nodosits de la fve
formes 35C taient de petite taille et que lactivit de la nitrognase tait trs basse.
La temprature optimale de la fixation dazote dune espce bactrienne est gnralement
corrle avec la temprature de lhabitat normal de cette espce. Il a t ainsi rapport que les
. 28
tempratures critiques de la fixation dazote sont de 30C pour la trfle et le pois (Michiels et
al., 1994), de 30C 33C pour le Haricot (Piha et Munns, 1987) et varient entre 35C et
40C pour les graines de cacahutes et de soja (Michiels et al., 1994).
Dans les conditions extrmes, en loccurrence sous stress thermique et hydrique, des souches
de rhizobiums ayant une capacit suprieure dadaptation peuvent tre slectionnes pour une
exploitation effective de la fixation dazote (Aurag et Brhada, 1995 ; Mpepereki et al., 1997).
3. 1. 1. 7 - Rsistance intrinsque aux antibiotiques
Le sol reprsente une niche cologique o diffrents microorganismes peuvent tre prsents.
Les rhizobiums rpondent de faon slective aux diffrents stimuli mis par ces organismes.
Ces derniers peuvent scrter des antibiotiques afin dinhiber la croissance ou de dtruire les
autres microorganismes voisins.
Schwinghamer (1967) et Brockwell et al. (1977) ont rapport que les antibiotiques exognes
peuvent affecter extrmement la capacit des rhizobiums infecter leur plante hte voire
mme entraner la perte de leur capacit symbiotique.
Laction dun antibiotique est caractrise par la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui
reprsente la plus faible concentration de lantibiotique inhibant la croissance du rhizobium
la temprature optimale de 28C. Les profiles de la CMI de diffrents antibiotiques sont dun
intrt cologique trs important puisquils permettent didentifier une souche de rhizobium
dtermine introduite dans un sol particulier (Obaton, 1971).
Les antibiotiques agissent globalement sur les enveloppes cellulaires (paroi, membrane
cytoplasmique) et sur la synthse des protines et des acides nucliques par des mcanismes
spcifiques (Karanja et Wood, 1988). Le mode daction de ces molcules varie en fonction du
type de lantibiotique (Graham, 1963) ainsi quen fonction de la concentration teste
(Lindstrm et Lehtomki, 1988).
La rsistance intrinsque aux antibiotiques a t tudie aussi bien chez les souches de
Rhizobium (Eaglesham, 1987 ; Zhang et al., 1992) que celles de Bradyrhizobium (Kuykendall
et al., 1988). Le degr de la rsistance peut varier dune espce une autre et mme entre les
souches de la mme espce (Shishido et Pepper, 1990 ; Zhang et al., 1991 ; Odee et al.,
1997). Une rsistance multiple diffrents types dantibiotiques peut tre identifie chez une
mme souche de rhizobium (Cole et Elkan, 1979 ; Jenkins et Bottomley, 1985). La rsistance
. 29
des rhizobia de lupin diffrents antibiotiques a t value par Slizak-Wank et Piotrowski

(1991).
Le mcanisme de rsistance aux antibiotiques le plus rpandu chez les bactries Gram
ngatives est linactivation extra ou intracellulaire de lantibiotique, ce qui aboutit la perte
de laffinit de lantibiotique pour sa cible. Un autre mode connu de rsistance consiste la
modification de la cible de lantibiotique (Weaver et Frederick, 1982).
3. 1. 1. 8 - Rsistance intrinsque aux mtaux lourds
Les mtaux lourds sont prsents naturellement dans le sol suite la dgradation des roches
mres. Plusieurs paramtres influencent la disponibilit et la mobilit des mtaux dans le sol.
Les plus importants signaler sont le pH, le type du sol et les processus physico-chimiques
exercs par les diffrents tres vivants qui existent dans ce sol.
Certains mtaux tels que le fer, le phosphore, le molybdne, le calcium et le nickel sont
indispensables pour la croissance aussi bien des rhizobiums que de leurs plantes htes.
Dautres mtaux tels que le cadmium, laluminium, le mercure, etc. ne semblent prsenter
aucune utilit. La disponibilit de ces lments se situe soit des niveaux trs bas ou trs en
excs, au point de la toxicit (Ernst, 1990).
La toxicit due aux mtaux lourds dans le sol peut entraner un dclin des populations de
rhizobiums et affecter irrversiblement leur croissance et leur performance symbiotique (Mc
Grath, 1994 ; Mc Grath et al., 1995 ; Giller et al., 1998). Tong et Sadowsky (1994) ont
rapport que les souches croissance lente sont plus rsistantes aux mtaux lourds que les
souches croissance rapide. Des rsultats non concordants ont t toutefois observs chez les
deux souches Sinorhizobium meliloti et Sinorhizobium fredii (Kinkle et al., 1994).
Les rhizobiums ragissent variablement aux diffrents types de mtaux lourds et ceci en
fonction des concentrations appliques (Kinkel et al., 1987). Le traitement de Rhizobium
leguminosarum et dAgrobacterium tumefaciens avec du cadmium a aboutit des bactries
qui ont perdu la capacit de reproduction (Alexander et al., 1999). Par contre, le traitement de
Bradyrhizobium japonicum avec du nickel a entran favorablement une augmentation
considrable de lactivit de lhydrognase dans les bactroides (Klucas et al., 1983).
Les mcanismes de rsistance des bactries aux mtaux lourds sont trs complexes. Ils
consistent soit la synthse de protines ou de polymres extracellulaires qui adhrent au
. 30
mtal, soit par compartimentation lintrieur des cellules et soit par le moyen le plus
commun, la diminution de lassimilation et lactivation de lexportation (Ross, 1993 ;
Tomsett, 1993). Comme chez toutes les bactries, les gnes de rsistance aux mtaux lourds
chez les rhizobiums sont localiss au niveau des plasmides (Silver, 1992).
Lidentification et la slection de couples symbiotiques Rhizobium-lgumineuse rsistants aux
mtaux lourds peut constituer un moyen trs efficace pour palier lcotoxicologie des sols
contamins (Wetzel et werner, 1995).
3. 1. 2 Les marqueurs molculaires

Ces marqueurs regroupent diffrentes techniques utilisant les acides nucliques ADN ou ARN
pour tudier la localisation ou la variabilit en squence des gnes ou de fragments de gnes.
Les techniques les plus utilises chez les rhizobiums sont les suivantes :
3. 1. 2. 1 Le pourcentage en nuclotides G+C
Lvaluation du pourcentage en molarit des bases G+C contenus dans lADN (coefficient de
Chargaff) est essentielle pour la description des bactries (Vandamme et al., 1996). Cette
mthode peut tre utilise comme un premier moyen taxonomique des rhizobia. Toutefois, ce
coefficient ne peut pas constituer lui seul une base suffisante pour sparer entre les
diffrents genres ou espces de rhizobium. En effet, selon Graham et al. (1991), les souches
de Rhizobium ont une valeur du pourcentage G+C qui varie de 59 64 %, les souches de
Badyrhizobium ont des valeurs comprises entre 61 et 65 % alors que les souches
dAzorhizobium prsentent des valeurs leves de 66 68 %.
3. 1. 2. 2 Le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (RFLP)
La RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) consiste en la coupure de fragments
dADN amplifis ou non par des enzymes de restriction des sites spcifiques composs par
4, 6 ou 8 bases nuclotidiques. Cette technique est souvent couple la mthode de
lhybridation molculaire par Southern Blot ou la PCR (PCR-RFLP).
-
Dans la PCR-RFLP, les fragments amplifis par PCR sont digrs par des enzymes de
restriction puis rvls par lectrophorse. Le nombre et la diffrence de migration des
diffrents fragments obtenus permet lvaluation et lanalyse du polymorphisme
apparent. Une des techniques qui drive de cette mthode est la PCR-RFLP du gne de
. 31
lADNr 16S connu galement par lARDRA (Grtler et al., 1991 ; Vaneechoutte et al.,
1992). Cette technique est largement utilise pour ltude de la diversit gntique ainsi
que la classification des rhizobia (Willems et Collins, 1993 ; Laguerre et al., 1994 ;
1997).
-
Dans le cas du Southern Blot, lADN digr est soumis une lectrophorse sur gel
dagarose puis les fragments obtenus sont sujets lhybridation par des sondes
spcifiques travers une membrane de nitrocellulose. Chez les rhizobiums, des sondes
drivs partir de lopron de lADNr ont t utilises (Sadowsky et al., 1990 ; Grimont
et Grimont, 1991 ; Eardly et al., 1992).
3. 1. 2. 3 Llectrophorse en champ puls (PFGE)

La PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) est un cas particulier de la RFLP. LADN est
digr avec des enzymes faible frquence de restriction. Par consquent, les fragments
obtenus sont plus faibles en nombre et plus grands en taille. Lanalyse lctrophortique de
ces fragments se fait par des modifications de la direction de migration travers des
changements successifs du courant. La vitesse de migration et la rorientation des fragments
se fait selon leurs tailles respectives (Huber et Selenka-Pobell, 1994 ; Morton et al., 2001).
La PFGE a t utilise pour la diffrentiation entre les souches dune mme population de
Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Corich et al., 1991) et entre les souches nodulant
diffrents arbres lgumineux originaires du Sudan (Haukka et Lindstrm, 1994).
3. 1. 2. 4 Mthodes utilisant des amorces alatoires (RAPD, lAP-PCR , DAF)
La RAPD (Random Amplied Polymopphic DNA) est une technique damplification par PCR
des squences alatoires disperses sur tout lADN gnomique. Les amorces utilises sont
courtes, gnralement 10 nuclotides, et sont non spcifiques, par consquent lamplification
gnre de nombreux fragments de diffrentes tailles qui permettent de caractriser une souche
de rhizobium dune autre (Vinuesa et al., 1998).
LAP-PCR (Arbitrary primed PCR) utilise des amorces arbitraires de 10 20 nuclotides
(Welsh et McClelland, 1990) alors que la technique DAF (DNA amplification fingerprinting)
utilise des amorces dont la taille varie entre 5 et 10 nuclotides (Caetano-Anolls et
Gresshoff, 1991).
. 32
Ces techniques sont trs sensibles aux variations infimes de la concentration de lADN, des
ions magnsium, de la polymrase et exigent une grande puret de lADN (Berg et al., 1994)
ce qui rend leur reproductibilit trs limite.
3. 1. 2. 5 Le polymorphisme de la longueur des fragments amplifis (AFLP)
LAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) est lamplification slective de
fragments de restriction partir de lADN gnomique totalement digr (Vos et al., 1995). La
technique de lAFLP permet une grande rsolution gntique et elle est plus reproductible que
les autres mthodes (Terefework et al., 2001). Cette technique sest rvle plus
discriminative que lARDRA dans le cas des souches de Bradyrhizobium (Willems et al.,
2001a, b, c).
3. 1. 2. 6 Les squences rptitives (REP, ERIC et BOX)
Les squences rptitives existent en multiples copies dans le gnome de la plupart des
bactries Gram ngatives et plusieurs Gram positives (Lupski et Weinstock, 1992). Trois
types de squences rptitives ont t identifis chez les bactries : des squences rptitives
inverses REP de 35 40 pb (Sharples et Lloyd, 1990), des consensus entrobactriens
squences rptitives intergniques ERIC de 124 127 pb (Hulton et al., 1991) et les
lments BOX de 154 pb (Versalovic et Lupski, 1998). Ces squences sont localises en
orientation inverse dans des zones distinctes sur le chromosome bactrien. Ces squences
paraissent hautement conserves chez les souches apparentes et trs distinctes entre les
diffrentes espces ou genres bactriens (Versalovic et al., 1991, 1992). Lamplification
slective des rgions existant entre ces squences conserves a t utilise comme une
mthode stable et rapide pour lidentification des bactries (Versalovic et al., 1998).
Lapplication de la PCR/REP aux rhizobiums a t initie par de Bruijn (1992). Ce dernier a
utilis la PCR/REP chez des souches de S. meliloti en utilisant des amorces de 18 22 pb
conues dune manire complmentaire aux squences inverses (Versalovic et al., 1991).
Depuis, plusieurs auteurs ont adopt cette mthode (Judd et al., 1993 ; Nick et Lindstrm,
1994 ; Laguerre et al., 1996 ; Vinuesa et al., 1998). Le point fort de la PCR/REP est que les
fragments amplifis issus dune cellule cultive en boite, dune prculture, voire mme dun
extrait nodulaire, prsentent des profils lctrophortiques similaires. Ce qui renforce le
caractre stable de cette mthode dans ltude de la diversit des souches, dans lidentification
. 33
des bactries et dans le suivi programm de souches nouvellement introduites dans le sol (de
Bruijn, 1992 ; Schneider et de Bruijn, 1996).
Dans un rapport rcent, Rademaker et al. (2000) ont compar la PCR/REP avec lAFLP et
lhybridation ADN / ADN chez diffrentes espces du genre Xanthomonas. Ils ont conclu que
les diffrentes techniques ont engendr des rsultats comparables et que le pouvoir
discriminant des squences rptitives est obtenu par la combinaison Box, ERIC et REP
autrement dit la BER-PCR.
Lanalyse gntique des squences rptitives, en outre sa rapidit et sa stabilit, peut tre
galement utilise comme un premier moyen dans ltude des relations taxonomiques et
phylogntiques des rhizobiums (Rademaker et al., 2000).
3. 1. 2. 7 Les gnes ribosomiques
Les gnes ribosomiques ont t utiliss comme marqueurs molculaires dans ltude
phylogntique de diffrents organismes en raison de leur universalit, leur abondance, leur
taille convenable aux analyses comparatives (Ludwig et Schleifer, 1999). En effet, la structure
de lADN ribosomique est dune nature mosaque. En effet, les ADNr contiennent des rgions
de squence hautement conserve trs utile pour la dsignation des amorces (Hillis et Dixon,
1991 ; Stahl et Amman, 1991) et dautres rgions de squence suffisamment variable pour
servir comme un excellent moyen taxonomique (Grimont et Grimont, 1986).
Chez les procaryotes, les gnes codant pour les ARN ribosomaux sont organiss en oprons
appels oprons rrn qui contiennent galement des espaces intergniques ainsi que dautres
gnes codant pour les ARNt (figure 2). Il existe trois types de lADN ribosomique : le 5S, le
16S et le 23S (Jensen et Straus, 1993). LADNr 5S est trs peu utilis vu sa petite taille
denviron 120 nuclotides, contrairement lADNr 16S codant pour la petite sous unit
ribosomique (SSU : small subunit) denviron 1500 pb (opron rrs : ribosomal rna small
subunit) et lADNr 23S codant pour la grande sous unit ribosomique (LSU : Large subunit)
denviron 2500 3000 pb (opron rrl : ribosomal rna large subunit) (Grtler et Stanisich,
1996). Lspace intergnique entre ces deux oprons ribosomiques est transcriptionel do la
dsignation ITS (intergenic transcribed spacer) (Normand et al., 1996).
. 34
Espace intergnique
(ITS)
Designation
des gnes
rrs
rrl
rrf
5
Produits
des gnes
3
ARNr 16S
ARNr 23S
ARNr 5S
ARNt
Figure 2. Organisation de lopron de lADN ribosomique observ chez les procaryotes.
. 35
Depuis que Woese (1987) a montr que le gne de lADNr 16S est prsent chez tous les
organismes, quil a la mme fonction et que sa structure primaire est conserve, plusieurs
chercheurs lont utilis comme une approche rapide pour valuer la variabilit gntique entre
les souches de rhizobiums (Laguerre et al., 1994 ; Nour et al., 1994b).
Lusage de lADNr 23S a t initialement rapport par Ludwig et Schleifer (1999). Un degr
de divergence gntique plus important peut tre galement obtenu partir de lanalyse de
lITS situ entre les gnes de la SSU et de la LSU (Hillis et Dixon, 1991 ; van Berkum et
Fuhrmann, 2000).
3. 1. 2. 8 Les gnes symbiotiques
3. 1. 2. 8. 1 - Les gnes nif
Les gnes nif existent chez plusieurs bactries dont les rhizobiums (Young et Haukka, 1996).
Ces gnes codent pour la nitrognase rductase. La phylognie des gnes nif H a t rapporte
comme tant en parfait accord avec celle qui drive de lanalyse du gne de lADNr 16S
(Hennecke et al., 1985 ; Dobert et al., 1994), en dpit de quelques exceptions (Eardly et al.,
1992). Ces dernires ont t supposes tre dues aux recombinaisons gntiques et au
transfert latral des gnes nif (Martinez-Romero et Cabarello-Mellado, 1996).
Rcemment, Haukka et al. (1998) ont compar plusieurs squences et ont conclu que la
phylognie rsultant du gne nif H est diffrente de celle de lADNr 16S mais plutt similaire
celle du gne nod A. Ce dernier rsultat est plus logique du fait que les gnes nif et nod sont
troitement lis et sont tous les deux localiss sur des lments transmissibles tels que les
plasmides chez beaucoup despces de rhizobiums ou comme des transposons chez
Mesorhizobium loti (Sullivan et al.,1995; Sullivan et Ronson, 1998). Plus de variabilit a t
galement rvle par lanalyse de lespace intergnique existant entre les gnes nif D et nif K
(Laguerre et al., 1996).
3. 1. 2. 8. 2 Les gnes nod
Les interactions entre les plantes lgumineuses et les rhizobiums varient en degr de
spcificit (Rsnen et al., 1991 ; Pueppke et Broughton, 1999). Cette spcificit est
dtermine par plusieurs lments dont principalement les facteurs Nod cods par les gnes
nod. 13 gnes de nodulation ont t dtermins : le nod D qui est un gne rgulateur et les
oprons nod ABCIJ, nod FEL, nod MNT et le nod O (Perret et al., 2000). La localisation des
. 36
gnes nod varie entre les rhizobiums, elle peut tre soit au niveau chromosomique, soit au
niveau plasmidique dans la majorit des cas (Mercado-Blanco et Toro, 1996). Le transfert
latral de ces gnes entre diffrentes espces de rhizobiums est bien vident par plusieurs
tudes (Ueda et al., 1995 ; Lorenz et Wackernagel, 1994). Les arbres phylogntiques bass
sur lanalyse des squences des gnes nod se sont rvls diffrents de ceux de lADNr 16S,
mais ils montrent toutefois des corrlations informatives avec les spectres dhtes (Haukka et
al., 1998 ; Wernegreen et Riley, 1999 ; Suominen et al., 2001).
3. 1. 2. 9 Le squenage
Les amliorations des techniques du squenage partiel ou total de gnes ont pu renforcer son
usage dans ltude de la taxonomie bactrienne. La squence la plus largement utilise chez
les rhizobiums est celle de lADNr 16S (Weisburg et al., 1991). Lutilisation de la variation
de la squence de lADNr 16S pour un but taxonomique suppose que lvolution du gnome
progresse un taux constant et que les gnes sont hrits de manire stricte dune gnration
une autre sans aucun transfert latral. Llucidation de ce fait par van Berkum et al (2003)
sest base sur la comparaison des squences de lADNr 16S, de lADNr 23S et du ITS 16S23S. Des analyses standard informatises ont t excutes et les donnes des squences ont
t utilises pour construire des arbres phylogntiques. Les rsultats ont montr que les
squences de lITS et de lADNr 23S fournissent des rsultats diffrents de ceux obtenus avec
lADNr 16S. Les trois ensembles de donnes ont produit trois arbres distincts qui ont t
impossible combiner dans un seul arbre. Selon van Berkum et al (2003), cette htrognit
pourrait tre due des vnements de conversions gntiques au sein des rgions squences
variables de lopron rrn.
En 1994, Huber et Selenka-Pobell ont rapport lexistence de multiples oprons rrn chez les
rhizobiums. Plusieurs copies de lADNr 16S peuvent exister chez les souches de la mme
espce, voire mme au sein de la mme souche (Young et Haukka, 1996).
Les donnes des squences de lADNr 16S reste nos jours, le moyen le plus simple et le
plus rapide pour ltude phylogntique des rhizobiums. Toutefois, plusieurs recherches ont
t entames dans le but dvaluer les donnes de squences partir dautres gnes tels que le
gln A, le nod C, et le rec A (Laguerre et al., 2001).
. 37
3. 1. 2. 10 Lhybridation des acides nucliques

Le taux dhomologie des acides nucliques a t largement utilis chez les rhizobiums (Jarvis
et al., 1980 ; Hollis et al., 1981 ; Scholla et al., 1984). Les valeurs dhomologie ADN / ADN
sont utiliss pour identifier le degr de similitude entre des organismes apparents, alors que
les valeurs dhomologie ARN / ADN sont couramment utilises pour valuer les similitudes
entre des organismes distincts (van Berkum et Eardly, 2003). Il a t convenu que
lhybridation ADN / ADN avec une valeur de 70% ou plus et une Tm (stabilit thermique
des hybrides) de 5% ou moins, devient une base standard pour la description de nouveaux
genres ou despces de rhizobiums (Graham et al., 1991). Par consquent, lanalyse de
lhybridation molculaire est devenue un moyen permettant dtudier les relations
phylogntiques entre les rhizobiums (van Berkum et al., 1993) et dlucider la position
taxonomique de diffrentes souches ou despces au sein des genres de rhizobiums connus
(Willems et al., 2001a).
3. 1. 2. 11 Les plasmides
Chez les bactries, une proportion significative du gnome est compose par les plasmides
(Teyssier et al., 2004). Ceux-ci font partie dun ensemble dlments gntiques
transmissibles qui peuvent tre transmis verticalement par le phnomne de la rplication ou
horizontalement par conjugaison (Johston et al., 1978 ; Djordjevic et al., 1983). La plasticit
gntique confre par le flux horizontal des gnes joue un rle principal dans la
diversification des populations bactriennes (Ochman et al., 2000). Les plasmides portent des
gnes essentiels comme ceux de la synthse des toxines, de la rsistance aux antibiotiques et
aux mtaux lourds, de la nodulation et de la fixation symbiotique, etc. (Downie et Young,
2001 ; Barnett et al., 2001).
Chez les rhizobiums, les gnes symbiotiques tels que les gnes nif, nod et fix sont
gnralement ports sur des mgaplasmides appels plasmides symbiotiques (pSym ou
plasmide Sym). La taille et le nombre des mgaplasmides varient entre les espces (Hartmann
et Amarger, 1991 ; Perret et al., 2000).
Lvidence du transfert latral du pSym chez les populations du sol a t dmontre entre les
souches dune mme espce dans le cas de R. leguminosarum (Schofield et al., 1987), entre
deux espces diffrentes dans le cas de R. leguminosarum et Sinorhizobium fredii (Kinkle et
Schmidt, 1991), voire mme entre des genres diffrents dans le cas de R. leguminosarum et
. 38
Enterobacter (Dohler et Klingmuller, 1988). Cette instabilit plasmidique peut rsulter la

perte ou au gain de la performance symbiotique (Martinez-Romero et al., 1991 ; Zhang et al.,
2001).
La comparaison des squences de plusieurs pSym a montr que les diffrents gnes ports par
les plasmides peuvent avoir des origines bien diffrentes (Freiberg et al., 1997). Les
squences totales du pSym de Sinorhizobium sp. NGR 234 (Freiberg et al., 1997), de
Mesorhizobium loti (Kaneko et al., 2000) et de Sinorhizobium meliloti (Galibert et al., 2001)
ont t rcemment publies.
3. 1. 3 Autres marqueurs
Ltude de la diversit des rhizobia emploie galement dautres marqueurs dont les plus
couramment utiliss sont dcrits ci-dessous,
3. 1. 3. 1 - Analyse des protines cellulaires totales par SDS-PAGE
Lisolement des protines cellulaires purifies est une tape critique dans cette analyse.
Lensemble des protines isoles est analys par lectrophorse sur un gel dacrylamide en
conditions dnaturantes par la prsence du SDS.
La SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) des protines
totales a t utilise dans ltude taxonomique de plusieurs souches de rhizobia trs
rapproches (Moreira et al., 1993 ; Vandamme et al., 1996). Cette mthode permet ltude de
la diversit qui existe entre les souches avec un pouvoir de rsolution allant du niveau souche
espce. Dans le cas des rhizobia darbres lgumineux telles que les acacias du sahel, cette
technique sest rvle trs fiable comme un marqueur de discrimination entre les souches (de
Lajudie et al., 1994 ; Dupuy et al., 1994).
3. 1. 3. 2 Le polymorphisme enzymatique (MLEE)
Par la MLEE (Multilocus enzyme electophoresis), plusieurs enzymes solubles peuvent tre
analyses (Selander et al., 1986). Lvaluation de la variabilit enzymatique ncessite en
premier lieu la culture de la bactrie en quantit suffisante pour lextraction du culot
protique. Cette tape prsente un inconvnient pour les bactries ayant un taux de croissance
assez long. La deuxime tape consiste lisolement dun enzyme dtermin chez les
diffrentes bactries analyser, la migration par lectrophorse SDS-PAGE, puis la rvlation
. 39
du polymorphisme par raction colore. Les diffrents types obtenus refltent les variations
relatives chaque enzyme (Barrera et al., 1997).
Les profils isoenzymatiques ont t analyss chez diffrents rhizobia pour estimer la diversit
gntique qui existe entre les souches croissance rapide et celles croissance lente (Young,
1985) et entre les rhizobia appartenant la mme espce telle que Rhizobium leguminosarum
bv. Phaseoli (Pinero et al., 1988) et Rhizobium meliloti (Eardly et al., 1990).
3. 1. 3. 3 - Analyse des acides gras
Les acides gras sont les constituants majeurs de plusieurs varits de lipides et de
lipopolysaccharides. Ils ont t largement utiliss dans ltude de la taxonomie bactrienne
(Vandamme et al., 1996).
-
Lanalyse des acides gras cellulaires ou FAME (fatty acid methyl esters) chez des
souches de Bradyrhizobium japonicum a montr des rsultats en concordance avec ceux
de lhomologie ADN / ADN (Kuykendall et al., 1988). Cette technique est largement
dcrite par Graham et al (1995).
Les lipopolysaccharides prsents au niveau de la membrane externe des bactries Gram

ngatives peuvent tre caractriss par SDS-PAGE (de Maagd et al., 1988). Lanalyse
des LPS a permis dobtenir une bonne valuation de la diversit qui existe entre
diffrentes souches de Rhizobium leguminosarum (Cava et al., 1989), de Rhizobium sp.
(Galegae) (Lipsanen et Lindstrom, 1989) et des rhizobia nodulant diffrentes espces
dacacia existantes au Maroc (Berkia, 2004).
3. 1. 3. 4 La srologie
La diversit srologique chez les rhizobiums a t largement tudie (Caldwell et Vest, 1968 ;
Weber et al., 1989 ; Fuhrmann, 1990). Les tests srologiques sont bass sur des techniques
immunologiques utilisant des anticorps poly- ou monoclonaux et permettent lidentification
des souches suivant des ractions dimmunoagglutination anticorps-antignes. Ces ractions
sont values par immunodiffusion sur gel (Dudman, 1971), par immunofluorescence
(Bohlool, 1987) et gnralement par spectrophotomtrie ELISA (Enzyme Linked
Immunoabsorbent Assay).
Lvaluation de la spcificit srologique est dun grand intrt dans ltude cologique des
rhizobiums (Keyser et Cregan, 1987 ; Damigri et al., 1967). La variation srologique chez les
. 40
Bradyrhizobium nodulant Glycine max a permis la description de 17 srogroupes diffrents

(Date et Decker, 1965), ce qui indique une diversit gntique assez importante.
Dautres marqueurs phnotypiques sont relativement peu utiliss, tels que lanalyse des
polyamines (Tabor et Tabor, 1985), la composition et la structure des peptidoglucans
(Schleifer et Kandler, 1972), lanalyse des quinones membranaires (Collins, 1994), la
production des rhizobitoxines (Fuhrmann, 1990), et le phage typing (Bromfield et al., 1986).
3. 1. 4 Etude polyphasique
Le terme de taxonomie polyphasique a t initi par Colwell (1970) cit par Nick (1998). A
lpoque, la classification tait base sur la comparaison de diffrentes analyses
phnotypiques et biochimiques. Cependant la rvolution de diffrentes techniques
molculaires durant les vingt dernires annes dont principalement la PCR (Mullis et Faloona,
1987) a permis la rvision de lapplication de la terminologie polyphasique. Ainsi, Graham et
al. (1991) ont propos les principes standard de la description de nouveaux genres ou
despces sur la base de lanalyse numrique qui est la synthse des rsultats de diffrents
tests phnotypiques et molculaires. Cette nouvelle dfinition de lapproche polyphasique a
permis ltude systmatique approprie de grands groupes bactriens, lvaluation de la
rsolution taxonomique de diffrentes techniques (Vandamme et al., 1996) (figure 3) et
ltablissement de bases de donnes comparables entre diffrents laboratoires de
microbiologie applique (Gillis et al., 2001).
4 TAXONOMIE ET PHYLOGENIE DES RHIZOBIA

4. 1 Taxonomie ou systmatique des rhizobiums
La taxonomie a pour but de rassembler des organismes partageant des caractristiques
communes en groupes ou taxons bien dlimits. Les groupes sont dfinis selon trois tudes,
lidentification, la nomenclature et la classification. La premire ncessite lisolement de la
bactrie, sa caractrisation par des analyses phnotypiques et molculaires universelles et la
comparaison des caractres ceux des bactries connues. La deuxime consiste donner un
nom spcifique la bactrie identifie selon le Code International de Nomenclature
Bactrienne qui comporte le nom du genre et de lespce. Tout genre doit tre reprsent par
une espce type et toute espce doit tre reprsente par une souche type.
. 41
Famille
Genre
Espce
Souche
Marquage aux sondes dADN

Squenage de lADN
Analyse phnotypique
(classique, API, etc.)
Squenage de lARN
Hybridation ADN : ARNr
Analyse chimiotaxonomique
(polyamines, quinones, etc.)
FAME
Hybridation ADN : ADN
PCR/ARNr
% en G+C
RFLP ARDRA
RAPD DAF APPCR
AFLP
Rep-PCR
Analyse des protines
cellulaires totales
Polymorphisme des isoenzymes
Phage typing
MLEE
Srologie
Figure 3. Rsolution taxonomique des diffrentes techniques utilises pour ltude de la

diversit des rhizobiums (Daprs Vandamme et al., 1996 et de Bruijn et al., 1997).
. 42
Par exemple, le genre Bradyrhizobium est reprsent par lespce Badyrhizobium japonicum
qui elle mme est reprsente par la souche USDA 110. La classification permet de regrouper
les espces par des approches molculaires en niveaux taxonomiques plus levs, du genre
la famille puis lordre.
Les rhizobiums sont reconnus comme tant des bactries fixatrices dazote, Gram ngatives,
arobiques et prsentes soit ltat libre et en gnral dans le sol soit en association avec des
lgumineuses. Ils appartiennent la sous classe alpha des protobactries de la grande classe
des eubactries (Maidak et al., 1994).
Les rhizobiums ont t antrieurement dfinis comme des micro-organismes symbiotiques
capables de former des nodosits au niveau du systme racinaire des lgumineuses. Frank
(1879) a rapport que ces micro-organismes taient des champignons en leur affectant le nom
de Schinzia leguminosarum. En 1888, Hellriegel et Willfarth ont fourni une explication
scientifique pour la fixation biologique de lazote. Dans la mme anne, Beyerinck (1888) a
pu isoler une bactrie dune plante lgumineuse et la nomme Bacillus radicicola. Par la
suite, le bacille a t renomm Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889). Baldwin et Fred
(1929) ont rapport que la classification des diffrents rhizobiums devrait tre base sur la
spcificit de lespce bactrienne par rapport la plante hte. Ainsi, Fred et al. (1932) ont pu
identifier six groupes de nodulation croise, Rhizobium leguminosarum pour Lathyrus, Pisum,
Vicia et Lens ; R. trifolii pour Trifolium ; R. phaseoli pour Phaseolus ; R. meliloti pour
Glycine max et R. lupini pour Lupinus. Cette premire classification a connu par la suite
plusieurs critiques (Wilson, 1944).
Lohnis et Hansen (1921) ont montr que les rhizobiums prsentent une croissance soit lente
soit rapide dans le milieu synthtique. Le concept du taux de croissance a t repris par Norris
(1965) qui a dfini en plus le critre de laffinit symbiotique. Selon lauteur, les bactries
croissance lente nacidifient pas le milieu de culture et nodulent les lgumineuses des rgions
tropicales, alors que les bactries croissance rapide acidifient le milieu de culture et nodulent
les lgumineuses des rgions tempres. Cependant, plusieurs contre-exemples ont t
rapports. Ainsi, Lupinus et Corallina qui sont des lgumineuses des rgions tempres, sont
nodules par des bactries croissance lente (Allen et allen, 1981). Sesbania et leucaena qui
sont des lgumineuses des rgions tropicales, sont nodules par des bactries croissance
rapide (de Lajudie et al., 1994). Des bactries taux de croissance diffrents peuvent tre
galement isoles partir dune mme espce comme glycine max (Scholla et Elkan, 1984),
. 43
voire mme de la mme plante comme Acacia. En fait, Acacia peut tre nodule par des
Rhizobium (Barnet et al., 1993), des Bradyrhizobium (Dupuy et al., 1994) et par des
Sinorhizobium (de Lajudie et al., 1994).
Les observations discordantes entre la croissance de la bactrie et la gamme dhte ont jet le
doute sur la validit de cette classification. Toutefois, sur la base du taux de croissance,
Jordan (1982) a pu classer les rhizobia en deux genres, le genre Rhizobium pour les souches
croissance rapide et le genre Bradyrhizobium pour les souches croissance lente.
Plusieurs mthodes comparatives comme la srologie, SDS-PAGE des isoenzymes ou des
protines totales, FAME, le coefficient de Chargaff, lhybridation ARN / ADN ou ADN /
ADN, et lanalyse des plasmides ont t adoptes pour la classification des rhizobiums. Mais
ce nest quaprs lidentification en 1987 par Woese que les ADNr 16S des bactries sont
spcifiques ces bactries que la taxonomie des rhizobiums sest considrablement modifie.
La premire squence partielle de lADNr 16S a t publie par Young et al. (1991) pour la
souche Rhizobium BTAi1.
Graham et al. (1991) ont rapport que la description de toute nouvelle espce doit se baser sur
lanalyse gntique (Squence de lADNr, homologie ADN / ADN) ainsi que sur lanalyse
numrique. La combinaison de ces deux analyses a t ensuite reconnue sous le nom de
lapproche polyphasique qui est retenue jusqu nos jours pour tablir la taxonomie des
rhizobiums.
4. 2 Phylognie des rhizobiums

La phylognie est lhistoire volutive qui rvle les rapports existants entre un groupe
dorganismes avec un anctre situ un plus haut niveau taxonomique.
La comparaison des donnes obtenues pour les souches ou les espces par diffrentes
approches molculaires permet lidentification de groupes ou de taxons. Les diffrents taxons
obtenus peuvent alors tre compars et utiliss pour le traage de lignes de filiation
reconnues communment sous le nom darbre phylogntique.
Les relations phylogntiques tablies entre les rhizobiums sont nos jours bases
principalement sur la comparaison des squences de lADN ribosomique 16S (Olsen et al.,
1994) (figure 4).
. 44
Figure 4. Arbre phylogntique des rhizobiums et despces apparentes construite par la

mthode du neighbor joining partir de la squence complte de lADNr 16S (Terefework et
al., 1998)
. 45
La squence de lADNr 16S est une base fiable pour la classification des espces des
niveaux plus levs, mais elle est peu informative aux niveaux souches et individus (Willems
et al., 2001b). A ces niveaux, lhybridation de lADN gnomique savre ncessaire.
Les lignes volutives values sur la base des squences de lADNr 16S des diffrents
genres reconnus des Rhizobiaceae ne semblent gure tre monophyltiques. Ces lignes
regroupent dautres bactries (Sawada et al., 2003) telles que Methylobacterium nodulans (Sy
et al., 2001 ; Knsel, 1984), Ralstonia taiwanansis (Chen et al., 2001), Devosia neptuniae et
Burkholderia qui appartiennent la sous-classe des - protobactries (Moulin et al., 2001).
Il a t rapport que la phylognie tablie actuellement pour les Rhizobiaceae ne peut pas
reflter la vraie phylognie de la famille parce quun seul gne (ADNr 16S) ne constitue pas
une base suffisante pour reprsenter le gnome entier (van Berkum et al., 2003). En outre, une
seule portion des rhizobiums, celles ayant la capacit former des nodosits, a t jusqu' lors
analyse. Cette portion ne peut pas tre reprsentative de la population totale prsente dans le
sol (Bromfield et al., 1995 ; Palmer et Young, 2000).
La phylognie des rhizobiums ne peut pas cependant reflter les traits symbiotiques impliqus
dans la spcificit de lhte cause de la difficult tablir la gamme dhte vu le grand
nombre despces de lgumineuses (Laguerre et al., 2001 ; Debell et al., 1997) mais aussi
cause du transfert latral des gnes symbiotiques (Smalla et al., 2000) qui engendre soit
lacquisition soit la perte de la capacit symbiotique (Young et Haukka, 1996 ; AmabileCuevas et Chicure, 1992).
Petes et Hill (1988) ont rapport que ltablissement des cartes gntiques ainsi que la
reconnaissance des frquences de recombinaisons gntiques entre les diffrentes genres ou
espces de rhizobia pourrait approfondir la base pour une systmatique plus fiable. Selon
Martinez-Romero et Caballero-Mellado (1996), les organismes apparents doivent avoir en
plus de la similitude nuclotidique des squences de gnes bien dfinis, une organisation des
gnes et une taille chromosomique similaire, en dautres termes des cartes gntiques trs
rapprochs.
De nos jours, lusage de la squence de lADNr 16S reste loutil principal dans ltude de la
phylognie microbienne. Cependant, de nouvelles techniques molculaires sont rcemment
adoptes. Les plus utilises sont : la technique FT-IR (Fourier-transfom infrared
spectroscopy) qui permet dtudier la diversit des bactries au niveau intraspcifique
. 46
(Oberreuter et al., 2002), la technique du typage par PCR cibl (target PCR fingerprinting)
(Perret et Broughton, 1998) et surtout la technique des puces ADN communment appele
DNA microarrays. Dans cette dernire technique, la conception des puces permet de dtecter
simultanment des milliers de squences voire mme recouvrir lintgralit du gnome dun
organisme (Shalon et al., 1996). Par la mme technique, Rberg et al. (2003) ont pu analyser
la totalit du gnome de Sinorhizobium meliloti. Lensemble de ces techniques peuvent
rvler plus dinformation sur la diversit des rhizobia et peuvent donc fournir plus de
donnes qui seront disponibles pour ltude de la phylognie.
4. 3 Classification actuelle des rhizobiums

Les diffrentes espces reconnues des rhizobiums (tableau 1) sont fondues dans les genres
dcrits ci-dessous.
4. 3. 1 - Allorhizobium
Le nom Allorhizobium qui signifie autres rhizobia, a t propos par de Lajudie et al. (1998a)
comme tant un genre non spcifique. La souche type de ce groupe est Allorhizobium
undicola qui a t isole partir dune lgumineuse tropicale endmique du Sngal :
Neptunia natans. La souche montre un linage distinct dans le cluster form par Rhizobium et
Agrobacterium dans larbre phylogntique avec un fort rapprochement dAgrobacterium
vitis (Young et al., 2001 ; Kuykendall et Dazzo, 2003).
4. 3. 2 - Azorhizobium
Azorhizobium caulinodans est la seule espce reconnue de ce genre. Elle se distingue par une
croissance rapide et la prsence dun seul flagelle latral. De plus, elle nodule non seulement
les parties racinaires mais aussi les parties ariennes de Sesbania rostata (Dreyfus et al.,
1988). Une seconde espce Azorhizobium johannae a t propose (Rinaudo et al., 1991).
Cette souche est caractrise par un faible taux dhybridation ADN / ADN par rapport la
souche type du genre. Lanalyse des squences de lADNr 16S a montr que la souche type se
trouve entre-mlange avec des souches du genre Xanthobacter et Aquabacter. Le
regroupement de ces deux derniers genres avec Azorhizobium a t examin sans tre
cependant propos en raison de la grande dissimilitude des caractres phnotypiques (Trinick,
1980 ; Kuykendall et al., 2004a).
. 47
Tableau 1. Classification actuelle des diffrentes espces de rhizobia.
Genres
Espces
Allorhizobium
A. undicola
Azorhizobium
A. caulinodans
Plantes htes
Rfrences
Neptunia natans
de Lajudie et al., 1998a
Sesbania rostrata
Dreyfus et al., 1988
Bradyrhizobium
Br. japonicum
Br. elkanii
Br. liaoningensis
Br. Yuanmingense
Br. betae
Br. canariense
Glycine max
Glycine max
Glycine max
Lespedeza
Betae vulgaris
-
Jordan, 1982, 1984

Kuykendall et al., 1992
Xu et al., 1995
Yao et al., 2002
Rivas et al., 2004
Vinuesa et al., 2005
Mesorhizobium
M. loti
M. huakuii
M. ciceri
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. plurifarium
M. amorphae
M. chacoense
M. sesptentrionale
M. temperatum
Lotus, Cicer, Anthyllis, Astragalus, etc.

Astragalus sinicus
Cicer arientinum
Glycyrrhiza pallidiflora
Cicer arientinum
Acacia, Chamaecrista, Leucaena, Prosopis,
Amorpha fruticosa
Prosopis alba
Astragalus adsurgens
Astragalus adsurgens
Jarvis et al ., 1982
Chen et al ., 1991
Nour et al ., 1994a
Chen et al., 1995
Nour et al ., 1995
de Lajudie et al ., 1998b
Wang et al ., 1999a
Velasquez et al, 2001
Gao et al., 2004
Gao et al., 2004
Pisum, viciae, Lens, Lathyrus

Trifolium pratense
Phaseolus vulgaris
Galega, Leucaena
Frank, 1889, Jordan, 1984

Lindstrm, 1989
Phaseolus, Medicago, Macroptilieum, etc.,

Phaseolus,
Mimosa affinis
Phaseolus vulgaris
Martinez-Romero et al., 1991

Segovia et al., 1993
Wang et al., 1999b
Amarger et al., 1997
Phaseolus vulgaris
Amarger et al., 1997
Desmodium sinuatum, Centrosema,etc.

Sesbania herbacea
Medicago ruthenica, Phaseolus
Ficus benjamina
Indigofera spp.
Hedysarum
Astrgalus, Lespedeza
Chen et al., 1997

Wang et al., 1998
Van Berkum et al., 1998
Tan et al., 2001
Bouzar et Jones, 2001
Wei et al., 2002
Squartini et al., 2002
Wei et al., 2003
Rhizobium
R. leguminosarum
biovar viciae
biovar trifolii
biovar phaseoli
R.galegae
biovar officinalis
biovar orientalis
R. tropici type IIA et IIB
R. etli
biovar mimosae
R. gallicum
biovar phaseoli
biovar gallicum
R. giardinii
biovar phaseoli
biovar giardinii
R. hainanensis
R. huautlense
R. mongolense
R. yanglingense
R. larrymoorei
R. indigoferae
R. sullae
R. loessense
. 48
Sinorhizobium
S. meliloti
S. fredii
biovar fredii
biovar siensis
S. saheli
S. terangae
biovar acaciae
biovar sesbania
S. medicae
S. arboris
S. kostiense
S. xingianense
S. morelense
S. kummerowiae
S. americanum
Medicago, Melilotus, Trigonella
Dangeard, 1926
Glycine, Vignia, Cajanus

Glycine
Acacia, Prosopis, Neptunia, Leucaena
Scholla et Elkan. 1984

Chen et al., 1988
de Lajudie et al ., 1994
de Lajudie et al ., 1994
Lorquin et al., 1997a
Lorquin et al., 1997b
Rome et al.1996
Nick et al ., 1999
Nick et al ., 1999
Chen et al., 1995
Wang et al., 2002.
Wei et al., 2002
Toledo et al., 2003
Acacia
Sesbania
Medicago truncatula, Melilotus
Acacia, Prosopis
Acacia, Prosopis
Glycine max
Leucaena leucocephala
Kummerowiae stipulaceae
Acacia
. 49
4. 3. 3 - Bradyrhizobium
Lidentification de souches croissance lente remonte 1932 (Fred et al.) mais leur
classification en un seul genre Bradyrhizobium a t tablie par Jordan en 1982. Plusieurs
espces sont nos jours reconnues, Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982),
Bradyrhizobium elkanii (Kuykendall et al., 1992) et Bradyrhizobium liaoningense (Xu et al.,
1995). Ces trois espces nodulent le soja. Elles ont t ainsi classes sur la base des
hybridations ADN / ADN et sur dautres critres gntiques et phnotypiques. La dernire
espce a t dcrite pour les souches croissance trs lente.
Par ailleurs dautres souches nodulant des lgumineuses autres que le soja, telles que Lupinus
(Barrera et al., 1997), Arachis hypogea (Urtz et Elkan, 1996), Astragalus, Oxytropis et
Onobrychis (Laguerre et al., 1997), Amphicarpaea (Sterner et Parker, 1999) et autres sont
encore non classes. Aussi sont-elles dsignes par Bradyrhizobium sp. suivi du genre de la
plante hte entre parenthses.
Plusieurs auteurs ont rapport lexistence de souches photosynthtiques appartenant au genre
Bradyrhizobium. Ces souches ont t isoles partir des tiges de lespce Aeschynomene
indica. Depuis, plusieurs souches ont t isoles partir dautres espces dAeschynomene
(Ladha et al., 1990 ; Lorquin, 1997b ; Giraud et al., 2000). Toutes ces souches forment un
groupe monophyltique au sein de la branche des bradyrhizobia (Young et al., 1991 ;
Molouba et al., 1999).
Les bradyrhizobia sont groups dans une branche bien individualise dans larbre
phylogntique des bactries symbiotiques (Sawada et al., 2003). Toutefois, dautres genres
de bactries non symbiotiques prsentent des squences de lADNr 16S qui les positionnent
dans la mme branche, cest le cas de Nitrobacter, Rhodopseudomonas, Brucella, Afipia et
Blastobacter (Martinez-Romero et Cabarello-Mellado, 1996). Certains de ces genres
prsentent des caractristiques bien particulires telles que la photosynthse (cas de
Rhodopseudomonas) et le pouvoir pathogne (cas dAfipia) (Wong et al., 1994).
La caractrisation de diffrentes souches de Bradyrhizobium par la comparaison de plusieurs
techniques molculaires a rvl lexistence de 11 gnotypes diffrents dont trois
correspondent aux souches reconnues, alors que les 8 gnotypes restants sont trs distincts
(Willems et al., 2001a, b, c).
. 50
Une nouvelle espce Br. yuanmingene a t rcemment isole du genre Lespedeza (Yao et al.,
2002 ; Euzby et Findall, 2004). Dans la mme anne, une souche de Bradyrhizobium
nodulant une plante sauvage du genre Phaseolus a t rapporte (Parker, 2002). Les autres
espces reconnues de ce groupe sont Bradyrhizobium betae (Rivas et al., 2004) et
Bradyrhizobium canariense (Vinuesa et al., 2005).
4. 3. 4 - Mesorhizobium
Ce groupe se distingue des autres rhizobiums par une flagellation polaire ou sub- polaire, par
des souches croissance intermdiaire entre celles croissance rapide et celles croissance
lente, et par la squence de lADNr 16S. Plusieurs espces ont t proposes:
-
Mesorhizobium loti (Jarvis et al., 1982) a t isole dune large gamme dhtes, Lotus,
Lupinus, Anthyllis, Astragalus, Caragena, Ononis, Genista, Cicer, Leucaena et
Ornithopus (Sahgal et Johri, 2003).
Mesorhizobium huakuii (Chen et al., 1991) a t isole partir dAstragalus mais elle
peut aussi noduler dautres lgumes.
Mesorhizobium ciceri (Nour et al., 1994a) nodule strictement le pois chiche.
Mesorhizobium tianshanense (Chen et al., 1995) dcrit un ensemble de souches trs

rapproches issues de la province xinjiang en Chine. Une seule partie de lADNr 16S a
t squence et sest rvle identique celle de M. ciceri. Cependant, lhybridation
ADN : ADN a rvl 60% dhomologie avec Mesorhizobium huakuii.
Mesorhizobium mediterraneum (Nour et al., 1995) nodule galement le pois chiche, mais
prsente des caractristiques diffrentes par rapport M. ciceri.
Mesorhizobium plurifarium (de Lajudie et al., 1998b) a t isol dAcacia, Leucaena,

Prosopis et Chamaecrista.
Mesorhizobium amorphae (Wang et al., 1999a) a t isole dAmorpha fruticosa.
Mesorhizobium chacoense (Velsquez et al., 2001) a t isole de Prosopis alba.
Mesorhizobium septentrionale (Gao et al., 2004) a t isole dAstragalus adsurgens
Mesorhizobium temperatum (Gao et al., 2004) a t isole galement dAstragalus

adsurgens.
. 51
Les espces du genre Mesorhizobium forment avec dautres espces des genres Aminobacter
et Pseudoaminobacter un seul groupe monophyltique (Sawada et al., 2003 ; Chen et al.,
2004).
4. 3. 5 Rhizobium
Rhizobium leguminosarum a t la premire espce reconnue du groupe (Frank, 1889) avec
trois biovars (Jordan, 1984) : Rhizobium leguminosarum Biovar viciae qui nodule les genres
Pisum, Viciae, Lathyrus et Lens ; Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli qui nodule le genre
Phaseolus et Rhizobium leguminosarum bv. trifolii qui nodule le genre Trifolium. Chez cette
espce, il est important de signaler que les gnes de fixation, de nodulation ainsi que ceux de
la spcificit de lhte sont localiss au niveau du plasmide, par consquent la dsignation
biovar reflte des caractristiques plasmidiques et non chromosomiques.
Rhizobium tropici a t dcrite par Martinez-Romero et al. (1991) sous deux types : type I et
type II. Les souches du type II forme des nodosits sur les racines de Phaseolus vulgaris,
Leucaena esculenta et Leuceana leucocephala. Les souches du type I ont t reclasses par
Segovia et al. (1993) sous le nom de Rhizobium etli. Les souches de ce nouveau genre ont t
reconnues pour noduler exclusivement lespce Phaseolus vulgaris. Cependant un nouveau
biovar a t isol partir de Mimosa sp. et a t nomm par consquent Rhizobium etli biovar
mimosae (Wang et al., 1999b).
Rhizobium galegae biovar orientalis et biovar officinalis ont t isoles respectivement de
Galega orientalis et Galega officinalis (Lindstrom, 1989). Cette espce prsente un ADNr
16S qui est trs diffrent de ceux des autres rhizobia mais rapproch de celui
dAgrobacterium vitis (Terefework et al., 1998, 2001).
Rhizobium gallicum biovar phaseoli et biovar gallicum et Rhizobium giardinii biovar
phaseoli et biovar giardinii ont t proposes par Amarger et al. (1997) sur la base de la
squence du gne de la SSU et des caractristiques phnotypiques pour quelques souches
isoles partir Phaseolus vulgaris et qui prsentent deux groupes distincts par rapport
Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli. Ces deux groupes de souches ont t isoles de
diffrentes rgions gographiques de France et ont t pralablement caractrises par la
mthode de la RFLP (Gniaux et al., 1993), lanalyse de la squence partielle de lADNr 16S
et lhydridation ADN / ADN (Laguerre et al., 1993).
. 52
Enfin, Rhizobium huautlense a t isole de Sesbania rostata (Wang et Martinez-Romero,

2000).
Les quatre dernires espces pourraient tre classes dans un groupe distinct, mais sont
toujours groupes avec le genre Rhizobium en raison de leur croissance rapide. Toutefois, leur
emplacement phylogntique reste vague (Kuykendall et al., 2004b).
Plusieurs nouvelles espces appartenant ce genre ont t identifies, R. mongolense (van
Berkum et al., 1998), R. yanglingense (Tan et al., 2001), R. Larrymoorei (Bouzar et Jones,
2001 ; Young, 2004), R. indigoferae (Wei et al., 2002), R. sullae (Squartini et al., 2002) et R.
loessense (Wei et al., 2003).
4. 3. 6 - Sinorhizobium
Sinorhizobium meliloti isole de Melilotus et caractrise initialement par Dangeard (1926) a
t la premire espce reconnue de ce groupe sous le nom de R. meliloti (Skerman et al.,
1980 ; Jordan, 1984).
Dautres recherches ont indiqu lisolement de souches croissance rapide partir des
nodosits de Glycine max (Keyser et al., 1982) et de diffrentes autres lgumineuses (Trinick,
1980). Ces souches ont t inclues dans le genre Rhizobium sous le nom de R. fredii (Scholla
et Elkan, 1984) puis elles ont t reclasses au sein de genre Sinorhizobium en tant que
Sinorhizobium fredii (Chen et al., 1988).
Des donnes molculaires ont indiqu que S. fredii et S. meliloti sont trs similaires (Jarvis et
al., 1992). Par une nouvelle rvision du genre, de Lajudie et al. (1994) ont pu diffrencier
entre quatre espces :
-
Sinorhizobium meliloti, propose initialement par Dangeard (1926) et isole partir des
espces Melilotus, Medicago et Trigonella,
Sinorhizobium Saheli et Sinorhizobium teranga, isoles respectivement partir dAcacia

et de Sesbania,
Sinorhizobium fredii, isole initialement de Glycine max, Vigna unguiculata et Cajanus

cajan, mais aussi dautres lgumineuses. Scholla et Elkan (1984) ont pu distinguer
partir de tests de srologie et dhybridation ADN / ADN, deux chmovars : fredii et
. 53
siensis. Chen et al. (1995) ont mme propos lexistence de deux espces diffrentes :
Sinorhizobium fredii et Sinorhizobium xinjiangensis,
La souche NGR 234 isole de Lablab purpureus a la particularit de possder un grand
spectre dhte. Les squences de lADNr 16S et des gnes nod sont trs rapproches celles
de Sinorhizobium fredii. Des tudes immunologiques ont t galement en faveur de ce
rapprochement (Jarvis et al., 1992). Toutefois, une tude rcente a rapport que les deux
souches ne forment en fait quune seule et mme souche (Saldana et Martinez-Alcantara,
2003).
Dautres nouvelles espces appartenant ce genre ont t caractrises au cours des dix
dernires annes, S. medicae (Rome et al., 1996), S. Kostiense et S. arboris (Nick et al.,
1999), S. Kummerowiae (Wei et al., 2002), S. morolense (Wang et al., 2002) et S.
americanum (Toledo et al., 2003).
Le genre Sinorhizobium forme avec quelques espces appartenant au genre Ensifer un seul
groupe monophyltique (Sawada et al., 2003 ; Willems et al., 2003).
4. 3. 7 - Cas particulier du genre Agrobacterium

Les espces du genre Agrobacterium ont t classes comme des phytopathognes capables
dinduire des tumeurs sur plusieurs espces de plantes. Ces phytopathognes ont t
distingus grce leurs plasmides. Ainsi, deux biovars ont t reconnus, Agrobacterium
Biovar 2 (rhizogenes) portant le plasmide Ri qui cause des tumeurs au niveau des racines
(Riker et al., 1930 cit par Sawada et al., 1993) et Agrobacterium Biovar 1 portant le
plasmide Ti et qui comporte deux types : Biovar 1 (tumefaciens) qui induit des tumeurs au
niveau du collet (Smith et Towsnd, 1907) et Biovar 1 (radiobacter) pour les souches non
pathognes (Beyerinck et van delden, 1902). Les deux types du biovar 1 ne peuvent tre
distingus que par leur effet pathognique (Holmes, 1988), ce qui a permis diffrentes
propositions de reclassement (Sawada et Ieki, 1992). Finalement, le Biovar 1 a t renomm
Agrobacterium tumefaciens et le Biovar 2 a t renomm Agrobacterium rhizogenes (Bouzar,
1994).
Une autre espce causant des tumeurs sur Rubus spp. a t identifie, Agobacterium rubi
(Hildebrand, 1940). Agobacterium vitis est jusqu lors la dernire espce reconnue du groupe
(Ophel et Kerr, 1990). Les diffrentes souches de cette espce ont t rapportes comme tant
. 54
spcifiques aux diffrentes espces de Vitis spp. Toutefois, des souches de la mme espce
ont t galement isoles dActinidia spp. (Sawada et Ieki, 1992).
Plusieurs autres espces dAgrobacterium ont t isoles. Cependant, leur nomenclature est
trs contreverse (Euzby et Findall, 2004).
De point de vue taxonomique, les espces dAgrobacterium sont classes avec celles du genre
Phyllobacterium (agent causal dhypertrophies chez les plantes) dans larbre phylogntique
des Rhizobiaceae (Knsel, 1984 ; Farrand et al., 2003).
Une tude plus rcente base sur lanalyse comparative des squences de lADNr 16S a
montr que les genres Rhizobium, Allorhizobium et Agrobacterium forment un seul groupe
monophyltique et quil serait judicieux de les regrouper dans un seul genre Rhizobium
(Young et al., 2001, 2003). Dans ce nouveau genre, la souche type du genre Agrobacterium
sera substitue par Rhizobium radiobacter qui regroupe les types pathognes et non
pathognes. Dans une autre tude plus rcente, il a t rapport que les trois genres forment en
effet un seul groupe monophyltique de la sous-classe - protobactries mais chaque genre
est individuellement distinct (Sawada et al., 2003).
4. 4 Taxonomie des souches nodulant le genre Lupinus

Les bactries symbiotiques nodulant le genre Lupinus ont t dcrits initialement par
Schroeter (1886). En fait, ce dernier a group ces bactries dans une mme espce Phytomyxa
lupini. En 1931, Eckhardt (cit par van berkum et Eardly, 1998) a propos deux souches types
pour les symbiotes du lupin, ATCC 10318 nodulant L. luteus et ATCC 10319 nodulant L.
angustifolius. Skerman (1980) (cit par van berkum et Eardly, 1998) a rapport que ces
bactries sont reconnues et classes comme tant Rhizobium lupini. La classification tablie
par Jordan (1982) et qui tient compte de la vitesse de croissance a permis de regrouper les
souches croissance lente dans un nouveau genre : Bradyrhizobium et par consquent les
bactries symbiotiques du lupin ont t dsignes par Bradyrhizobium sp. (Lupinus).
Les symbiotes du lupin ont t tudis par plusieurs auteurs (Crow et al., 1981 cit par van
berkum et Eardly, 1998 ; Jordan, 1982 ; Scholla et al., 1990 ; Bottomley et al., 1994). Hollis
et al. (1981) ont montr que le taux dhomologie ADN / ADN entre la souche ATCC 10319
(L. angustifolius) et Bradyrhizobium japonicum correspondait 99%. Cette valeur a t par la
suite corrige 35% par Scholla et al (1990) qui ont galement dmontr que la culture de la
. 55
souche ATCC 10319 a t contamine par Br. japonicum. Plusieurs autres mthodes, en
loccurrence FAME (Graham et al., 1995), MLEE et PyMS (Barrera et al., 1997), lanalyse
de lADNr 16S (Xu et al., 1995 ; Laguerre et al., 1994, 1997) ont montr que les
Bradyrhizobium sp. (Lupinus) sont trs rapprochs de Bradyrhizobium japonicum. Ludwig et
al. (1995) ont montr quune souche de lupin est plus rapproche du Bradyrhizobium par la
squence nuclotique aussi bien de la sous-unit ribosomique 16S que de la sous-unit
ribosomique 23S. La majorit de ces tudes ont t bases cependant, sur lanalyse
comparative dun nombre trs limit de souches nodulant le lupin.
Rcemment, Trujillo et al. (2005) ont montr par lanalyse de la squence de lADNr 16S que
deux souches croissance rapide nodulant lespce Lupinus honoratus appartiennent au genre
Ochrobactrum qui fait partie de la branche 2 des Protobactries.
Des souches croissance rapide ont t galement identifies chez le lupin (Jensen, 1967 ;
Jordan, 1982 ; Schlinkert-Miller et Pepper, 1988) mais la caractrisation prcise de ces
souches na pas connu de suite.
Vu le grand nombre despces du genre Lupinus spp. qui existent, approximativement 300
espces, ainsi que leur grande diversit cogographique (Cowling et al., 1998), on pourrait
sattendre une grande diversit au niveau des symbiotes de ces espces. Ltude de la
biodiversit et lanalyse molculaire de ces symbiotes devrait tre entreprise pour dterminer
avec exactitude leur position taxonomique au sein de la grande famille des Rhizobiaceae.
CHAPITRE II
CONSTITUTION DUNE
COLLECTION DE RHIZOBIA
NODULANT LE LUPIN ET
EVALUATION DE SA
DIVERSITE GENETIQUE
PAR PCR/REP
Constitution dune collection de rhizobia nodulant le lupin
56
.
1 - INTRODUCTION
Au Maroc, il y a eu durant les dernires annes une focalisation importante sur la constitution
dun germoplasme despces fourragres et pastorales autochtones. Parmi ces espces figurent
celles qui appartiennent au genre Lupinus. Suite cette attention, plusieurs tudes ont t
effectues afin de connatre dune part laire dadaptation et de distribution des espces et des
populations spontanes et de mieux dfinir dautre part laire potentiel o ces espces peuvent
tre cultives avec succs (Bounejmate et al., 1993 ; Beale et al., 1991 ; Thami Alami et al.,
2004).
Pour russir linstallation de ces lgumineuses et augmenter substantiellement leur rendement,
des essais dinoculation avec des rhizobia spcifiques haute performance symbiotique
peuvent tre entre autres entrepris en fonction des diffrentes rgions du pays. Au Maroc, les
lupins sont spontanment noduls par des souches autochtones de rhizobia (Birouk, 1990).
Par consquent, lamlioration de la symbiose lupin - rhizobium exige que la conservation et
la connaissance du microsymbiote soient dtermines en parallle avec les efforts de
conservation de la plante hte. Cest ainsi que nous nous sommes fix comme premier
objectif dans cette tude la constitution dune collection de souches de rhizobia nodulant les
diffrentes espces locales de lupin.
De plus, la diversit des bactries symbiotiques est un lment trs important dans les
programmes de slection de souches appliquer comme inoculum et dans ltude de
linteraction ou de la spcificit plante - microorganisme. Lune des techniques molculaires
avance utilise pour ltude de la diversit gntique des rhizobia consiste amplifier
diffrentes classes de squences rptitives (REP, ERIC, et BOX) qui existent en multiples
copies dans le gnome bactrien (PCR-rep) (Versalovic et al., 1991).
Le typage des squences rptitives REP prsente plusieurs avantages par rapport aux autres
techniques damplification par PCR dont principalement le grand pouvoir discriminatif entre
les souches de rhizobia mais galement la facilit et la rapidit, la possibilit de lapplication
sur un grand nombre de bactries et la possibilit de lamplification soit partir dune colonie
en culture pure soit directement partir dun broyat nodulaire (Lupski et Weinstock, 1992 ; de
Bruijn, 1992 ; Nick et Lindstm, 1994).
57
.
En plus de son utilisation dans ltude de la diversit gntique, la PCR/REP est galement
utilise dans ltude cologique de microorganismes nouvellement introduits dans un
environnement dtermin (de Bruijn et al., 1996).
2 - CONSTITUTION DUNE COLLECTION DE RHIZOBIA NODULANT

LE LUPIN
2. 1 - sites de collecte et analyse des chantillons de sols
Des campagnes de collecte de plantes nodules appartenant diffrentes espces de lupin ont
t menes pendant la priode du printemps des annes 1999 / 2000 et 2000 / 2001 dans
diffrentes rgions du pays (figure 5, tableau 2).
Pour chaque site, nous avons not la localit, laltitude et la pluviomtrie pays (Annexe 1).
Le nombre total des sites de collecte dans les diffrentes rgions prospectes figure dans le
tableau 2. Ces rgions sont rparties selon lchelle bioclimatique dHemberger de ltage
aride hiver froid (Asni) jusqu ltage humide hiver doux (Rif). Les diffrents sites
varient en altitude de 10 m 1000 m et en pluviomtrie moyenne annuelle de 380 mm 1000
mm (Annexe 1).
Des chantillons de sols ont t systmatiquement prlevs en surface du sol dans tous les
sites de collecte. Ces chantillons ont permis de dterminer la texture et le niveau de fertilit
de chaque sol. Lanalyse du sol reprsente une tape importante dans la dtermination des
caractristiques daphiques relatives chaque site de collecte. La texture du sol a t
dtermine par analyse granulomtrique. Le niveau de fertilit a t dtermin par des
analyses chimiques qui ont port essentiellement sur le pH, la teneur du sol en matire
organique ainsi que la teneur en azote, en potassium (K2O) et en phosphore assimilable
(P2O5). Les quatre dernires analyses ont t effectues dans le laboratoire des analyses du sol
la Station Guich, INRA, Rabat.
Les rsultats des diffrentes analyses physico-chimiques des diffrents chantillons de sols
figurent dans le tableau 3.
Lanalyse granulomtrique nous a rvl que la majorit des sols sont de type sablonneux ou
sablo-limoneux.
58
ALGERIE
MAROC
MAURITANIE
Figure 5. Position gographique des zones de prospection
Tableau 2. Liste des diffrents sites gographiques de prlvement (voir Annexe 1)
Rgions
Province ou Localit prospecte
Nombre total
de sites
Dardara Chefchaouen Ttouan Bab Taza

Cherafat
rgion de Fs- rgion de Mekns
Province de Marrakech : Asni, Ourika
La Cte atlantique
Rabat Kenitra Larache
17
Rgion du Gharb
province de Kenitra et celle de Sidi Yahya
10
Settat
Rif
Moyen Atlas
Haut Atlas
Rgion de Chaouia
59
Tableau 3. Analyse minrale et granulomtrique des sols collects

Station Texture du sol
pH
(eau)
pH
(KCl)
MO
(%)
P205
K20
(ppm) (ppm)
N
(%)
Sablonneux
7,88
7,46
0,92
25
81
0,0055
Sablonneux en mottes
7,4
7,3
0,78
13
51
0,0055
Sablo-limoneux
7,9
7,5
0,8
38
60
0,111
Sablo-limoneux
7,5
5,72
54
48
0,0047
Sablo-limoneux dur
6,66
5,25
0,91
19
51
0,0147
7,3
5,73
29
102
0,0067
7,2
6,59
1,37
16
66
0,0047
7,44
7,28
1,93
50
187
0,0095
5
6
Sablo-limoneux
6
7
Sablo-limoneux
7,2
5,22
2,75
71
0,0147
Sablo-limoneux dur
7,3
5,59
1,83
12
56
0,0078
argileux
6,4
5,6
10
Limoneux
6,44
5,74
11
Sablonneux
7,5
7,35
12
Sablo-limoneux
7,91
7,34
1,47
90
0,0026
13
Sablo-limoneux sur roche mre

calcaire
7,13
6,48
3,12
57
0,0007
14
Sablo-limoneux sur roche mre

calcaire
8,1
7,24
1,89
19
193
0,0026
15
Argileux limoneux sur roche mre

calcaire
7,28
6,79
5,53
84
422
16
Argileux
7,46
7,33
1,89
19
193
0,0150
17
Argileux limoneux sur shistes
6,36
4,05
5,3
172
0,0086
18
Argileux limoneux sur shistes
7,56
5,37
2,4
81
253
0,0944
19
limoneux
6,32
3,4
73
307
0,0127
20
Limoneux sur roche mre calcaire
6,19
22,8
153
0,0143
21
limoneux -sableux
7,21
6,84
9,4
88
0,0110
22
Sablo-limoneux
7,86
7,19
0.60
12
0,0050
60
.
Le pH du sol a t dtermin selon deux manires : le pH eau et le pH au KCl. Le pH eau

dtermin partir de la suspension du sol indique des valeurs variant de 7 8,1 cest dire
neutre lgrement alcalin. Le pH au KCl indique des valeurs infrieures celles du pH
eau. En effet, Le KCl ajout la suspension du sol permet la libration des protons adsorbs
sur les argiles. La libration de ces protons fait diminuer la valeur du pH. La variation entre
les deux mesures du pH ne dpassait gnralement pas 1 unit sauf pour les stations 17 et 18
o le sol est de type argileux-limoneux et dont les variations mesures sont de 2 units.
La majorit des sols analyss prsentent des taux moyens en matire organique (1 < % < 2).
Le pH du sol, la nature de la roche mre ainsi que le pourcentage en matire organique (MO)
sont les paramtres les plus influents sur la prcipitation et la solubilit des lments nutritifs
minraux.
Lazote est llment le plus variable et le plus dficient dans le sol, sa teneur dpend du
pourcentage de la matire organique, des amendements dengrais mais galement des espces
bactriennes fixatrices dazote. Dans notre cas, la quasi-totalit des sols analyss prsentent
des taux trs bas en azote.
Les valeurs obtenues pour le phosphore assimilable sont infrieures 50 ppm, ceci signifie
que les diffrents sols sont trs pauvres en phosphore. Ce dernier est connu pour tre
facilement adsorb sur les argiles et la matire organique du sol. Il peut galement tre
facilement prcipit sous forme de phosphates de calcium dans les sols neutres ou alcalins.
Les teneurs en potassium sont gnralement infrieurs 100 ppm et donc trs faibles. Le
potassium changeable est trs peu influenc par le pH que par la texture du sol. Il est moins
disponible sur les sols texture grossire. En outre, le potassium peut tre considrablement
lessiv dans les sols sableux.
La quasi-totalit des sols analyss possdent donc un pH soit neutre soit acide avec des
teneurs trs faibles en lments nutritifs minraux (K, P, N).
61
.
2. 2 Constitution dune collection de rhizobia

2. 2. 1- Isolement et purification des rhizobia
Les plantes de six espces de lupin, L. luteus, L. albus, L. angustifolius, L. cosentinii, L.
pilosus et L. atlanticus, ont t collectes soit en phase vgtative soit en dbut de la phase de
floraison. Les nodosits racinaires de petites tailles ont t prleves et mises dans des tubes
contenant du gel de silice dshydrat, alors que les nodosits de grande taille ont t gardes
sur les plantes qui ont t ramenes au laboratoire.
Les nodosits racinaires prleves sur les plantes des diffrentes espces de lupin ont t
prsentes en nombre et en taille variable. Les nodosits des deux espces cultives L. luteus et
L. albus ont t faibles en nombre (n 4) mais plus grandes en taille de 0,7 2,5 cm. Les
nodosits prleves sur les racines des autres espces ont t plus nombreuses (1< n < 14),
leur taille ne dpassait gure les 0,8 cm et prsentaient toutes une forme sphrique.
Les nodosits prleves sur les diffrentes plantes collectes ont servi lisolement direct des
bactries symbiotiques. Les diffrents chantillons de sol ont t galement utiliss pour
piger les bactries par lintermdiaire des plantules de L. luteus et de L. albus mises en
culture en pots contenant ces diffrents sols. Lensemble des nodosits ont t rcoltes afin
de pouvoir constituer aprs lisolement, une collection de rhizobia autochtones nodulant le
lupin.
Les nodosits collectes par isolement direct ou par pigeage ont t rinces leau courante
afin dliminer le sol, dsinfectes par une solution de chlorure mercurique acidifi (0,1%
HgCl2 dans 0,06 N HCl) pendant 5 min, puis rines abondamment avec de leau distille
strile.
Les nodosits de taille infrieure 0,5 cm ont t crases dans des ependorfs contenant 500
l dune solution de NaCl strile 0,85% (w/v). Une partie du broyat obtenu a t strie sur le
milieu YEM solide (Vincent, 1970) (Annexe 2) additionn de rouge congo 2,5%.
Les nodosits de taille suprieure 0,5 cm ont t coupes aseptiquement sur des boites de
ptri striles et la partie rougetre lintrieur de chaque nodosit a t prleve laide dune
pince strilise puis tale par striation directement sur des boites contenant du YEM solide.
62
Tableau 4. Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin et dans chaque
station de collecte
Station
Plantes htes
Nombre
des isolats
L. luteus
16
L. angustifolius
L. cosentinii
L. luteus
7
8
7
L. angustifolius
L. cosentinii
7
3
L. luteus
+
L. cosentinii
L. luteus
10
L. luteus
11
L. luteus
12
L. luteus
13
L. luteus
14
15
L. angustifolius
L. cosentinii
L. pilosus
1
3
7
16
L. angustifolius
17
18
L. luteus
L. pilosus
L. angustifolius
2
5
5
19
L. angustifolius
20
L. angustifolius
21
L. angustifolius
22
L. cosentinii
Pigeage
L. luteus+ L albus
7+2
3
4
5
6
7
63
.
Tableau 5. Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin selon les
prospections menes par lINRA de Rabat.
Localit des sites des campagnes de collecte des plantes de lupin mene par lINRA de Rabat
Plantes htes
Nombre
des isolats
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. cosentinii
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. pilosus
L. atlanticus
Settat
L. pilosus
Sehoul
L. luteus
Blad Dandoun
L. albus
Merchouch
L. albus
L. luteus
L. albus
L. angustifolius
L. cosentinii
Rabat
Gharb
Entre Azilah
et Tanger
64
.
Les diffrentes boites ont t incubes 28C pour lobtention de colonies isoles. Les
colonies obtenues ont t repiques sur le mme milieu suivant quatre dix repiquages
successifs afin de les purifier.
Un nombre de 159 isolats a pu tre obtenu via isolement direct partir des nodosits fraches
des plantes prleves au champ ainsi que par pigeage. Le nombre disolats issus de chaque
espce dans chaque station de collecte figure dans les tableaux 4 et 5. Les isolats obtenus ont
fait lobjet du test de Gram (Annexe 3) et ont t identifis comme tant des bacilles Gram
ngatifs.
Ces isolats ont form sur le milieu YEM solide des colonies circulaires de 1 3 mm de
diamtre dun aspect gommeux translucide ou crmeux et ont pu tre visibles en deux trois
jours dincubation 28C.
2. 2. 2 - Authentification des isolats

La capacit dinduire la formation de nodosits sur la racine de la lgumineuse hte est un
critre de base dans la caractrisation des rhizobia.
Lauthentification nous permet dvaluer le pouvoir infectieux de chacun des 159 isolats
obtenus vis--vis des plantules de lupin. Dans notre cas, les plantules issues des graines des
deux espces cultives au Maroc, savoir L. luteus et L. albus, ont t utilises (les souches
de lINRA ont t authentifies sur L. luteus).
2. 2. 2. 1 - Germination aseptique des graines
Les graines ont t dsinfectes dans une solution dhypochlorite de calcium 5% pendant 30
min, rinces plusieurs fois avec de leau distille strile puis immerges dans du H2SO4 95%
sous agitation manuelle pour induire la scarification. La dure de la scarification des graines a
t variable selon les deux espces. Pour L. albus, la dure a t de 3 min. contre 6 min. pour
L. luteus. Aprs plusieurs lavages, les graines ont t mises imbiber sous des conditions
striles pendant 6 heures temprature ambiante. Cette tape remplace la mise au frais 4C
pour la leve de la dormance de lembryon. Les graines bien imbibes ont t transfres dans
des boites de ptri contenant de leau glose 0,7% (w/v) puis ont t places dans un
incubateur lobscurit et 25C pendant 3 5 jours. La premire espce a donn 100% de
germination et la seconde a donn un pourcentage de 87%.
65
.
2. 2. 2. 2 - Culture et inoculation des plantules de lupin

Les graines bien germes et dont la longueur de la radicelle varie de 2,5 3 cm de long ont t
transfres dans des pots contenant 700 g dun sol de type sablo - limoneux tamis avec un
tamis de maille 0,9 mm et pralablement lav puis strilis pendant une heure 121C en
deux cycles spars par 24 h. Ce sol provient de la rgion du Guich situe Rabat.
Trois graines ont t semes aseptiquement dans chaque pot, puis les pots ont t placs dans
une chambre de culture avec une photopriode lumire/obscurit de 16 h / 8 h et un cycle de
temprature jour/nuit de 25C / 18C. Aprs cinq jours, les plantules ont t inocules avec
1ml de la suspension bactrienne en phase exponentielle de la croissance de chaque isolat mis
en culture dans du YEM liquide. Deux pots ont t utiliss pour chaque souche et pour chaque
espce. Les plantules ont t arroses deux fois par semaine avec de leau distille strile pour
viter toute contamination extrieure. Aprs un mois de culture, les plantes ont t dterres et
inspectes pour la prsence ou labsence de nodosits.
Les tests dinoculation ont pu aboutir la formation de nodosits sur les racines des plantes
des deux espces et ce pour chaque isolat. Ceci signifie que les isolats ont t infectifs la
fois vis--vis de L. luteus et de L. albus mme sils ont t initialement isols partir dautres
espces de lupin.
2. 2. 3 - Stockage et nomenclature des isolats

Suite aux diffrentes tapes danalyses prcdentes, les isolats slectionns ont t maintenus
4C dans des tubes contenant du milieu YEM dpourvu de rouge congo glose incline et
ont t galement mis en conservation -25C dans des pendorfs contenant 1 ml de la
prculture frache de chaque isolat mlang volume gale avec une solution de glycrol
80%.
Les diffrents isolats ont t dsigns par le code MSMC (Moroccan Symbiotic Microbial
Collection) suivi du chiffre 5 utilis comme rfrence pour le lupin, ensuite du chiffre 1, 2, 3,
4, 5, ou 6 respectivement pour L. luteus, L. albus, L. angutifolius, L. cosentinii, L. pilosus, et
L. atlanticus et finalement par le chiffre dsignant le numro de la souche.
Les isolats de provenance INRA ont t dsigns par le code INRA L, la dsignation de
lespce ainsi que de la souche sont identiques celles des souches de la collection MSMC 5.
Etude de la diversit molculaire par PCR/REP
. 66
3 - EVALUATION DE LA DIVERSITE GENETIQUE DES ISOLATS

DE LA COLLECTION PAR PCR/REP
Dans la technique PCR/REP, les amorces sont conues pour shybrider dune faon
complmentaire aux extrmits des squences rptitives inverses de telle manire que la
PCR permet lamplification de toute la squence localise entre les sites dhybridation des
amorces. Lamplification gnre ainsi diffrents fragments dADN de tailles variables. Par
sparation lectrophortique, ces fragments permettent la rvlation dune empreinte
gntique spcifique chaque souche (Versalovic et al., 1991 ; de Bruijn, 1992).
Dans cette tude, on sest intress valuer la diversit gntique des 159 isolats nodulant le
lupin comme un premier moyen de caractrisation et de slection.
3. 1 Matriel et mthodes
3. 1. 1 - Souches bactriennes et milieu de culture
Des colonies obtenues sur le milieu YEM solide en culture pure de chacun des 159 isolats ont
t prleves et cultives sur le milieu TY (Tryptone Yeast Extract) (Beringer, 1974) dilu
de moiti (Annexe 4). Ce milieu permet de rduire la production des LPS et des EPS
synthtiss par les bactries par rapport au milieu YEM.
3. 1. 2 - Extraction de lADN gnomique

A partir des bactries cultives sur le milieu TY pendant deux jours 28C, une plusieurs
colonies bien formes ont t prleves et suspendues dans 25 l deau bidistille strile.
LADN gnomique a t extrait de la suspension bactrienne par la mthode de la lyse
alcaline tablie par Manniatis et al. (1989) modifie. 25 l dun tampon de lyse frachement
prpar contenant 0,1N NaOH et 0,5 % SDS sont ajouts la suspension bactrienne (Annexe
5). Le SDS permet la dnaturation des protines et la solubilisation des lipides membranaires
induisant ainsi la lyse des cellules. Le mlange est agit au vortex puis mis en bullition
100C pendant 15 min. 200 l deau bidistille strile sont ajouts au mlange qui est ensuite
soumis une centrifugation pendant 10 min 13000g. Dans certains cas, 100 l de TE 10 :1
(Tris HCl, pH 8,0 ; EDTA) (Annexe 6) ont t utiliss la place de leau. Aprs
centrifugation, le surnageant constitu par la phase aqueuse claire et qui contient lADN en
suspension est transfr dans de nouveaux tubes striles.
. 67
Un volume de 10 l dADN a t sujet une lectrophorse sur un gel dagarose 1%

pendant 45 min. 70V pour lvaluation de la qualit dADN.
3. 1. 3 - Amplification par PCR des squences rptitives

Les ractions damplification ont t ralises selon une optimisation du protocole dcrit
initialement par de Bruijn (1992). Lamplification est effectue dans des microtubes de 100 l
contenant 30 l de volume final de raction. Le mlange ractionnel comprend le tampon de
raction au 1/10 du volume final et qui contient 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, et 0.1% Triton
X-100 ; 1 mM de chaque deoxyribonucloside triphosphate (dNTP) ; 5 mM MgCl2 ; 3 l de
DMSO 10% ; 1 l de BSA 10 mg/ml ; 30 pmol de chaque amorce ; 2U de la Taq
polymrase et 2 l du lysat dADN. Les deux amorces palindromiques utilises pour amplifier
les squences rptitives REP sont REP 1R et REP 2.
amorces
Squence 5 3
Rfrence
REP 1R
5-IIIICGICGICATCIGGC-3
Versalovic et al.,1991
REP 2
5-ICGICTTATCIGGCCTAC-3
Versalovic et al.,1991
Aprs laddition des chantillons dADN, les microtubes sont placs dans un thermocycleur
(Amplitron, Thermolyne Co.). Un microtube dont lADN est remplac par de leau bidistille
strile est utilis en tant que tmoin ngatif. Les mlanges sont alors soumis au processus
damplification tabli par Grundmann et al (1997) selon le programme suivant :
-
Une dnaturation de lADN 94C en 3 min.
Dnaturation de lADN 94C en 3 min.
Hybridation de lamorce 40C en 1 min.
Extension des amorces 65C en 8 min.
Extension finale 65C en 8 min.
35 cycles
A la fin de lamplification, un aliquote de 15 l de chaque amplifiat est mlang avec 3l

dun tampon de charge (Annexe 7). Les diffrents mlanges sont soumis une lectrophorse
sur gel dagarose 1,5% dans le tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) (Annexe 8) pendant trois
heures 80V. Le 100pb et le 1Kb step ladder (Promega) ont t utiliss comme marqueurs de
poids molculaire lors de chaque migration effectue. Le gel est color dans une solution de
bromure dthidium 1mg/ml (Annexe 9) pendant 20 25 min, rinc dans de leau distille
. 68
strile pendant 3 min. puis plac sous UV pour tre photographi. Un film de type Polaroid
B/W ISO 3000/36 a t utilis pour la prise des photos.
3. 1. 4 - Analyse des donnes

La taille en paire de base des diffrentes bandes obtenues a t value par comparaison
celles des marqueurs molculaires utiliss laide du logiciel PM, Macintoch, Vs 4,0. Une
matrice bidimensionnelle refltant la prsence (1) ou labsence (0) de chaque bande REP pour
chaque isolat a t construite. Cette matrice a servi de base pour la construction dun
dendrogramme en utilisant la mthode UPGMA (Unweighted Pair Group of Mean Averages ,
Moyennes non Pondres des Groupes Associs) laide du logiciel STATISTICA Vs 6.0.
3. 2 Rsultats et discussion
3. 2. 1 - Qualit de lADN
LADN extrait par la mthode de la lyse alcaline sest rvl dune bonne qualit (figure 6)
En fonction de lpaisseur et de lintensit de la bande obtenue pour les diffrents isolats, on
peut noter que lADN na pas montr de grandes variations quantitatives. Par consquent,
aucune dilution na t effectue pour les ractions damplification par PCR.
3. 2. 2 - Diversit gntique rvle par PCR/REP

Lobjectif de la prsente tude consiste caractriser les souches et valuer la diversit qui
existe entre les 159 isolats de la collection. Une mthode simple et assure ayant le pouvoir de
mettre en vidence la variabilit gntique au sein des isolats a t donc indispensable
utiliser.
Les nouvelles mthodes de type PCR permettent dtudier la diversit des rhizobia sur des
bases reprsentatives soit de lensemble du gnome bactrien soit dun gne spcifique. La
PCR/REP est largement utilise pour tudier la variabilit intraspcifique des rhizobia. Par
cette mthode, les variations gntiques sont dtectes au niveau chromosomique. Dautant
plus quelle a t utilise avec succs pour le typage disolats de grandes collections et sest
rvle dun grand pouvoir de rsolution (Judd et al., 1993 ; Leung et al., 1994 ; Louws et al.,
1996 ; Versalovic et al., 1994 ; Vinuesa et al., 1998). Par consquent, cette technique a fait
lobjet de choix pour cette tude.
. 69
1Kb
MSMC5331
MSMC5330
MSMC5325
MSMC5327
MSMC5510
MSMC5318
MSMC5316
MSMC552
MSMC5158
MSMC522
MSMC521
CN
100pb
Figure 6. Extraction de lADN gnomique par la mthode de la lyse alcaline
1500pb
2000pb
500pb
Figure 7. Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP de quelques

souches nodulant le lupin
CN: Control ngatif, 100pb et 1Kb = marqueurs molculaires
. 70
La sparation lectrophortique des produits de lamplification a rvle une htrognit

considrable entre les isolats, ce qui signifie lexistence dun grand degr de polymorphisme
molculaire (figure 7).
En fait, la PCR/REP est une mthode trs sensible qui permet de dtecter de faibles
diffrences entre les souches appartenant au mme genre voire la mme espce (Judd et al.,
1993). Les positions relatives des squences REP dans le gnome bactrien sont trs
conserves chez les souches les plus rapproches et distinctes entre les diffrentes espces ou
genres bactriens (Lupski et Weinstock, 1992). Ces squences seraient sujettes un
mcanisme particulier de lvolution. Elles subissent des duplications ou des pertes du motif
rptitif aboutissant une variation de leur longueur et par ailleurs au polymorphisme
apparent entre les souches. Toutefois, les mcanismes et les vnements qui rgissent
lvolution spcifique de ces squences sont encore mal compris (Versalovic et al., 1998).
Ltude des isolats a montr labondance des squences rptitives. En effet, la taille et la
distribution des bandes se sont rvles trs distinctes et trs spcifiques chaque isolat. La
taille des bandes a t comprise entre 90 pb et 3000 pb et leur nombre variait de 1 21 bandes
par profil. Cependant la majorit des bandes a montr des poids molculaires compris entre
100 pb et 1000 pb. Les rsultats dautres tudes ont montr que des souches de
Bradyrhizobium japonicum prsentent plusieurs bandes dont la taille varie entre 100 pb et
5000 pb (Judd et al., 1993) alors que des souches de Sinorhizobium meliloti analyses par de
Bruijn (1992) prsentent peu de bandes avec des poids molculaires compris entre 700 pb et
4000 pb.
Pour examiner la reproductibilit de la technique, lamplification de certains isolats a t
reconduite dans les mmes conditions. La rvlation des produits de la PCR a gnr des
fragments dont la taille et le nombre sont identiques ceux rvls par la premire
amplification et a permis par consquent de confirmer que les profils obtenus sont
reproductibles. La reproductibilit maintenue des profiles REP a t galement rapport par
Tylor et al. (1997).
Les profils des diffrentes bandes obtenues sur les gels dagarose ont t rapports sur une
matrice bidimensionnelle o chaque bande a t indique par sa prsence ou par son absence.
Le dendrogramme form sur la base de cette matrice par analyse UPGMA est reprsent par
la figure 8.
. 71
Cluster 6
MSMC 511
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5145
MSMC 5155
MSMC 555
Cluster 8
MSMC 535
INRA L31
MSMC 548
MSMC 544
MSMC 5418
MSMC 549
MSMC 5141
INRA L24
MSMC 5410
MSMC 5416
MSMC 522
MSMC 5411
MSMC 5129
INRA L23
MSMC 5140
MSMC 5333
MSMC 5510
MSMC 5123
MSMC 557
MSMC 559
MSMC 5117
MSMC 5118
MSMC 5119
MSMC 5413
MSMC 5159
INRA L44
INRA L210
MSMC 5120
MSMC 5150
Cluster 5
MSMC 517
MSMC 5160
MSMC 536
INRA L11
MSMC 518
MSMC 5316
MSMC 5122
INRA L14
MSMC 5424
INRA L19
Cluster 7
MSMC5116
MSMC 5125
MSMC 5412
MSMC 521
INRA L213
MSMC 5146
MSMC 5419
MSMC 531
MSMC 5139
MSMC 5332
MSMC 543
MSMC 5313
MSMC 5142
MSMC 551
MSMC 532
MSMC 5415
MSMC 5420
MSMC 546
MSMC 5423
MSMC 5422
MSMC 5324
MSMC 554
MSMC 5133
MSMC 5327
MSMC 547
MSMC 553
MSMC 5417
MSMC 5143
MSMC 5131
MSMC 533
MSMC 5511
MSMC 5334
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5512
MSMC 5130
INRA L34
MSMC 5326
MSMC 5147
MSMC 5322
MSMC 5325
MSMC 5323
MSMC 5126
MSMC 558
INRA L12
INRA L32
Cluster 3
MSMC 5154
MSMC 5158
MSMC 5319
Cluster 2
MSMC 514
INRA L41
MSMC 5310
INRA L29
INRA L38
INRA L17
INRA L 212
INRA L61
INRA L27
INRA L26
INRA L35
INRA L33
Cluster 4
MSMC 512
MSMC 5321
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 5110
MSMC 5121
MSMC 5312
MSMC 534
MSMC 538
MSMC 5132
MSMC 5320
MSMC 5149
MSMC 539
MSMC 5153
MSMC 537
MSMC 5124
MSMC 5425
MSMC 5317
MSMC 541
MSMC 5148
MSMC 513
MSMC 5151
INRA L37
MSMC 542
MSMC 545
INRA L43
INRA L28
MSMC 5311
INRA L15
INRA L42
MSMC 5315
MSMC 5152
MSMC 5127
MSMC 5331
MSMC 556
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 519
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5318
MSMC 5421
MSMC 552
INRA L36
INRA L51
INRA L52
INRA L13
Cluster 1
INRA L16
INRA L18
INRA L10
INRA L211
100
90
80
70
60
50
% de similitude
Figure 8. Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des souches nodulant le lupin
. 72
Le dendrogramme a pu fournir plus dinformations sur la variabilit spcifique des isolats. A

lexception de INRA L 26 avec INRA L 27 et INRA L 36 avec INRA L 51 qui reprsentent
100% de similarit, tous les autres isolats constituent des souches distinctes. Par consquent,
le nombre total de souches de la collection est quivalent 157.
La divergence gntique des souches rvle par la PCR/REP entre les souches de la
collection est dautant plus importante puisquon na pas pu identifier un polymorphisme
molculaire dlimitant les symbiotes appartenant une espce de lupin ou un site de
collecte bien dtermin. Autrement dit, dans chaque site de collecte et pour chaque espce de
lupin, les souches isoles semblent tre gntiquement distinctes.
En fait, en se situant un niveau de similarit gntique de 80%, on obtient plus dune
trentaine de petits clusters et plus dune vingtaine de linages indpendants, ce qui tmoigne
lexistence dun grand degr de divergence gntique entre les souches. Des groupes de
souches nettement spars ne pouvaient tre dlimits qu un niveau plus bas de similarit
compris entre 60% et 70%. A ce niveau, on obtient huit grands clusters. Ces clusters sont
subdiviss en 2 10 petits clusters aboutissant un nombre total de 29.
A partir de chacun des 29 petits clusters, une trois souches ont t slectionnes. Ainsi,
cinquante deux souches ont t repres pour les analyses ultrieures. La slection des
souches a t effectue en prenant en considration le site et la plante hte dorigine (tableau
6).
La spcificit des profils obtenus par la prsente tude et leur reproductibilit pourrait
prsenter un intrt cologique important dans les programmes dinoculation en permettant le
suivi de la souche dans le nouvel environnement o elle serait introduite.
3. 2. 3 - Cas particulier de lamas nodulaire

La mthode PCR/REP a t applique en premier lieu 14 souches particulires de la
collection. Ces souches ont t obtenues partir dun mme amas nodulaire (figure 9).
Lamas prsentait une taille assez grande de 2,5 cm et a t rcupr la partie basale du
niveau du collet dune plante de lespce Lupinus luteus collecte dans le site Mnasra dans la
province de Kenitra.
. 73
Tableau 6. Liste des souches slectionnes partir des diffrents clusters dlimits par
lanalyse PCR/REP
L. albus
INRA L 21
INRA L 23
INRA L 29
INRA L 211
INRA L 212
L. angustifolius
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L 32
L. cosentinii
MSMC 541
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5425
INRA L 43
INRA L 44
L. pilosus
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L 15
INRA L 16
INRA L 17
Souche
MSMC 554
MSMC 556
INRA L 51
INRA L 52
L. atlanticus
L. luteus
Souche
INRA L 61
Figure 9. Coupe longitudinale de lamas nodulaire
. 74
. 75
Lamplification des squences rptitives des 14 isolats a pu gnr des profils distincts avec
plusieurs bandes. La grande variabilit mise en vidence prouve que les isolats sont
gntiquement trs diversifis (figure 10).
Le dendrogramme issu de la comparaison des diffrents profils illustre la grande diversit
gntique qui existe entre ces souches (figure 11). A 70% de similarit gntique, les souches
forment deux clusters A et B ainsi que trois linages indpendants. En outre, au sein des deux
groupes A et B, la relation gntique entre les souches semble prsenter une grande
htrognit.
Le typage molculaire par PCR/REP nous a permis de mettre en vidence, et pour la premire
fois, lexistence de plusieurs souches gntiquement distinctes au sein dun mme amas
nodulaire. Or, il est gnralement tabli que les nodosits abritent un nombre singulier de
souches de rhizobia et il est galement bien tabli que les mcanismes de nodulation sont
contrls par une reconnaissance mutuelle hautement spcifique entre la bactrie et la plante
hte (Long, 2001 ; Perret et al., 2000 ; Denari et al., 1996 ). Cette spcificit a t mme
rapport tre diffrentiellement rduite un srogroupe bien dtermin (Somasegaran et
Hoben, 1985). En plus de la spcificit, les rhizobia sont caractriss par leur pouvoir
comptitif (Laguerre et al., 2003). La comptition peut concerner non seulement les lments
nutritifs ou lespace vital (rhizosphre) mais aussi les sites dinfection au niveau des racines
de la lgumineuse.
Autre renseignement qui rsulte de cette analyse est lvidence de la multiple infection
nodulaire. En dautres termes, la capacit de diffrentes souches de rhizobium infecter en
grand nombre le mme endroit de la racine dune mme plante hte et coexister en
harmonie dans la mme nodosit.
Toutefois, il est difficile dexpliquer comment toutes ces souches peuvent coexister dans la
mme structure nodulaire et de dfinir les mcanismes dinfection impliqus dans la
formation dun tel type de nodosits.
Il a t rapport que la dominance dun gnotype particulier dans les nodosits peut rsulter
dune haute abondance dans le sol plutt qu une grande comptitivit de nodulation
(Hartman et al., 1998). Les mmes auteurs ont signal que les causes de labondance dun
microorganisme dans le sol peuvent tre trs variables, en loccurrence la synthse ou la
dtoxification dantibiotiques, la grande sensibilit aux stimuli mis par la plante et la
. 76
1Kb
MSMC5116
MSMC5112
MSMC5111
MSMC5115
MSMC5114
MSMC5113
MSMC5110
MSMC518
MSMC517
MSMC516
MSMC513
MSMC511
CN
100pb
3000pb
1500pb
500pb
Figure 10. Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP des souches de lamas
nodulaire
CN: Control ngatif, 100pb et 1Kb = marqueurs molculaires
MSMC511
MSMC5113
Groupe A
MSMC5114
MSMC5115
MSMC5116
MSMC513
MSMC515
MSMC518
Groupe B
MSMC516
MSMC5110
MSMC5111
MSMC5112
MSMC517
MSMC514
95
90
85
80
75
70
65
60
% of similarity
Figure 11. Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des 14 souches de lamas
nodulaire.
. 77
croissance rapide des souches pour lenvahissement de la rhizosphre. Certains auteurs ont
attribu la nodulation aux facteurs slectifs rgis par lhte dans la rhizosphre (Moawad et
al., 1984) tandis que dautres ont indiqu que la comptitivit pour la nodulation est rgle
par les gnes rhizobials (Brewin et al., 1983 ; Laguerre et al., 2003).
Concernant les mcanismes dinfection, Hirsch et al. (2001) ont signal que les modes
dinfection connus chez les rhizobia et qui aboutissent la formation de nodosits de type soit
dtermin soit indtermin existent tous les deux chez le lupin. Rcemment, un autre mode
dinfection bien particulier a t rapport chez lupinus albus par Gonzalez-sama et al. (2004).
Selon ces auteurs, le rhizobia pntre la racine travers la jonction situe la base du poil
absorbant et la cellule pidermique adjacente. La bactrie envahit directement la zone
corticale sous pidermique. Les cellules infectes se divisent successivement pour former le
noyau central de la nouvelle nodosit. Ce nouveau mode d'infection pidermique direct
aboutit la formation de nodosit de type indtermine. Cependant, aucune indication d'une
possible multiple infection na t signale.
Lexistence dune paire de souches dans la mme nodosit a t signale chez une autre
lgumineuse qui est le soja, ceci a t toutefois rapport non pas sous des conditions
naturelles mais suite une inoculation mixte par ces souches (Linderman et al., 1974). Un
mme rsultat a t obtenu par Johnson et Beringer (1975) dans le cas du pois suite une
inoculation par une paire de souches efficientes de Rhizobium leguminosarum. Deux souches
appartenant mme deux espces diffrentes, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii et
Bradyrhizobium ont t identifies dans la mme nodosit dune non lgumineuse Parasponia
andersonii (Trinick et al., 1989). Tous ces travaux indiquent par consquent quune mme
nodosit peut hberger diffrentes souches qui peuvent appartenir une mme espce ou
des espces diffrentes.
Les rsultats de cette analyse permettent de soumettre quelques hypothses thoriques pour
expliquer une telle multiple infection : (i) un haut niveau de compatibilit de l'hte qui
pourrait entrer en symbiose avec plusieurs souches bactriennes afin de couvrir ses besoins en
lments nutritifs azots, (ii) les souches pourraient prsenter des facteurs de reconnaissance
et de nodulation similaires vis--vis de lhte et par consquent une capacit comptitive
identique et (iii) un mode dinfection assez particulier.
CHAPITRE III
CARACTERISATION
PHENOTYPIQUE DES
RHIZOBIA NODULANT LE
LUPIN
Caractrisation phnotypique
.78
1 - INTRODUCTION
La caractrisation phnotypique des diffrentes souches nodulant le lupin nous permettra
dune part de mettre en vidence ltendue des variations phnotypiques qui existent entre les
souches et dautre part dexploiter ces variations pour la slection de candidats pouvant
maintenir une capacit suprieure de fixation dazote sous les variations des facteurs du
milieu. En effet, les facteurs environnementaux affectent tous les aspects de la fixation
symbiotique dazote. Parmi les facteurs les plus importants figurent le pH, la salinit et la
temprature.
Dans le sol, le pH affecte non seulement le dveloppement des bactries mais aussi la
solubilit des diffrents cations mtalliques qui influencent indirectement le dveloppement
bactrien.
Dans les rgions arides ou semi-arides, les tempratures extrmes affectent la survie des
rhizobia. Elles agissent galement sur leur mobilit et sur leur potentiel infectieux en agissant
sur le taux de lhumidit relative du sol (Bordeleau & Prvost, 1994).
La salinit constitue de nos jours une menace srieuse envisager. Elle agit ngativement sur
la persistance et sur le dveloppement des rhizobia (Zahran et al., 1994 ; Graham, 1998).
Pour le bon fonctionnement de la symbiose rhizobia - lupin, une bonne synrgie entre les
deux partenaires symbiotiques et les facteurs dapho- climatiques du milieu est indispensable.
Il est donc primordial didentifier en premier lieu les rhizobia autochtones nouvellement
isols puis slectionner ceux qui peuvent survivre et maintenir une haute performance
symbiotique sous les diffrentes contraintes de lenvironnement.
Dans cette optique, ltude porte sur la dtermination des caractristiques phnotypiques des
souches. Lensemble de ces caractres pourra constituer une base pour ltablissement de
stratgies dinoculations dans diffrentes rgions du pays mais aussi une base dtude de la
diversit phnotypique qui existe entre ces souches autochtones.
.79
2 MATERIEL ET METHODES
Ltude de la diversit phnotypique a t mene pour la caractrisation de 52 souches
nodulant le lupin et qui ont t slectionnes sur la base de la diversit gntique value par
la PCR/REP. La tolrance au pH, la salinit et la temprature a t value pour
lensemble des souches de la collection vu que ces trois paramtres constituent les plus
importants facteurs du stress abiotique. La tolrance ces trois facteurs a t doublement
exploite : dune part pour la slection des candidats les plus tolrants pour des tests
dinoculation de lupin qui seront mens par lINRA de Rabat sur des sols de type calcoalcalins et dautre part dans le cadre de la caractrisation classique tablie pour les rhizobia
nouvellement isols.
2. 1 Evaluation des paramtres symbiotiques

L. luteus reprsente lespce de lupin la plus cultive au Maroc. De ce fait, les critres
symbiotiques des diffrentes souches ont t valus en association avec cette espce.
Les graines ont t strilises avec du HgCl2 0,1% (w/v) acidifi (HCl 0,06N), scarifies
avec du H2SO4 95% et mises germer sur de leau glose 0,7% (w/v) pendant trois jours
lobscurit. Les graines bien germes ont t transfres aseptiquement dans des pots
remplis de sable strile raison de trois graines par pot. Les pots ont t ensuite placs dans
une chambre de culture sous les mmes conditions dcrites prcdemment pour le test de
lauthentification des isolats. Chaque plantule a t inocule par 1 ml dune suspension
bactrienne frachement prpare (108 bactries/ml). Trois pots ont t utiliss pour chaque
souche. Aprs inoculation, le sable a t recouvert de gravier strile pour empcher
lvaporation. Les plantes ont t arroses 3 fois par semaine alternativement avec de la
solution nutritive dpourvue dazote (Broughton et Dillworth, 1971) (Annexe 10) et de leau
distille strile. Des plantes non inocules ont t utilises comme tmoin non azot (T0). Le
tmoin azot (TN) a t reprsent par des plantes non inocules mais recevant du KNO3
0,5% (w/v) additionn dans chaque arrosage par la solution nutritive. Huit semaines aprs
inoculation, les plantes ont t dterres. Les nodosits formes sur les racines de chaque
plante ont t dnombres et le poids sec de la partie vgtative a t mesur aprs schage
70C pendant 48 heures. Le nombre moyen de nodosits formes sur chaque plante et par
chaque souche a t utilis pour lvaluation de linfectivit. Le poids sec moyen des plantes
issues de 3 pots inoculs par la mme souche a t utilis pour lvaluation de lefficience
.80
relative qui est exprime sous forme du pourcentage de gain en matire sche des parties
ariennes des plantes inocules (PSPi) par rapport aux plantes tmoins non inocules mais qui
ont reu du KNO3 (PSTn) :
ER = PSPi / PSTn x 100
2. 2 Temps de gnration sur YEM liquide

Le temps de gnration des souches a t valu doublement dans des fioles contenant 100 ml
de YEM liquide. Les fioles ont t ensemences par les prcultures frachement prpares
dans le mme milieu de chacune des souches. Lensemencement a t ralis de manire
obtenir une DO initiale dans les fioles de lordre de 0,05. Les fioles ont t ensuite places
sous agitation rotative de 200 rpm 28C. La lecture de la DO a t ralise 600 nm des
intervals de temps successifs de 45 min. Les diffrentes valeurs de DO ont t portes sur une
chelle semi-logarithmique en fonction du temps. Le temps de gnration a t calcul partir
de la phase exponentielle de la courbe de croissance.
Le pH du milieu contenu dans chaque fiole a t mesur la fin de la phase exponentielle de
croissance de chaque souche afin de dterminer sa capacit acidifier ou alcaliniser le
milieu.

La capacit des souches alcaliniser ou acidifier le milieu YEM a t value par laddition
de lindicateur color bromophnol bleu une concentration de 0,0025% (w/v) (Annexe 11).
Les boites inocules ont t mises en incubation 28C pendant 24 heures. Les ractions ont
t identifies par le changement de la coloration du milieu. Une coloration jaune indique une
raction acide et une coloration bleu fonc indique une raction basique.

Lassimilation de diffrents substrats carbons a t teste en utilisant les galeries API (API
50CH, BioMrieux, France) selon la procdure dcrite par Kersters et al. (1984). Les
prcultures ont t prpares comme suit : des colonies bien formes obtenues aprs 24 heures
dincubation sur du YEM solide 28C ont t prleves et disperses dans 1 ml deau
distille strile. Le mlange a t suspendu dans un milieu dpourvu de toute source de
carbone, maintenu 45C et contenant en g/l : 0,46 de K2HPO4; 0,13 de KH2PO4; 0,2 de
MgSO4; 0,1 de NaCL; 2 de Yeast Nitrogen base (Difco); 2 de (NH4)2SO4 et 7,5 dagar
.81
(Difco). Les prcultures frachement prpares ont t utilises pour remplir les puits des
galeries. Les microplaques ont t ensuite places horizontalement 28C pendant 7 jours.
Lutilisation de la source de carbone par la souche se traduit par un trouble bien apparent par
rapport au tmoin.
2. 5 Hydrolyse de lure
Pour chaque souche, 10 l de la prculture frachement prpare dans le milieu YEM ont t
utiliss pour ensemencer des boites contenant le mme milieu solide additionn de 2% dure
et 0,012% de rouge de phnol (Jarvis et al., 1977). Les solutions de ces deux produits ont t
strilises par filtration. Trois rptitions ont t ralises pour chaque souche. Les boites ont
t incubes 28C pendant 24 heures. Les rsultats ont t valus par le changement de la
coloration du milieu. Une coloration rouge indigo indique lhydrolyse de lure alors quune
coloration jauntre indique une raction ngative.
2. 6 Rduction du nitrate
Pour ce test, les souches ont t cultives pendant 5 jours 28C dans du YEM liquide
modifi dpourvu du tampon phosphate mais contenant 0,003% Na2SO4 et une source dazote
sous forme de KNO3 0,1%. Le pH du milieu a t ajust 7 avec du NaOH 5N. Quatre
rptitions ont t ralises pour chaque souche. La rduction du nitrate a t mise en
vidence par laddition de 5 7 gouttes dacide sulphanilique 8 g/l prpar dans de lacide
actique 5N puis quelques gouttes de l-naphthylamine 5 g/l galement prpar dans de
lacide actique 5N. Une raction positive se traduit par une coloration rose ou rouge du
milieu.

Les tests ont t raliss sur des boites de ptri contenant du milieu YEM solide. Les boites
ont t subdivises en 20 secteurs. Chaque secteur a t ensemenc avec 10 l dune
prculture frachement prpare ayant une DO de lordre de 108 bactries/ml. Trois rptitions
ont t ralises pour chaque traitement et pour chaque souche. Pour chaque test, des boites
tmoins ont t prpares. Ces tmoins ont t raliss sous des conditions standard avec
0,1% (w/v) NaCl, pH 7,0 et 28C. Les rsultats de chaque test ont t valus aprs une
semaine dincubation. Par comparaison avec les boites tmoins, les souches ont t notes
sensibles (pas de croissance) ou rsistantes.
.82
Le milieu a t additionn de diffrentes quantits dantibiotiques (Sigma Products Co.) selon

la mthode dcrite par Somasegaran et Hoben (1985). Les solutions dantibiotiques ont t
strilises par filtration (Annexe 12) puis additionnes au milieu YEM pralablement
autoclav et maintenu une temprature de 55C. Les antibiotiques ont t tests en g/ml
des concentrations variant de 10 100 pour la spectinomycine, la ttracycline, la
streptomycine, la kanamycine et lacide nalidixique, de 10 150 pour le chloramphnicol et
de 15 200 pour lrythromycine et lampicilline.

Ce test a t conduit pour valuer la capacit des souches rsister six diffrents types de
mtaux lourds tous sous forme de chlorures. Le test a t ralis comme dans le cas prcdant.
Les solutions de diffrents mtaux ont t strilises par filtration (Millipore 0,22 m, Sigma)
puis additionnes au milieu YEM glos pour aboutir des concentrations en g/ml variant
de 200 400 pour AlCl3 6H2O, ZnCl2 et MnCl2 4H2O, de 50 100 pour CoCl2 et de 5 50
pour CdCl2 2H2O et HgCl2.
La tolrance la salinit a t value pour le NaCl. Le sel a t ajout au milieu avant
autoclavage des concentrations variant de 170 mM 1700 mM. Les boites ont t
ensemences comme dans les tests prcdents et ont t ensuite mises en incubation 28C.
2. 10 Tolrance au pH
Les souches ont t values pour leur tolrance au pH sur du YEM solide 0,1% NaCl aprs
une semaine dincubation 28C et selon la procdure dcrite pour les tests prcdents. Le
pH du milieu a t ajust avec le tampon Homopipes 25 mM pour les valeurs comprises
entre 3 et 5, le tampon MES 20 mM pour les valeurs comprises entre 5 et 7 et par le tampon
phosphate additionn de NaOH 5N pour les valeurs comprises entre 7 et 9,5.
Pour les pH 8,5 ; 9 et 9,5, les tests ont t reconduits sur le milieu YEM liquide pour la
confirmation des rsultats obtenus sur boites.
.83
Control ngatif
Souche
MSMC 5419
Control positif
Figure 12. Photo indiquant des plantes de Lupinus luteus inocules compares au
control ngatif et au control fertilis par du KNO3
.84
Ce test a t ralis comme prcdemment sur du YEM solide 0,1% NaCl, pH 7 et selon la
procdure dcrite prcdemment. La capacit des souches tolrer diffrentes tempratures a
t dtermine aprs une semaine dincubation 4, 10, 15, 20, 30, 35, 38 et 42C.

Les rsultats de lensemble des tests phnotypiques ont t indiqus par 1 pour tout rsultat
positif et par 0 pour tout rsultat ngatif. Les donnes symbiotiques ont t traites en classes.
Pour le test de linfectivit, les nombres moyen de nodosits (n) obtenus par plante ont t
subdiviss en trois classes : classe 1 pour n < 30, classe 2 pour 30 < n < 50 et classe 3 pour n
> 50. Les diffrents pourcentages obtenus de lefficience relative des souches ont t
galement subdiviss en trois classes : classe 1 pour les pourcentages infrieurs 60 %, classe
2 pour les pourcentages compris entre 60 % et 70% et classe 3 pour les pourcentages
suprieurs 70 %. Ainsi, 105 caractres phnotypiques ont t rapports sur une mme
matrice. La comparaison entre les souches prises deux deux a t ralise par la mthode
UPGMA (Unweighted Pair Group Methode with Arithmetic Average). Sur la base de cette
mthode, un phnogramme a t construit laide du logiciel STATISTICA (V.6).
3 RESULTATS ET DISCUSSION
3. 1 Caractrisation symbiotique
Cette caractrisation a t effectue afin dvaluer la diversit des souches de lupin par leur
potentiel infectieux et fixateur et afin de reprer les souches les plus efficientes.
La capacit symbiotique dune souche de rhizobium est value par deux paramtres : son
infectivit et son efficience. Linfectivit de chaque souche est apprcie par le nombre de
nodosits formes sur la racine de chaque plante. Lefficience est estime par la dtermination
du pourcentage de gain en matire sche de la partie arienne des plantes inocules par
rapport au tmoin azot (figure 12).
Lexprience a t mene en pots pour permettre le bon dveloppement du systme racinaire.
Les plantes ont t dterres au mme stade vgtatif afin que les performances symbiotiques
puissent tre comparables.
.85
A
Petites nodosits en chapelets sur les racines latrales
Souche MSMC 5419
Grandes nodosits sur les racines latrales
Souche INRA L 23
Figure 13. Forme des nodosits obtenues sur Lupinus luteus inocul par la souche
MSMC 5419 (A) et la souche INRA L 23 (B).
T0
511
513
514
515
516
517
518
5110
5111
5112
5113
5114
5115
5116
5119
5123
5126
5127
5133
5142
5143
5150
5155
5156
L15
L16
L17
L21
L23
L29
L211
L212
532
536
539
5319
5326
5328
L32
541
5416
549
547
5419
5425
L43
L44
554
556
L51
L52
L61
TN
Efficience relative
T0
511
513
514
515
516
517
518
5110
5111
5112
5113
5114
5115
5116
5119
5123
5126
5127
5133
5142
5143
5150
5155
5156
L15
L16
L17
L21
L23
L29
L211
L212
532
536
539
5319
5326
5328
L32
541
5416
5419
547
549
5425
L43
L44
554
556
L51
L52
L61
TN
Nombre moyen de nodules / plante
(T0 = tmoin non azot, TN = tmoin fertilis au KNO3)
.86
120
100
80
60
40
20
Figure 14. Infectivit des souches nodulant le lupin value sur L. luteus
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Figure 15. Efficience relative des souches nodulant le lupin value huit semaines aprs
linoculation des plantes.
.87
Les rsultats obtenus montrent que L. luteus a pu tre nodul par toutes les souches testes
mme si elles ont t isoles partir dautres plantes htes. Cette plasticit de nodulation chez
le lupin a t galement rapporte par Jensen et Hansen (1968).
La localisation des nodosits sur le systme racinaire de la plante a montr galement une
grande variabilit. Les nodosits de 7 mm ou plus ont t localises en grande majorit au
dessous du collet alors que les diffrentes nodosits de moindre taille ont t plus dense sur
les racines latrales (figure 13). La forme des nodosits sest rvle galement trs
diversifie tout en refltant les deux formes des nodosits connues : dtermine ou
indtermines (au dessous du collet) et indtermine (sur les racines latrales). En effet, il a
t rapport que les deux formes peuvent exister chez le lupin (Hirsch, 1992, Hirsch et al.,
2001).
Une large variabilit de la capacit infective des souches a t mise en vidence (figure 14).
En effet, mme si linoculation des plantes par les diffrentes souches rapportait un nombre
moyen de bactries de lordre de 108 bact/ml, le nombre moyen des nodosits formes par
plante varie de 8 109. La souche la plus infective est la MSMC 5142 avec 108 nodosits
formes par plante. La souche MSMC 5127, la moins infective, a pu induire la formation de 8
nodosits.
La rponse des plantes linoculation montre diffrentes efficiences relatives (figure 15).
Laugmentation du poids de la matire sche des plantes inocules na dpass en aucun cas
celui des plantes fertilises par lazote minral.
Les efficiences relatives obtenues varient de 35% 87%. Les plus grandes valeurs ont t
obtenues avec les souches MSMC 518 et MSMC 5419 avec 87% et 83% defficience relative
(ER) respectivement. En gnral, les souches se sont rvles trs efficientes. 74% des
souches prsentent une efficience relative suprieure 60%.
Il est important de signaler que toutes les souches qui nont pas t isoles de lespce L.
luteus montrent une efficience suprieure 60%. Alors que les souches isoles de cette espce
prsentent des pourcentages variant de 35% 87%.
Quant aux souches issues de lamas nodulaire, nous remarquons quen dpit de leur prsence
dans la mme structure nodulaire, ces souches prsentent des niveaux trs variables du
potentiel infectieux et il en est de mme pour lefficience relative. La souche la moins
.88
efficiente (MSMC 5115) ainsi que la souche la plus efficiente (MSMC 518) appartiennent
toutes les deux ce groupe. Les souches de lamas nodulaire semblent donc fonctionner en
complmentarit au sein de la nodosit. En outre, lefficience relative de ces souches parat
tre proportionnelle leur capacit infective ( lexception de la souche MSMC 5113) alors
que pour les autres souches de lupin, aucune corrlation entre les deux paramtres
symbiotiques na t enregistre.
Ltude de linfectivit et de lefficience symbiotique a conduit lidentification des souches
qui prsentent le meilleur pouvoir fixateur dazote : MSMC 518, MSMC 5125, MSMC 5126,
MSMC 539 et INRA L 61.
Plusieurs auteurs ont tudi les paramtres symbiotiques de diffrentes souches nodulant le
lupin pour la slection de couples rhizobia - lupin haute performance symbiotique
(Howieson et al., 1988 ; Legocki et al., 1997 ; Kurlovick et al., 1997 ; Hoeflich et al., 1994 ;
Roughley et al., 1993 ; Cheremisov, 1991).
La slection de couples symbiotiques performants de diffrentes espces ou de varits de
lupin et de microsymbiotes complmentaires peut augmenter le rendement de la symbiose. En
effet, Kozhemyakov et al. (2000) ont valu la capacit de la fixation biologique dazote chez
1050 accessions de lupin reprsentant 4 espces dorigine mditerranenne et 16 espces
dorigine amricaine. Les plantes des diffrentes accessions ont t sujettes une inoculation
par diffrentes souches de Bradyrhizobium sp. (Lupinus). Les rsultats ont montr que la
fixation symbiotique dazote varie dune accession une autre et que les souches ont t plus
performantes avec les accessions des plantes sauvages quavec les accessions des plantes
cultives. Dans notre tude, nous avons remarqu que les souches isoles des espces
sauvages de lupin rcoltes au Maroc se sont rvles plus efficientes que celles isoles de
lespce cultive L. luteus.
Rcemment, Younis et al. (2002) ont montr que linoculation de lespce Lupinus varius par
les deux souches TAL 1303 et TAL 1407 de Bradyrhizobium sp. (Lupinus) a permi dobtenir
un bon niveau de nodulation et de fixation dazote sous des conditions de salinit et de stress
hydrique trs accentus en Egypte.
Dans la prsente tude, on sest intress valuer lefficience chez le lupin jaune qui est la
premire espce de lupin au niveau de la culture au Maroc. Toutefois et en raison de la grande
diversit inter- et intraspcifique qui existe entre les diffrentes espces de lupin (Kurlovich,
.89
Tableau 7. Temps de gnration des souches de lupin et pH final du milieu de culture
3h
1h30
1h 15min
1h 15min
2h 30min
1h 15min
1h 15min
45min
45min
45min
1h 45min
1h 45min
1h 15min
1h 15min
1h 10min
1h 30min
1h 55min
1h 25min
1h 40min
1h 5min
1h 25min
2h
1h 35min
2h 10min
2h 5min
1h
1h 5min
6,92
7,1
5,82
5,21
6,96
6,34
6,2
4,86
4,68
4,62
6,76
6,49
7,35
7,22
6,5
5,5
5,4
6,8
6,8
6,2
5,1
5,4
5,4
5,87
6,09
4,96
5,5
INRA L21
INRA L23
INRA L29
INRA L211
INRA L212
2h 5min
1h 50min
4h 45min
1h 50min
1h
7
7,1
6,9
5,3
4,6
L. angustifolius
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L15
INRA L16
INRA L17
plante Souche
hte
L. Cosentinii
pH
final
L. pilosus
Temps de
gnration
L. atlanticus
L.albus
L. luteus
plante Souche
hte
Temps de
gnration
pH
final
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L32
1h 45min
1h 40min
1h 15min
1h 5min
1h 35min
1h 35min
1h 45min
6,4
5,1
6,1
6,5
5,1
6,7
7
MSMC 541
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 5425
INRA L43
INRA L44
1h 25min
1h 25min
1h 25min
1h 20min
1h 30min
1h 25min
2h 15min
1h 15min
5,2
5,4
5,1
5,02
7,5
6,2
6,8
5,2
MSMC 554
MSMC 556
INRA L51
INRA L52
2h 15min
3h 30min
1h 15min
1h 15min
6,18
5,2
5,3
5,3
INRA L61
1h 55min
5,28
.90
1998), il serait ncessaire dvaluer les paramtres symbiotiques des souches bactriennes
avec chaque espce pour slectionner les candidats les plus performants et assurer par
consquent un bon rendement.
3. 2 Croissance sur le milieu YEM

Lvaluation du temps de gnration dans le milieu YEM des 52 souches de lupin est
rcapitule dans le tableau 7. Une grande variation de la vitesse de croissance a t observe
entre les diffrentes souches tudies. La dure minimale du temps de gnration (45 min.) a
t enregistre pour les souches MSMC 5110, MSMC 5111 et MSMC 5112 alors que les
deux souches MSMC 556 et INRA L 29 ont montr un temps de gnration suprieur 3h.
La figure 16 montre que la majorit des souches possde un temps de gnration entre 1 h et 3
h. 10% des souches ont montr un temps de gnration infrieur ou gale une heure et 4%
de souches ont montr un temps de gnration variant de 3h 5 h.
Daprs le temps dapparition des colonies sur le milieu YEM solide (de 1 3 jours) et
daprs leurs caractristiques morphologiques, les souches se sont montres plus en accord
avec la description dcrite par Jordan (1982) pour les souches croissance rapide des
rhizobia. Cette constatation a t donc confirme par le temps de gnration rapide des
souches.
Aucune corrlation entre la vitesse de croissance et la plante hte ou le site dorigine na t
identifie. Toutefois, une grande diversit du temps de gnration a t note chez les souches
de la mme plante hte et du mme amas nodulaire. En effet, diffrents temps de gnration
ont t particulirement identifis chez les souches de lamas nodulaire (de 45 min 3 h).
Le pH du milieu mesur au dbut de la croissance avait une valeur 7. Le pH du milieu la fin
de la phase exponentielle de la croissance a t galement mesur (tableau 7). Certaines
souches ont pu acidifier le milieu de culture alors que dautres nont entran aucune
modification du pH. Il a t rapport que les souches croissance rapide acidifient le milieu et
linverse pour les bradyrhizobia (Vincent, 1970 ; Jordan, 1982). Ahmad et Smith (1985) ont
montr que sous les conditions du laboratoire, la capacit des souches produire une raction
acide ou basique dans le milieu dpend du type et de la concentration du substrat qui leur est
fourni. Cependant, et en prenant en considration que le mannitol utilis dans le milieu YEM
.91
% de souches
80
60
40
20
0
G 1h
1h < G 2h
2h < G 3h
3h < G 5h
Temps de gnration
Figure 16. Croissance des souches nodulant le lupin value dans le milieu YEM
.92
est la source de carbone la plus communment utilise dans les diffrents tests de
caractrisation
des rhizobia, on peut noter que nos rsultats sont en accord avec ceux de Jordan (1982). En
outre, les souches de lupin extrmement rapides (MSMC 5110, MSMC 5111, MSMC 5112,
INRA L 16 et INRA L 212) ont t repres comme les souches les plus acidifiantes du
milieu (4.6 pH 4.96).
Il rsulte de ltude de la croissance bactrienne que les rhizobia de lupin croissance rapide
peuvent noduler les diffrentes espces de lupin existantes au Maroc et ceci dans diffrents
sites et rgions du pays. Des rsultats plus ou moins similaires ont t rapports par Pudelko
et Madrzak (1996). Ces derniers ont pu mettre en vidence lexistence de souches croissance
rapide nodulant Lupinus spp. en Pologne. Dautres souches croissance rapide ont t
galement rapportes chez dautres espces de lupin par Schlinkert-Miller et Pepper (1988).

Les rsultats de ce test sont indiqus dans le tableau 8. En fait, le bleu de bromothymol est un
indicateur color qui permet de mettre en vidence une raction acide ou basique dans une
gamme de pH qui stend de 6 7,6. Une raction acide se traduit par le changement de la
coloration du bleu vers le jaune. Par contre une raction alcaline se traduit par le renforcement
de la coloration bleue.
Les souches croissance rapide sont considres gnralement comme des bactries
acidifiantes. Par consquent, elles devraient changer la coloration du BTB vers le jaune
contrairement aux souches croissance lente qui sont considres comme des bactries qui
alcalinisent le milieu de culture (Jordan, 1984).
Dans notre cas, toutes les souches sont croissance rapide. Toutefois, 66% des souches ont
produit des ractions acides sur le YEM solide + BTB alors que les 33% restantes ont produit
soit une lgre alcalinisation soit aucune modification du pH du milieu. En outre, les rsultats
de ce test sont en parfait accord avec ceux obtenus par la mesure du pH la fin de la
croissance des souches.
Xu et al. (1995) ont rapport que 80% des souches testes de Rhizobium et dAgrobacterium
ont pu donn des ractions positives avec le YEM + BTB, alors que les souches de
Bradyrhizobium ont toutes donn des ractions ngatives.
.93
BTB
Plante hte
MSMC 511
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5119
MSMC 5123
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5133
MSMC 5142
MSMC 5143
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 5156
INRA L15
INRA L16
INRA L17
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
1
1
1
MSMC 521
INRA L211
INRA L212
INRA L21
INRA L23
INRA L29
1
1
0
1
1
1
Souches
BTB
0
0
0
1
0
0
1
MSMC 541
MSMC 547
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 5425
INRA L43
INRA L44
1
1
0
1
1
1
1
0
MSMC 554
MSMC 556
INRA L51
INRA L52
1
1
1
0
INRA L61
L. Cosentinii
MSMC 532
MSMC 536
MSMC 539
MSMC 5319
MSMC 5326
MSMC 5328
INRA L32
L. pilosus
Souches
L. atlanticus
L.albus
L. luteus
Plante hte
L. angustifolius
Tableau 8. Raction des souches nodulant le lupin sur le milieu YEM+BTB
1 reprsente une raction acide ; 0 reprsente une raction neutre ou lgrement alcaline
Assimilation
source de carbone
Figure 17. Assimilation de diffrents substrats carbons par les souches nodulant le lupin
0%
20%
40%
60%
80%
100%
.94
.95
Glucose
78%
Fructose 100%
Galactose 95%
L-Sorbose 0%
Pentoses
Xylose
87%
Rhamnose
68%
Polyols
Glycrol
100%
Mannitol 100%
Inositol
60%
Sorbitol
68%
Saccharose 73%
Cellobiose 78%
Maltose
82%
Melibiose
40%
Raffinose 68%
Melizitose 8%
Hexosans
L-Arabinose 100%
Polysaccharides
Monosaccharides
Mannose 85%
Trisaccharides
Hexoses
Disaccharides
Tableau 9. Pourcentage dassimilation de diffrents types de carbohydrates par les souches

nodulant le lupin
Amidon
8%
Inuline
4%
Glycogne 4%
Glucosides
Amygdaline 32%
Esculine
75%
.96
Toutefois, des souches de Bradyrhizobium raction acide ont t rapportes par Moreira et
al. (1993). De mme, des souches croissance rapide alcalinisant le milieu ont t mises en
vidence (Hernandez et Focht, 1984).

Les galeries API ont t utilises afin dvaluer laptitude des souches assimiler chacun des
49 substrats comme seule source de carbone (figure 17 et Annexe 13). Selon le type du
substrat, lassimilation peut galement tre rpartie comme lindique le tableau 9.
Les rsultats montrent que les souches assimilent prfrentiellement les mono- et les
disaccharides mais on peut noter galement que les souches peuvent se dvelopper sur
diffrentes sources de carbones.
Aucune souche na pu utiliser le L-sorbose, par contre 100% de souches ont pu assimiler le
glycrol et le mannitol : substrats communment utiliss pour la culture et le stockage des
rhizobia. Un mme pourcentage a t aussi obtenu avec le gluconate, le N-acetyl-glucosamine
et larabinose. Ltude mene par Chakrabati et al. (1981) a montr que parmi tous les
bradyrhizobia quils ont test, seuls les souches de lupin ont t capables dassimiler
larabinose.
Certaines souches de lupin tudies ont pu galement assimiler les polysaccharides complexes
de type hexosans (tableau 9). Cependant, lincapacit de diffrentes souches de rhizobia
assimiler ces substrats a t rapporte par Rome et al. (1996) pour des souches de
Sinorhizobium nodulant Medicago et par Nour et al. (1994a) pour des souches de
Mesorhizobium nodulant Cicer arietinum. Matallah (2002) a pu caractriser quelques
souches nodulant Cicer arietinum pouvant toutefois assimiler lamidon.
Les donnes de lutilisation des diffrents substrats carbons par les diffrentes souches
tudies ont t galement utilises pour le traage dun arbre dassimilation (figure 18).
Larbre montre trois grands groupes de souches et trois linages indpendants qui sont
dlimits un pourcentage de similarit quivalent 75%. Chaque groupe est form par des
souches qui prsentent des profils similaires dassimilation de substrats (Annexe 13). Les
linages indpendants sont forms par les souches INRA L 53, MSMC 5419 et INRA L15.
Ces trois souches se distinguent essentiellement par leur aptitude utiliser le D-tagatose et /ou
linuline et lamidon.
.97
INRA L15
Groupe 3
MSMC 5419
et INRA L43
Groupe 2
Groupe 1
MSMC 511
MSMC 5116
MSMC 513
INRA L21
MSMC 5114
MSMC 5115
INRA L23
MSMC 556
INRA L29
INRA L44
INRA L32
MSMC 516
MSMC 517
INRA L52
MSMC 518
MSMC 5112
MSMC 5111
INRA L17
INRA L212
INRA L51
INRA L16
MSMC 5110
MSMC 5150
MSMC 5142
MSMC 5326
MSMC 554
INRA L211
MSMC 549
MSMC 5416
MSMC 541
MSMC 5425
INRA L61
MSMC 5126
MSMC 5143
MSMC 547
MSMC 5419
INRA L43
MSMC 514
MSMC 536
MSMC 5123
MSMC 5113
MSMC 5119
MSMC 5319
MSMC 5133
MSMC 532
MSMC 5328
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 539
MSMC 515
MSMC 5127
INRA L15
100
90
80
70
60
50
% de similarit
Figure 18. Dendrogramme indiquant les affinits dassimilation entre les souches nodulant le
lupin
.98
Plusieurs tudes ont rapport la variabilit de la nutrition carbone chez les rhizobia (Graham,
1964 ; Zhang et al., 1991 ; Stowers et Eaglesham, 1984). Ces mmes auteurs ont confirm
lexistence de la variabilit de lutilisation des substrats carbons entre les rhizobia et les
bradyrhizobia. Les souches croissance rapide possdent une prfrence pour les hexoses, les
pentoses, les disaccharides ainsi que les acides organiques (Stowers, 1985 ; van Rossum et al.,
1995). Un mme rsultat a t rapport par Lindstrm et Lehtomaki (1988) pour des souches
de Rhizobium galeagae. Les souches croissance lente prsentent une utilisation rare pour les
monosaccharides et une utilisation variable pour les disaccharides (Jordan, 1984). Des
rsultats similaires ont t rapports par Xu et al. (1995) pour Bradyrhizobium liaoningense et
Bradyrhizobium japonicum.
Lutilisation des sucres et des acides organiques par les rhizobia reprsente un aspect
intressant et essentiel pour la culture au laboratoire. Cependant dans le sol, la croissance des
rhizobia dpend principalement de composs aromatiques. Lutilisation de ces derniers
comme seule source de carbone a t rapporte aussi bien chez les souches croissance rapide
que chez les souches croissance lente. Les bradyrhizobia montrent toutefois une large
utilisation de ces composs (Parke et Ornston, 1984).
Selon Stowers (1985), il existe trois voies principales du catabolisme des substrats carbons
entre les rhizobia croissance rapide de type Rhizobium et Sinorhizobium et les souches
croissance lente de type Bradyrhizobium :
la voie dEntner-Doudoroff, qui est galement la voie principale du mtabolisme
des hexoses.
la voie dEmbden-Meyerhof-Parmas, qui est variable dune souche de rhizobium
une autre. Cette voie repose sur lactivit de lenzyme phosphofructokinase.
la voie du Pentose Phosphate, observe uniquement chez les souches croissance
rapide. Elle dpend principalement de lenzyme 6-phosphogluconate (6-PG) dshydrognase
NADP dpendante.
Les souches tudies ont prsent 100% dassimilation du gluconate ce qui prouve que la 6PG dshydrognase est prsente chez toutes les souches. En outre, lexistence de cet enzyme a
t rapporte uniquement chez les rhizobia croissance rapide. Le rsultat obtenu nous
permet donc de confirmer sur une base mtabolique le taux de croissance rapide des souches.
.99
Tableau 10. Hydrolyse de lure et rduction du nitrate par les souches nodulant le lupin
Nitrate
Plante hte
L.albus
Ure
Souches
Ure Nitrate
MSMC 521
INRA L211
ND
INRA L212
ND
INRA L21
ND
MSMC 513
MSMC 514
INRA L23
ND
MSMC 515
INRA L29
ND
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 532
MSMC 518
MSMC 536
MSMC 5110
MSMC 539
MSMC 5111
MSMC 5319
MSMC 5112
ND
MSMC 5326
MSMC 5113
MSMC 5328
MSMC 5114
INRA L32
ND
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 541
MSMC 5119
ND
MSMC 547
ND
MSMC 5123
MSMC 549
ND
MSMC 5126
MSMC 5416
MSMC 5127
ND
MSMC 5419
MSMC 5133
MSMC 5425
MSMC 5142
INRA L43
ND
MSMC 5143
INRA L44
ND
MSMC 5150
MSMC 5155
MSMC 554
MSMC 5156
MSMC 556
INRA L15
ND
INRA L51
ND
INRA L16
ND
INRA L52
ND
INRA L17
ND
INRA L61
ND
L. cosentinii
L. ngustifolius
MSMC 511
L. atlanticus L. pilosus
L. luteus
Plante hte Souches
1 reprsente une raction positive, 0 reprsente une raction ngative, ND = rsultat indtermin
.100
Il rsulte de cette tude que les souches testes de lupin prsentent une assimilation de sources
de carbone nettement similaire celle des souches croissance rapide.
3. 5 Hydrolyse de lure et rduction du nitrate

La mise en vidence de la capacit des rhizobia hydrolyser lure a t initialement dcrite
par Jarvis et al. (1977) en utilisant le rouge de phnol comme un indicateur de pH.
Laugmentation du pH du milieu par les souches suite une raction hydrolytique de lure se
traduit par un changement de la coloration du milieu vers le rouge fonc ou le rouge indigo.
Les rsultats obtenus pour les 52 souches testes sont rapports dans le tableau 10. En gnral,
63% des souches ont pu hydrolyser lure. Des rponses variables ont t mises en vidence
entre les souches isoles de la mme rgion et partir de la mme espce de lupin et en
particulier entre les souches de lamas nodulaire.
Dans le sol, lazote est prsent principalement sous forme dions ammonium (NH4+) et sous
formes doxydes dazote, les ions nitrates (NO3-) ou nitrites (NO2-).
Les nitrates sont la source prfrentielle dazote pour la plupart des microorganismes et de
leur plantes htes. Le nitrate est rduit en nitrite par le nitrate rductase qui catalyse la
raction suivante :
NO3-
nitrate rductase
NAD(P)H+H+
NO2-
NAD(P)+
Les nitrites forms sont rduits leur tour en ammonium.

La capacit des souches de lupin testes rduire le nitrate est reprsente dans le tableau 10.
En fait, 52% des souches ont pu rduire le nitrate contre 37% des souches, les 12% restantes
auraient pu rduire le nitrate au-del du stade nitrite do un rsultat non dtermin.
La variabilit de laptitude rduire le nitrate a t galement rapporte chez diffrents
rhizobia (Mc Neil, 1982 ; Zahran, 1991). Munns (1968) ont rapport que la prsence du
nitrate dans le sol affecte la capacit de ladsorption des rhizobia aux racines des plantes et
inhibe leur capacit infective. Des travaux rcents ont montr que la sensibilit au nitrate peut
varier entre les diffrentes souches de Bradyrhizobium (Gibson et Harper, 1985) alors que
.101
dautres travaux ont montr que le nitrate affecte la comptition des souches de
Bradyrhizobium japonicum pour infecter le soja (Martensson et al., 1989).
Laptitude hydrolyser lure et rduire le nitrate est une caractristique cologiquement
importante dont il faut tenir compte pour la slection dune souche particulire. En fait, un
excs de nitrate dans le sol peut exercer un effet inhibiteur sur ladsorption des rhizobia sur la
surface des racines (Sherwood et al., 1984) ainsi que sur leur capacit infective et effective
(Davidson et Robson, 1986 ; Arreseigor et al., 1997).

Les marges de rsistance des souches aux diffrents antibiotiques tests sont reprsentes
dans le tableau 11. Les rsultats indiquent que les souches montrent des rponses variables
aux diffrents antibiotiques tests. Cette variabilit est notamment bien marque chez les
souches de lamas nodulaire. De fortes rsistances allant jusqu 200g/ml ont t notes avec
lampicilline et lrythromycine alors que les plus faibles rsistances de 10g/ml ont t nots
avec la ttracycline, la kanamycine, et la streptomycine.
La figure 19 indique que les souches de lupin ont montr une rsistance bien marque
lrythromycine, plus de 80% ont prsent une bonne croissance la concentration de 200
g/ml. Lampicilline qui est un inhibiteur de la synthse de la paroi cellulaire (Annexe 10) na
prsent quun moindre effet sur linhibition de la croissance des souches, environ 70% ont pu
se dvelopper la concentration de 200 g/ml.
Les souches se sont montres plus rsistantes au chloramphnicol, lacide nalidixique et la
spectinomycine. A la concentration de 50 g/ml, des pourcentages de rsistance de 94%, 79%
et 63% ont t respectivement nots pour les trois antibiotiques.
Les antibiotiques inhibiteurs de la synthse des protines et de membrane plasmique (Annexe
10) tels que la kanamycine, la ttracycline et la streptomycine se sont rvls les plus nfastes
sur la croissance des souches. En effet, moins de 50% des souches ont pu crotre avec la
ttracycline et la streptomycine la concentration de 50 g/ml. Linhibition a t plus
marque avec la kanamycine, 25 g/ml, seul 15% des souches ont pu se dvelopper.
Graham et al. (1991) ont rapport que leffet inhibiteur dun antibiotique dpend de sa nature
et de sa concentration dans le milieu et que le degr dinhibition est variable dune espce
une autre et dune souche lautre.
.102
80%
60%
40%
20%
0%
Tetr 10
Tetr 50
Strep 10
Strep 50
Spec 10
Spec 50
Spec 100
Chl 10
Chl 50
Chl 100
Kan 10
Kan 25
Amp 100
Amp 200
Nal ac 10
Nal ac 50
Ery 100
Ery 200
% Souches tolrantes
100%
Antibiotiques (g/ml)
Figure 19. Effet des antibiotiques sur la croissance des souches nodulant le lupin
.103
Tableau 11. Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin diffrents types
dantibiotiques.
L. luteus
Plante
hte
Souches
Tetr.
Strep.
Spec.
Chl.
Kan.
Amp.
Nal.
Ery.
MSMC 511
< 10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 513
< 10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 514
50
50
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 515
< 10
< 10
50
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 516
10
50
100
100
< 10
100
50
200
MSMC 517
< 10
< 10
50
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 518
< 10
< 10
50
100
< 10
100
< 10
200
MSMC 5110
50
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5111
< 10
< 10
50
50
< 10
200
10
200
MSMC 5112
< 10
< 10
50
50
< 10
100
10
200
MSMC 5113
10
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5114
< 10
10
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5115
10
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5116
50
50
50
50
25
100
50
200
MSMC 5119
50
50
10
100
< 10
100
50
100
MSMC 5123
10
10
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 5126
50
10
100
100
10
200
50
200
MSMC 5127
< 10
< 10
10
50
< 10
200
10
200
MSMC 5133
10
10
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 5142
< 10
< 10
< 10
10
< 10
15
10
100
MSMC 5143
50
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5150
10
50
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5155
10
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5156
10
10
100
50
10
200
50
200
INRA L15
50
< 10
10
50
< 10
200
10
200
INRA L16
50
50
100
50
25
200
50
200
INRA L17
50
10
100
100
< 10
200
50
200
.104
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Souches
Tetr.
Strep.
Spec.
Chl.
Kan.
Amp.
Nal.
Ery.
INRA L21
< 10
50
100
100
25
200
50
200
INRA L211
10
50
50
100
< 10
15
50
200
INRA L212
10
10
50
100
< 10
15
50
100
INRA L23
50
< 10
< 10
50
< 10
15
50
ND
INRA L29
10
< 10
< 10
50
< 10
15
50
200
MSMC 532
50
50
< 10
100
< 10
200
10
< 25
MSMC 536
50
10
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 539
< 10
50
10
100
< 10
200
50
20
MSMC 5319
< 10
50
10
100
< 10
200
50
25
MSMC 5326
50
50
100
100
25
200
50
200
MSMC 5328
< 10
10
10
< 10
10
200
50
25
INRA L32
< 10
50
100
100
25
200
50
200
MSMC 541
10
50
10
100
< 10
200
50
200
MSMC 547
50
10
10
50
< 10
100
< 10
200
MSMC 549
< 10
10
50
100
< 10
200
50
200
MSMC 5416
< 10
< 10
10
50
< 10
< 15
50
100
MSMC 5419
10
10
10
100
< 10
200
< 10
200
MSMC 5425
50
50
100
100
25
200
50
200
INRA L43
50
50
100
100
25
200
50
200
INRA L44
10
< 10
10
50
25
100
50
200
MSMC 554
50
50
100
100
< 10
200
50
200
MSMC 556
< 10
< 10
50
10
< 10
< 15
50
200
INRA L51
10
10
10
50
< 10
200
50
200
INRA L52
50
50
100
100
10
200
50
200
INRA L61
50
10
100
100
10
200
50
200
Tetr. = ttracycline, Strep. = spectinomycine, Spec. = streptomycine, Kan. = kanamycine

Chl. = chloramphnicol, Amp. = ampicilline, Nal. = acide nalidixique, et Ery. = lrythromycine.
.105
Paralllement nos rsultats, les trois derniers antibiotiques prcits se sont rvls les plus
inhibiteurs de la croissance de quelques souches croissance rapide de lupin (Schlinkert et
Pepper, 1988). La Kanamycine sest rvle galement lantibiotique le plus inhibiteur de la
croissance de certaines souches de Bradyrhizobium nodulant le lupin en Pologne (Madrzak et
al., 1995) et de quelques souches nodulant diffrentes espces dAcacia au Maroc (Zerhari et
al., 2000).
La sensibilit de diffrentes souches de lupin la streptomycine a t galement rapporte
(Gabor, 1965). La mme sensibilit a t rapporte pour des souches croissance rapide
dAcacia (Mohammed et al., 2000).
Jordan (1984) a montr que les souches croissance rapide sont plus sensibles la
ttracycline et la streptomycine alors que les bradyrhizobia sont plus rsistants aux
antibiotiques. Le mme rsultat a t rapport par Elkan (1992) et Mpepereki et al. (1997).
Cependant, des souches de Rhizobium hautement tolrantes aux antibiotiques ont t isoles
de diffrents sols de Malaisie (Roughley et al., 1992). Paralllement, Odee et al. (1997) ont
montr que les bradyrhizobia sont plus sensibles que les souches croissance rapide vis--vis
de diffrents antibiotiques tests la mme concentration de 40 g/ml.
Lvaluation de la rsistance des souches de lupin aux diffrents antibiotiques tests a montr
que les profils sont gnralement similaires ceux des souches croissance rapide concernant
la kanamycine, la ttracycline et la streptomycine. Toutefois, les souches montrent une grande
tolrance lrythromycine et lampicilline.
La slection de souches prsentant une rsistance multiple aux diffrents antibiotiques est trs
intressante du fait que cette rsistance peut tre utilise comme un important marqueur pour
lidentification des souches et ltude de leur diversit (Josey et al., 1979 ; Shishido et Pepper,
1990 ; Sawada et al, 1990).

Leffet de six diffrents mtaux lourds sur le dveloppement des souches de lupin a t valu
(tableau 12). La plus forte rsistance a t enregistre pour les chlorures daluminium, de
magnsium et de zinc. Les concentrations varient entre 200 400 g/ml. A loppos, une plus
faible rsistance a t enregistre pour le chlorure de cadmium et le chlorure de mercure tests
de 5 30g/ml et 40g/ml respectivement. Ces deux mtaux savrent donc les plus
.106
Tableau 12. Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin aux mtaux lourds
L. luteus
Plante hte Souches
Mtaux lourds (g/ml)
MSMC 511
Al
400
Mn
400
Zn
400
Cd
30
Hg
40
Co
100
MSMC 513
400
400
400
30
100
MSMC 514
300
400
200
40
< 100
MSMC 515
400
400
400
30
40
100
MSMC 516
400
400
400
30
40
100
MSMC 517
400
400
400
30
40
100
MSMC 518
400
400
400
30
40
100
MSMC 5110
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5111
400
400
400
30
40
100
MSMC 5112
400
400
200
40
100
MSMC 5113
300
400
400
30
40
< 100
MSMC 5114
200
400
400
20
40
< 100
MSMC 5115
400
400
400
40
< 100
MSMC 5116
400
400
< 200
30
40
100
MSMC 5119
400
200
< 200
<5
40
< 100
MSMC 5123
200
400
< 200
40
< 100
MSMC 5126
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5127
400
400
200
40
< 100
MSMC 5133
400
400
300
40
< 100
MSMC 5142
400
200
400
40
< 100
MSMC 5143
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 5150
200
200
< 200
40
100
MSMC 5155
300
200
300
30
< 100
MSMC 5156
400
400
< 200
30
< 100
INRA L15
400
200
400
30
< 100
INRA L16
400
200
400
30
< 100
INRA L17
400
400
400
30
100
.107
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Plante hte Souches
Mtaux lourds (g/ml)

Al
Mn
Zn
Cd
Hg
Co
INRA L21
400
400
400
30
100
INRA L211
400
400
400
30
< 100
INRA L212
400
400
400
30
100
INRA L23
400
400
400
30
100
INRA L29
400
400
400
30
< 100
MSMC 532
200
400
< 200
40
< 100
MSMC 536
200
400
200
30
40
< 100
MSMC 539
400
400
< 200
40
< 100
MSMC 5319
300
400
300
40
100
MSMC 5326
400
400
200
30
40
< 100
MSMC 5328
300
400
< 200
30
20
< 100
INRA L32
400
400
400
30
100
MSMC 541
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 547
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 549
400
400
< 200
20
40
< 100
MSMC 5416
400
400
< 200
40
100
MSMC 5419
400
400
200
20
40
< 100
MSMC 5425
400
400
400
30
40
< 100
INRA L43
400
400
400
30
100
INRA L44
400
200
400
30
100
MSMC 554
400
400
400
30
40
< 100
MSMC 556
400
400
400
40
< 100
INRA L51
400
200
400
30
20
100
INRA L52
400
400
400
30
20
100
INRA L61
400
400
400
30
20
100
Al = aluminium, Mn = manganse, Zn = zinc, Cd = cadmium, Hg = mercure et Co = cobalt.
.108
80%
60%
40%
20%
Co 100
Hg 40
Hg 20
Hg 5
Cd 30
Cd 20
Zn 400
Zn 300
Mn 400
Mn 300
Alu 400
0%
Alu 300
% Souches tolrantes
100%
Mtaux lourds (g/ml)

Figure 20. Effet des mtaux lourds sur la croissance des souches nodulant le lupin
.109
inhibiteurs pour le dveloppement des souches. Toutefois, les souches de lamas nodulaire
sont majoritairement rsistantes ces deux formes de mtaux. Toutefois, les niveaux de
rsistance aux diffrents mtaux tests taient gnralement similaires entre les diffrentes
souches.
La figure 20 indique que plus de 80% des souches montrent une grande rsistance
laluminium et au manganse la concentration de 400 g/ml. A la mme concentration en
zinc, plus de 60% des souches se sont rvles galement rsistantes. Contrairement nos
rsultats, Zerhari et al. (2000) a montr que les souches dacacia croissance rapide taient
plus sensibles laluminium.
Il a t rapport que laluminium agit au niveau de lADN des souches de Rhizobium
(Johnson et Wood, 1990). Lexposition de ces bactries aux fortes concentrations en
aluminium affecte galement leur mobilit dans le sol et leur capacit infective (Octive et al.,
1994).
Lexposition un excs de manganse affecte la composition de la membrane externe chez
les rhizobia. En fait, Appana (1988) a montr que les fortes concentrations en manganse
peuvent altrer la composition ainsi que le rle des exopolysaccharides chez des souches de
Sinorhizobium meliloti.
Wilson et Reisensauer (1970) ont rapport que le manganse et le zinc affectent ngativement
la croissance des rhizobia. Un excs de zinc exerce un effet inhibiteur non seulement sur la
croissance des rhizobia mais aussi sur leur efficience travers la perte des plasmides
symbiotiques (Casella et al., 1988 ; Giller et al., 1998).
La rsistance des souches de lupin aux diffrentes concentrations testes en cadmium et en
mercure parait tre semblable. Ces deux mtaux ont t tests de faibles concentrations et
les rsultats confirment quils sont les plus inhibiteurs de la croissance. La taille des colonies
formes a t galement et visiblement trs rduite par rapport celle des tmoins.
Actuellement, le cadmium est reconnu comme tant nfaste aussi bien pour les
microorganismes symbiotiques que pour ltablissement de la symbiose (Tiller et al., 1994 ;
Purchase et al., 1997 ; Gusmao-lima et al., 2005).
Le cobalt test 100 g/ml a pu entraner linhibition de la croissance de plus de 50% des
souches. Il a t rapport que les fortes concentrations en cobalt agissent ngativement sur la
.110
croissance des souches de Bradyrhizobium japonicum (Lowe et al., 1960). Ce mtal exerce un
effet ngatif sur la survie des rhizobia de lupin, sur linitiation nodulaire ainsi que sur la
colonisation de la rhizosphre par ces bactries (Riley et Dilworth, 1985).
Les mtaux lourds prsents dans le sol peuvent entraner un disfonctionnement du
mtabolisme cellulaire des rhizobia (Gusmao-lima et al., 2005). Le nombre et la survie de ces
bactries dans les sols contamins peuvent tre svrement affects (Reddy et al., 1983 ;
Obbard et al., 1994).
Angle et al. (1993) ainsi que Tong et Sadowsky (1994) ont rapport que les souches de
Bradyrhizobium sont plus rsistantes aux mtaux lourds puisquils ont la capacit dalcaliniser
le milieu et rendre ainsi les mtaux moins disponibles dans leur environnement. Cependant,
une grande variabilit de rsistance diffrents mtaux lourds a t observe entre les souches
appartenant la mme espce Bradyrhizobium japonicum (Kinkle et al., 1987).
La nature du sol et son pH peuvent influencer la prcipitation ou la solubilit des minraux.
Sous forme ionique, un mtal devient plus mobile et donc plus toxique. Leffet combin du
pH et des mtaux lourds sur une population de Rhizobium leguminosarum et sur son potentiel
fixateur dazote sest rvl plus nfaste sous les conditions dacidit (Ibekwe et al., 1997).
Certaines associations rhizobium lgumineuse sont capables de se maintenir sur des sols
haut contenu en mtaux lourds. En effet, linoculation des graines de trfle cultives sous
stress mtallique par des souches de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii efficientes et
rsistantes aux mtaux lourds a pu augmenter le taux de la fixation dazote (Giller et al.,
1989). Linoculation de Glycine max par des rhizobia hautement rsistants a t rapporte tre
bnfique (Dev et al., 1998).
La slection de souches rsistantes aux mtaux lourds prsente un grand intrt pratique.
Plusieurs recherches se penchent actuellement sur lutilisation de la symbiose entre des
rhizobia et des lgumineuses rsistantes comme un moyen efficace de bio-remdiation
contre la contamination des sols par les mtaux lourds. En outre, lutilisation du rhizobium
comme un agent de prvention dans les sols contamins a t rcemment rapporte par Abbes
et Kamel (2004).
.111
Les souches tudies se sont avres trs tolrantes des concentrations leves en NaCl
(Tableaux 13 et Annexe 14). La limite de tolrance des souches au sel stend de 170 mM
avec la souche INRA L52 jusqu 1700 mM avec 9% de souches en loccurrence la MSMC
5124, INRA L 213, INRA L 34, MSMC 5411 et autres. Particulirement, les souches de
lamas nodulaire prsentent diffrentes marges de tolrance qui se situent entre 680 mM et
1530 mM.
La figure 21 montre que la tolrance la salinit diminue progressivement en fonction de
laugmentation de la concentration en sel. Toutefois 80 % des souches peuvent tolrer une
concentration de 850 mM NaCl et presque 60% tolrent plus de 1M NaCl. Des souches
hautement tolrantes (9% des souches) pouvant crotre 1700 mM NaCl ont t galement
identifies.
Raza et al. (2001) ont isol des souches de lupin pouvant tolrer jusqu 1190 mM NaCl.
Paralllement nos rsultats, Zahran et al. (1994) ont rapport des niveaux de tolrance chez
des souches de lupin isoles dEgypte pouvant aller jusqu 1700 mM NaCl. Les rhizobia
darbres lgumineux sont supposs tre plus tolrants la salinit. Des souches nodulant
Acacia, Prosopis et Leucaena se sont rvles tolrantes 500 mM et 850 mM NaCl (Lal et
Khanna, 1995 ; Zerhari et al., 2000). Toutefois, un dveloppement a une concentration saline
de 850 mM et mme plus a t rapport pour diffrentes souches nodulant des plantes
annuelles cultives ou fourragres au Maroc. Matallah et al. (2002) ont pu identifier des
souches nodulant le pois chiche qui tolrent 850 mM NaCl. Des rhizobia nodulant le
funegreck sont capables de crotre une concentration en NaCl aussi leve que 2380 mM
(14%) (Abdelmoumen et al., 1999).
Les limites de tolrance la salinit entre les rhizobia peuvent varier considrablement dune
espce une autre (Elsheikh et Wood, 1989 ; Rai, 1983) et mme entre les souches de la
mme espce (Kassem et al., 1985).
Graham et Parker (1964) ont montr que les souches croissance rapide sont plus tolrantes
la salinit que les bradyrhizobia. Des rsultats similaires ont t galement rapports par
plusieurs auteurs (Jordan, 1984 ; Stowers et Elkan, 1984 ; Elsheikh et Wood, 1989 ; Odee et
al., 1997). Toutefois, des souches croissance lente nodulant le genre Vigna pouvant tolrer
des concentrations leves en NaCl de lordre de 4 % 5,5 % ont t caractrises par
.112
80%
60%
40%
20%
1700mM
1530mM
1360mM
1190mM
1020mM
850mM
680mM
510mM
340mM
0%
170mM
% Souches tolrantes
100%
Concentration en NaCl
Figure 21. Tolrance des souches nodulant le lupin diffrentes concentrations en NaCl
.113
Tableau 13. Marge de tolrance des rhizobia nodulant le lupin au NaCl, au pH et la

temprature.
L. luteus
Plante hte Souches

MSMC 511
MSMC 512
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 519
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5117
MSMC 5118
MSMC 5119
MSMC 5120
MSMC 5121
MSMC 5122
MSMC 5123
MSMC 5124
MSMC 5125
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5128
MSMC 5129
MSMC 5130
MSMC 5131
MSMC 5132
MSMC 5133
MSMC 5134
MSMC 5135
MSMC 5136
MSMC 5137
MSMC 5138
MSMC 5139
MSMC 5140
MSMC 5141
MSMC 5142
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
850
1360
850
1020
1360
850
1530
1530
1530
850
1530
1530
1020
680
850
680
850
1020
1020
680
680
850
1020
1700
850
850
1530
1360
850
1530
1700
850
850
1530
1530
850
1360
1530
1530
1530
1530
1530
4.5 9,5
3 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
3 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4.5 - 9,5
4 - 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4.5 9,5
5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
15 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
.114
L. albus
L. luteus
Souches
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
MSMC 5143
MSMC 5144
MSMC 5145
MSMC 5146
MSMC 5147
MSMC 5148
MSMC 5149
MSMC 5150
MSMC 5151
MSMC 5152
MSMC 5153
MSMC 5154
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5158
MSMC 5159
MSMC 5160
INRA L11
INRA L12
INRA L13
INRA L14
INRA L15
INRA L16
INRA L17
INRA L18
INRA L19
1530
1530
1360
1360
1360
1530
850
850
1360
510
1360
680
850
850
1360
680
1020
1190
1700
850
1700
1700
1700
1530
1360
1360
1700
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
MSMC 521
MSMC 522
INRA L21
INRA L210
INRA L211
INRA L212
INRA L213
INRA L23
INRA L24
INRA L26
INRA L27
INRA L28
INRA L29
1190
1020
1530
1530
1360
1190
1700
1530
680
850
680
680
680
3.5 - 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
5.5 9,5
4 9,5
4 9,5
5 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
10 - 42
.115
L. angustifolius
Souches
MSMC 531
MSMC 532
MSMC 533
MSMC 534
MSMC 535
MSMC 536
MSMC 537
MSMC 538
MSMC 539
MSMC 5310
MSMC 5311
MSMC 5312
MSMC 5313
MSMC 5314
MSMC 5315
MSMC 5316
MSMC 5317
MSMC 5318
MSMC 5319
MSMC 5320
MSMC 5321
MSMC 5322
MSMC 5323
MSMC 5324
MSMC 5325
MSMC 5326
MSMC 5327
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 5331
MSMC 5332
MSMC 5333
MSMC 5334
INRA L31
INRA L32
INRA L33
INRA L34
INRA L35
INRA L36
INRA L37
INRA L38
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
510
340
850
850
850
680
850
1020
1190
680
680
850
850
850
1020
1190
340
1020
680
1530
850
850
850
1020
1020
680
1020
340
850
680
1020
1360
1020
1360
850
1530
680
1700
1360
1700
680
680
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
4 9,5
3 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 35
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 35
4 42
4 35
4 35
4 42
4 42
.116
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
Souches
NaCl (mM)
pH (units)
T (C)
MSMC 541
MSMC 542
MSMC 543
MSMC 544
MSMC 545
MSMC 546
MSMC 547
MSMC 548
MSMC 549
MSMC 5410
MSMC 5411
MSMC 5412
MSMC 5413
MSMC 5414
MSMC 5415
MSMC 5416
MSMC 5417
MSMC 5418
MSMC 5419
MSMC 5420
MSMC 5421
MSMC 5422
MSMC 5423
MSMC 5424
MSMC 5425
INRA L41
INRA L42
INRA L43
INRA L44
1360
1360
1190
1190
1360
1360
1190
680
1530
1530
1700
1700
850
1530
1700
1530
1530
680
850
850
510
680
1190
1700
1360
680
680
850
340
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
5 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3.5 9,5
4 9,5
3 9,5
4 9,5
4 9,5
3.5 9,5
3.5 9,5
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
10 42
4 - 42
MSMC 551
MSMC 552
MSMC 553
MSMC 554
MSMC 555
MSMC 556
MSMC 557
MSMC 558
MSMC 559
MSMC 5510
MSMC 5511
MSMC 5512
INRA L51
INRA L52
1190
340
1530
850
1530
510
1530
1020
1020
1530
1020
1020
1530
170
3.5 9,5
4 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
4.5 9,5
3 9,5
3 9,5
3 9,5
3.5 9,5
3 9,5
3 9,5
4 9,5
5 9,5
4 - 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 42
4 - 42
10 - 42
INRA L61
1190
5 9,5
4 - 42
.117
Mpepereki et al. (1997). Des tudes ont montr cependant que la tolrance au sel nest pas
corrle avec le taux de croissance (Zerhari et al., 2000) mais dautres mcanismes
physiologiques et biochimiques (Botsford et Lewis, 1990 ; Brhada et al., 1997 ; Gouffi et al.,
1999).
Nous avons not que les souches MSMC 5317 et INRA L 52 qui proviennent des rgions non
irrigues ont t inhibes par les basses concentrations testes de 170 mM et 340 mM NaCl
alors que les souches qui proviennent de sites des rgions irrigues telles que les souches
isoles de L. luteus dans la rgion du Gharb sont toutes tolrantes au sel. Le Gharb est class
comme tant une rgion menace par une salinisation croissante du sol. La tolrance au sel
qui caractrise les souches tudies pourrait tre en rapport avec le taux de salinit du site
disolement. Un rsultat similaire a t rapport par Matallah et al. (2002) pour des souches
de Mesorhizobium nodulant le pois chiche au Maroc et par Mohammed et al. (2000) pour des
souches nodulant Acacia en Libye.
Mpepereki et al. (1997) ont rapport que lexistence de souches tolrantes la salinit dans
les sites salins peut tre une indication dune adaptation au stress osmotique qui est d
laugmentation de la concentration dions et la variation de lhumidit du sol durant les
priodes sches.
Dans cette tude, nous avons not que la majorit des souches prsentent une bonne tolrance
la salinit. Cependant, dans les environnements salins, la symbiose rhizobia - lupin dpend
non seulement du microorganisme mais galement de la plante hte. Il a t rapport que
lespce L. angustifolius peut se dvelopper un niveau de salinit de sol trs lev
(Bordeleau et Prvost, 1994). Cependant, Cette espce est trs riche en alcalodes et se trouve
au Maroc essentiellement ltat sauvage.
La slection de couples symbiotiques tolrants la salinit reste llment essentiel pour
lamlioration de la symbiose sous des conditions de stress salin.
3. 9 Tolrance au pH
Les rsultats de la tolrance aux pH acides et alcalins de lensemble des souches de la
collection sont prsents dans le tableau 13. Les pH alcalins sont plus tolrs que les pH
acides. Les souches, y compris ceux de lamas nodulaire, ont pu toutes tolrer la grande
valeur de pH teste qui est de 9,5. La tolrance lacidit sest rvle par contre trs variable
.118
avec des marges comprises entre 3 et 5. Toutefois, la souche INRA L 23 ne peut se

dvelopper qu partir du pH 5,5.
La figure 22 reprsente le pourcentage de souches tolrantes aux diffrents pH tests. Aux pH
neutres et alcalins, toutes les souches prsentent un dveloppement optimal. 100% des
souches testes sont mme capables de pousser au pH 9,5. Les tests du pH conduits sur le
milieu YEM liquide ont pu confirmer les rsultats obtenus sur le YEM solide.
Aux pH acides, une sensibilit variable des souches de lupin a t note. La figure 22 montre
une diminution de la tolrance en partant de la neutralit vers lacidit. Toutefois, 99% des
souches peuvent crotre au pH 5, 80% des souches peuvent crotre au pH 4, la moiti des
souches peut tolrer un pH de 3,5 et 33% ont pu crotre au pH 3.
Nos rsultats sont en accord avec ceux de Raza et al. (2001) qui ont rapport une tolrance
allant du pH 4 au pH 10 pour quelques souches isoles des deux espces L. luteus et L.
angustifolius. Cordero et Blair (1978) ont rapport que la limite infrieure de la tolrance au
pH pour Rhizobium lupini est denviron 4,2 3,2.
Selon Graham (1964) et Jordan (1984), les rhizobia peuvent tolrer des pH allant de 4,5 9.
Yadav et Vyas (1971) ont mme montr quune vingtaine de souches isoles de huit espces
diffrentes de lgumineuses ont pu tolrer des pH levs de lordre de 10 sous des conditions
non salines.
Daprs nos rsultats, les souches tudies ont gnralement un taux de croissance rapide et
sont globalement tolrantes lalcalinit et majoritairement tolrantes lacidit.
Zablotowicz et Focht (1981) ont rapport que les souches croissance lente qui nodulent
Vigna unguiculata ont t plus sensibles aux pH alcalins que celles croissance rapide.
Dautres tudes ont montr que les rhizobia croissance rapide sont gnralement plus
sensibles lacidit que les bradyrhizobia (Jordan, 1984 ; van Rossum et al., 1994).
Cependant, des souches de la mme espce peuvent montrer une large variation de tolrance
au pH (Glenn et Dilworth, 1994). En effet, des souches tolrantes des valeurs trs basses de
pH ont t retrouves chez des espces croissance rapide telles que Mesorhizobium loti et
Rhizobium tropici (Cooper, 1982 ; Cooper et al., 1985 ; Graham, 1992 ; Graham et al., 1994 ;
Gao et al., 1994). Toutefois, certains auteurs ont montr quil ny a pas de corrlation entre la
.119
80%
60%
40%
20%
pH
Figure 22. Tolrance aux pH des souches nodulant le lupin
9,5
4,5
3,5
0%
3
% souches tolrantes
100%
.120
tolrance dune souche au pH acide du milieu et le taux de sa croissance (Mohamed et al.,

2000). De plus, Correa et Barneix (1997) ont montr que la tolrance au pH acide de quelques
souches croissance rapide appartenant lespce Mesorhizobium loti ne peut pas tre
corrle leur aptitude acidifier le milieu. Ces auteurs ont suggr que la tolrance
apparente ne peut pas tre due lexcrtion de composs qui alcalinisent le milieu mais plutt
la prsence dautres facteurs qui protgent la cellule bactrienne de laction de la forte
concentration extracellulaire en protons.
Il a t rapport que la tolrance des souches lacidit peut tre due au pH acide du milieu
disolement de ces souches. Dans notre cas, les valeurs du pH au KCl mesures pour les
diffrents sites disolement des souches tudies sont majoritairement acides ou neutres.
Graham (1998) a rapport que les souches isoles des sols acides ne sont pas toutes tolrantes
lacidit mais celles-ci peuvent se dvelopper dans des microniches pH favorable.
Cependant, lisolement et la slection de souches efficientes tolrantes lacidit partir de
sols acides a t largement rapport (Nour et al., 1994b ; Del Papa et al., 1999). En Australie
de louest, lusage dune souche indigne de Sinorhizobium meliloti tolrante au pH acide
pour linoculation de Medicago polymorpha, lgumineuse galement adapte aux conditions
acides, a pu aboutir laugmentation des terrains de pturage sur sols acides (Howieson et al.,
1988). Gardner et al. (1983) (cit par Bordeleau et Prvost, 1994) ont rapport que diffrentes
espces du genre Lupinus montrent une bonne adaptation au pH acide. En outre, une grande
rduction de la nodulation et de la fixation dazote chez les lupins cultives a t observe sur
des sols pH suprieur 6,5 (ITCF et al., 1988). Dans de tel cas, la slection de couples
tolrants lalcalinit savre llment ncessaire pour une symbiose efficace. Dans notre
tude, la majorit des souches prsente une tolrance de 100% au pH variant entre 4,5 et 9.
Par consquent, la slection de souches tolrantes un pH acide ou alcalin est trs large.
Les rsultats indiquant les marges de tolrance la temprature des souches de lupin sont
reprsentes dans le tableau 13. La totalit des souches de lamas nodulaire et la plupart des
autres souches tolrent des tempratures variant de 4 42C. La souche 5135 ne prsente
aucun dveloppement des tempratures infrieures 15C et 5% de souches sont inhibes
par les tempratures infrieures 10C (INRA L12, INRA L24, INRA L 29, MSMC 536 et
autres). Certaines souches ne peuvent pas tolrer des tempratures suprieures 35C, cest le
cas de 4% de souches telles que la MSMC 5156, INRA L 14, MSMC 537, etc. Il rsulte de ce
.121
test que la majorit des souches prsentent une bonne thermotolrance tant aux basses quaux
hautes tempratures.
La figure 23 montre que toutes les souches prsentent une bonne croissance entre 10C et
35C. En outre, 95 % des souches ont pu crotre 4C et 38C et peuvent mme supporter
une temprature de 42C.
Les souches thermotolrantes peuvent ne pas crotre une temprature leve dtermine
mais peuvent plutt survivre un rythme trs ralenti. Ceci a t mis en vidence par le suivi
de la croissance de la souche MSMC 5110 aux tempratures de 28C et 42C. A 28C, le
temps de gnration a t valu 45min. alors qu 42C la DO ne dpassait gure la valeur
de 0,64 mme aprs 15 jours dincubation.
Graham (1992) a rapport que les rhizobia sont des bactries msophiles qui peuvent se
dvelopper des tempratures se situant entre 10C et 37C et que la temprature optimale de
croissance de la plupart des souches est 28C. Toutefois, il existe des souches qui tolrent des
tempratures extrmes comme celles qui nodulent certaines lgumineuses dans les rgions
arctiques (Lipsanen et Lindstrm, 1989) ou bien celles isoles dans lenvironnement chaud et
sec de la savane du sahel en Afrique et qui peuvent tolrer des tempratures au-del de 40C
(Eaglesham et Ayanaba, 1984 ; Karanja et Wood, 1988).
Des souches de Rhizobium leguminosarum isoles de plantes de lentille dans la valle du Nil
peuvent tolrer jusqu 35C et 40C (Moawad et Beck, 1991). Plusieurs tudes ont rapport
que les rhizobia darbres lgumineux ont laptitude de tolrer une temprature de 40C (de
Lajudie et al., 1994 ; Zahran et al., 1994 ; Missbah El Idrissi, 1996).
Il a t rapport que les bradyrhizobia sont plus thermotolrants que les souches croissance
rapide (Robert et al., 1982 ; Munevar et Wollum, 1981). Une tolrance 48,7C a t
rapporte pour quelques souches de Bradyrhizobium japonicum (Munevar et Wollum, 1981).
Nanmoins, Karanja et Wood (1988) ont montr que quelques souches de Rhizobium phaseoli
peuvent tolrer des tempratures de 45C 47C. Ces mmes auteurs ont rapport que mme
si ces souches peuvent bien tolrer les hautes tempratures, elles perdent en revanche leur
capacit infective.
.122
% souches tolrantes
100%
80%
60%
40%
20%
0%
4
10
15
35
38
42
Temperature (C)
Figure 23. Tolrance des souches nodulant le lupin diffrentes tempratures
.123
Il a t rapport que les basses tempratures sont parmi les principaux facteurs limitant la
fixation dazote par les rhizobia dans les rgions trs humides ou froides (Zhang et Smith,
1996). Laction similaire des hautes tempratures a t galement rapport (Kishinevsky et
al., 1992 ; Hungria et Franco, 1993).
Lexposition aux hautes tempratures peut mener la perte du plasmide symbiotique et par
consquent la perte de la capacit infective de la bactrie. Les tempratures leves peuvent
mener la rduction du nombre de cellules au dessous du niveau demand pour une bonne
nodulation. Somasegaran et al. (1984) ont pu montr un dclin graduel de la persistance dune
population de souches de Rhizobium incube 37C pendant huit semaines.
Il est vident que les rhizobia peuvent conserver une bonne performance quand elles sont
utilises dans un environnement conditions climatiques similaires leur site dorigine.
Cependant, plusieurs auteurs ont signal quil nexiste aucune corrlation entre la temprature
du site disolement et la tolrance des souches au stress thermique (Zahran et al., 1994 ;
Mohammed et al., 2000). De mme, dans la prsente tude, on a not que les souches isoles
dans les rgions chaudes et arides (Marrakech) tolrent la temprature de 4C et que les
souches isoles dans les rgions plus humides (Rif) peuvent supporter les tempratures
leves de 40C et 42C.
Daprs les rsultats des trois tests prcdents, une grande plasticit de tolrance au pH, la
salinit et la temprature a t note pour lensemble des souches nodulant les diffrentes
espces de lupin malgr leur provenance de rgions trs diffrentes et trs loignes. Par
consquent, la slection de souches hautement tolrantes est trs large. Ainsi, des candidats
ont t slectionns pour les tests dinoculations qui ont t mens par lINRA de Rabat tout
en prenant en considration le site et la plante hte dorigine (Tableau 14).
Tableau 14. Souches slectionnes pour les inoculations
Rgion
Plante hte
Souches
Mnasra
L. luteus
MSMC 5116
Ceinture verte, Rabat
L. luteus
MSMC 5134
Guich, Rabat
L. albus
MSMC 522
Gharb
L. angustifolius
MSMC 537
Gharb
L. cosentinii
MSMC 545
.124
3. 11 Analyse numrique
Lanalyse numrique englobe la comparaison des caractristiques morphologiques,
physiologiques et biochimiques entre les souches prises deux deux. Cette mthode danalyse
a t utilise comme une premire mthode de caractrisation et de regroupement de
diffrentes souches non encore identifies (Zhang et al., 1991).
Il a t rapport que lanalyse numrique ne peut tre valable que sur une base comparative
dau moins 50 caractres relatifs aux souches (Sneath, 1984). Cette marge ntait pas toujours
respecte. Cest le cas dans ltude qui a t mene par Schlinkert-Miller et Pepper (1988)
pour la description de quelques symbiotes croissance rapide de lupin.
Il est galement recommand que la caractrisation phnotypique soit effectue sous des
conditions standardises afin que la comparaison avec les souches de rfrence ou mme entre
les souches de diffrents laboratoires soit applicable (Martinez-Romero et al., 1991).
La prsente analyse mene pour ltude des souches de lupin sest base sur 105 caractres
phnotypiques. Ceux-ci ont t tests selon des mthodes dcrites comme rfrences fiables
pour la caractrisation des rhizobia. Les caractres les plus discriminants de cette analyse ont
t groups et reprsents dans le tableau 15. Toutefois, les rsultats de lensemble des
caractres phnotypiques ont t traits par UPGMA. Le dendrogramme qui drive de cette
analyse est reprsent par la figure 24. A 75% de niveau de similarit, les souches se trouvent
rparties en quatre clusters bien dlimits avec deux linages indpendants reprsents par les
deux souches MSMC 5419 et INRA L15. En fait, lanalyse par UPGMA nous a permis de
mettre en vidence des groupes phnotypiques qui renferment une large diversit aussi bien
entre les clusters dtermins qu lintrieur de chaque cluster. En effet, les souches de chaque
cluster prsentent une grande variabilit au niveau de lassimilation des carbohydrates ainsi
quau niveau des profils de rsistance aux diffrents antibiotiques et mtaux lourds tests.
Toutefois, lensemble des souches des quatre diffrents clusters prsente une large gamme de
tolrance au pH et la temprature. En outre, les souches appartenant une mme plante hte
et au mme site gographique peuvent tre groupes dans diffrents clusters, cest le cas des
souches de lamas nodulaire qui se trouvent rparties entre les clusters 1, 2 et 4.
Les deux souches MSMC 5419 et INRA L15 se caractrisent par leur capacit assimiler les
sucres complexes tels que le D- tagatose, linuline, lamidon et lesculine. En outre, la souche
MSMC 5419 prsente dimportants traits phnotypiques. Elle peut tolrer une concentration
.125
Tableau 15. Rsultats des tests phnotypiques diffrenciant entre les souches nodulant le
lupin des diffrents clusters forms par lanalyse UPGMA
Nombre de souches
Plantes htes
Cluster
1
13
Cluster
2
9
Cluster
3
16
Cluster
4
12
MSMC
5419
1
INRA
L15
1
Les 6
L. luteus
Les 6
L. luteus
L.
L.
espces
L. cosentinii
espces
L.
cosentinii
luteus
angustifolius
Caractristiques phnotypiques
Infectivit (nombre de nodosits par plante)
n < 30
30 < n < 50
12
n > 50
% < 60
60 < % < 70
11
% > 70
G < 2h
14
11
G > 2h
Test du BTB
12
Efficience relative
Temps de gnration
Assimilation des substrats carbons

Glucose
12
Fructose
13
16
12
L - Arabinose
13
16
12
Glycrol
13
16
12
Mannitol
13
16
12
Saccharose
12
16
Raffinose
13
16
Amidon
Esculine
13
12
Hydrolyse de lure
13
10
Rduction du nitrate
6 - 6ND
3 - 3ND
8 - 7ND
10 - 1ND
ND
.126
Rsistance aux antibiotiques (g/ml)
Ttracycline 50
12
Streptomycine 50
11
Spectinomycine 50
10
13
Chloramphnicol 100
14
11
Kanamycine 25
Acide nalidixique 50
12
14
11
Ampicilline 200
14
11
Erythromycine 200
12
15
Rsistance aux mtaux lourds (g/ml)

Aluminium 400
13
14
Manganse 400
12
14
10
Zinc 400
11
13
Cadmium 30
10
14
Mercure 40
Cobalt 100
170
13
16
12
340
13
15
12
510
12
15
10
680
11
15
10
850
14
1020
10
1190
10
1360
1530
1700
3,5
14
4,5
12
15
12
5,5 9,5
13
16
12
Tolrance au NaCl (mM)
Tolrance au pH
Tolrance la temprature (C)

4
12
15
12
10 42
13
16
12
.127
Cluster 2
Cluster 1
Cluster 3
Cluster 4
II
MSMC511
MSMC513
MSMC516
MSMC5114
MSMC5115
MSMC5116
INRAL21
INRAL23
INRAL32
INRAL43
MSMC556
INRAL29
INRAL44
MSMC515
MSMC517
MSMC518
MSMC5111
MSMC5112
MSMC5142
MSMC5127
MSMC549
MSMC5416
MSMC5110
INRAL16
INRAL51
INRAL17
INRAL212
MSMC5126
MSMC541
MSMC5425
INRAL211
INRAL61
MSMC5143
MSMC547
MSMC5150
MSMC5326
MSMC554
INRAL52
MSMC5419
MSMC514
MSMC5123
MSMC536
MSMC5113
MSMC539
MSMC5119
MSMC5319
MSMC5133
MSMC5155
MSMC5156
MSMC532
MSMC5328
INRAL15
100
95
90
85
80
75
70
65
60
% de similarit
Figure 24. Phnogramme indiquant les similarits phnotypiques entre les souches nodulant
le lupin issues de diffrentes rgions du Maroc sur la base de lanalyse numrique.
.128
de 850 mM NaCl et son efficience relative de fixation dazote est trs leve de lordre de
83%. Elle peut galement rduire le nitrate et hydrolyser lure. La souche INRA L 15
prsente galement quelques traits distinctifs. Elle peut tolrer 1700 mM NaCl et montre un
potentiel de fixation dazote de lordre de 74%. Cependant, les tests biochimiques se sont
rvls ngatifs.
Le cluster 1 est form par des souches qui appartiennent diffrentes espces de lupin
(Tableau 15). Toutes les souches de lespce L. luteus sont issues de lamas nodulaire. La
majorit des souches de ce cluster peut tolrer une concentration en sel allant jusqu 1530
mM NaCl. Ce cluster renferme des souches majoritairement moins infectives. Concernant
lefficience relative, les souches de L. luteus sont les moins efficientes et prsentent un
pourcentage qui varie entre 39% et 57% alors que lefficience relative des autres souches
varie de 62% 78%. La moiti des souches prsente un temps de gnration suprieur 2h.
Pour les tests biochimiques, toutes les souches prsentent une activit positive de lurase.
Tandis que pour la nitrate rductase, seules les souches de L. luteus montrent un rsultat
positif. Particulirement, les souches de cette espce se sont rvles toutes rsistantes la
plus forte concentration du chlorure mercurique teste qui est de 40 g/ml. Pour les autres
minraux, les souches se sont rvles gnralement rsistantes.
Le cluster 2 est form par des souches qui appartiennent aux espces L. luteus et L. cosentinii.
Ces souches se distinguent spcialement par leur grande tolrance de fortes concentrations
en sel allant jusqu 1530 mM NaCl. Les souches sont majoritairement moins infectives.
Celles de L. luteus prsentent une efficience relative qui varie entre 51% et 59% sauf pour la
MSMC 518 qui reprsente la souche la plus efficiente (ER = 87%) alors que les souches de L.
cosentinii prsentent une efficience relative qui varie de 62% 74%.Toutes les souches ont un
temps de gnration infrieur 2h. Le tiers seulement de souches prsente des ractions
biochimiques positives. Une grande sensibilit aux antibiotiques a t note. Les fortes
concentrations testes en ttracycline, en spectinomycine et en kanamycine ont pu entraner
une inhibition total des souches. A loppos, pour les mtaux lourds, une rsistance totale a
t not pour les fortes concentrations en aluminium, en manganse et en mercure.
Le cluster 3 reprsente le cluster le plus htrogne avec des souches appartenant au six
diffrentes espces de lupin. Ce cluster est subdivis 77% de niveau de similarit en deux
subclusters I et II. Les souches du subcluster I sont capables de tolrer 1190 mM 1700 mM
NaCl. Lefficience relative des souches varie de 66% 77%. Cependant, les tests
.129
biochimiques se sont rvls majoritairement ngatifs. Les souches du subcluster II peuvent

tolrer 680 mM 850 mM NaCl, prsentent des pourcentages defficience relative de 55%
70% et des ractions positives pour la rduction du nitrate et lhydrolyse de lure.
Particulirement, ces souches sont toutes rsistantes la ttracycline teste 50 g/ml et la
spectinomycine 100 g/ml. Concernant les mtaux lourds, la sensibilit a t note
essentiellement pour le cobalt.
Le cluster 4 est form par des souches appartenant aux espces L. luteus et L. angustifolius.
Ces souches peuvent tolrer des concentrations en sel variant de 680 mM 1020 mM NaCl (
lexception des deux souches MSMC 532 et MSMC 5328), prsentent des capacits infectives
variables et possdent des efficiences relatives majoritairement leves. Les pourcentages
enregistrs varient de 55% 78%. Ces souches prsentent gnralement des ractions
positives pour les tests biochimiques et un temps de gnration infrieur 2h. La rsistance
aux diffrents antibiotiques et aux minraux tests montre des profils trs variables avec
toutefois une sensibilit gnrale pour la kanamycine. Les fortes concentrations en
aluminium, en zinc et en cobalt se sont rvles trs inhibiteurs pour les souches de ce cluster.
Dans cette analyse, nous avons remarqu que les similarits phnotypiques entre les souches
de lupin et qui sont bases sur lanalyse numrique tablie par UPGMA sont trs
concordantes avec les similarits bases sur les affinits de lassimilation des 49 substrats
carbons tests. En fait, selon Vandamme et al. (1996), lanalyse numrique et lanalyse de
lassimilation des carbohydrates par le biais des galeries API prsentent une rsolution
taxonomique similaire. En effet, la figure 23 (analyse numrique (clusters)) et la figure 18
(assimilation des substrats carbons (groupes)) montrent des groupements quasi-identiques.
Le cluster 1 renferme toutes les souches du groupe 1 plus la souches INRA L43 qui formait
un linage indpendant, les clusters 2 et 3 renferment toutes les souches du groupe 2, le
cluster 4 est identique au groupe 3 et les deux souches MSMC 5419 et INRA L15 qui sont
indpendamment classes dans la premire analyse forment galement des linages bien
dlimits dans la seconde.
La biodiversit des souches de lupin dtermine par lanalyse numrique confirme galement
la grande diversit dtermine par lanalyse PCR/REP. En effet, les souches issues de
diffrents sites et de diffrentes plantes htes peuvent tre groupes dans un mme cluster, le
cluster 3 en est lexemple.
.130
Cette diversit phnotypique nous permet toutefois de slectionner avec prcision les bons
candidats pour tout essai dinoculation de lupin selon les exigences recommandes et selon les
diffrentes conditions pdo climatiques envisages (stress salin, tempratures extrmes,
excs de nitrate, etc.). Ainsi,
-
En faveur de laugmentation du rendement de lupin cultiv sur des sols sans

problmes majeurs, on propose les souches MSMC 5126, MSMC 5425 et MSMC 518.
Ces trois souches sont trs tolrantes la salinit, au pH, la temprature et possdent
une nitrate rductase active. Elles sont galement trs rsistantes vis--vis des mtaux
lourds et des antibiotiques et surtout trs efficientes avec des efficiences relatives qui
varient de 74% 87%.
Pour les sols contamins par les mtaux lourds, on propose les souches MSMC 541,
MSMC 547 et MSMC 5126, qui sont non seulement trs rsistantes aux mtaux lourds
mais aussi diffrents antibiotiques. En outre, elles prsentent des pourcentages
defficience relative allant de 73% 76%.
Pour les sols problmes de salinit et dalcalinit, on recommande les souches INRA
L 61 et MSMC 554 en raison de la grande plasticit de tolrance et de rsistance
quelles prsentent pour lensemble des tests phnotypiques.
CHAPITRE IV
CARATERISATION
MOLECULAIRE
DES SOUCHES PAR
PCR/RFLP DE LADNr 16S
Caractrisation molculaire des souches par PCR/RFLP de lADNr 16S
.131
1 INTRODUCTION
Diffrentes approches phylogntiques permettant de classer les bactries fixatrices dazote
ont succd aux moyens dtude traditionnels. Rcemment, la PCR est intensment utilise
pour lanalyse du gne codant pour lARNr 16S (Woese, 1987, Graham et al., 1991).
LADNr 16S possde une taille de 1452 bases nuclotidiques (sauf pour la souche Rhizobium
tropici type II CFN 299 dont le gne est caractris par une insertion dun fragment dADN
de 72 paires de bases (Willems et Collins, 1993). Cette courte taille permet une amplification
rapide du gne par PCR laide damorces spcifiques.
Lanalyse par PCR/RFLP de lADNr 16S chez les rhizobia a t initialement dcrite par
Vaneechoutte et al. (1992). Cette technique connue galement par le terme ARDRA
(Amplified rDNA Restriction Analysis) prsente une grande importance comme approche
phylogntique puisquelle permet de regrouper les souches bactriennes un niveau de
rsolution taxonomique qui stend de lespce au genre (Heyndrickx et al., 1996). Laction
des enzymes de restriction sur le gne de lADNr 16S amplifi engendre la gense de
fragments de diffrentes tailles. Le polymorphisme de restriction peut tre ensuite rvl par
lectrophorse sur un gel dagarose.
Plusieurs tudes ont t menes pour lanalyse de ce gne chez de nombreuses souches et
espces bactriennes fixatrices dazote afin dtablir la relation phylogntique qui existe
entre ces bactries et les diffrents genres de rhizobium connus (van Berkum et Fuhrman,
2000 ; Sawada et al., 1993 ; Willems et Collins, 1993 ; Yanagi et Yamasato, 1993).
Dans ce chapitre, nous nous sommes fix pour objectif ltude de la diversit gntique qui
existe entre les 52 souches reprsentatives des grands groupes dlimits par lanalyse
PCR/REP de toutes les souches de la collection nodulant les diffrentes espces de lupin dans
diffrentes rgions du Maroc, la dtermination du positionnement taxonomique de ces
souches et lvaluation du niveau de rapprochement ou de divergence entre ces souches et les
souches de rfrence appartenant aux diffrents genres des rhizobia.

Tableau 16 : Liste des souches de rfrence utilises
Espce
Souche
Bradyrhizobium sp. (Arachis)
ISRA 616
Bradyrhizobium sp. (Arachis)
ISRA 601
Bradyrhizobium japonicum
USDA 110
Bradyrhizobium elkanii
ORS 2800
Bradyrhizobium canariense
BTA-1
Mesorhizobium plurifarium
ORS 1032
Mesorhizobium loti
NZP 2213
Mesorhizobium huakuii
ORS1752
Mesorhizobium tianshanense
ORS 2640
Mesorhizobium mediterraneum
ORS 2739
Mesorhizobium ciceri
ORS 2738
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli
ORS 663
Rhizobium leguminosarum biovar viciae
ORS 639
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii
ORS 662
Rhizobium giardinii
STM 854
Rhizobium gallicum
STM 853
Rhizobium etli
ORS 645
Rhizobium galegae
STM 1834
Rhizobium mongolensis
STM 246
Rhizobium huautlense
STM 247
Sinorhizobium fredii
USDA 205
Sinorhizobium meliloti
ORS 665
Sinorhizobium arboris
ORS 1755
Sinorhizobium saheli
ORS 100
Sinorhizobium terangae
ORS 1007
Sinorhizobium medicae
ORS 504
Sinorhizobium kostiense
ORS 97
Agrobacterium tumefaciense
ORS 1351
Agrobacterium rhizogene
ORS 1352
Agrobacterium rubi
ORS 1353
Agrobacterium vitis
ORS 2643
Allorhizobium undicola
ORS 992
.132
.133
2 MATERIEL ET METHODES
2. 1 - Souches bactriennes et milieu de culture
Les souches utilises dans cette tude reprsentent les 52 souches slectionnes partir de
lanalyse par PCR/REP et qui ont t caractrises phnotypiquement dans le chapitre
prcdant ainsi que 32 souches types reprsentant les genres Rhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Allorhizobium et Agrobacterium (tableau 16).
Lensemble des souches obtenues en culture pure sur le milieu YEM a t repiqu sur le
milieu TY solide pendant 48 h.
Les diffrentes souches de rfrence ainsi que certaines souches nodulant le lupin
productrices de quantits importantes dexopolysaccharides ont t ensuite mises en culture
dans le milieu TY liquide pendant 2 jours.
2. 2 - Mthodes dextraction de lADN

LADN de la majorit des 52 souches de lupin cultives sur le milieu TY solide a t
obtenue par la mthode de la lyse alcaline comme a t dcrit dans le chapitre II.
LADN des souches de rfrence et des autres souches nodulant le lupin cultives dans le
milieu TY liquide a t obtenu par la mthode dextraction au phnol chloroforme.
La mthode adopte est celle dcrite par Wilson (1989) avec quelques modifications. Ainsi,
pour la lyse bactrienne : 1,5 ml de la culture de chaque souche a t transfr dans un
ependorf et soumis une centrifugation pendant 7 min. 13000g. Le culot obtenu a t
additionn de 435 l de tampon TE (10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA, pH 8), 50 l de SDS
10% et 15 l dune solution de NaCl 5M. Le mlange a t incub une temprature de 70C
pendant 30 min. puis plac 4C pendant 2 min.
Afin dliminer les protines, 2 l de la Protinase K (10 mg/ml) ont t additionns au
mlange qui a t ensuite plac au bain- marie 37C durant 30 min.
Du phnol/chloroforme/alcool isoamylique (25 :24 :1) a t ajout volume gal (500 l) au
mlange. Le phnol a t additionn dans cette tape dans le but de dnaturer les protines
restant dans le milieu ractionnel. Lutilisation du chloroforme avec ce dernier lui permet une
bonne dnaturation des protines. Pour une bonne sparation des deux phases aqueuse et
.134
organique, la prsence de lalcool isoamylique savre indispensable. Aprs agitation, le tout

a t centrifug pendant 15 min. 13000g. La phase aqueuse (surnageant) a t rcupre
dans un nouveau ependorf strile puis un volume gal de chloroforme/alcool isoamylique
(24 :1) a t ajout dans le tube. Aprs une autre centrifugation pendant 15 min. 13000g, la
phase aqueuse a t encore rcupre dans un nouveau ependorf strile.
La prcipitation des acides nucliques a t effectue par lajout du 1/10 V dactate de
sodium 3 M, pH 4,8 (environ 50 l) ainsi que 2 V dthanol absolu -20C. Les ependorfs
ont t placs -80C pendant une heure puis on t mis en centrifugation pendant 20 min.
13000g. Le surnageant a t cart et le culot obtenu a t lav avec de lthanol froid 70%,
centrifug pendant 7 min. 13000g puis sch sous vide pendant 30 min. Le culot sch a t
suspendu dans 50 l TE (10 :1, pH 7,8).
Pour liminer toute contamination par les acides ribonucliques, 1 l dARNase a t
additionn au mlange qui a t ensuite incub dans un thermoblock 37C pendant une
heure. Aprs cette tape, les diffrents ependorfs ont t placs 4C jusquau lendemain
pour permettre la dissolution totale de lADN.
La quantit dADN a t dtermine par dosage spectrophotomtrique 260 nm. La puret de
lADN a t value par le rapport DO 260/280 (pour une bonne qualit dADN, le rapport
doit tre compris entre 1,8 et 2). Sachant que : 1 unit DO correspond 50 g/ml dADN, la
concentration de lADN en suspension a t dtermine selon la formule suivante :
La quantit de lADN (g/ml) = DO260 x Inverse du facteur de dilution x 50
LADN de chaque souche a t ensuite dilu dans du TE une concentration finale de 50
ng/l pour lutilisation dans les ractions damplification.
La qualit des ADN obtenus par les deux mthodes dextraction utilises a t rvle par
lectrophorse horizontale. Ainsi, 8 l de chaque chantillon dADN dpos sur un gel
dagarose 0,8% prpar dans le tampon TBE a t soumis une migration sous une
impulsion lectrique de 80V.
2. 3 - Amplification par PCR de lADNr 16S

La prsente PCR consiste multiplier la squence du gne de lADNr 16S laide damorces
spcifiques encadrant la squence de ce gne (tableau 16).
.135
Tableau 17. Squences des amorces utilises pour lamplification de lADNr 16S
Amorce
Squence 5 3
Rfrence
41f
5-GCTCAAGATTGAACGCTGGCG-3
Herrera-Cervera et al (1999)
1488r
5-CGGTTACCTTGTTCGACTTCACC-3
Une quantit de 4 l de lADN chromosomique des diffrentes souches a t ajoute un

mlange ractionnel de 66 l par microtube contenant le tampon de raction une
concentration finale 1X, 200 M de chaque dNTP, 1,4 mM de MgCl2, les deux amorces 41f et
1488r une concentration de 20 pmole/l et 4 units de Taq Polymrase (Promega).
Les ractions damplification ont t ralises dans un thermocycleur de type Gene Amp PCR
System 2700 (Applied Biosystems). Les mlanges ont subi un prchauffage de 2 min. 94C,
puis 10 cycles raliss comme suit : une tape de dnaturation de lADN 94C pendant 40
secondes, une tape dhybridation des deux amorces 60C pendant 60 secondes et une tape
dextension 72C pendant 120 secondes. Puis encore 25 cycles avec les mmes conditions
de dnaturation et dextension que prcdemment mais ltape de lhybridation a t effectue
50C pendant 60 secondes. Les deux sries de cycles sont suivies dune tape dlongation
finale des amorces 72C pendant 3 min. puis les microtubes ont t placs 4C jusqu
utilisation.
Des chantillons de 10 l des diffrents amplifiats dADNr 16S gnrs par PCR ont t
rvls dans un gel dagarose de 1,5% 80V pendant 90 min.
2. 4 - Digestion des produits de lamplification par les enzymes de

restriction
Un chantillon de 10 l des diffrents produits damplification de lADNr 16S a t utilis
pour la PCR/RFLP. Les amplifiats de 9 souches prises au hasard partir des souches
slectionnes reprsentant les 9 clusters dlimits par lanalyse PCR/REP ont t digrs avec
huit diffrents enzymes de restriction : Msp I et Hinf I (Promega Co, USA) ainsi que Hha I
(ou Cfo I), Taq I, Sau 3AI, Alu I, Rsa I et Dde I (Biolabs, NE, USA) pour la slection des
enzymes les plus discriminantes. La digestion a t ralise dans un volume final de 30 l.
Ces enzymes ont t utilises une concentration de 5 8 U/raction dans un volume final de
30 l contenant le tampon de raction 10X au 1/10me du volume final et conformment aux
recommandations du fournisseur du BSA 10 g/l au 1/100me du volume final.
.136
Les rsultats nous ont permis de retenir quatre enzymes, les plus discriminantes : Msp I, Hinf
I, Hha I et Taq I.
Pour activer laction des quatre enzymes, les mlanges ont t incubs dans un thermoblock
(Bioblock Scientific) pendant une heure 65C pour la TaqI et 37C pour les trois autres
enzymes.
15 l des produits de la digestion de toutes les souches tudies par chaque enzyme ont t
ensuite rvls par lectrophorse sur un gel dagarose 1,8% 70V pendant 4 heures.
Pour chaque gel, 5 l du marqueur de poids molculaire connu, le 100pb (Promega) ont t
mis en migration paralllement avec les chantillons analyser.
Le dpt des chantillons dans les puits a t facilit par laddition de 3 l du tampon de
charge. Ce tampon permet de suivre aisment la migration des chantillons dans le gel.
Aprs migration, les gels ont t mis dans un bain de coloration au Bromure dEthidium 1
mg/ml pendant 20 min. Ensuite, les gels ont t placs sur un trans-illuminateur UV puis
scanns (Perfect Image V.6).

Les distances de migration des diffrents fragments de restriction gnrs par chaque enzyme
ont t mesures indpendamment pour chaque gel. Les poids molculaires de ces fragments
ont t calculs laide de la fonction de la rgression linaire de la courbe logarithmique
obtenue par la distance des diffrentes bandes du marqueur molculaire utilis (le 100pb) en
fonction de leurs poids molculaires.
Les similarits entre les diffrentes souches analyses ont t values par la comparaison des
profils de restriction prises deux deux. Une matrice bidimensionnelle a t construite sur la
base de ces profils comme a t dcrit dans le chapitre II. Les distances gntiques calcules
en utilisant la moyenne algorithmique UPGMA ont permis la construction dun
dendrogramme qui permet de mettre en vidence les relations gntiques existant entre les
diffrentes souches analyses.
.137
3 RESULTATS
Lanalyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction du gne de lADNr
16S amplifi par PCR est lune des mthodes les plus utilises pour lidentification des
rhizobia (Young et al., 2001). Elle est rapide, ne ncessite pas de grandes quantits de matire
premire et surtout reproductible (Clark, 1997). Sa rsolution taxonomique qui permet la
distinction entre les diffrentes espces et genres de rhizobia nous a incit lutiliser comme
un premier moyen pour ltude de la phylognie des 52 souches de lupin pralablement
identifies et caractrises gntiquement par PCR/REP.
3. 1 - Amplification par PCR de lADNr 16S

Le gne ribosomique de lADNr 16S des 52 souches de lupin ainsi que celui des 32 souches
de rfrence a t amplifi. Lamplification a donn lieu une bande unique rvle par
lectrophorse chez lensemble des souches. La taille de la bande a t value visuellement
par comparaison au marqueur utilis, le 100 pb. Elle correspond au poids molculaire de
1500pb (figure 25). Ce rsultat est parfaitement conforme aux travaux de Willems et Collins
(1993) et celui de Laguerre et al. (1994).
3. 2 - Analyse par PCR/RFLP de lADNr 16S

Le gne de lADNr 16S amplifi par PCR des 9 souches reprsentatives des diffrents
groupes REP a t sujet une digestion par huit enzymes de restriction. Les profils
lectrophortiques des fragments obtenus ont permis la slection des enzymes les plus
discriminantes : Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I. Les sites de clivage de la squence
nuclotidique spcifique reconnue par chacune de ces quatre enzymes figurent dans le tableau
suivant
Tableau 18. Tableau indiquant le site de clivage de la squence nuclotidique
.
spcifique reconnue par les quatre enzymes de restriction utilises
Msp I
C CGG
Taq I
T CGA
Hha I
GCG G
Hinf I
G ANTC
Les profils de restriction obtenus pour les 32 souches de rfrence utilises dans cette analyse
(figure 26) ont t valids par la comparaison aux profils de restriction tablis par Neyra et al.
(1998).
M. loti
M. tianshanense
M. plurifarium
M. mediterraneum
M.ciceri
Rh. etli
Rh. gallicum
(C)
M. huakuii
M. ciceri
M. plurifarium
M. mediterraneum
M. tianshanense
100pb
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
Rh. Leg. bv. phaseoli
Rh. Leg. bv. trifolii
Rh. Leg. bv. viciae
M. loti
M.ciceri
M. plurifarium
M. mediterraneum
M. tianshanense
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
Rh. Leg. bv. viciae
100pb
(A)
Rh mongolensis
Rh. giardinii
Rh. huautlense
Rh. galegae
Rh. Leg. bv. viciae
100pb
M. loti
M. plurifarium
M.ciceri
M. mediterraneum
M. tianshanense
Rh. etli
Rh. gallicum
Rh. giardinii
Rh.mongolensis
Rh. huautlense
Rh. galegae
Rh. Leg. bv. viciae
100pb
100pb
INRA L 61
MSMC 556
MSMC 547
MSMC 541
MSMC 539
MSMC 536
INRA L 212
INRA L 21
MSMC 5111
MSMC 513

.138
1500pb
100pb: marqueur de poids molculaire utilis.
Figure 25: Profil de la bande de lADNr 16S de quelques souches nodulant le lupin
(B)
(D)
Figure 26. Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
quelques souches de rfrence aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI (B),
TaqI (C) et HinfI (D)
.139
Les profils obtenus pour les souches de lupin montrent des bandes de tailles variables. Une
onze bandes ont t obtenues selon la souche et selon lenzyme utilis (figures 27 et 28).
Concernant les souches de lamas nodulaire, lendonuclase Msp I reprsente lenzyme la plus
discriminante indiquant la grande diversit qui existe entre ces souches (figure 27 B). La
diversit est galement bien illustre par les profils de la Hha I (figure 27 A). Les profils
obtenus par ces deux enzymes ainsi que ceux obtenus par la Taq I (figure 27 C) montrent une
nette distinction des souches de lamas nodulaire par rapport non seulement aux souches de
rfrence mais galement aux diffrentes souches nodulant le lupin analyses (figure 28).
Concernant les autres souches de la collection nodulant le lupin, on constate que
lendonuclase Hha I est lenzyme qui rvle le plus de polymorphisme. Sur la base des
diffrents profils lectrophortiques obtenus, la majorit des souches prsente des bandes
intenses de 380 pb et 550 pb (figure 28 A). Alors que les souches de rfrences prsentent des
bandes intenses de tailles diffrentes : 300 pb et 350 pb dans le cas de Rhizobium et 350 pb
dans le cas de Mesorhizobium (figure 26 A).
Les profils de restriction gnrs par lendonuclase Taq I ont permis galement de mettre en
vidence un polymorphisme assez important chez les souches nodulant le lupin (figure 28 C).
Contrairement aux souches de lamas nodulaire (figure 27), les profils lectrophortiques
obtenus par lendonuclase Msp I semblent tre peu diversifis (figure 28 B). Toutefois, ces
profils sont plus proches de ceux des souches de rfrence (figure 26 B).
Les profils obtenus par la Hinf I prsentent galement un monomorphisme apparent. La
majorit de ces profils prsentent des bandes communes dont les tailles sont de 320 pb et 690
pb (figure 28 D). Ces deux bandes figurent galement dans les profils des souches de
Rhizobium (figure 26 D).
Lanalyse lectrophortique de la PCR/RFLP de lADNr 16S nous a permis de rvler la
grande diversit qui existe entre les souches nodulant le lupin. Cette diversit est trs
importante chez les souches de lamas nodulaire.
(A)
.140
(B)
Numros de gauche droite :100pb - MSMC 513 - MSMC 515 - MSMC 516 - MSMC 517 - MSMC
5110 - MSMC 5111 - MSMC 5112 - MSMC 5113 - MSMC 5114 - MSMC 5116 - MSMC 5115
(C)
(D)
Numros de gauche droite : 100pb - MSMC 513 - MSMC 515 - MSMC 516 - MSMC 517 - MSMC
5110 - MSMC 5112 - MSMC 5111 - MSMC 5113 - MSMC 5114 - MSMC 5115 - MSMC 5116
Figure 27 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
quelques souches de lamas nodulaire aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI
(B), TaqI (C) et HinfI (D)
MSMC 554
MSMC 5419
MSMC 5416
MSMC 5319
MSMC 539
(C)
MSMC 5328
MSMC 5326
INRA L 212
INRA L 212
Rh. giardinii
INRA L 211
INRA L 17
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5123
INRA L 29
100pb
100pb
INRA L 61
INRA L 51
MSMC 556
INRA L 44
INRA L 32
MSMC 5328
MSMC 5326
MSMC 539
MSMC 536
INRA L 29
INRA L 212
(A)
MSMC 536
MSMC 5156
MSMC 5150
MSMC 5143
MSMC 5127
100pb
M. mediterraneum
Ag. rubi
INRA L 23
INRA L 21
Rh. giardinii
MSMC 547
MSMC 5156
MSMC 5150
MSMC 5133
INRA L 29
100pb

.141
(B)
(D)
Figure 28 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S obtenus pour
des souches nodulant le lupin aprs la digestion par les endonuclases HhaI (A), MspI (B),
TaqI (C) et HinfI (D)
.142
3. 3 - Ribotypes dtermins par PCR/RFLP de lADNr 16S

Lanalyse par PCR/RFLP de lADNr 16S avec les enzymes Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I nous
a permis de distinguer entre plusieurs profils de restriction. Les profils obtenus par chaque
enzyme et pour chaque souche ont t dsigns par des lettres alphabtiques. Les mmes
profils ont t compars par paire afin dtablir le ribotype correspondant chaque souche.
Dans le cas des 32 souches de rfrence, 28 combinaisons de profils de restriction ont t
obtenues. Chaque combinaison correspond un gnotype bien dtermin (tableau 19). Des
combinaisons identiques ont t retrouves chez Rhizobium Leguminosarum bv. viciae et
Rhizobium Leguminosarum bv. Trifolii, chez Rhizobium gallicum et Rhizobium mongolensis,
chez Mesorhizobium ciceri et Mesorhizobium loti et chez.deux souches de Bradyrhizobium
nodulant larachide ISRA 601 et ISRA 616.
Laguerre et al. (1994) ont montr que les diffrents biovars des souches de Rhizobium
leguminosarum possdent le mme ribotype. Matallah (2003) a montr que Mesorhizobium
ciceri et Mesorhizobium loti possdent des ribotypes diffrents. En fait, le nombre de
ribotypes peut varier chez les souches appartement la mme espce et chaque ribotype
caractrise une souche type bien dtermine.
Concernant les souches nodulant le lupin, 50 combinaisons diffrentes ont t distingues
(tableau 20). Ainsi, sur les 52 souches tudies, seules les deux paires de souches MSMC
5110 avec MSMC 5112 et MSMC 5114 avec MSMC 5116 prsentent deux ribotypes
identiques. Ces quatre souches appartiennent toutes au groupe de lamas nodulaire.
Chacune des combinaisons obtenues a t compare celles des souches de rfrence. Toutes
se sont rvles trs distinctes, lexception de la souche INRA L 61 qui est caractrise par
le mme ribotype que celui de la souche Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
Le nombre important de combinaisons obtenues indique lexistence dun taux lev de
variabilit gntique entre les souches tudies. En effet, tous les ribotypes obtenus,
lexception de ceux de lamas nodulaire, varient dune souche lautre et ce pour lensemble
des souches nodulant chacune des six espces de lupin (tableau 21).
.143
Tableau 19. Groupes de ribotypes des souches de rfrence utilises dtermins par
PCR/RFLP du gne de lARNr 16S.
Souches
Profils de restriction du gne de

lADNr 16S par les quatre enzymes de
restriction utilises
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
Rhizobium leguminosarum bv. viciae

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli
Rhizobium gallicum
Rhizobium huautlense
Rhizobium mongolensis
Rhizobium giardinii
Rhizobium gallicum
Rhizobium etli
A
A
B
B
B
B
B
B
F
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
A
A
A
H
A
B
B
B
B
C
G
C
A
H
I
AABB
AABB
BABB
BAAC
BAAG
BAAC
BAHA
BAAH
FABI
Mesorhizobium tianshanense
Mesorhizobium mediterraneum
Mesorhizobium huakuii
Mesorhizobium plurifarium
Mesorhizobium ciceri
Mesorhizobium loti
D
G
C
C
C
C
D
D
E
E
F
F
D
D
E
E
F
F
J
D
D
K
E
E
DDDJ
GDDD
CEED
CEFK
CFFE
CFFE
Sinorhizobium arboris
Sinorhizobium meliloti
Sinorhizobium medicae
Sinorhizobium terangae
Sinorhizobium saheli
Sinorhizobium kostiense
Sinorhizobium fredii
C
D
C
C
C
D
D
G
G
C
C
C
C
C
C
C
I
C
J
K
A
L
M
N
F
F
F
O
CGCL
DGCM
CCIN
CCCF
CCJF
DCKF
DCAO
Agrobacterium tumefaciense
Agrobacterium rhizogene
Agrobacterium rubi
Agrobacterium vitis
B
B
H
I
A
A
A
A
A
B
A
A
A
P
A
A
BAAA
BABP
HAAA
IAAA
Allorhizobium undicola
FHLQ
Bradyrhizobium japonicum
Bradyrhizobium elkanii
Bradyrhizobium canariense
Br.sp. (Arachis) ISRA 601
Br.sp. (Arachis) ISRA 616
E
E
E
E
E
B
B
B
B
B
M
G
N
G
G
R
S
A
A
A
EBMR
EBGS
EBNA
EBGA
EBGA
.144
Tableau 20. Groupes de ribotypes des souches nodulant le lupin dtermins par PCR/RFLP
du gne de lARNr 16S.
Souches
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
MSMC 511
NJFE
MSMC 513
HKOX
MSMC 514
ANMZ
MSMC 515
KLMX
OQPA
KLNX
PONE
LKIU
LOIU
LKIU
KLQX
MSMC 5114
MOIW
MSMC 5115
MKIW
MSMC 5116
MOIW
MSMC 5119
BRRT
MSMC 5123
FTLB
MSMC 5126
HBJE
MSMC 5127
AMSS
MSMC 5133
AJLX
MSMC 5142
AJAB
MSMC 5143
AZJX
MSMC 5150
AZKX
MSMC 5155
ANLX
MSMC 5156
FUAX
INRA L15
HBJE
INRA L16
HSHE
INRA L17
HJHT
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
L. luteus
Profils de restriction du gne de lADNr 16S

par les quatre enzymes de restriction utilises
Souches de lamas nodulaire
Plante
hte
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
L. angustifolius
L. albus
Plante
hte
Souches
Profils de restriction du gne de lADNr 16S

par les quatre enzymes de restriction utilises
.145
Ribotype
HinfI
HhaI
TaqI
MspI
INRA L211
AJLX
INRA L212
ANWX
INRA L21
HBJT
INRA L23
HBJX
INRA L29
CVBU
MSMC 532
BWAV
MSMC 536
FJAV
MSMC 539
AMAY
MSMC 5319
AMAT
MSMC 5326
AJLZ
MSMC 5328
HSFE
INRA L32
AJLX
MSMC 541
HXKT
MSMC 547
BRTV
MSMC 549
AFFX
MSMC 5416
APAX
MSMC 5419
APAT
MSMC 5425
AJHT
INRA L43
JNBB
INRA L44
AJHX
MSMC 554
JNHT
MSMC 556
ANUX
INRA L51
HJHX
INRA L52
FYVT
INRA L61
AABB
.146
3. 4 - Etude des groupements phylogntiques tablis par lanalyse UPGMA

La combinaison des diffrents profils de restriction en une mme matrice a t utilise pour la
construction dun dendrogramme par analyse algorithmique UPGMA.
Les groupements phylogntiques des souches de rfrence tablis par notre tude sur la base
des 4 endonuclases ; Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I sont reprsentes par la figure 29.
A 75%, on obtient quatre clusters et un linage indpendant form par la souche
Allorhizobium undicola. Le premier cluster (A) regroupe les souches des deux genres
Rhizobium et Agrobacterium; le deuxime cluster (B) regroupe les souches de
Mesorhizobium; le troisime cluster (C) regroupe les souches de Sinorhizobium et le
quatrime cluster (D) est reprsent par les souches de Bradyrhizobium.
Les groupements des souches de rfrence obtenus dans notre tude sont en parfait accord
avec ceux obtenus par Laguerre et al. (1994) en utilisant lARDRA sur la base de 9 enzymes
de restriction. En fait, ces mmes auteurs ont rapport quun minimum de 4 enzymes peut tre
utilisable pour une bonne discrimination entre les souches de rhizobia. En effet, les 4 enzymes
utiliss, Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I, donnent des profils haut niveau de diffrenciation
entre les souches les plus loignes et figurent parmi celles les plus couramment utilises dans
ltude de taxonomie des rhizobia (Laguerre et al., 1994 ; Neyra et al., 1998).
La classification des souches de rfrence tudies reflte la classification tablie sur la base
de lARDRA par plusieurs autres tudes (Laguerre et al., 1994 ; 1997 ; Khbaya et al., 1998).
En effet, par notre tude, nous avons galement pu noter que les deux souches S. meliloti et S.
fredii sont groupes ensemble. Le cluster 1 indique que les souches de Rhizobium et celles
dAgrobacterium sont entre-mlanges. En outre, A. rhizogenes est class avec les diffrentes
souches de Rhizobium leguminosarum et A. tumefaciens est proche de R. galegae. Cependant,
selon Laguerre et al. (1997), les deux souches S. terangae et S. saheli prsentent 100% de
similitude. Dans notre cas, ces souches montrent un niveau de divergence de 0,5% seulement.
Le groupement gnral de lensemble des souches de rfrence reflte galement la
classification tablie sur la base de la squence complte de lADNr 16S (Terefework et al.,
2001 ; Sawada et al., 2003 ; van Berkum et Fuhrmann, 2000). Dans notre cas, nous avons
galement pu mettre en vidence le regroupement de S. kostiense avec S. terrangae et de M.
huakuii avec M. plurifarium.
.147
Allorhizobium
Bradyrhizobium
Sinorhizobium
Mesorhizobium
Rhizobium & Agrobacterium
Rh.leg.bv.viciae
Rh.leg.bv.trifolii
Rh.leg.bv.phaseoli
Ag. rhizogene
Rh. giardinii
Rh. etli
Rh. galegae
Rh. mongolensis
Ag. tumefaciense
Ag. rubi
Rh. gallicum
Rh.huautlense
Ag. vitis
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. huakuii
M. plurifarium
M. ciceri
M. loti
S. arboris
S. meliloti
S. fredii
S. medicae
S. terangae
S. saheli
S. kostiense
All. undicola
Br. canariense
Br. japonicum
Br.elkanii
Br.sp.ArachisISRA601
Br.sp.ArachisISRA616
100
90
80
70
60
50
% of similarity
Figure 29 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position phylogntique
des souches de rfrence utilises sur la base de la PCR/RFLP de lADNr 16S
.148
Les groupements phylogntiques combinant aussi bien les souches de lupin que les souches
de rfrence sont reprsents par la figure 30. Concernant les souches de lupin, au niveau de
similarit de 70%, elles se rpartissent en cinq groupes distincts. Si on se situe un niveau de
similarit de 80%, on remarque que chacun des clusters 2, 3, 4 et 5 se trouve subdivis en 3
4 sub-clusters indiquant ainsi la grande diversit gntique qui existe entre ces souches.
En comparant avec les souches de rfrence, nous avons not que trois souches seulement de
lupin ont un niveau de similitude lev avec les souches de rfrence. Il sagit de la souche
INRA L 61 qui forme un mme et unique linage avec R. leguminosarum bv. viciae et R.
leguminosarum bv. Trifolii ; la souche INRA L 23 rapproche de R giardinii avec un
coefficient de similitude de 88%, et enfin, la souche INRA L 29 rapproche des souches de
Mesorhizobium avec toutefois un niveau de divergence de 25%.
Les souches du cluster 1 forment, un niveau de similarit de 75%, un mme groupe avec les
diffrentes souches de Rhizobium et dAgrobacterium.
Le groupe de souches form par les clusters 2, 3 et 4 se trouve rapproch au groupe de
souches de rfrence appartenant aux genres Rhizobium, .Mesorhizobium et Sinorhizobium
un niveau de similitude de 62% qui correspond la troisime subdivision de larbre
phylogntique.
Le cluster 5 est form par 11 souches de lamas nodulaire. En fait, ces souches forment une
branche spare dans larbre phylogntique et sont classes distinctement de la totalit des
souches analyses ds la premire subdivision de larbre qui se situe un niveau infrieur
55% de similitude.
A travers les groupements phylogntiques, un grand niveau de polymorphisme molculaire a
t dtect au sein des souches nodulant les six espces de lupin et entre ces souches et les
souches de rfrence utilises. Toutefois, la grande diversit obtenue entre les souches
nodulant le lupin ne prsente aucune relation avec la plante hte dorigine puisquon retrouve
des souches nodulant la mme espce dans diffrents clusters (ex. Lupinus luteus). Cette
diversit est galement indpendante de la rgion dorigine puisque les souches issues de la
mme rgion, par exemple du Gharb ou de Rabat, se trouvent rparties dans les diffrents
clusters dlimits. Ceci, lexception des souches de lamas nodulaire qui ont t isoles de
lespce L. luteus dans la rgion de Mnasra et qui constituent par leur positionnement distinct
un cas bien particulier (Tableau 21).
.149
Rhizobium &
Agrobacterium
Mesorhizobium
Sinorhizobium
Bradyrhizobium Allorhizobium
R. leg. bv. viciae

R. leg. bv. trifolii
INRAL61
R. leg.bv. phaseoli
Ag. rhizogenes
R. etli
R. galegae
R. mongolense
Ag. tumefaciense
Ag. rubi
R. gallicum
R. huautlense
R. giardinii
INRAL23
Ag. vitis
MSMC5119
MSMC547
MSMC532
MSMC5126
INRAL15
INRAL21
INRAL16
MSMC5328
MSMC541
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. huakuii
M. plurifarium
M. ciceri
M. loti
INRAL29
S. arboris
S. meliloti
S. fredii
S. medicae
S. terrangae
S. saheli
S. kostiense
MSMC511
INRAL17
INRAL51
MSMC5425
INRAL44
MSMC5133
MSMC5326
INRAL211
INRAL32
MSMC5142
MSMC536
MSMC514
MSMC556
MSMC5155
INRAL212
MSMC518
MSMC5127
MSMC539
MSMC5319
MSMC5416
MSMC5419
MSMC5143
MSMC5150
MSMC549
MSMC5123
MSMC5156
INRAL52
INRAL43
MSMC554
All. undicola
Br. canariense
Br. japonicum
Br elkanii
Br.sp.arachisISRA601
Br.sp.arachisISRA616
MSMC513
MSMC5110
MSMC5112
MSMC5111
MSMC5114
MSMC5116
MSMC5115
MSMC515
MSMC517
MSMC5113
MSMC516
100
90
80
70
60
50
% de similarit
Figure 30 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position phylogntique
des souches nodulant le lupin et des souches de rfrence sur la base de la PCR/RFLP
de lADNr 16S
.150
Tableau 21. Groupes de souches nodulant le lupin formant les diffrents clusters dlimits
par la PCR/RFLP du gne de lADNr 16S par rapport la plante et la rgion dorigine.
Cluster
Souches
Nbr. de
Rgion dorigine
Plante
ribotype
dorigine
MSMC 5119
Gharb
MSMC 5126
Rabat
L. luteus
INRA L 15
Assilah vers Tanger
INRA L 16
9
1
INRA L 21
Rabat
L. albus
MSMC 532
Gharb
L. angustifolius
MSMC 5328
Cherafat
MSMC 541
Gharb
L. cosentinii
MSMC 547
MSMC 511
Mnasra
L. luteus
MSMC 5133
Rabat
MSMC 5142
Sidi Yahya
INRA L 17
Assilah vers Tanger
INRA L 211
Blad dandoun
L. albus
11
2
MSMC 536
Gharb
MSMC 5326
Taza vers Bab Berred L. angustifolius
INRA L 32
Rabat
MSMC 5425
Rabat vers Larache
L. cosentinii
INRA L 44
Assilah vers Tanger
INRA L 51
Gharb
L. pilosus
MSMC 514
Mnasra
MSMC 518
L. luteus
MSMC 5127
Rabat
MSMC 5143
Sidi Yahya
MSMC 5150
Asni
MSMC 5155
pigeage
INRA L 212
Merchouch
L. albus
13
3
MSMC 539
Gharb
L. angustifolius
MSMC 5319
Larache vers Tetouan
MSMC 549
Kenitra vers Larache
L. cosentinii
Rabat
MSMC 5416
MSMC 5419
MSMC 556
L. pilosus
MSMC 5123
Gharb
L. luteus
MSMC 5156
pigeage
5
4
INRA L 43
Rabat
INRA L 52
Settat
MSMC 554
MSMC 513 - MSMC 515
MSMC 516 - MSMC 517
MSMC5110 - MSMC5111
9
Mnasra
L. luteus
5
MSMC5112 - MSMC5113
MSMC5114 - MSMC5115
MSMC 5116
.151
4 DISCUSSION
Ltude des relations gntiques rvles aussi bien par la PCR/REP que par la PCR/RFLP de
lADNr 16S a permis de mettre en vidence un haut niveau de polymorphisme molculaire
entre les diffrentes souches de lupin. En outre, les deux analyses ont montr que les souches
de lamas nodulaire reprsentent un groupe particulier parmi les souches de lupin tudies.
La conclusion la plus intressante qui drive de lanalyse par PCR/RFLP de lADNr 16S est
que les souches de lupin tudies sont totalement distinctes des souches du genre
Bradyrhizobium. En outre, ces souches ne prsentent pas un statut taxonomique prcis et par
consquent leur classification phylogntique exacte reste dterminer.
En fait, le positionnement taxonomique des souches nodulant le lupin reste jusqu prsent
trs controvers vu lisolement de souches croissance rapide et de souches croissance lente
rapport dans diffrentes recherches. Lisolement de souches croissance rapide a t
rapport par Corich et al. (1981) (cit par van Berkum et Eardly, 1998) ainsi que par Jordan
(1984) chez L. densiflorus. La souche LUP 43 isole dune autre espce de lupin dans la
rgion de Baja California au Mexique prsentait galement un temps de gnration de 3,6
heures (Schlinkert-Miller et Pepper, 1988). Toutefois, ces souches nont t caractrises que
sur la base du temps de gnration et de quelques caractres phnotypiques. Cependant, sur la
base des mmes caractres, dautres recherches ont pu classer les souches de lupin en tant que
des bradyrhizobia (Jordan, 1982 ; Bottomley et al., 1994). Xu et al. (1995) ont rapport, sur la
base de 191 caractres phnotypiques, que la souche Bradyrhizobium sp (Lupinus) G13
originaire dArgentine prsentait une grande similitude de lordre de 90% avec des souches de
Bradyrhizobium japonicum originaire de Chine.
De point de vue gntique et sur la base de la PCR/RFLP de lADNr 16S, Laguerre et al.
(1994, 1997) ont rapport que la souche MSDJ 718 isole de L. luteus en France ainsi que la
souche VK7,VK4 isole de Lupinus sp. en Afrique du Sud se sont rvles trs proches des
souches de Bradyrhizobium. En outre, sur la base de lanalyse aussi bien de lADNr 16S que
de lADNr 23S, la souche DSM 30140 nodulant le lupin a montr un positionnement
taxonomique au sein des bradyrhizobia (Ludwig et al., 1995). De plus, Barrera et al. (1997)
ont pu caractriser 41 souches de lupin isoles de L. campestris, L. montanus et L. exaltatus
originaires du Mexique par lanalyse de la squence complte de lADNr 16S. Les rsultats
ont montr que lensemble des souches a t regroup avec la souche Bradyrhizobium
japonicum USDA 6.
.152
Cependant, une tude rcente mene par Jarabo-Lorenzo et al. (2003) a montr travers la
PCR/RFLP de lADNr 16S et par lanalyse de la squence de ce gne, lexistence de 9
gnotypes diffrents chez 45 souches nodulant le lupin dans les les des Canaries. 69% de ces
souches possdent des gnotypes qui se sont rvls trs distincts de ceux des souches de
rfrence nodulant le soja.
Rcemment, Trujillo et al. (2005) ont montr sur une base comparative de la squence
complte de lADNr 16S que des souches croissance rapide de lupin LUP 21 et LUP 23
isoles de Lupinus honoratus ont t classes avec les espces du genre Ochrobactrum et ont
prsent un niveau de similitude de 99,5% avec lespce Ochrobactrum antropi. Ces deux
souches appartiennent par consquent au genre Ochrobactrum qui appartient la famille des
Brucellaceae faisant partie de la sous-classe 2 des Protobactries. Cette dcouverte a permis
aux auteurs de conclure quil existe une dynamique trs active entre les bactries du sol via le
transfert de plasmides porteurs de gnes symbiotiques de nodulation et de fixation.
En effet, durant les quatre dernires annes, plusieurs bactries, autres que les rhizobia, ont
t rapportes comme tant des bactries pouvant tablir des relations symbiotiques avec
diffrentes lgumineuses. Parmi ces bactries, on trouve quelques espces du genre
Methylobacterium (Sy et al., 2001) et Devosia (Rivas et al., 2002, 2003) qui appartiennent
la sous-classe des Protobactries ainsi que dautres espces du genre Ralstonia (Chen et
al., 2001) et Burkholderia (Moulin et al., 2001 ; Vandamme et al., 2003) qui appartiennent
la sous-classe des Protobactries.
CONCLUSION
GENERALE
ET PESPECTIVES
Conclusion gnrale et perspectives
.153
Le dveloppement de nouveaux systmes de production agricole qui renforcent lutilisation

des ressources naturelles cologiquement non polluants et qui permettent de rduire lusage
dengrais notamment riches en azote a permis de concentrer lattention sur le rle potentiel de
la fixation biologique de lazote. En effet, la reconnaissance de limportance de la symbiose
rhizobia lgumineuse a jou un rle considrable dans laccroissement du rendement des
lgumineuses cultives, dans lamlioration de la fertilit du sol et dans la rhabilitation des
sols appauvris.
Laxe de notre recherche couvre ltude de la biodiversit des populations naturelles des
bactries symbiotiques nodulant les six espces de lupin rencontres au Maroc. Cette
recherche a permis de dceler dune part les diffrentes caractristiques dintrt fonctionnel
des souches et leur diversit en vue dtablir leur position taxonomique et de dterminer des
candidats inoculer. Or, jusqu nos jours, aucune tude prcise na t mene pour tudier la
variabilit des bactries symbiotiques de lupin au Maroc et moins encore celles des espces
sauvages. Il a t donc crucial de pouvoir caractriser les souches indignes sur des bases
prcises et selon les normes internationales.
A cet effet, des prospections de collecte de plantes nodules appartenant diffrentes espces
de lupin ont t menes dans diffrentes rgions du Maroc. Une collection de 159 isolats issus
partir des nodosits fraches a t ralise. Ces isolats ont t authentifis par inoculation
des plantules de L. luteus et L. albus cultives sur un sol strile. Les rsultats analyss aprs
un mois de culture se sont rvls tous positifs et ceci indpendamment de lespce dorigine
des isolats.
La cte atlantique qui stend de Rabat jusqu Larache et la rgion du Gharb ont pu donner le
plus grand nombre disolats. En effet, le lupin se dveloppe efficacement sur les sols de type
sableux qui caractrisent la cte atlantique marocaine et le Gharb (province de Kenitra et celle
de Sidi Yahya) reprsente la rgion la plus productrice en fourrage et en semences de lupin
dans le pays.
La population des rhizobia dans chacun des sols caractriss nest pas homogne mais il sest
avre quelle est compose de bactries phnotypiquement et gntiquement trs distinctes.
Lanalyse par PCR/REP a t adopte comme un premier moyen de caractrisation, elle a t
utilise essentiellement pour la diffrenciation des 159 isolats au niveau souche. Une
.154
htrognit considrable a t mise en vidence tmoignant de lexistence dun nombre trs

lev de souches quivalent 157.
Par cette mme analyse, nous avons pu dmontrer lexistence de souches gntiquement
Diffrentes au sein dun mme amas nodulaire. En fait, mme si les structures nodulaires de
type lupinoid est une des caractristiques qui distingue le genre Lupinus des autres genres
appartenant aux Gnistes, aucune investigation na montr jusqu lors que ces structures
peuvent abriter diffrentes souches bactriennes. Ainsi, pour expliquer, titre hypothtique, la
formation dun tel type de nodosits, deux suppositions ont t mises. La premire considre,
quen dpit de leur htrognit gntique, les souches prsenteraient les mmes facteurs de
nodulation et par consquent, une grande compatibilit dinfection et dinduction du
dveloppement nodulaire chez la mme plante. La deuxime considre que la plante hte, L.
luteus prsenterait une grande affinit pour diffrentes souches bactriennes et par consquent
la spcificit est moins restreinte.
La multiple infection nodulaire mise en vidence par cette tude pourrait tre dune grande
valeur agronomique et pourrait constituer une direction importante pour lamlioration de la
symbiose rhizobium lgumineuse travers des inoculations multiples.
52 souches ont t slectionnes partir de lanalyse PCR/REP et ont t utilises dans les
tapes de caractrisation ultrieures. Ces souches ont prsent une bonne affinit infective
avec la plante hte utilise, L. luteus. La majorit des souches a prsent galement des
pourcentages defficience relative trs importants et ceci indpendamment de la plante hte
ou du site dorigine. Toutefois, les souches isoles partir des espces sauvages se sont
rvles particulirement trs efficientes.
Curieusement, toutes les souches ont prsent un taux de croissance rapide. Cependant, les
symbiotes de lupin sont gnralement dfinis comme des bradyrhizobia. Quelques souches
croissance rapide ont t toutefois rapportes mais leur attribution un genre bien dtermin
de rhizobia na pas t lucide. Rcemment, il a t rapport que deux souches de lupin
croissance rapide appartiennent au genre Ochrobactrum qui fait partie de la branche 2 des
Protobactries (Trujillo et al., 2005).
Dans notre tude, vu que les souches ont t isoles partir de diffrentes espces de lupin et
de diffrents sites gographiques, on peut conclure que les souches croissance rapide sont
.155
prsentes dans les diffrents sols marocains. Cette croissance rapide est dune grande
importance pratique surtout dans les stratgies de production dinoculums.
Lutilisation des diffrents substrats carbons a montr galement un profil dassimilation trs
similaire celui des souches croissance rapide.
Laptitude des souches hydrolyser lure ou rduire le nitrate a rvl une grande
variabilit. Cependant, les souches croissance trs rapide ont montr des rsultats ngatifs et
par consquent, un excs dure ou de nitrate exogne dans le sol pourrait affecter le caractre
symbiotique de ces souches.
Disposer dune bonne collection de souches nodulant le lupin est essentiel pour la cration de
symbioses complmentaires et efficaces. Les souches indignes sont plus comptitives et plus
adaptes pour survivre sous les contraintes daphiques locales (salinit, acidit, alcalinit,
temprature, etc.) en labsence de la plante hte.
Ainsi, nous avons valu la tolrance de toutes les souches de la collection vis--vis des
principaux facteurs de stress, en loccurrence la salinit et principalement le NaCl qui
reprsente le sel le plus rpandu Maroc, le pH et les tempratures extrmes.
Losmotolrance sest rvle trs importante pouvant aller jusqu 1190 mM et 1700 mM
NaCl. Les souches ont t capables galement de pousser sur une gamme assez large de pH
allant de 4,5 9,5. Cependant, Tang et Robson (1996) ont rapport que des valeurs de pH audessus de 6 ont un effet inhibiteur sur la nodulation chez le lupin. Quant la temprature, la
tolrance totale stend de 10C 35C.
Dans le sol, la salinit et les variations du pH sont accompagnes gnralement par la toxicit
minrale. Nous avons donc apprci le degr de linhibition de la croissance des souches par
six diffrents mtaux sous formes de chlorure. Linhibition sest rvle plus importante selon
lordre suivant Cd > Hg > Co > Zn > Al > Mn. La rsistance des souches aux huit diffrents
antibiotiques tests a indiqu une grande rsistance lrythromycine et lampicilline contre
une sensibilit bien marque la kanamycine.
Lanalyse combine de toutes les donnes phnotypiques nous a permis de reprer des
souches trs performantes. En fait, les souches ont prsent une htrognit suffisante pour
permettre de slectionner des souches adaptes des conditions environmentales trs
variables. A travers la mme analyse, on a pu dduire que lhtrognit des souches ne peut
.156
tre due ni aux diffrentes espces de lupin ni aux diffrents sites gographiques dorigine
puisquon retrouve dans un mme cluster des souches isoles partir de diffrentes espces et
de diffrents sites.
La mthode molculaire adopte pour valuer la position taxonomique des souches est la
PCR/RFLP du gne de lADNr 16S. La dimension et le degr de conservation de ce gne font
de lui un marqueur phylogntique idal. Les rsultats obtenus ont montr que les souches
sont galement sur le plan gntique trs htrognes et sont rparties dans cinq clusters trs
distincts de ceux des souches de rfrence utilises. En outre, onze souches de lamas
nodulaire ont t groupes dans un mme cluster (cluster 1) qui est largement distinct par
rapport aux autres clusters (53 % de similitude). Quelques souches se sont rvles toutefois
plus rapproches certaines souches de rfrence. Cest le cas de INRA L 61 avec R.
leguminosarum, INRA L 23 avec R. giardinii et INRA L 29 avec le genre Mesorhizobium.
La conclusion la plus importante qui drive de lanalyse ARDRA est que les souches de lupin
tudies sont parfaitement et totalement distinctes du genre Bradyrhizobium. Ce rsultat
confirme par ailleurs le taux de croissance rapide des souches. Cependant, la plupart des
souches nont pu tre rattaches aux souches de rfrence utilises et par consquent leur
classification phyltique exacte reste dterminer.
Les diffrents rsultats obtenus dans cette tude ouvrent dintressantes perspectives sur le
plan appliqu et pourraient galement servir de base gntique pour les travaux ultrieurs.
Sur le plan appliqu, on peut noter :
-
Lexploitation de la grande tolrance des souches aux diffrents stress environmentaux

et de leur potentiel fixateur dazote par leur utilisation dans des essais dinoculation
sous serre puis au champ (en cours avec lINRA de Rabat).
Lexploitation de la grande rsistance des souches aux mtaux lourds.
Ltablissement de stratgies damlioration efficace de la symbiose par la production

dinoculum de bonne qualit, cest--dire ltude de laptitude des souches
slectionnes survivre et maintenir leur potentiel symbiotique durant le stockage de
linoculum, pendant linoculation au champ et durant les annes suivantes (besoin de
rinoculation).
.157
Sur le plan cophysiologique et molculaire, on peut citer :

-
Llucidation des mcanismes dinfection et des dterminants gntiques impliqus

dans la formation de lamas nodulaire.
La dtermination du statut taxonomique des souches de lupin tudies par dautres

techniques molculaires, en loccurrence le squenage du gne de lADNr 16S
(analyse en cours). Lhybridation ADN/ADN pourra prciser si ces souches
constituent une nouvelle espce parmi les rhizobia ou parmi tout autre genre des
protobactries.
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
Rfrences bibliographiques
.158
Aarons, S. R., and P. H. Graham. 1991. Response of Rhizobium leguminosarum bv.

phaseoli to acidity. Plant Soil. 134, 145-151.
Abbas S. M., and E.A. Kamel. 2004. Rhizobium as a Biological Agent for Preventing Heavy
Metal Stress. Asian J. Plant Sc. 3, 416-424.
Abdalla. M. H. 1999. Nodulation and nitrogen fixation of Lupinus species with
Bradyrhizobium (Lupinus) strains in iron-deficient soil. Biol. Fertile. Soils. 28, 405-415.
Abdelmoumen, H., A. Filali-Maltouf, M. Neyra, A. Belabed, and M. Missbah El Idrissi.
1999. Effect of high salt concentrations on the growth of rhizobia and responses to added
osmotica. J. Appl. Microbiol. 86, 886-898.
Ahmad, M. H., and E. Smith. 1985. Utilization of carbon and nitrogen sources and
acid/alkali production by Cowpea rhizobia. Plant and Soil. 86, 279-282.
Alexander, E., D. Pham, and T. R. Steck. 1999. The viable-but-nonculturable condition is
induced by copper in Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum. Appl.
Environ. Microbiol. 65, 3754-3756.
Allen E. K., and O.N. Allen. 1950. Biochemical and Physiological properties of the rhizobia.
Bacteriol. Rev. 14, 173-330.
Allen E. K., and O.N. Allen. 1981. The leguminosae: A source book of characteristics, uses
and nodulation. Madison : University of Wisconsin Press, 812 pp.
Amabile-Cuevas, C. F., and M. E. Chicure. 1992. Bacterial plasmids and gene flux. Cell
70, 189-199.
Amarger, N., A. Mariotti, and F. Mariotti. 1977. Essai dstimation du taux dazote fix
symbiotiquement chez le lupin par le traage isotopique naturel (15N). C. R. Acad. Sci. 284,
2179-2182.
Amarger, N., V. Macheret, and G. Laguerre. 1997. Rhizobium gallicum sp. nov. and
Rhizobium giardinii sp. nov. from Phaseolus vulgaris nodules. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 9961006.
Angel, J. S., S. P. Mc Grath, A. M. Chaudri, R. L. Chaney, and K. E. Giller. 1993.
Inoculation effect on legumes grown in soil previously contaminated with sewage sludge. Soil
Biol. Biochem. 25, 575-580.
Appana, V. D. 1988. Alteration of polysaccharides composition in Rhizobium meliloti. JJ-1
exposed to manganese. FEMS Microbiol. Lett. 215, 79-82.
Ara Begum A., S. Leibovitch, P. Migner, and F. Zhang. 2001. Specific flavonoids induced
nod gene expression and pre-activated nod genes of Rhizobium leguminosarum increased pea
(Pisum sativum L.) and lentil (Lens culinaris L.) nodulation in controlled growth chamber
environments. J. Exp. Bot. 360, 1537-1543.
Arreseigor, C., F. R. Minchin, A. J. Gordon, and A. K. Nath. 1997. Possible cause of the
physiological decline in soybean nitrogen fixation in response to nitrate. J. Exp. Bot. 48, 905913.
Ascherson P. and P. Graebner. 1907. Synopsis der mitteleuropischen Flora, Band III
(Monocotyledones). Verlag Wilhelm Engelmann, Leipzig.
Aurag J., and F. Brhada. 1995. Dynamique des populations de Rhizobium introduites dans
le sol: influence du stress hydrique, de lacidit et de la texture du sol. In: INRA (eds)
.159
Facteurs limitant la fixation simbiotique de lazote dans le Bassin Mditerranen. Paris, pp

149-158.
Aurag, J., and A. Sasson. 1992. Tolerance of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli to
acidity and drought. W. J. Microbiol. Biotech. 8, 532-533.
Ayisi, K. K. D. H. Putnam, C. P. Vance, and P. H. Graham. 1992. Bradyrhizobium
inoculation and nitrogen fertiliser effects on seed yield and protein of white lupin. Agronomy
J. 84, 857-861.
Baldwin, I. L., and E. B. Fred. 1929. Nomenclature of the root nodule bacteria of the
leguminosae. J. Bacteriol. 17, 141-150.
Barnett, M. J., R. F. Fisher, T. Jones, C. Komp, A. P. Abola, F. Barloy-Hubler, L.
Bowser, D. Capela, F. Galibert, J. Gouzy, M. Gurjal, A. Hong, L. Huizar, R. W. Hyman,
D. Kahn, M. L. Kahn, S. Kalman, D. H. Keating, C. Palm, M. C. Peck, R. Surzycki, D.
H. Wells, K-C. Yeh, R. W. Davis, N. A. Federspiel, and S. R. Long. 2001. Nucleotide
sequence and predicted functions of the entire Sinorhizobium meliloti pSymA megaplasmid.
Proc. Natl. Sci. USA. 98, 9883-9888.
Barnett, Y., P. C. Catt, R. Jenjareontham, and K. Mann. 1993. Fast-growing root nodule
bacteria from Australian Acacia spp., in New Horizons in Nitrogen Fixation, Palacios, R. et
al., Eds., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 594p.
Barrera, L. L., M. E. Trujillo, M. Goodfellow, F. J. Garcia, I. Hernandez-lucas, G.
Davila, P. van Berkum, and E. Martinez-Romero. 1997. Biodiversity of bradyrhizobia
nodulating Lupinus spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1086-1091.
Bassett, B., R. N. Goodman, and A. Novacky. 1977. Ultrastructure of soybean nodules.
Release of rhizobia from the infection thread. Can. J. Microbiol. 23, 573-582.
Beale P. E., A. Lahlou, and M. Bounejmate. 1991. Distribution of wild annual legume
species in Morocco and relationship with soil and climatic factors. Aust. J. Agric. Res. 42,
1217-1230.
Berg, D. E., N. S. Akopyants, and D. Kersulyte. 1994. Fingerprinting microbial genomes
using the RAPD or AP-PCR method. Methods Mol. Cellular Biol. 5, 13-24.
Beringer J. E. 1974. R factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Genet. Microbiol 84,
188-198.
Beringer, J. E., N. J. Brewin, A. W. B. Johnston, H. M. Schulman, and D. A Hopwood.
1979. The Rhizobium-legume symbiosis. Proc. R. Soc. Lond. B. 204, 219-233.
Berkia, A. 2004. La symbiose Acacia-Rhizobium : effet de la salinit et implication des
lipopolysaccharides. Thse du Doctorat Nationale. Universit Mohammed V. Rabat.
Beyerinck, M. W. 1888. Die Bacterien der Papilionaceen-Knllchen. Bot. Zeitung 46, 725804.
Beyerinck, M. W. 1890. Knstliche Infection von Vicia Faba mit Bacillus radicicola.
Ernhrungsbedingungen dieser Bacterie. Bot. Zeitung 52, 837-843.
Beyerinck, M. W., and van Delden. 1902. Uber die assimilation des freien stickstoffs durch
bakerien. Zentrablatt fur Bakteriologie,Parasitenkude, Infektionkrankheiten und Hygienne.
Abteilung II. 9, 3-43.
.160
Bhagwat, A. A., K. C. Gross, R. E. Tully, and D. Keister. 1996. -Glucan synthesis in

Bradyrhizobium japonicum: characterization of a new locus (ndvC) influencing -(1 6)
linkages. J. Bacteriol. 178, 4635-4642.
Birouk, A. 1990. Le lupin. IAV. HASSAN II. Dpt. de Biotechnologie et de Ressources
Gntiques. IAV. HASSAN II. Rabat.
Bohlool, B. B. 1987. Fluorescence methods for study of Rhizobium I culture and in situ, p.
127-147. In G. H. Elkan (ed.) symbiotic nitrogen fixation technology. Marcel Dekker Inc.,
New York.
Boncompagni E., M. Osteras, M.C. Poggi, and D. Le Rudulier. 1999. Occurence of
chomine and glycine betaine uptake and metabolisme in the family of rhizobiaceae and their
roles in omoprotection. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2072-2077.
Bordeleau L. M., and D. Prvost. 1994. Nodulation and nitrogen fixation under extreme
environments. Plant and Soil. 161, 115-135.
Botsford L., and Lewis T. 1990. Osmoregulation in Rhizobium meliloti production of
glutamic acid in response to osmotic stress. Appl. Env. Microbiol. 56, 488-494.
Bottomley, P. J., Hsin-hua Cheng, and S. R. Strain. 1994. Genetic structure and symbiotic
characteristics of a bradyrhizobium population recovered from a pasture soil. Appl. Environ.
Microbiol. 60, 1754-1761.
Bounejmate, M., B. J. Buirchell, A. Birouk, A. Bouizgaren, and N. Sadi. 1993.
Distribution naturelle au Maroc de trois espces de lupin en relation avec certains facteurs du
milieu. Al Awamia. 84, 29-42.
Bouzar, H. D. 1994. Request for a judicial opinion concerning the type species of
Agrobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 373-374.
Bouzar, H. D., and J. B. Jones. 2001. Agrobacterium Larrymoorei sp. nov., a pathogen
isolated from aerial tumors of Ficus benjamina. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1023-1026.
Breedveld M. W., and K. J. Miller 1998. Cell-surface -glucans. In Spaink HP, Kondorosi
A, Hooykaas J. J., eds. The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. The
Netherlands, pp 81 96.
Breedveld M. W., C. Dijikema, L. P. T. M. Zevenhuizen, and A. J. B. Zehender. 1993.
Response of intracellular carbohydrates to a NaCl shock in Rhizobium leguminosarum biovar
trifolii TA-1 and Rhizobium meliloti SU-47. J. Gen. Microbiol. 139, 3157-3163.
Brewin N. J., Wood E. A., Young J. P. W. 1983. Contribution of the symbiotic plasmid to
the competitiveness of Rhizobium leguminosarum. J. Genet. Microbiol. 129, 2973-2977.
Brhada F.; M.C. Poggi, and D. Le Rudulier. 1997. Choline and Glycine betaine uptake in
various strains of Rhizobia isolated from nodules of Vicia faba var. major and Cicer
arietinum L.: Modulation by salt, choline and glycine betaine. Current Microbiol. 34, 167172.
Brockwell, J., A. Pilka, and R. A. Holliday. 1991. Soil pH is a major determinant of the
numbers of naturally-occurring Rhizobium meliloti in non-cultivated soils of New South
Wales. Aust. J. Exp. Agric. 31, 211-219.
Brockwell, J., E. A. Schwinghamer and R. R. Gault. 1977. Ecological studies of rootnodule bacteria introduced into field environments. A critical examination of the stability of
antigenic streptomycine resistance markers for identification of strains of Rhizobium trifolii.
Soil Biol. Biochem. 9, 19-24.
.161
Bromfield, E. S., I. B. Sinha, and M. S. Wolynetz. 1986. Influence of location, host cultivar,
and inoculation on the composition of naturalized populations of Rhizobium meliloti in
Medicago sativa nodules. Appl. Environ. Microbiol. 51, 1077-1084.
Bromfield, E. S., L. R. Barran, and R. Wheatcroft. 1995. Relative genetic structure of a
population of Rhizobium meliloti isolated directly from soil and from nodules of alfalfa
(Medicago sativa) and sweet clover (Melilotus alba). Mol. Ecol. 4, 183-188.
Broughton W. J., and M. J. Dillworth. 1971. Control of leghaemoglobin synthesis in snake
beans. Biochem J. 125, 1075-1080.
Broughton, W. J., S. Jabbouri, and X. Perret. 2000. Keys to symbiotic harmony. J.
Bacteriol. 182, 5641-5652.
Caetano-Anolles G., and P. M. Gresshoff. 1991. Plant genetic control of nodulation. Annu
Rev Microbiol. 45, 345-382.
Caldwell, B. E., and G. Vest. 1968. Nodulation interactions between soybean genotypes and
serogroups of Rhizobium japonicum. Crop Sci. 8, 680-682.
Casella, S., J. P. Shapleigh, F. Lupi, and W. J. Payne. 1988. Nitrite reduction in bacteroids
of Rhizobium "hedysari" strain HCNT1. Arch. Microbiol. 149, 384-388.
Cava, J. R., P. M. Elies, D. A. Truowski, and K. D. Neol. 1989. Rhizobium leguminosarum
CFN 42 genetic regions encoding lipopolysaccharide structures essential for complete nodule
development on bean plants. J. Bacteriol. 171, 8-15.
Chaintreuil, C., E. Giraud, Y. Prin, J. Lorquin, P. de Lajudie, A. Ba, M. Gillis, and B.
Dreyfus. 2000. Photosynthetic Bradyrhizobia are Natural Endophytes of the African Wild
Rice Oryza breviligulata. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5437-5447.
Chakrabati, S. K., M. S. Lee and A. H. Gibson. 1981. Diversity in the nutritional
requirements of the strains of various Rhizobium strains. Soil Biol. Biochem. 13, 349-354.
Chen, H., A. E. Richardson, and B. G. Rolfe. 1993a. Studies on the physiological and
genetic basis of acid tolerance in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl. Environ.
Microbiol. 59, 1798-1804.
Chen, H., A. E. Richardson, E. Cartner, M. A. Diordjevic, R. J. Roughley, and B. G.
Rolfe. 1991. Construction of an acid-tolerant Rhizobium leguminosarum biovar trifolii strain
with enhanced capacity for nitrogen fixation. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2005-2011.
Chen, H., E. Gartner, and B. G. Rolfe. 1993b. Involvement of genes on a megaplasmid in
the acid-tolerant phenotype of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl. Environ.
Microbiol. 59, 1058-1064.
Chen, W. M., S. Laevens, T. M. Lee, T. Coenye, P. De Vos, M. Mergeay, and P.
Vandamme. 2001. Ralstoni taiwanensis sp nov., isolated from root nodules of Mimosa
species and sputum of cystis fibrosis patient. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1729-1735.
Chen, W. X., E. T. Wang, and L. D. Kuykendall. 2004. Genus Mesorhizobium, Family
Photobacteriaceae. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, 2nd Volume.
Chen, W. X., E. T. Wang, S. Wang, X. Chen, and Y. Li. 1995. Characteristics of
Rhizobium tianshanense sp. nov., a moderately and slowly growing root nodule bacterium
isolated from an arid saline environment in Xinjiang, Peoples Republic of China. Int. J. Syst.
Bacteriol. 45, 153-159.
.162
Chen, W. X., G. H. Yan, and J. L. Li. 1988. Numerical taxonomic study of fast-growing
soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned by Sinorhizobium gen. nov.
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 38, 392-397.
Chen, W. X., Z. Y. Tan, J. L. Gao, Y. Li, and E.T. Wang. 1997. Rhizobium hainanense sp.
nov., isolated from tropical legumes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 47, 870-873.
Cheremisov, B. M. 1991. Evaluation of lupine collection under inoculation conditions and
without nodule bacteria. Bull. VIR. St. Petersburg. 213, 12-17.
Clark, C. G. 1997. Ribotyping : a general tool for the study of genetic diversity in
microorganisms. J. Euk. Microbiol. 44, 277-283.
Clements, J. C., B. J. Buirchell, and W. A. Cowling. 1996. Relationship between
morphological variation and geographical origin on selection history in Lupinus pilosus. Plant
Breed. 115, 16-22.
Cloutier J., D. Prvost, P. Nadeau, and H. Antoun. 1992. Heat and cold shock protein
synthesis in artic and temperate strains of rhizobia. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2846-2853.
Cohen-Krausz S., and S. Trachtenberg. 1998. Helical perturbations of the flagellar
filament: Rhizobium lupini H 13-3 at 13A resolution. J. Stuct. Biol. 122, 267-282.
Cole, M. A., and G. H. Elkan. 1979. Multiple antibiotic resistance in Rhizobium Japonicum.
Appl. Env. Microbiol. 37, 867-870.
Collins, M. D. 1994. Isoprenoid quinines, p. 265-311. In M. Good-fellow and A. G.
ODonnell (ed.), Modern microbial methods. Chemical methods in prokaryotic systematics.
John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, United Kingdom.
Cooper, J. E. 1982. Acid production, acid tolerance and growth rate of Lotus rhizobia in
laboratory media. Soil. Biol. Biochem. 14, 127-131.
Cooper, J. E., M. Wood, and A. J. Bjourson. 1985. Nodulation of Lotus pedunculatus in
acid rooting solution by fast-and slow-growing rhizobia. Soil Biol. Biochem. 17, 487-492.
Corby, H. D. L. 1988. Types of rhizobial nodules and their distribution among the
leguminosae. Kirkia 13 (1).
Cordero S., and J. G. Blair. 1978. The effects of lime-pelleting and lime-superphosphate
fertilizer on the growth of three annual legumes in an acid soil. Plant and Soil. 50, 257-268.
Cordovilla, M. P., F. Ligero, and C. Lluch. 1994. The effect of salinity on N fixation and
assimilation in Vicia faba. J. Exp. Bot. 45, 1483-1488.
Corich, V., A. Giacomini, F. J. Ollero, A. Squartini, and M. F. Nuti. 1991. Pulsed-field
electrophoresis in contour-clamped homogeneous electric fields (CHEF) for the fingerprinting
of Rhizobium spp. FEMS, 1991.
Correa, O. S., and A. J. Barneix. 1997. Cellular mechanisms of pH tolerance in Rhizobium
loti. World J. Microbiol. Biotechnol. 13, 153-157.
Cowling, W. A., C. Huyghe, and W. Swiecicki. 1998. Lupin breeding. In Lupins as Crop
Plants: Biology, production and utilization (J. S. Gladstones, C. A. Alkins, and J. Hamblin,
eds.) CAB International, Oxon.
Damigri, S. M., L. R. Frederick, and I. C. Anderson. 1967. Serogroups of Rhizobium
japonicum in soybean nodules as affected by soil types. Agron. J. 59, 10-12.
.163
Dangeard, P. A. 1926. Recherches sur les tubercules radicaux des lgumineuses. Le

botaniste, Ser.16. 270 p. Paris.
Date, R. A., and A. M. Decker. 1965. Minimal antigenic constitution of 28 strains of
Rhizobium japonicum. Can. J. Microbiol. 11, 1-8.
Davidson, I. A., and M. J. Robson. 1986. Effect of contrasting patterns of nitrate uptake, N2fixation, nodulation and growth of white clover. Ann. Bot. 57, 331-338.
Davis, E. O., and A. W. B. Johnston. 1990. Regulatory functions of the 3 nodD genes of
rhizobium leguminosarum bv. Phaseoli. Mol. Microbiol. 4, 933-941.
de Bruijn, F. J. 1992. Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial
repetitive intergenic consensus) sequences and the polymerase chain reaction to fingerprint
the genomes of Rhizobium meliloti isolates and other soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol.
58, 2180-2187.
de Bruijn, F. J., J. Rademaker, M. Schneider, U. Rossbach, and F. J. Louws. 1996. Rep
PCR Genomic Fingerprinting of Plant Associated Bacteria and Computer Assissted
Phylogenetic Analyses. Biology of Plant Microbe Interaction; Procceding of the 8th
International Congress of Molecular Plant Microbe Interactions (G. Stacey, B. Mullin and
P. Gresshoff. Eds.) APS Press, p. 497-502.
de Bruijn, F. J., M. E. Mc Spadden-Gadener, B. Millcamps, J. L. Rademaker, W.
Ragatz, D. Schultz, M. L. Struffi, and J. Stoltzfus. 1997. Molecular approaches in
microbial ecology to assess genomic diversity and stress induced gene expression in plant
associated diazotrophs. In Nitrogen Fixation: fundamentals and applications, pp. 571-576.
Edited by C. Elmerich, A Kondorosi and W. E. Newton. Kluwer. The Netherlands.
de Faria, S. M., G.T. Hay, and J. I. Sprent. 1988. Entry of rhizobia into roots of Mimosa
scabrella Bentham occours between epidermal cells. J. Gen. Microbiol. 134, 2291-2296.
de Lajudie, P., A. Willems, B. Pot, and 7 other authors. 1994. Polyphasic taxonomy of
Rhizobia: emendation of the genus Sinorhizobium and description of Sinorhizobium meliloti
comb. nov., Sinorhizobium saheli sp. nov., Sinorhizobium terangae sp. nov. Int. J. Syst.
Bacteriol. 44, 715-733.
de Lajudie, P., E. Laurent-Fulele, A. Willems, U. Torck, R. Coopman, M. D. Collins, K.
Kersters, and M. Gillis. 1998a. Allorhizobium undicola gen. Nov. sp. nov., nitrogen-fixing
bacteria that efficiently nodulate Neptunia natans in Senegal. Int.J. Syst.Bacteriol. 48, 12771290.
de Lajudie, P., A. Willems, G. Nick, A. Moreira, F. Molouba, B. Hoste, U. Torck, M.
Neyra, M. D. Collins, K. Lindstrom, B. Dreyfus, and M. Gillis. 1998b. Characterisation of
tropical tree rhizobia and description of Mesorhizobium plurifarium sp. Nov. Int.J.Syst.
Bacteriol. 48, 369-382.
de Maagd, R. A., C. van Rossum, and B. J. J. Lugtenberg. 1988. Recognition of individual
strains of fast-growing rhizobia by using profiles of membrane proteins and
lipopolysaccharides. J. Bacteriol. 170, 3782-3788.
Debell, F., G. P. Yag, M. Ferro, G. Truchet, J. C. Prom, and J. Denari. 1997.
Rhizobium nodulation factors in perspective. NATO Adv. Study Inst. Ser. G Ecol. Sci. 39, 1523.
Del Papa, M. F., L. J. Balague, S. C. Sowinski, C. Wegener, E. Segundo, F. M. Abarca,
N. Toro, K. Niehaus, A. Phler, O. M. Aguilar, G. Martinez-Drets, and A. Lagares.
.164
1999. Isolation and characterization of alfalfa-nodulating rhizobia present in acidic soils of

central Argentina and Uruguay. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1420-1427.
Dnari, J., F. Debell and J-C. Prom. 1996. Rhizobium lipochitooligosaccharide
nodulation factors : signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu.
Rev. Biochem. 65, 503-535.
Dev, A., R. K. Gour, R. K. Jain, P. S. Bisen, and L. K. Sengupta. 1998. Effect of vesicular
arbuscular mycorrhiza-Rhizobium inoculation interaction on heavy metal (Cu, Zn and Fe)
uptake in soybean (Glycine max, var. JS-335) under variable P doses. Int. J. Tropic. Agric. 15,
75-79
Djordjevic S. P., H. Chen, M. Bately, J. W. Redmond, and B. G. Rolfe. 1987. Nitrogen
fixation ability of exopolysaccharide synthesis mutants of Rhizobium sp. strain NGR234 and
Rhizobium trifolii is restored by the addition of homologous exopolysaccharides. J Bacteriol
169, 53 60.
Djordjevic, M. A., W. Zurkowski, J. Shine, and B. G. Rolfe. 1983. Sym plasmid transfer to
various symbiotic mutants of Rhizobium trifolii, R. leguminosarum, and R. meliloti. J.
Bacteriol. 156, 1035-1045.
Dobert, R. C., B. T. Breil, and E. W. Triplett. 1994. DNA sequence of the common
nodulation genes of Bradyrhizobium elkani and their phylogenyic relationships to those of
other nodulating bacteria. Mol. Plant-Microbe Inter. 7, 564-572.
Dohler, K. and W. Klingmuller. 1988. Genetic interaction of Rhizobium leguminosarum
biovar viceae with Gram-negative bacteria. In W. Klingmuller (ed.) Risk assessment for
deliberate releases, Springer-Verlag, Berlin.
Downie, J. A., and J. P. W. Young. 2001. Genome sequencing: The ABC of symbiosis.
Nature. 412, 597-598.
DPV-DREF (Direction de la Production Vgtale). Ministre de lAgriculture, du
dveloppement rural et des eaux et forts. Bilan des cultures fourragres, Campage agricole
1999/2000.
Dracup, M. 1993. Establishment of lupin seedlings. W. A. Journal of Agriculture. 34, 157159.
Dreyfus, B., J. L. Garcia, and M. Gillis. 1988. Characterization of Azorhizobium
caulinodans gen. Nov., sp. nov., a stem-nodulating nitrogen-fixing bacterium isolated from
Sesbania rostata. Int. J. Syst. Bacteriol. 38, 89-98.
Dudman, W. F. 1971. Antigenic analysis of Rhizobium japonicum by immunodiffusion.
Appl. Microbiol. 21, 973-985.
Dunn, D. B. 1984. Cytotaxonomy and links distribution of New World lupin species. Pp. 6885. In Proceeding of the Third International Lupine Conference. International Lupin
Association. La Rochelle, France.
Dupuy, N., A. Willems, B. Pot, D. Dewettinck, I. Vandenbruaene, G. Maestrojuan, B.
Dreyfus, K. Kersters, M. D. Collins, and M. Gillis. 1994. Phenotypic and genotypic
characterization of bradyrhizobia nodulating the leguminous tree Acacia albida. Int. J. Syst.
Bacteriol. 44, 461-473.
Eaglesham, A. R. J. 1987. The use of intrinsic antibiotic resistance for Rhizobium study. In
Symbiotic Nitrogen Fixation Technology. Ed. H. Elkan. Pp 185-204. Macel Dekker Inc., New
York.
.165
Eaglesham, A. R. J., and A. Ayanaba. 1984. Tropical stress ecology of rhizobia, rootnodulation and legume fixation, p. 1-35. In N. S. Subba Rao (ed.), Current developments in
biological nitrogen fixation. Edward Arnold Publishers, London, United Kingdom.
Eardly, B. D., J. P. W. Young, and R. K. Selander. 1992. Phylogenetic position of
Rhizobium sp. Strain ORS 191, a symbiont of both Medicago sativa and Phaseolus vulgaris,
based on partial sequences of the 16S rRNA and nifH genes. Appl. Environ. Microbiol. 58,
1809.
Eardly, B. D., L. A. Materon, N. H. Smith, D. A. Johnso, M. D. Rumbaugh, and R. K.
Selander. 1990. Genetic structure of natural populations of the nitrogen-fixing bacterium
Rhizobium meliloti. Appl. Environ. Microbiol. 56, 187-194.
Eckhardt, M. M., I. L. Baldwin, and E. B. Fred. 1931. Studies of the root nodule organism
of lupines. J. Bacteriol. 21, 273-285.
Elkan. G. H. 1992. Taxonomy of the rhizobia. Can J. Microbiol. 38, 446-450.
El-Mzouri E., and I. Thami Alami. 2000. Forage and pasture legume biodiversity in the
semi-arid areas of West Central Morocco. In Sulas L. (eds.). Legumes for Mediterranean
forage crops, pastures and alternative uses. CIHEAM-IAMZ. Cahiers Options
Meditrranennes, 45, 91-94.
El-sheikh, E. A. E., and M. Wood. 1989. Response of chickpea and soybean rhizobia to salt:
osmotic and specific ions effects of salts. Soil. Biol. Biochem. 21, 889-895.
Engelhard, M., T. Hurek, and B. Reinhold-Hurek. 2000. Preferentiel occurrence of
diazotrophic endophytes, Azoarcus spp., in wild rice species and land races of Oryza sativa in
comparison with modern races. Environ. Microbiol. 2, 131-141.
Ernst, W. H. O. 1990. Mine vegetation in Europe, p. 21. In A. J. Shaw (ed.), Heavy metal
tolerance in plants: evolutionary aspects. CRC Press, Boca Raton, Fla.
Eriksson, J. 1873. Studier fver leguminosernas rotknlar. Acta Univ. Lu. (10) 8, 1-30.
Etzler, M. E., Kalsi, G., Ewing, N. N., Roberts, N. J., Day, R. B., and Murphy, J. B. 1999.
A nod factor binding lectin with apyrase activity from legume roots. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 96, 5856-5861
Euzby J. P., and B. J. Findall. 2004. Status of strains that contravene rules 27(3) and 30 of
the Bacteriological Code. Request for an Opinion. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 293-301.
FAO. 1988. Programme de cooperation technique. Programme de dveloppement des
productions fourragres et de llevage. Rapport de synthse. 45p.
Farrand, S. K., P. B. van Berkum, and P. Oger. 2003. Agrobacterium is a definable genus
of the family Rhizobiaceae. Int J Syst Evol Microbiol. 53, 1681-1687
Forsberg, L. S., and R. W. Carlson. 1998. The structures of the lipopolysaccharides from
Rhizobium etli strains CE358 and CE359. The complete structure of the core region of R. etli
lipopolysaccharides. J. Biol. Chem. 273, 2747-2757.
Foury, A. 1954. Les lgumieuses fourragres au Maroc. Les cahiers de la recherche
agronomique. 3, 55-78.
Frank, B. 1879. ber die Parasiten in den Wurzelanschwellungen der Papilionaceeen. Bot.
Zeitung. 24, 377-388.
Frank, B. 1889. Uber die Pilzsymbiose der Leguminosen. Ber. Dtsc. Bot. Ges. 7, 332-346.
.166
Frank, B. 1890. Uber die Pilzsymbiose der Leguminosen Landuv Jahrb, .., 523-640.
Fred, E. B., I. L. Baldwin, and E. McCoy. 1932. Root nodule bacteria and leguminous
plants. University of Wisconsin Press, Madisson, Wis. (in: Elkan, 1902).
Freiberg, C., R. Fellay, A. Bairoch, W. J. Broughton, A. Rosenthal, and X. Perret. 1997.
Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature 387, 394-401
Fuhrman, J. J. 1990. Symbiotic effectiveness of indigenous soybean bradyrhizobia as related
to serological, morphological, rhizobitoxie, and hydrogenase phenotypes. Appl. Environ.
Microbiol. 56, 224-229.
Fujihara, S., and T. Yoneyama. 1993. Effects of pH and osmotic stress on cellular
polyamine contents in the soybean rhizobia Rhizobium fredii p220 and Bradyrhizobium
japonicum A 1017. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1104-1109.
Gabor, M. 1965. Tansformation of streptomycin markers in rough strains of Rhizobium
lupini. II. The relation between the determinant of streptomycin dependence and those for
streptomycin resistance and sensitiveness. Genetics. 52, 905-913.
Gagnon H., and R. K. Ibrahim. 1998. Aldonic acids: a novel family of nod gene inducers of
Mesorhizobium loti, Rhizobium lupini and Sinorhizobium meliloti. Mol.Plant Microbe
Interact. 11, 988-998.
Galibert F., Finan T. M., Long S. R., Phler A., Abola P., Ampe F., Barloy-Hubler F.,
Barnett M. J., Becker A., Boistard P. etc. 2001. The composite genome of the legume
symbiont Sinorhizobium meliloti. Science 293, 668-672.
Gao J.-L., S. L. Turner, F. L. Kan, E. T. Wang, Z. Y. Tan, Y. H. Qiu, J. Gu, Z.
Terefework, J. P. W. Young, K. Lindstrm, and W. X. Chen. 2004. Mesorhizobium
septentrionale sp. nov. and Mesorhizobium temperatum sp. nov., isolated from Astragalus
adsurgens growing in the northern regions of China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 20032012.
Gao, J. L., J. G. Sun, Y. Li, E. T. Wang, and W. X. Chen. 1994. Numerical taxonomy and
DNA relatedness of tropical rhizobia isolated from Hainan province, China. Int. J. Syst.
Bacteriol. 44, 151-158.
Gault, R. R., J. Brockwell, E. J. Corbin, and K. A. Boundy. 1986. Nodulation studies on
legumes exotic to Australia: Lupinus and Ornithopus spp. Aust. J. Exp. Agric. 26, 37-48.
Gniaux, E., G. Laguerre, and N. Amarger. 1993. Comparison of geographically distant
population of Rhizobium isolated from root nodules of Phaseolus vulgaris. Mol. Ecol. 2, 295302.
Geurts R, and T. Bisseling. 2002. Rhizobium Nod factor perception and signaling. Plant Cell
14, 239-249.
Gibson, A. H., and J. E. Harper. 1985. Nitrate effect on nodulation of soybean by
Bradyrhizobium japonicum. Crop Sci. 25, 497-501.
Giller, E. K., E. Witter, and S. P. Mc Grath. 1998. Toxicity of heavy metals to
microorganisms and microbial processes in agricultural soil: a review. Soil Biol. Biochem. 30,
1389-1414.
Giller, K. E., S. P. McGrath, and P. R. Hirsch. 1989. Absence of nitrogen fixation in clover
grown on soil subject to long-term contamination with heavy metals is due to survival of only
ineffective Rhizobium. Soil Biol. Biochem. 21, 841-848.
.167
Gillis, M. P. Vandamme, P. De Vos, J. Y. Swings, and K. Kersters. 2001. Polyphasic

taxonomy. Pp. 43-48. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, Volume I.
Boone, D.R., R. W. Castenholz, G. M. Garrity (eds.).
Giraud, E., L. Hanibal, J. Fardoux, A. Vermeglio, and B. Dreyfus. 2000. Effect of
Bradyrhizobium photosynthesis on stem nodulation of Aeschynomene sensitive. Proceedings
of National Academy of Science USA. 97, 14795-14800.
Gladstones, J. S. 1973. Observations on the distribution and ecology in Iberia and North
Africa of some annual legumes adapted to neutral and acid soils. Aust. Plant. Introd. Rev. 11,
9-23.
Gladstones, J. S. 1974. Lupins of the Mediterraean Region and Africa. Technical Bulleti
number 26. Wester Australian Departement of Agriculture, Perth.
Gladstones, J. S. 1980. Recent developments in the understanding, improvement, and use of
Lupinus. In: Summerfield R. J. & Bunting A. H. (ed.), Advances in Legumes Science, p. 603611. University of Reading.
Gladstones, J. S. 1998. Distribution, origin, taxonomy, history, importance. In Lupins as
Crop Plant: Biology, Production and Utilization (J. S. Gladstones, C. A. Alkins and J.
Hamblin, eds.). CAB International, Oxon.
Glenn, A. R., and M. J. Dilworth. 1994. The life of root nodule bacteria in the acidic
underground. FEMS Microbiol. Lett. 123:1-10.
Gonzalez, J. E., B. L. Reuhs, and G. C. Walker. 1996. Low molecular weight EPS II of
Rhizobium meliloti allows nodule invasion in Medicago sativa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
93, 8636-8641.
Gonzlez-Sama A., M. M. Lucas, M. R. de Felipe, and J. J. Pueyo. 2004. An unusual
infection mechanism and nodule morphogenesis in white lupin (Lupinus albus). New
Phytologist. 163, 371-380.
Gouffi K., N. Pica, V. Pichereau, and C. Blanco. 1999. Disaccharides as a new class of non
accumulating osmoprotectants for Sinorhisobium meliloti. Appl. Environ. Microbiol. 65,
1491-1500.
Graham, P. H. 1963. Antibiotic sensitivities of the root nodule bacteria. Aust. J. Biol. Sci. 16:
557-559.
Graham, P. H. 1964. Studies on the utilization of carbo-hydrates and Krebs cycle
intermediates by rhizobia, using an agar plate method. Antinie van Leeuwenhoek. 30, 68-72.
Graham, P. H. 1992. Stress tolerance in Rhizobium and Bradyrhizobium, and nodulation
under adverse soil conditions. Can. J. Microbiol. 38, 475-484.
Graham, P. H. 1998. Symbiotic nitrogen fixation. In Principles and applications of soil
microbiology. D. Sylvia et al (Eds.) pp: 325-347. Prentice Hall.
Graham, P. H., and C. A. Parker. 1964. Diagnostic features in the characterization of root
nodule bacteria of legumes. Plant Soil. 20, 383-396.
Graham, P. H., K. Draeger, M. L. Ferrey, M. J. Conroy, B. E. Hammer, E. Martinez, S.
R. Naarons, and C. Quinto. 1994. Acid pH tolerance in strains of Rhizobium and
Bradyrhizobium, and initial studies on the basis for acid tolerance of Rhizobium tropici
UMR1899. Can. J. Microbiol. 40, 198-207.
.168
Graham, P. H., M. J. Sadowsky, H. H. Kersters, Y. M. Barnet, R. S. Bradley, J. E.

Cooper, D. J. De Ley, B. D. W. Jarvis, E. B. Roslycky, B. W. Strijdom, and J. P. W.
Young. 1991. Proposed minimal standards for the description of new genera and species of
root-and stem-nodulating bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 582-587.
Graham, P. H., M. J. Sadowsky, S. W. Tighe, J. A. Thompson, R. A. Date, J; G;
Howieson, and R. Thomas. 1995. Differences among strains of Bradyrhizobium in fatty
acid-methy ester analysis. Can. J. Microbiol. 41, 1038-1042.
Grimont, F., and P. A. D. Grimont. 1986. Ribosomal ribonucleic acid gene restriction
patterns as potential taxonomic tools. An. Inst. Pasteur Microbiol. 137B, 165-175.
Grimont, F., and P. A. D. Grimont. 1991. La carte molculaire des bactries. Bull. Soc. Fr.
Microbiol. 6, 9-12.
Grundmann H. J., K. J. Towner, L. Dijkshoorn, P. Gerner-Smidt, M. Maher, H. Seifert,
and M. Vaneechoutte. 1997. Multicenter study using standardized protocols and reagents
for evaluation of reproducibility of PCR-based fingerprinting of Acinetobacter spp. J. Clin.
Microbiol. 35, 3071-3077.
Guedira A. 2002. Contribution ltude de leffet des sols calcaires sur la nodulation du
lupin (Lupinus albus L.). Mmoire de DESA. Universit Ibn Tofail. Kenitra.
Guillemand, M. 1999. Le lupin comme alternative au soja. La France agricole 03.09.1999, S.
40.
Grtler, V., and V. A. Stanisich. 1996. New approaches to typing and identification of
bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology 142, 3-16.
Grtler, V., V. A. Wilson, and B. C. Mayall. 1991. Classification of medically important
clostridia using restriction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rDNA. J. Gen.
Microbiol. 137, 2673-2679.
Gusmo-Lima A. I., E. Figueira, M. P. de Almeida, and S. I. A. Pereira. 2005. Cadmium
tolerance plasticity in Rhizobium leguminosarum bv. viciae: glutathione as a detoxifying
agent. Can. J. Microbiol. 51, 7-14.
Hartman, A., and N. Amarger. 1991. Genotypic diversity of an indigenous Rhizobium
meliloti field population assessed by plasmid profiles, DNA fingerprinting, and insertion
sequence typing. Can. J. Microbiol. 37, 600-608.
Hartmann A., Giraud J. J., Catroux G. 1998. Genotypic diversity of Sinorhizobium
(formerly Rhizobium) meliloti strains isolated directly from a soil and from nodules of alfalfa
(Medicago sativa) grown in the same soil. FEMS Microbiol. Ecol. 25, 107-116.
Haukka, K. and K. Lindstrom. 1994. Pulsed-field gel electrophoresis for genotypic
comparison of Rhizobium bacteria that nodulate leguminous trees. FEMS Microbiol. Lett. 119,
215-220.
Haukka, K., Lindstrm, K., and Young, P. W. 1998. Three phylogenetic groups of nodA
and nifH genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolates from leguminous trees growing
in Africa and Latin America. Appl. Environ. Microbiol. 64, 419-426
Hellriegel, H., and H. Wilfarth. 1988. Untersuchungen ber die stickstoffnahrung der
gramineon und leguminosen. Beilageheft zu der ztschr. Ver Rbenzucker Industrie
Deutchen Reichs.
.169
Hennecke, H., K. Kaluza, B. Thny, M. Fuhrmann, W. Ludwig, and E. Stackebrandt.

1985. Concurrent evolution of nitrogenase genes and 16S rRNA in Rhizobium species and
other nitrogen fixing bacteria. Archiv. Microbiol. 142, 342-348.
Hernandez B. S., and D. D. Focht. 1984. Invalidity of the concept of slow growth and alkali
production in cowpea rhizobia. Appl. Environ. Microbiol. 48, 206-210.
Herrera-Cervera, J. A., J. M. Sanjuan-Pinilla, J. Olivares, and J. Sanjuan. 1998. Cloning
and identification of conjuguative transfer origins in Rhizobium meliloti genome. J. Bacteriol.
180, 4583-4590.
Heumann, W. 1979. Rhizobium lupini genetics (lupin). Current Topics in Microbiology and
Immunology. 88, 1-24.
Heyndrickx, M., L. Vauterin, P. Vandamme, K. Kersters, and P. Vos. 1996. Applicability
of combined amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) patterns in bacterial
phylogeny and taxonomy. J. Microbiol. Methods. 26, 247-259.
Hildebrand, E. M. 1940. Cane gall of brambles caused by Phytomonas rubi nov. sp. J. Agri.
Res. 61, 685-696.
Hillis, D. M., and M. T. Dixon. 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and
phylogenetic inference. Q. Rev. Biol. 66, 411-453.
Hirsch A. M., M. R. Lum, and J. A. Downie. 2001. What makes the Rhizobia-legume
symbiosis so special? Plant Physiol. 127, 1484-1492.
Hirsch A. M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytol 122, 211-237.
Hirsch A. M. 1999. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation.
Curr Opin Plant Biol. 2, 320-326.
Hoeflich, G., G. Kuehn, H. Goerlitz, P. Roemer, M. Brummund, and J. Heelmund. 1994.
Promotion of biological nitrogen fixation in lupines and serradella, a contribution to an
economizing plant nutrition. Arch. Agron. & Soil Sc. 38, 405-414.
Hollis, A. B., W. E. Kloos, and G. H. Elkan. 1981. Hybridization studies of rhizobium
japonicum and related Rhizobiaceae. J. Gen. Microbiol. 123, 215-222.
Holmes, B. 1988. Taxonomy of Agrobacterium. Acta Hortic. 225, 47-52.
Howieson, J. G., I. R. P. Fillery, A. B. Legocki, M. M. Sikorski, T. Strepkowsky, F. R.
Minchin, and M. J. Dilworth. 1998. Nodulation, nitrogen fixation and nitrogen balance. Pp.
149-180. In Lupins as Crop Plant. Biology, Production and Utilization (J. S. Gladstones, C. A.
Alkins and J. Hamblin, eds.). CAB International, Oxon, UK.
Howieson, J. G., M. A. Ewing, and M. F. D Antuono. 1988. Selection for acid tolerance in
Rhizobium meliloti. Plant Soil. 105, 179-188.
Huber, I., and S. Selenka-Pobell. 1994. Pulsedfield electrophoresis-fingerprinting, genome
size estimation and rrn loci number of Rhizobium galegae. J. Appl. Bacteriol. 77, 528-533.
Hulton, C. S. J., C. F. Higgins, and P. M. Sharp. 1991. ERIC sequences: a novel family of
repetitive elements I the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other
enterobacteria. Mol. Microbiol. 5, 825-834.
Hume, D. J., and B. J. Shelp. 1990. Superior performance of the hup-Bradyrhizobium
japonicum strain 532C in Ontatio soybean field trials. Can J. Plant Sci.70, 661-666.
.170
Hungria, M. and A. A. Franco. 1993. Effect of high temperature on nodulation and nitrogen
fixation by Phaseolus vulgaris L. Plant Soil. 149, 95-102.
Ibekwe, A. M., J. S. Angle, R. L. Chaney, and P. Vonberkum. 1997. Enumeration and
nitrogen fixation potential of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii grown in soil with
varying pH values and heavy metal concentrations. Agric. Ecosyst. Environ. 61, 103-111.
Irigoyen, J. J., M. Sanchez-Diaz and D. W. Emerich. 1990. Carbon metabolism enzymes of
Rhizobium meliloti cultures and bacteriods and their distribution within alfalfa nodules. Appl.
ITCF, UNIP, FNAMS et AFPP. 1988. Le lupin blanc doux protagineux, culture
utilisation. Brochure rdige sous la responsabilit de Ph. Blanc-quaert, Paris.
Jarabo-Lorenzo A., R. Perez-Galdona , J. Donate-Correa , R. Rivas , E. Velazquez , M.
Hernandez , F. Temprano , and E. Martinez-Molina , T. Ruiz-Argueso, M. LeonBarrios. 2003. Genetic diversity of bradyrhizobial populations from diverse geographic
origins that nodulate Lupinus spp. and Ornithopus spp. Syst. Appl. Microbiol. 26, 611-623.
Jarvis, B. D. W., A. G. Dick, and R. M. Greenwood. 1980. Deoxyribonucleic acid
homologies among strains of Rhizobium trifolii and related species. Int. J. Syst. Bacteriol. 30,
42-52.
Jarvis, B. D. W., C. E. Pankhurst, and J. J. Pastel. 1982. Rhizobium loti, a new species of
legume root nodule bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 32, 378-380.
Jarvis, B. D. W., H. L. Downer, and J. P. W. Young. 1992. Phylogeny of fast- growing
soybean nodulating rhizobia supports synonymy of Sinorhizobium and Rhizobium and
assignment to Rhizobium fredii. Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 93-96.
Jarvis, B. D. W., P. van Berkum, W. X. Chen, S. Nour, M. P. Fernandez, J. C. CleyetMarrel, and M. Gillis. 1997. Transfet of Rhizobium loti, Rhizobium huakuii, Rhizobium
ciceri, Rhizobium mediterraneum, and Rhizobium tianshanense to Mesorhizobium gen. nov.
Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 895-898.
Jarvis, B. D. W., T. S. Mc lean, I. G. C. Robertson, and G. R. Fanning. 1977. Phenetic
similarity and DNA base sequence homology and root nodule bacteria from New Zealand
native legumes and Rhizobium strains from agricultural plants. New Zealand J. Agric. Res. 20,
42-52.
Jenkins M. B., and P. J. Bottemley. 1985. Composition and field distribution of the
population of Rhizobium meliloti in root nodules of uninoculated field grown alfalfa. Soil
Biol. & Biochem. 17, 173-179.
Jensen, H. L. 1967. Mutual host plant relationships in two groups of legume root nodule
bacteria (Rhizobium spp.). Arch. Microbiol. 59, 174-179.
Jensen, H. L., and A. L. Hansen. 1968. Observations on host relations in root nodule
bacteria of the lotus-Anthillis and Lupinus-Ornithopus groups. Acta. Agric. Scand. 18, 135142.
Jensen, M. A., and N. Straus. 1993. Effect of PCR conditions on the formation of
heteroduplex and single-stranded DNA products in the amplification of bacterial ribosomal
DNA spacer regions. PCR Methods Appl. 3, 186-194.
Jian, W., Y. Susheng, and L. Jilun. 1993. Studies on the salt tolerance of Rhizobium
meliloti. Acta Microbiol. Sin. 33, 260-267.
.171
Johnson, A. C., and M. Wood. 1990. DNA: a possible site of action of aluminium in
Rhizobium spp. Appl. & Environ. Microbiol. 26, 3629-3633.
Johnston, A. W. B. and Beringer J. E. 1975. Identification of the Rhizobium strains in pea
root nodules using genetic markers. J. Gen. Microbiol. 87, 343-350.
Johnston, A. W. B., J. L. Beynon, A. V. Buchanan-Wollaston, S. M. Setchell, P. R.
Hirsch, and J. E. Beringer. 1978. High frequency transfer of nodulating ability between
strains and species of Rhizobium. Nature. 276, 634-636.
Jordan, D.C. 1982. Transfer of rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen.
nov., a genus of slow growing root nodule bacteria from leguminous plants, Int. J. Syst.
Bacteriol. 32, 136-139.
Jordan, D.C. 1984. Family III. Rhizobiaceae, p.234-242. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.),
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, vol.1. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
Josey, D. P., J. Beynon, A. W. B. Jonston, and J. E. Beringer. 1979. Strain identification of
Rhizobium using intrinsic antibiotic resistance. J. Appl. Bacteriol. 46, 343-350.
Judd, A. K., M. Schneider, M. J. Sadowsky, and F. J. de Bruijn. 1993. Use of repetitive
sequences ad the polymerase chain reaction technique to classify genetically related
Bradyrhizobium japonicum serocluster 123 strains. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1702-1708.
Kaneko T., Y. Nakamura, S. Sato, E. Asamizu, T. Kato, S. Sasamoto, A. Watanabe, K.
Idesawa, A. Ishikawa, and K. Kawashima. 2000. Complete genome structure of the
nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti. DNA Res. 7, 331-338.
Kannenberg, E. L., and R. W. Carlson. 2001. Lipid A and O-chain modifications cause
Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development. Mol.
Microbiol. 39, 37939.
Karanja, N. K., and M. Wood. 1988. Selecting Rhizobium phaseoli strains for use with
beans (Phaseolus vulgaris L.) in Kenya. Tolerance of high temperature and antibiotic
resistance. Plant Soil. 112, 15-22.
Kass, E., and M. Wink. 1997. Molecular phylogeny and phylogeography of Lupinus
(leguminosae) inferred from nucleotide sequences of the rbcL gene and ITS 1+2 regions of
rDNA. Plant Syst. Evol. 208, 139-167.
Kassem M., Capellano A., and A. M. Gounot. 1985. Effets du chlorure de sodium sur la
croissance in vitro, l'infectivit et l'efficience de Rhizobium meliloti. MIRCEN J. 1, 63-65.
Kersters K., K. H. Hinz, A. Hertle, P. Sergers, A. Lievens, O. Siegmann, and J. De Ley.
1984. Bordetella avium sp. nov., isolated from the respiratory tracts of turkeys and other
birds. Int. J. Syst. Bacteriol. 34, 56-70.
Keyser, H. H., and P. B. Cregan. 1987. Nodulation and competition for nodulation of
selected soybean genotypes among Bradyrhizobium japonicum serogroup 123 isolates. Appl.
Keyser, H. H., B. B. Bohlool, T. S. Hu, and D. F. Weber. 1982. Fast-growing rhizobia
isolated from roots of soybean. Science 215, 1631-1632.
Khbaya B., M. Neyra, P. Normand, K. Zerhari, and A. Filali-Maltouf. 1998. Genetic
Diversity and Phylogeny of Rhizobia That Nodulate Acacia spp. in Morocco Assessed by
Analysis of rRNA Genes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4912-4917.
.172
Kinkle, B. K., J. S. Angle, and H. H. Keyser. 1987. Long-term effects of metal-rich sewage
sludge application on soil populations of Bradyrhizobium japonicum. Appl. Environ.
Microbiol. 53, 315-319.
Kinkle, B. K., M. J. Sadowsky, K. Johnstone, and W. C. Koskinen. 1994. Tellurium and
selenium resistance in rhizobia and its potential use for direct isolation of Rhizobium meliloti
from soil. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1674-1677.
Kinkle, K. B. and E. L. Schmidt. 1991. Transfer of the pea symbiotic plasmid pJB5JI in
non-sterile soil. Appl. Environ. Microbiol. 57, 3264-3269.
Kishinevsky, B. D., D. Sen, and R. W. Weaver. 1992. Effect of high root temperature on
Bradyrhizobium peanut symbiosis. Plant Soil. 143, 275-282.
Klucas, R. V., F. J. Hans, S. A. Russell, and H. J. Evans. 1983. Nickel: a micronutrient
element for hydrogen-dependent growth of Rhizobium japonicum and for expression of urease
activity in soybean leaves. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 2253-2257.
Knsel, D. H. 1984. Genus IV. Phyllobacterium (ex. Knsel. 1962) nom. Rev.
(Phyllobacterium Knsel. 1962, 96). In Bergeys Manual of Systematic Bacteriolog, vol.1, pp.
254-256. Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins.
Kozhemyakov, A. P., B. M. Cheremisov, B. S. Kurlovich, I. A. Tikhonovich, L. T.
Kartuzova, S. A. Tchetkova, and T. A. Emeljanenko. 2001. Evaluation of the biological
nitrogen-fixing ability of lupin (Lupinus L.). PGR Newsletter. 123, 66-77.
Kurlovich, B. S. 1998. Species and intraspecific diversity of white, blue and yelleow lupins.
Plant Genet. Resour. Newsl. 115, 1-10.
Kurlovich, B. S., I. A. Tikhonovich, L. T. Kartuzova, and A. P. Kozhemyakov. 1997.
Trends and methods pf lupine breeding for increasing level of symbiotic nitrogen fixation.
Bull. Appl. Bot. Gen. Pant Breed. 152, 39-47.
Kuykendall, L. D. 2004a. Genus Azorhizobium of the family Hypomicrobiaceae. Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, 2nd Volume.
Kuykendall, L. D. and F. B. Dazzo. 2003. Genus Allorhizobium. In Bergeys Manual of
Systematic Bacteriol, vol. II. 2nd Edition.
KuyKendall, L. D., B. Saxena, T. E. Devine, and S. E. Udell. 1992. Genetic diversity in
bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for bradyrhizobium elkanii sp nov.
Can. J. Microbiol. 38, 501-505.
Kuykendall, L. D., J. M. Young, E. Martinez-Romero, A. Kerr, and H. Sawada. 2004b.
Genus Rhizobium, a highly divergent genus in a revised family, the Rhizobiaceae. Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, 2nd Volume.
Kuykendall, L. D., M. A. Roy, J. J. ONeil, and T. E. Devine. 1988. Fatty acids, antibiotic
resistance, and deoxyribonucleic acid homology groups of Bradyrhizobium japonicum. Int. J.
Syst. Bacteriol. 38, 358-361.
Ladha, J. K., R. P. Pareek, R. So, and M. Becker. 1990. Stem nodule symbiosis and its
unusual properties, p. 633-640. In P. M. Gresshoff et al (ed.), Nitrogen fixation: achievements
and objectives. Chapman & Hall, Ltd., London.
Lagares .A, G. Caetano-anolles, K. Niehauss, J. Lorenzen, H. D. Ljunggren, and G.
Favelukes. 1992. A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness
for nodulation of alfalfa. J. Bacteriol. 174, 5941-5952.
.173
Laguerre G., Louvier P., Allard M. R., Amarger N. 2003. Compatibility of rhizobium
genotypes within natural populations of Rhizobium leguminosarum Biovar viciae for
nodulation of host legumes. Appl. & Environ. Microbiol. 69, 2276-2283.
Laguerre, G., M. P. Fernadez, V. Edel, P. Normand, and N. Amarger. 1993. Genomic
heterogeneity among Frensh Rhizobium strains isolated from Phaseolus vulgaris L. Int. J.
Syst. Bacteriol. 43, 761-767.
Laguerre, G., M. R. Allard, F. Revoy, and N. Amarger. 1994. Rapid identification of
rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR- amplified 16S rRNA
genes. Appl. Environ. Microbiol. 60, 56-63.
Laguerre, G., P. Mavingui, M. R. Allard, M. P. Charnay, P. Louvrier, S. I. Mazurier, L.
Rigottier-Gois, and N. Amarger. 1996. Typing of rhizobia by PCR DNA fingerprinting and
PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal and symbiotic gene
regions: application to Rhizobium leguminosarum and its different biovars. Appl. Environ.
Microbiol. 62, 2029-2036.
Laguerre, G., P. van Berkum, N. Amarger, and D. Prvost. 1997. Genetic diversity of
rhizobial symbionts isolated from legume species within the genera Astragalus, Oxytropis,
and Onobrychis. Appl. Environ. Microbiol. 63, 4748-4758.
Laguerre, G., S. M. Nour, V. Macheret, J. Sanjuan, P. Drouin, and N. Amarger. 2001.
Classification of rhizobia based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic
relationship among Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology 147, 981-993.
Lal, B., and S. Khanna. 1995. Selection of salt tolerant Rhizobium isolates of Acacia
nilotica. W. J. Microbiol. Biotech. 10, 637-639.
Legocki, A. B., W. Karlowski, J. Podlkowski, M. Sikorski, and T. Stepkowski. 1997.
Advances in molecular characterization of the yellow lupin- Bradyrhizobium sp. (Lupinus)
symbiotic model. Pp. 263 266 in Biological Nitrogen Fixation for Ecology and Sustainable
Agriculture (A. B. Legoki and H. Both, eds.). Proceedings NATO Advanced Research
Workshop, Pozan, Poland, 10-14 September 1996. Springer-Verlag; Berlin, Germany.
Lerouge, I., Laeremans, T., Verreth, C., Vanderleyden, J., Van Soom, C., Tobin, A., and
R. W. Carlson. 2001. Identification of an ATP-binding Cassette Transporter for Export of the
O-antigen across the Inner Membrane in Rhizobium etli based on the Genetic, Functional, and
Structural Analysis of an lps Mutant Deficient in O-antigen. J. Biol. Chem. 276, 1719017198.
Leung K., S. R. Strain, F. J. de Bruijn, and P. J. Bottomley. 1994. Genotypic and
Phenotypic comparison of chromosomal types within an indeginuous soil population of
Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii. Appl. Environ. Microbiol. 60, 416-426.
Lindermann, W. C., E. L. Schmidt, and G. E. Ham. 1974. Evidence for double infection
within soybean nodules. Soil Science. 118, 274279.
Lindstrm K. 1989. Rhizobium galegae, a new species of legume root bacteria. Int. J. Syst.
Bacteriol. 39, 365-367.
Lindstrm K., and S. Lehtomki. 1988. Metabolic properties, maximum growth
temperature and phase sensitivity of rhizobium sp. (Galega) compared with others fastgrowing rhizobia. FEMS Microbiol. Lett. 50, 277-287.
Lipsanen, P. and K. Lindstrm. 1989. Lipopolysaccharides and protein patterns of
Rhizobium sp. (Galega). FEMS Microbiol. Lett. 58, 323-328.
.174
Lodeiro, A. R., S. L. Lopez-Garcia, T. E. Vasquez, and G. Favelukes. 2000. Stimilation of

adhesiveness, infectivity, and competitiveness for nodulation of Bradyrhizobium japonicum
by its treatment with soybean seed lectin. FEMS Microbiol. Lett. 188, 177-184.
Lohnis, F., and R. Hansen. 1921. Nodule bacteria of leguminous plants. J. Agr. Res. 20,
543-546.
Long, S. R. 2001. Genes and signals in the Rhizobium-legume symbiosis. Plant Physiology,
125, 69-72.
Lorenz, M. G., and W. Wackernagel. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic
transformation in the environment. Microbiol. Rev. 58, 563.
Lorquin, J., G. Lortet, M. Ferro, N. Mear, B. Dreyfus, J. C. Prome, and C. Boivin.
1997b. Nod factors from Sinorhizobium saheli and S. teranga bv. sesbaniae are both
arabinosylated and fucosylated, a structural feature specific to Sesbania rostrata symbionts.
Mol. Plant-Microbe Interact. 10, 879-890.
Lorquin, J., G. Lortet, M. Ferro, N. Mar, J.-C. Prom, and C. Boivin. 1997a.
Sinorhizobium teranga bv. acaciae ORS1073 and Rhizobium sp. strain ORS1001, two
distantly related Acacia-nodulating strains, produce similar Nod factors that are O
carbamoylated, N methylated, and mainly sulfated. J. Bacteriol. 179, 3079-3083.
Louws F. J., M. Schneider and F. J. de Bruijn. 1996. In: Toranzos G, (ed), Nucleic Acid
Amplification Methods for the Analysis of Environmental Samples. Technomic Publishing Co
63-94.
Lowe, R. H., H. J. Evans, and S. Ahmed. 1960. The effect of cobalt on the growth of
Rhizobium japonicum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 3, 675-678.
Ludwig, W., and K. H. Schleifer. 1999. Phylogeny of bacteria beyond the 16S rRNA
Standard. ASM News. 65, 752-757.
Ludwig, W., R. Rosselo-Mora, R. Aznar, S. Klugbauer, S. Springs, K. Reetz, C.
Beimfohr, E. Brockmann, G. Kirchhof, S. Dorn, M. Bachleitner, N. Klugbauer, N.
Springers, D. Lane, M. Weizenegger, and K. H. Schleifer. 1995. Comparative sequence
analysis of 23 rRNA from Proteobacteria. Syst. Appl. Microbiol. 18, 164-188.
Lupski, J. R. and G. M. Weinstock. 1992. Short interspersed repetitive DNA sequences in
prokaryotic genomes. J. Bacteriol. 174, 4525-4529.
Lynch, D. H., and D. L. Smith. 1993. Soybean (Glycine max) nodulation and N2-fixation as
affected by exposure to low root-zone temperature. Plant Physiol. 88, 212-220.
Lynch, J. M., and J. M. Wipps. 1990. Substrate flow in the rhizosphere. Plant & Soil. 129,
1-10.
Matallah, J. 2003. Biodiversit et position phylogntique des rhizobia nodulant le pois
chiche au Maroc: evidence dun transfert de gene de nodulation entre Mesorhizobium et
Sinorhizobium. Thse de Doctorat dEtat Es-Sciences. Universit Mohammed V. Rabat.
Matallah, J., E. B. Berraho, S. Munoz, J. Sanjuan, and C. Lluch. 2002. Phenotypic
characterization of rhizobia isolated from chickpea (Cicer arietinum L.) growing in Moroccan
soils. Agronomie 22, 321-329.
Madrzak, C. J., B. Golinska, J. Kroliczak, K. Pudelko, D. Lazewska, B. Lampka and M.
Sadowsky. 1995. Diversity among field populations of Bradyrhizobium japonicum in Poland.
Appl. Environ. Microbiol. 6, 1194-1200.
.175
Maidak, B. L., N. Larsen, M. J. McCaughey, R. Overbeek, G. J. Olsen, K. Foge, J.

Blandy, and C. R. Woese. 1994. The ribosomal database project. Nucleic Acid Res. 22,
3485-3487.
Manniatis T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Martensson A. M., L. Brutti, and H. Ljunggren. 1989. Competition between strains of
Bradyrhizobium japonicum for nodulation of soybeans at different nitrogen fertilizer levels.
Plant Soil. 117: 219225.
Martinez-Romero, E., and J. Caballero-Mellado. 1996. Rhizobium phylogenies and
bacterial genetic diversity. Crit. Rev. Plant Sci. 15, 113-140.
Martinez-Romero, E., L. Segovia, F. M. Mercante, A. A. Franco, P. Graham, and M. A
Pardo. 1991. Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and
Leucaena sp. Trees. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 417-426.
McGrath, S. P. 1994. Effects of heavy metals from sewage sludge on soil microbes in
agricultural ecosystems. In Toxic metals in soil plant Systems, ed. S. M. Ross. Pp. 242-274.
John Wiley, Chichester.
McGrath, S. P., A. M. Chaudri, and K. E. Giller. 1995. Long term effects of land
application of sewage sludge: soils, microorganisms and plants. J. Indust. Microbiol. 14, 94104.
McNeil, D. L. 1982. Variation in Rhizobium japonicum strains to nodulate soybean and
maintain fixation in the presence of nitrate. Appl. Environ. Microbiol. 44, 647-652.
Mercado-Blanco, J., and N. Toro. 1996. Plasmids in rhizobia: The role of nonsymbiotic
plasmids. MPMI. 9, 535-545.
Michiels, J., C. Verreth, and J. Vanderleyden. 1994. Effects of temperature stress on bean
nodulating Rhizobium strains. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1206-1212.
Ministre dAgriculture et de Dveloppement Rural. 2005. Bilan des cultures fourragres.
2005 DPV.
Missbah El Idrissi M., N. Auajjar, A. Belabed, Y. Dessaux, and A. Filali-Maltouf. 1996.
Characterization of rhizobia isolated from carob tree (Ceratonia siliqua) .J. Appl. Bacteriol.
80, 165-173.
Moawad H. A., Ellis W. R., Schmidt E. L. 1984. Rhizosphere response as a factor in
competition among three serogroups of indigenous Rhizobium japonicum for nodulation of
field-grown soybeans. Appl. & Environ. Microbiol. 47, 607-612.
Moawad, H., and D. Beck. 1991. Some characteristics of Rhizobium leguminosarum isolates
from uninoculated field-grown lentil. Soil Biol. Biochem. 23, 917-925.
Mohamed, S. H., A. Smouni, M. Neyra, D. Kharchaf, and A. Filali-Matouf. 2000.
Phenotypic characteristics of root-nodulating bacteria isolated from Acacia spp. grown in
Libya. Plant & Soil. 224, 171-183.
Molouba, F., J. Lorquin, A. Willems, B. Hoste, E. Giraud, B. Dreyfus, M. Gillis, P. de
Lajudie, and C. Masson-Boivin. 1999. Photosynthetic bradyrhizobia from Aeschynomene
spp. are specific to stem-nodulated species and form a separate 16S ribosomal DNA
restriction fragment length polymorphism group. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3084-3094.
.176
Monteiro, R., and P. E. Gibbs. 1986. A taxonomic revision of the unifoliolate species of
Lupinus (Leguminosea) in Brazil. Notes RBG Edinb. 44, 71-104.
Moreira, F. M. S., M. Gillis, B. Pot, K. Kersters, and A. A. Franco. 1993. Characterisation
of rhizobia isolated from different groups of tropical leguminosae by comparative
polyacrylamide gel electrophoresis of their total proteins. Syst. Appl. Microbiol. 16, 135-146.
Morton, A. C., A. P. Begg, G. A. Anderson, S. Takai, C. Lammler, and G. F. Browning.
2001. Epidemiology of Rhodococcus equi strains on thoroughtbred horse farms. Appl.
Moulin, L., A. Munive, B. Dreyfus, and C. Boivin-Masson. 2001. Nodulation of legumes
by members of the -subclass of Proteobacteria. Nature. 411, 948-950.
Mpepereki S, Makonese F, and A. G. Wollum. 1997. Physiological characterization of
indigenous rhizobia nodulation Vigna unguiculata in Zimbabwean soils. Symbiosis. 22, 275292.
Muchbach, M., A. Nocker, and F. Narbahaus. 1999. Multiple small heat shock proteins in
rhizobia. J. Bacteriol. 181, 83-90.
Mullis, K. B., and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA I vitro via a polymerasecatalysed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350.
Munevar, F., and A. G. Wollum. 1981. Growth of Rhizobium japonicum strains at
temperatures above 27C. Appl. Environ. Microbiol. 42, 272-276.
Munns D. N. 1968. Nodulation of Medicago sativa in solution culture. III. Effects of nitrate
on root hairs and infection. Plant Soil. 29, 3349.
Ndoye, I., F. de Billy, J. Vasse, B. Dreyfus, and G. Truchet. 1994. Root nodulation of
Sesbania rostata. J. Bacteriol. 176, 1060-1068.
Neyra, M., B. Khbaya, P. de Lajudie, B. Dretfus, and P. Normand. 1998. Computer
assissted selection of restriction enzyme for rrs genes PCR/RFLP descrimination of rhizobial
species. Genet. Sel. Evol. 30, 297-309.
Nick, G. 1998. Polyphasic taxonomy of rhizobia isolated from tropical tree legumes. Ph. D.
Thesis. Departement of Applied Chemistry & Microbiology. University of Helsinki.
Nick, G., and K. Lindstrm. 1994. Use of repetitive sequences and polymerase chain
reaction technique to fingerprint the genomic DNA of Rhizobium Galegae strains and to
classify the DNA obtained by sonicating the liquid cultures and root nodules. Syst. Appl.
Microbiol. 17, 265-273.
Nick, G., P. de Lajudie, B. D. Eardly, S. Suomalainen, L. Paulin, X. Zhang, M. Gillis,
and K. Lindstrm. 1999. Sinorhizobium arboris sp. nov. and Sinorhizobium kostiense sp.
nov., isolated from leguminous trees in Sudan and Kenya. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 13591368.
Niehaus K, Lagares A, and A. Phler. 1998. A Sinorhizobium meliloti lipopolysaccharide
mutant induces effective nodules on the host plant Medicago sativa (alfalfa) but fails to
establish a symbiosis with Medicago truncatula. Mol Plant-Microbe Interact. 11, 906-914
Noel, K. D., Forsberg, L. S., and Carlson, R. W. 2000. Varying the Abundance of O
Antigen in Rhizobium etli and its Effect on Symbiosis with Phaseolus vulgaris. J. Bacteriol.
182, 5317-5324.
.177
Normand, P., C. Ponsoet, X. Nesme, M. Neyra, and P. Simonet. 1996. ITS analysis of
prokaryotes. Mol. Microbial. Ecol. Manual. 3, 1-12.
Norris, D. P. 1965. Rhizobium relationships in legumes. Proc. 9th Int. Grassl. Congr. Sao
Paulo. 2, 1087-1092.
Nour, S. M., Cleyet-Marel, J. C., Normand, P., and Fernandez, M. P. 1995. Genomic
heterogeneity of strains nodulating chickpeas (Cicer arietinum L.) and description of
Rhizobium mediterraneum sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 640-648.
Nour, S. M., Fernandez, M. P., Normand, P., and Cleyet-Marel, J. C. 1994a. Rhizobium
ciceri sp. nov., consisting of strains that nodulate chickpea (Cicer arietinum L.). Int. J. Syst.
Bacteriol. 44, 511-522.
Nour, S. M., J. C. Cleyet-Marel, D. Beck, A. Effose, and M. P. Fernandez. 1994b.
Genotypic and phenotypic diversity of Rhizobium isolated from chickpea (Cicer arietinum
L.). Can J. Microbiol. 44, 345-354.
Novikova, T. I., and N. I. A. Gordienko. 2001. Study of the root nodules in some species of
the Papilionaceae subfamily by scanning electron microscopy. Tsitologiia. 43, 107-113.
O.R.M.V.A.G., Mars 1999. Diagnostic agronomique sur les possibilits de dveloppement du
lupin dans la rgion du Gharb. Rapport N3.
Obaton, M. 1971. Utilisation de mutants spontans resistants aux antibiotiques pour ltude
cologique des Rhizobiums. C. R. Acad. Sci. Ser. D. 272, 2630-2633.
Obbard, J. P., D. R. Sauerbeck, and K. C. Jones. 1994. The effect of heavy metalcontaminated sewage sludge on the rhizobial soil population of an agricultural field trial, p.
127-161. In M. H. Donker, H. Eijsackers, and F. Heimback (ed.), Ecotoxicology of soil
organisms. Lewis Publishers, London, United Kingdom.
Oberreuter, H, J. Chrzinski, and S. Scherer. 2002. Intraspecific diversity of
Brevibacterium linens, Corynebacterium glutamium and Rhodococcus erythropolis based on
partial 16S rDNA sequence analysis and Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy.
Microbiology. 148, 1523-1532.
Ochman, H., J. G. Lawrence, and E. A. Groisman. 2000. Lateral gene transfer and the
nature of bacterial innovation. Nature 405, 299-304.
Octive, J. C., A. Johnson, and M. Wood. 1994. Effects of previous aluminium exposure on
motility and nodulation by Rhizobium and Bradyrhizobium. Soil Biol. & Biochem. 26, 14771482
Odee, D. W., J. M. Sutherland, E. T. Makatiani, S. G. Mc Inroy, and J. I. Sprent. 1997.
Phenotypic characteristics and composition of the rhizobia associate with woody legumes
growing in diverse Kanyen conditions. Plant & Soil. 188, 65-75.
O'Hara, G. W., and A. R. Glenn. 1994. The adaptive acid tolerance response in root nodule
bacteria and Escherichia coli. Arch. Microbiol. 161, 286-292.
Olsen, G., J. C. Woese, and R. Overbeek. 1994. The winds of (evolutionary) change:
breathing new life into microbiology. J. Bacteriol. 176, 1-6.
Ophel, K., and A. Kerr. 1990. Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium
biovar 3 from grapevines. Int. J. Syst. Bacteriol. 40, 236-241.
.178
Palmer, K. M., and J. P. W. Young. 2000. Higher diversity of Rhizobium leguminosarum

biovar viciae populations in arable soils than I grass soils. Appl. Environ. Microbiol. 66,
2445-2450.
Parke, D. and L.N. Ornston. 1984. Nutitional diversity of rhizobiaceae revealed by
auxanography. J. Gen. Microbiol. 130, 1743-1750.
Parker M. A. 2002. Bradyrhizobia from wild Phaseolus, Desmodium and Macroptilium
species in northern Mexico. Appl. Env. Microbiol. 68, 2044-2048.
Pawlowski, K, and T. Bisseling. 1996. Rhizobial and actinorhizal symbioses: What are the
shared features? Plant Cell. 8, 1899-1913.
Perret, X., and W. J. Broughton. 1998. Rapid identification of Rhizobium strains by
targeted PCR fingerprinting. Plant & Soil. 204, 21-34.
Perret, X., C. Staehelin, and W. J. Broughton. 2000. Molecular basis of symbiotic
promiscuity. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 180-201
Peters N. K., and Verma D. P. S. 1990. Phenolic compounds as regulators of gene
expression in plantmicrobe interactions. Mol. Plant Microbe Interac. 3, 4-8.
Petes, T. D., and C. W. Hill. 1988. Recombination between repeated genes in
microorganisms. Annu. Rev. Genet. 22, 147-168.
Pfeffer P. E., G. Becard, D. B. Rolin, J. Uknalis, P. Cook, and S. Tu. 1994. In vivo nuclear
magnetic resonance study of the osmoregulation of phosphocholine-substituted -1,3;1,6
cyclic glucan and its associated carbon metabolism in Bradyrhizobium japonicum USDA 110.
Appl. Environ. Microbiol. 60, 2137 2146.
Piha, M. I., and D. N. Munnus. 1987. Sensitivity of the common bean (Phaseolus vulgaris
L.) symbiosis to high soil temperature. Plant Soil. 98, 183-194.
Pinero D., E. Martinez-Romero, and R. K. Selander. 1988. Genetic diversity and
relationships among isolates of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Appl. Environ.
Microbiol. 54, 2825 2832.
Plitman, U. and C. C. Heyn. 1984. Old World lupins: taxonomy, evolutionary relationships
and links with New World species. Pp. 56-66. In Proceeding of the Third International Lupine
Conference. International Lupin Association. La Rochelle, France.
Pointereau, P. 2001. Lgumineuses : quels enjeux cologiques ? Le courrier de
lenvironnement. N44.
Prvost, D., H. Antoun, and L. M. Bordeleau. 1987. Effects of low temperature on
nitrogenase activity in sainfoin (Onobrychis viciifolia) nodulated by arctic rhizobia. FEMS
Microbiol. Ecol. 45, 205-210.
Pudelko, K., and C. J. Mdrzak. 1996. Populations of Rhizobium and Bradyrhizobium
nodulating Lupinus in Poland, p. 156. In Abstracts of Biological Fixation of Nitrogen for
Ecology and Sustainable Agriculture. 2nd European Nitrogen Fixation Conference and NATO
Advanced Research Workshop. Scientific Publishers OWN, Poznan, Poland.
Pueppke, S. G., and W. J. Broughton. 1999. Rhizobium sp. NGR234 and R. fredii
USDA257 share exceptionally broad, nested host-ranges. Mol. Plant-Microbe Interact. 12,
293-318
.179
Purchase, D., R. J. Miles and T. W. K. Young. 1997. Cadmium uptake and nitrogen fixing
ability in heavy-metal resistant laboratory and field strains of Rhizobium leguminosarum
biovar trifolii. FEMS Microbiol. Ecol. 22, 85-93.
Rademaker, J. L., B. Hoste, F. J. Louws, K. Kersters, J. Swings, L. Vauterin, P.
Vauterin, and F. J. de Bruijn. 2000. Comparison of AFLP and rep-PCR genomic
fingerprinting with DNA-DNA homology studies: Xanthomonas as a model system. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 50, 665-677.
Rai R. 1983. The salt tolerance of Rhizobium strains and lentil genotypes and the effect of
salinity on the aspects of symbiotic N-fixation. J. Agric. Sci. 100, 81-86.
Rsnen, L., U. Heikkil-Kallio, L. Suominen, P. Lipsanen, and K. Lindstrom. 1991.
Expression of Rhizobium galegea common nod clones in various backgrounds. Mol. Plant
Microbe Interc. 4, 536-544.
Raza S., B. Jornsgard, H. Abou-Taleb , and J. L. Christiansen. 2001. Tolerance of
Bradyrhizobium sp. (Lupini) strains to salinity, pH, CaCO3 and antibiotics. Lett. Appl.
Microbiol. 32, 379-83.
Reddy, G. B., C. N. Cheng, and S. J. Dunn. 1983. Survival of Rhizobium japonicum in
sludge environment. Soil Biol. Biochem. 15, 343-345.
Riley, I. T., and M. J. Dillworth. 1985. Cobalt status and its effects on soil population of
rhizobium lupini, rhizosphere colonization, and nodule initiation. Soil bacteriol. & Biochem.
17, 81-85.
Rinaudo, G., S. Orenga, M. P. Fernandez, H. Meugnier, and R. Bardin. 1991. DNA
homologies among members of the genus Azorhizobium and other stem- and root-nodulating
bacteria isolated from the tropical legume Sesbania rostata. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 114120.
Rivas R., E. Velzquez, A. Willems, N. Vizcano, N. S. Subba-Rao, P. F. Mateos, M.
Gillis, F. B. Dazzo, and E. Martnez-Molina. 2002. A New Species of Devosia That Forms
a Unique Nitrogen-Fixing Root-Nodule Symbiosis with the Aquatic Legume Neptunia natans
(L.f.) Druce. Appl. Environ. Microbiol. 68, 52175222.
Rivas R., Willems A., Subba-Rao N. S., Mateos P.F., Dazzo F. B., Kroppenstedt R. M.,
Martnez-Molina E., Gillis M., and E.Velzquez. 2003. Description of Devosia neptuniae
sp. nov. that nodulates and fixes nitrogen in symbiosis with Neptunia natans, an aquatic
legume from India. Syst. Appl. Microbiol. 26, 47-53.
Rivas, R., A. Willems, J. L. Palomo, P.,Garcia-Benavides, P. F. Mateos, E. MartinezMolina, M. Gillis, and E. Velazquez. 2004. "Bradyrhizobium betae sp. nov. isolated from
roots of Beta vulgaris affected by tumor-like deformations." Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54,
1271-1275.
Robert, F. M., J. A. E. Molina and E. L. Schmidt. 1982. Properties of Rhizobium
leguminosarum isolated from various regions of Morocco. Ann. Microbiol. 133, 461-470.
Robinson, K. O. 1997. Evaluation of lupin and Bradyrhizobium germplasm for nitrogen
fixation. MS Thesis, Virginia State University.
Robinson, K. O., D. A. Beyene, P. van Berkum, R. Knignt-Mason, and H. L. Bhardwaj.
2000. Variability in plant-microbe interaction between Lupinus lines and Bradyrhizobium
strains. Plant Science. 159, 257-264.
.180
Rome, S., M. P. Fernandez, B. Brunel, P. Normand, and J. C. Cleyet-Marel. 1996.

Sinorhizobium medicae sp. nov., isolated from annual Medicago spp. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 46, 972-980.
Ross, I. S. 1993. Membrane transport processes and response to heavy metals. In Stress
Tolerance of Fungi, ed. D. H. Jennings, pp: 97-125. Marcel Dekker, New York.
Roth, L. E., and G. Stacey. 1989. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing
soybean nodules: The symbiosome membrane comes from three sources. Eur. J. Cell. Biol.
49, 13-23.
Roughley, R. J. 1970. The influence of root temperature, Rhizobium strain and host selection
on the structure and nitrogen-fixing efficiency of the root nodules of Trifolium subterraneum.
Ann. Bot. 34:631-646.
Roughley, R. J., F. A. Wahab, and J. Sundram. 1992. Intrinsic resistance to streptomycin
and spectinomycin among root-nodule bacteria from Malaysian soils. Soil Biol. Biochem. 24,
715-716.
Roughley, R. J., L. G. Gemell, J. A. Thompson, and J. Brockwell. 1993. The number of
Bradyrhizobium sp (Lupinus) applied to seed and effect on the rhizosphere colonization,
nodulation and yield of lupin. Soil. Biol. Biochem. 25, 1453-1458.
Rberg, S., Z. X. Tian, E. Krol, B. Linke, F. Meyer, Y. Wang, A. Phler, S. Weidner,
and A. Becker. 2003. Construction and validation of a Sinorhizobium meliloti whole genome
DNA microarray: genome-wide profiling of osmoadaptive gene expression. J. Biotechnol.
106, 255-68
Sadowsky, M. J., P. B. Crega, and H. H. Keyser. 1990. DNA hybridization probe for use in
determining restricted nodulation among Bradyrhizobium japonicum serocluster 123 fields
isolates. Appl. Environ. Microbiol. 56, 1768-1774.
Sahgal M. and B. N. Johri. 2003. The changing face of rhizobial systematics. Current
Science (84) No. 1, 43-47.
Saldana G., and V. Martinez-Alcantara. 2003. Genetic diversity of fast growing rhizobia
that nodulate soybean (Glycine max L. Merr). Arch. Microbiol. 180, 45-52.
Sawada H., and H. Ieki. 1992. Phenotypic characteristics of the genus Agrobacterium. Soc.
Japan. 58, 37-45.
Sawada H., H. Ieki, H. Oyaizu, and S. Matsumoto. 1993. Proposal for rejection of
Agrobacterium tumefaciens and revised description for the genus Agrobacterium and for
Agrobacterium radiobacter and Agrobacterium rhizogenes. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 694702.
Sawada H., L. D. Kuykendall, and J. M. Young. 2003. Changing concepts in the
systematics of bacterial nitrogen-fixing legume symbionts. J. Gen. Appl. Microbiol. (49) 3,
155-179.
Sawada, Y. Miyashita K., and T. Yokoyama. 1990. Diversity within serogroups of
Japanese isolates of Bradyrhizobium as indicated by intrinsic antibiotic resistance. Soil Sci.
Plant Nutr. 30, 501-504.
Scharf, B., S. Wolff-Bhring, R. Rachel, and R. Schmitt. 2001. Mutational analysis of the
Rhizobium Lupini H 13-3 and Sinozhizobium meliloti flagellin genes: Importance of Fagellin
A for flagellar filament structure and transcriptional regulation. J. Bact. 183, 5334-5342.
.181
Schleifer, K. H., and O. Kandler. 1972. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their
taxonomic implications. Bacteriol. Rev. 36, 407-477.
Schlinkert-Miller, M., and I. L. Pepper. 1988. Physiological and biochemical
characteristics of a fast-growing strain of lupin rhizobia isolated from the Sonaran Desert. Soil
Biol. Biochem. 20, 319-322.
Schneider, M. and F. J. de Bruijn. 1996. Rep-PCR mediated genomic fingerprinting of
rhizobia and computer-assisted phylogenetic pattern analysis. W. J. Biotch. 12, 163-174.
Schofield, P. R., A. H. Gibson, W. F. Dudman, and J. M. Watson. 1987. Evidence for the
genetic exchange and recombination of Rhizobium symbiotic plasmids in a soil population.
Schofield, P. R., A. H. Gibson, W. F. Dudman, and J. M. Watson. 1987. Evidence for the
genetic exchange and recombination of Rhizobium symbiotic plasmids in a soil population.
Scholla, H. M., J. A. Moorefield, and H. E. Elkan. 1990. DNA homology between species
of the rhizobia. Syst. Appl. Microbiol. 13, 288-294.
Scholla, M. H., and G. H. Elkan. 1984. Rhizobium fredii sp. nov., a fast growing species that
effectively nodulates soybean. Int. J. System. Bact. 34, 484-486.
Scholla, M. H., J. A. Moorefield, and G. H. Elkan. 1984. Deoxyribonucleic acid homology
between fast-growing soybean-nodulating bacteria and other rhizobia. Int. J. System. Bact. 34,
283-286.
Schroeter, J. 1886. p 1-814, in Cohn, F. (ed.) Kryptogamenflora von Schlesien, Band 3,
Heft3, Pilze J. U. Kerns Verlag, Breslau.
Schwinghamer, E. A. 1967. Effectiveness of Rhizobium as modified by mutation for
resistance to antibiotics. Antonie van Leeuwenhoek. J. Microbiol. Serol. 33, 121-136.
Segovia, L., D. Pinero, R. Palacios, and E. Martinez Romero. 1991. Genetic structure of a
soil population of nonsymbiotic Rhizobium leguminosarum. Appl. Environ. Microbiol. 57,
426-433.
Segovia, L., J. P. W. Young, and Martinez-Romero. 1993. Reclassification of American
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli type I strains as Rhizobium etli sp. nov. Int. J.
Syst. Bacteriol. 43, 374-377
Selander, R. K., D. A. Caugent, H. Ochman, J. M. Musser, M. N. Gilmour, and T. S.
Whittam. 1986. Methods of multilocus ezyme electrophoresis for bacterial population geetics
and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 51, 873-884.
Shalon D., S. J. Smith, and P. O. Brown. 1996. A DNA microarray system for analyzing
complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res. 6, 639645.
Sharples, G. J., and R. G. Lloyd. 1990. A novel repeated DNA sequence located in the
intergenic regions of bacterial chromosomes. Nucl. Acid Research. 19, 6503-6508.
Sherwood, J. E., G. L. Truchet, and F. B. Dazzo. 1984. Effect of nitrate supply on the in
vivo synthesis and distribution of trifoliin A, a Rhizobium trifolii-binding lectin, in Trifolium
repens seedlings. Planta. 126, 540-547.
Shishido, M., and I. L. Pepper. 1990. Identification of dominant indigenous Rhizobium
meliloti by plasmid profiles and intrinsic antibiotic resistance. Soil Biol. Biochem. 22, 11-16.
.182
Silver, S. 1992. Plasmid determined metal resistance mechanisms: Range and overview.
Plasmid 27, 1-3.
Singleton P. W., El Swaify S. A., and B. B. Bohlool. 1982. Effect of salinity on Rhizobium
growth and survival. Appl. Environ. Microbiol. 44, 884-890.
Skerman, V. B. D., V. Mc Gowan, and P. H. A. Sneath. 1980. Approved lists of bacterial
names. Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 225-240.
Slizak, W., and W. Piotrowski. 1991. Response of Rhizobium lupini to some fungides and
antibiotics. Phytopathologicia Polonica. 14, 77-82.
Smalla, K., E. Krogerrecklenfort, H. Heuer, W. Dejonghe, E. Top, and M. Osborn. 2000.
PCR-based detection of mobile genetic elements I total community DNA. Microbiology. 146,
1256-1257.
Smith, E. F., and C. O. Towsnd. 1907. A plant-tumor of bacterial origin. Science 25, 671673.
Sneath, P. H. A. 1984. In Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, pp. 19 23.
Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. Baltimore, USA: Williams & Wilkins.
Somasegaran, P. and H. J. Hoben. 1985. Methods in legume-Rhizobium technology, pp.
128-138. University of Hawaii, Honolulu.
Somasegaran, P., V. G. Reyes, and H. J. Hoben. 1984. The influence of high temperatures
on the growth and survival of Rhizobium spp. in peat inoculants during preparation, storage
and distribution. Can. J. Microbiol. 30, 23-30.
Spaink H. P. 2000. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria.
Annu. Rev. Microbiol. 54, 257-288.
Spaink H. P., C. A. Wijffelman, E. Pees, R. J. H. Okker, and B. J. J. Lugtengerg. 1987.
Rhizobium nodulation gene nodD as a determinant of host specificity. Nature. 328, 337-340.
Squartini A., P. Struffi, H. Dring, S. Seleka-Pobell, E. Tola, A. Giacomini, E.
Vendramin, E. Velsquez, P. F. Mateos, E. Martinez-Molina, F. B. Dazzo, S. Casella,
and M. P. Nuti. 2002. Rhizobium sullae sp. nov. (formerly Rhizobium hedysari), the rrotnodule microsymbiont of Hedysarum coronarium L. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 12671276.
Stahl, D. A., and R. Amman. 1991. Development and application of nucleic acid probes. In
nucleic acid techniques in bacterial systematics. Edited by E. Stackebrandt and M.
Goodfellow, Wiley, London.
Sterner, J. P, and M. A. Parker. 1999. Diversity and relationships of bradyrhizobia from
Amphicarpaea bracteata based on partial nod and ribosomal sequences. Syst. Appl.
Microbiol. 22, 387-392.
Stougaard, J. 2000. Regulators and regulation of legume root nodule development. Plant
Physiol. 124, 531-540.
Stowers M. D. 1985. Carbon metabolism in Rhizobium species. Ann. Rev. Microbiol. 39, 89108.
Stowers M. D., and G. H. Elkan. 1984. Gluconate catabolism in Cowpea rhizobia: evidence
111 for a Ketogluconate pathway. Arch. Microbiol. 137, 3-9.
Stowers, M. D., and A. R. J. Eaglesham. 1984. Physiological and symbiotic characteristics
of fast-growing Rhizobium japonicum. Plant Soil. 77, 3-14.
.183
Sullivan, J. T., and Ronson, C. W. 1998. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500 kb

symbiosis island integrates into a phe-rRNA gene. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 95, 5145-5149.
Sullivan, J. T., B. D. Eardly, P. van Berkum, and C. W. Roson. 1996. Four unnamed
species of nonsymbiotic rhizobia isolated from the rhizosphere of Lotus corniculatus. Appl.
Sullivan, J. T., H. N. Patrick, W. L. Lowther, D. B. Scott, and C. W. Ronson. 1995.
Nodulation strains of Rhizobium loti arise through chromosomal symbiotic gene transfer in
the environment. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92, 8985-8989.
Suominen L., C. Roos, G. Lortet, L. Paulin, and K. Lindstrom. 2001. Identification and
structure of the Rhizobium galegea common nodulation genes: Evidence of horizontal gene
transfer. Mol. Biol. & Evol. 18, 907-916.
Swiecicki, W., W. K. Swiecicki, and B. volko. 1996. Lupinus anatolicus, a new species of
the Old World. Genet. Ressour. Crop Evol. 43, 109-117.
Sy, A., E. Giraud, P. Jourand, N. Garcia, A. Willems, P. de Lajudie, Y. Prin, M. Neyra,
M. Gillis, C. Boivin-Masson, and B. Dreyfus. 2001. Methylotrophic Methylobacterium
bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol. 183, 214-220.
Szabolcs I. 1986. Agronomical and ecological impact of irrigation on soil and water salinity.
Adv. Soil Sci. 4, 189-218.
Tabor, C. W., and H. Tabor. 1985. Polyamines in microorganisms. Microbiol. Rev. 49, 8199.
Tan Z. Y., F. L. Kan, G. X. Peng, E. T. Wang, B. Reinhold-Hurek, and W. X. Chen.
2001. Rhizobium yanglingense sp. nov., isolated from arid and semi-arid regions in China. Int.
J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 909-914.
Tang, C., and A. D. Robson. 1993. pH above 6.0 reduces nodulation in Lupinus species.
Plant Soil. 152, 269-276.
Terefework, Z., G. Nick, S. Suomalainen, L. Paulin, and K. Lindstrm. 1998. Phylogeny
of Rhizobium galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol.
48, 349356.
Terefework, Z., S. Kaijalainen, and K. Lindstrm. 2001. AFLP fingerprinting as a tool to
study the genetic diversity of Rhizobium galegae. J. Biotech. 91, 169-180.
Teyssier, C., H. Marchandin, and E. Jumas-Bilak. 2004. Le gnome des alphaprotobactries : complxit, rduction, diversit et fluidit. Can. J. Microbiol. 6, 383-387.
Thami-Alami, I. J. Papineau, C. Huyghe, and C. Al Faiz. 2004. Collection of the genus
Lupinus in Morocco. Dans le dveloppement des cultures fourragres; une ncessit pour
amliorer les productions animals et attnuer la degradation des resources naturelles, INRA
Proceeding. Mars 2004. INRA. Rabat.
Thami-Alami, I., and M. Bounejmate. 1997. Lupins (Lupinus spp) In Jaritz et M.
Bounejmate (ed.). Production et utilisation des cultures fourragres au Maroc. P: 198-204.
INRA. Rabat.
Tiller, K., R. Merry, and M. Mc Laughlin. 1994. Cadmium: a modern day problem. Rural
Research. 162, 32-35.
.184
Toledo I., L. Lloret, and E. Martinez-Romero. 2003. Sinorhizobium americanus sp. nov., a
new Sinorhizobium species nodulating native Acacia spp. in Mexico. Syst. Appl. Microbiol.
26, 54-64.
Tomsett, A. B. 1993. Genetics and molecular biology of metal tolerance in fungi. In Stress
Tolerance of fungi, ed. D. H. Jennings, pp: 69-95. Marcel Dekker, New York.
Tong, Z., and M. J. Sadowsky. 1994. A selective medium for the isolation and
quantification of Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii strains from soils
and inoculants. Appl. Environ. Microbiol. 60, 581-586.
Trinick M. J., D. J. Goodchild, and C. Miller. 1989. Localization of Bacteria and
Hemoglobin in Root Nodules of Parasponia andersonii Containing Both Bradyrhizobium
Strains and Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Appl. Environ. Microbiol. p. 2046-2055.
Trinick, M. J. 1980. Relationships amongst the fast-growing rhizobia of Lablab purpureus,
Leucaena leucocephala, Mimosa spp., Acacia farnesiana and Sesbania grandiflora and their
affinities with other rhizobial groups. J. Appl. Bact. 49, 39-53.
Trujillo, M. E., A. Willems, A. Abril, A. M. Planchuelo, R. Rivas, D. Ludena, P. F.
Mateos, E. Martinez-Molina, and E. Velazquez. 2005. "Nodulation of Lupinus albus by
strains of Ochrobactrum lupini sp. nov." Appl. & Environ. Microbiol. 71, 1318-1327.
Tylor, K. D., G. Wang, S. D. Tyler, and W. M. Johson. 1997. Factors affecting reliability
and reproductibility of amplified based DNA fingerprinting of representative pathogens. J.
Clin. Microbiol. 35, 339-346.
Ueda, T., Suga, Y., Yahiro, N., and Matsuguchi, T. 1995. Phylogeny of Sym plasmids of
rhizobia by PCR-based sequencing of a nodC segment. J. Bacteriol. 177, 468-472.
Urtz, B. E., and G. H. Elkan. 1996. Genetic diversity among Bradyrhizobium isolates that
effectively nodulate peanut (Arachis hypogaea). Can. J. Microbiol. 42, 1121-1130.
van Berkum, P., and B. D. Eardly. 1998. Molecular Evolutionary Systematics of the
Rhizobiaceae. In: The Rhizobiaceae: Molecular Biology of plant-associated bacteria. 1-24.
(Spaink, H. P., A. Kondorosi and P. J. J. Hooykaas ed.) Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht/Boston/London.
van Berkum, P., and B. D. Eardly. 2003. Impact of genomics on the reconstruction of
evolutionary relationships of nitrogen-fixing bacteria and implications for taxonomy, p. 1-21.
In R. Palacios and W. E. Newton (ed.), Nitrogen fixation: 1888-2001. VI. Genomes and
genomics of nitrogen-fixing organisms. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the
Netherlands.
van Berkum, P., and J. J. Fuhrman. 2000. Evolutionary relationships among the soybean
bradyrhizobia reconstructed from the 16S rRNA gene ad internally transcribed spacer region
sequence divergence. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 2165-2172.
van Berkum, P., D. Beyene, G. Bao, T. A. Campbell, and B. D. Eardly. 1998. Rhizobium
mongolense sp. nov. in one of three rhizobial genotypes identified which nodulate and form
nitrogen fixing symbioses with Medicago ruthenica [(L.) Ledebour]. Int. J. Syst. Evol.
van Berkum, P., S. I. Kotob, H. A. Basit, S. Salem, E. M. Gewail, and J. S. Angle. 1993.
Genotypic diversity among strains of Bradyrhizobium japonicum belonging to serogroup 110.
.185
van Berkum, P., Z. Terefework, L. Paulin, S. Suomalainen, K. Lindstrm, and B. D.

Eardly. 2003. Discordant phylogenies with the rrn loci of rhizobia. J. Bacteriol. 185, 29882998.
van Rossum, D., A. Muyotcha, B. M. De Hope, H. W. Van Verseveld, A. H. Stouthamer,
and F. C. Boogerd. 1994. Soil acidity in relation to groundnut-Bradyrhizobium symbiotic
performance. Plant Soil. 163, 165-175.
van Rossum,D., F. P. Schuurmans, M. Gillis, A. Muyotcha, H.W. van Verseveld, A. H.
Stotthamer, and F. C. Boogerd. 1995. Genetic and phenetic analysis of Bradyrhizobium
strains nodulating Peanut (Arachis hypogae L.) roots. Appl. Env. Microbiol. 61, 1599-1609.
Vance C. P,, M. A. Egli, S. M. Griffith, and S. S. Miller. 1998. Plant regulated aspects of
nodulation and N2-fixation. Plant Cell Environment 11 (5), 413-427.
Vandamme P., J. Goris, W. M. Chen, P. de Vos, and A. Willems. 2003. Burkholderia
tuberum sp. nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes.
Syst. Appl. Microbiol. 25, 507-512.
Vandamme, P., B. Pot, M. Gillis, P. De Vos, K. Kersters, and J. Swings. 1996. Polyphasic
taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. 60, 407-438.
Vaneechoutte, M., R. Rossau, P. De Vos, M. Gillis, D. Janssens, N. Paepe, A. De Rouck,
T. Fiers, G. Claeys, and K. Kersters. 1992. Rapid identification of bacteria of the
comamonadaceae with amplified ribosomal DNA-restriction analysis (ARDRA). FEMS
Microbiol. Lett. 93, 227-233.
Velasquez, E., J. M. Igual, A. Williams, E. Murez, P. F. Mateos, A. Abril, N. Toro, P.
Normand, E. Cervantes, G. Gillis, and E. Martnez-Romero. 2001. Mesorhizobium
Chocoense sp. nov., a novel species that nodulates Prosopis alba in the Chaco Arido region
(Argentina). Int. J. Syst. Bacteriol. 51, 1011-1021.
Verma, D. P. S., and S. Long. 1983. The molecular biology of Rhizobium- legume
symbiosis. International review and cytology, supplement, 14. pp 211-245. New York:
Academic Press.
Versalovic J. T., M. Schneider, F. J. de Bruijn, and J. R. Lupski. 1994. Genomic
fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods
Mol. Cell. Biol. 5, 25-40.
Versalovic, J., and J. R. Lupski. 1998. Interspersed repetitive sequence in bacterial
genomes. In Bacterial Genomes: Physical Structure ad Analysis, pp. 437-454. Edited by F. J.
de Bruijn, J. R. Lupski and G. M. Weinstock. New York: Chapmann & Hall.
Versalovic, J., F. J. de Bruijn, and J. R. Lupski. 1998. Repetitive sequence-based PCR
(rep-PCR) DNA fingerprinting of bacterial genomes. In Bacterial Genomes: Physical
Structure ad Analysis, pp. 437-454. Edited by F. J. de Bruijn, J. R. Lupski and G. M.
Weinstock. New York: Chapmann & Hall.
Versalovic, J., T. Koeuth, and J. R. Lupski. 1991. Distribution of repetitive DNA
sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids
Res. 19, 6823-6831.
Versalovic, J., T. Koeuth, Y. H. Zang, E. R. B. McCabe, and J. R. Lupski. 1992. Quality
control for bacterial inhibition assays: DNA fingerprinting of micoorganisms by rep-PCR.
Screening 1, 175-183.
.186
Vincent, J. M. 1970. A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. IBP
handbook, no. 15. Blackwell Scientific Publications, Ltd., Oxford, England.
Vinuesa P., M. Leon-Barrios, C. Silva, A. Willems, A. Jarabo-Lorenzo, R. PerezGaldona, D. Werner and E. Martinez-Romero. 2005. Bradyrhizobium canariense sp. nov.,
an acid-tolerant endosymbiont that nodulates endemic genistoid legumes (Papilionoideae:
Genisteae) from the Canary Islands, along with Bradyrhizobium japonicum bv. genistearum,
Bradyrhizobium genospecies alpha and Bradyrhizobium genospecies beta. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 55, 569-575.
Vinuesa, P., L. W. Rademaker, F. J. de Bruijn, and D. Werner. 1998. Genotypic
characterization of Bradyrhizobium strains nodulating endemic woody legumes of the Canary
Islands by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of genes encoding 16S
rRNA (16S rDNA) and 16S-23S rDNA intergenic spacers, Repetitive Extragenic Palindromic
PCR genomic fingerprinting and partial 16S rDNA sequencing. Appl. Environ. Microbiol. 64,
2096-2104
Vos, P., R. Hogers, M. Beeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot,
J. Peleman, M. Kuiper, and M. Zabeau. 1995. AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23, 4407-4414.
Wang E. T., P. Van Berkum, D. Beyene, X. H. Sui I., O. Dorado, W. X. Chen, and E.
Martinez-Romero. 1998. Rhizobium huautlense sp. nov., a symbiont of Sesbania herbacea
which has a close phylogenetic relationships with Rhizobium galegae. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 51, 1023-1026.
Wang, E. T., and E. Martinez-Romero. 2000. Sesbania herbacea-Rhizobium huautlense
nodulation in flooded soils and comparative characterization of S. herbacea-nodulating
rhizobia in different environments. Microb. Ecol. 40, 25-32.
Wang, E. T., P. Van Berkum, X. H. Sui, D. Beyene, W. X. Chen, and E. MartinezRomero. 1999a. Diversity of rhizobia associated with Amorpha fruticosa isolated from
Chinese soils and description of Mesorhizobium amorpha sp. nov. Int. J. Syst. Evol.
Wang, L. X., M. Antonio Rogel, A. G. los Santos, J. Martnez-Romero, M. A. Cevallos,
and E. Martinez-Romero. 1999b. Rhizobium etli bv. mimosae, a novel biovar isolted from
Mimosa affinis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 49, 1475-1491.
Wang, L. X., Z. Y. Ta, A. Willems, M. Fernandez-lpez, B. Reinhold-Hurek, and E.
Martinez-Romero. 2002. Sinorhizobium morolense sp. nov., a leucaena leucocephala
associated bacterium that is highly resistant to multiple antibiotics. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 52, 1687-1693.
Weaver, R. W., and L. R. Frederick. 1982. Rhizobium. In Methods of Soil Analysis. Part2Chemical and Microbiological Properties, 2nd ed. (A. L. Page, R. H. Miller and D. R, Keeny,
Eds), pp. 1043-1070. Am. Soc. Argonomy.
Weber, D. F., H. H. Keyser, and S. L. Uratsu. 1989. Serological distribution of
Bradyrhizobium japonicum from U.S. soybean production areas. Agron. J. 786-789.
Wei, G. H., E. T. Wang, Z. Y. Tan, M. E. Zhu, and W. X. Chen. 2002. Rhizobium
indigoferae sp. nov. and Sinorhizobium kummerowiae sp. nov., respectively isolated from
Indigofera spp. and Kummerowia stipulacea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 2231-2239.
Wei, G. H., Z. Y. Tan, M. E. Zhu, E. T. Wang, S. Z. Han, and W. X. Chen. 2003.
Characterization of rhizobia isolated from legume species within the genera Astragalus and
.187
Lespedeza grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium Loessense sp.
nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 1575-1583.
Weisburg, W. G., S. M. Barns, D. A. Pelletier, and D. J. Lae. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phyllogenetic study. J. Bacteriol 173, 697-703.
Welsh, J., and M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary
primers. Nucleic Acids Res. 18, 7213-7218.
Wernegreen, J. J., and M. A. Riley. 1999. Comparison of the evolutionary dynamics of
symbiotic and housekeeping loci: a case for the genetic coherence of rhizobial lineages. Mol.
Biol. Evol. 16, 98113.
Wetzel, A., and D. Werner. 1995. Ecotoxicological evaluation of contaminated soil using
the legume root nodule symbiosis as effect parameter. Environ. Toxicol. Water Qual. 10, 127134.
Whipps J. M. 1990. Carbon economy. In The Rhizosphere. J.M. Lynch Ed., John Wiley and
Sons, Chester, p 59-97.
Wiesniewski, J. P., and F. M. Delmote. 1996. Modulation of carbohydratebinding
capacities and attachement ability of Bradyrhizobium sp. (Lupinus) to white lupine roots.
Can. J. Microbiol. 42, 234-242.
Willems, A., and M. D. Collins. 1993. Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria
based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 305-315.
Willems, A., M. Fernndez-Lopez, E. Minos-Adelantado, P. De Vos, E. MartinezRomero, N. Y. Toro, and M. Gillis. 2003. Description of new Ensifer strains from nodules
and proposal to transfer adhaerens Cassida 1982 to Sinorhizobium as Sinorhizobium
adhaerens com.nov. Request for an Opinion. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 1207-1217.
Willems, A., R. Coopman, and M. Gillis. 2001b. Comparison of sequences analysis of 16S23S rDNA spacer regions, AFLP analysis, and DNA-DNA hybridization in Bradyrhizobium.
Int. J. Syst. Bacteriol. 51, 623-623.
Willems, A., R. Coopman, and M. Gillis. 2001c. Phylogenetic analysis and DNA-DNA
hybridization analyses of Bradyrhizobium species. Int. J. Syst. Bacteriol. 51, 111-117.
Willems,A., F. Doignon-Bourcier, J. Goris, R. Coopman, P. de Lajudie, and M. Gillis.
2001a. DNA-DNA hybridization study of Bradyrhizobium strains. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 51, 1315-1322.
Williams, M. 1993. Lupin blight. Forest pathology in New Zealand. No. 22. New Zealand
Forest Research Institute, Rotorua, New Zealand.
Wilson D. O., and H. M. Reisenauer. 1970. Effect of Manganese and Zinc Ions on the
Growth of Rhizobium. J Bacteriol. 102, 729732.
Wilson, J. K. 1944. Over five hundred reasons for abandoning the cross inoculation groups of
legumes. Soil Sci. 58, 61-69.
Wilson, K. 1989. Preparartion of genomic DNA frombacteria, pp. 2.4.1-2.4.5. In Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D.,
Seidman, J. G., Smith, J. A. and Srtruhl, K. eds). Greene Publishing Associates and WileyInterscience.
Wink, M. 1993. Allelochemical properties and the raison dtre of alkaloids. In The
Alkaloids, G. Cordell (ed.), vol. 43: 1-117, Academic press.
.188
Woese C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol Rev. 512, 221-71.

Wong, F. Y., K. E. Stackebrandt, J. K. Ladha, D. E. Fleischman, R. A. Date, and J. A.
Fuerst. 1994. Phylogenetic analysis of Bradyrhizobium japonicum and photosynthetic stemnodulating bacteria from Aeschynomene species grown in separated geographical regions.
Wood, M., J. E. Cooper, and A. J. Bjourson. 1988. Response of Lotus rhizobia to acidity
and aluminum in liquid culture and in soil. Plant Soil. 107, 227-231.
Woronin, M. S. 1866. ber die bei der Schwarzerle (Alnus glutinosa) und bei der
gewhnlichen Gartenlupine (Lupinus mutabilis) auftretenden Wurzelanschwellungen.
Mmoires de l'Academie Impriale des Sciences de St. Ptersbourg, VII Series, vol. X.
Xu, L. M., C. Ge, Z. Cui, J. Li, and H. Fan. 1995. Bradyrhizobium liaoningense sp. nov.
isolated from the root nodules of soybeans. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 706-711.
Yadav, N. K., and S. R. Vyas. 1971. Response of root nodule bacteria to saline, alkaline and
acid conditions. Indian J. Agric. Sc. 41, 875-881.
Yadav, N. K., and S. R. Vyas. 1973. Salt and pH tolerance of rhizobia. Folia Microbiologica
18, 242-247.
Yanagi, M., and K. Yamasato. 1993. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and
related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequence. FEMS
Microbiol. Lett. 107, 115-120.
Yao, Z. Y., F. L. Kan, E. T. Wang, G. H. Wei, and W. X. Che. 2002. Characterization of
rhizobia that nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of
Bradyrhizobium yuanmingense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 52, 2219-2230.
Young, J. M. 2004. Renaming of Agrobacterium larrymoorei Bouzar and Jones 2001 as
Rhizobium larrymoorei (Bouzar & Jones, 2001) comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54,
149.
Young, J. M., L. D. Kuykendall, E. Martinez-Romero, A. Kerr, and H. Sawada. 2003.
Classification and nomenclature of Agrobacterium and Rhizobium - a reply to Farrand et al.
(2003). Int J Syst Evol Microbiol. 53, 1689-1695
Young, J. M., L. D. Kuykendall, E. Martinez-Romero, A. Kerr, and H. Sawada. 2001. A
revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the
inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie
et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R.
undicolaand R. vitis . Int. J. Syst. Bacteriol. 51, 89-103.
Young, J. P. W. 1985. Rhizobium population genetics: enzyme polymorphism in isolates
from peas, clover, beans, and lucerne grown at the same site. J. Gen. Microbiol. 131, 23992408.
Young, J. P. W., and K. E. Haukka. 1996. Diversity and phylogeny of rhizobia. New
Phytol. 133, 87-94.
Young, J. P. W., H. L. Downer, and B. D. Eardly. 1991. Phylogeny of the phototrophic
Rhizobium strain BTAi1 by polymerase chain reaction based sequencing of a 16S rRNA gene
segment. J. Bact. 173, 2271- 2277.
Younis, M. 2002. Nodulation and Nitrogen fixation by Lupinus varius L. a wild type of
lupine grown in the southern part of the eastern desert of Egypt under different water regimes.
Online J. Biol. Sc. 9, 596-600.
.189
Zablotowicz, R. M. and D. D. Focht. 1981. Physiological characteristics of cowpea rhizobia

evaluation of symbiotic efficiency in Vigna unguiculata. Appl. Environ. Microbiol. 41, 679685.
Zahran, H. H. 1991. Conditions for successful Rhizobium-legume symbiosis in saline
environments. Biol. Fertil. Soils. 12, 73-80.
Zahran, H. H. 1999. Rhizobium-Legume Symbiosis and Nitrogen Fixation under Severe
Conditions and in an Arid Climate. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 968-989.
Zahran, H. H., L. A. Rsnen, K. Karsisto, and K. Lindstrm. 1994. Alteration of
lipopolysaccharide and protein profiles in SDS-Page of rhizobia by osmotic and heat stress.
W. J. Microbiol. Biotechnol. 10, 100-105.
Zerhari K., J. Aurag, B. Khbaya, D. Kharchaf, and A. Filali-Maltouf. 2000. Phenotypic
characteristics of rhizobia isolates nodulating Acacia species in the arid and Saharan regions
of Morocco. Lett. Appl. Microbiol. 30, 351-357.
Zhang, F., and D. L. Smith. 1996. Inoculation of soybean (Glycine max L. Merr.) with
genistein-preincubated Bradyrhizobium japonicum or genistein directly into soil increases
soybean protein and dry matter yield under short season conditions . Plant Soil. 179, 233-241.
Zhang, F., T. C. Charles, B. Pan, and D. L. Smith. 1996. Inhibition of the expression of
Bradyrhizobium japonicum nod genes at low temperatures. Soil Biol. Biochem. 28, 15791583.
Zhang, X., M. Karsisto and K. Lindstrm. 1992. Assessment of the competitiveness of
fast-growing rhizobia infecting Acacia Senegal using antibiotic-resistance and melanin
production as identification markers. W. J. Microbiol. Biotech. 8, 199-205.
Zhang, X.-X., B. Kosier, and U. B. Priefer. 2001. Genetic diversity of indigenous
Rhizobium leguminosarum bv. viciae isolates nodulating two different host plants during soil
restoration with alfalfa. Mol. Ecol. 10, 2297-2305.
Zhang, X.-X., R. Harper, M. Karsisto, and K. Lindstrm. 1991. Diversity of Rhizobium
bacteria isolated from root nodules of leguminous trees. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 104-113.
Zuanazzi, J. A. S., Clergeot, P. H., Quirion, J.-C., Husson, H. P., Kondorosi, A., and
Ratet, P. 1998. Production of Sinorhizobium meliloti nod gene activator and repressor
flavonoids from Medicago sativa roots. Mol. Plant-Microbe Interact. 11, 784794.
ANNEXES
190
.
Annexes
ANNEXE 1
Paramtres climatiques des sites chantillonns
Localit des sites dchantillonnage
Numro de
la station
Altitude
Pluviomtrie
Mnasra
15
500
24 Km de Rabat vers Knitra
50
500
15 Km de souk Larba vers Knitra
30
594
30 Km de Knitra vers Larache
10
500
prs du IAV, Rabat
50
523
entre IAV et la Ceinture verte, Rabat
55
523
prs de la Ceinture verte, Hay Riad, Rabat
60
523
Ceinture verte, Hay Riad, Rabat
65
523
Ourika, Marrakech
800
400
Asni, Marrakech
10
10 Km de Kenitra vers My bousselham
11
50
500
Sidi Yahya du Gharb
12
25
530
67 Km de Rabat vers Larache
13
50
500
87 Km de Rabat vers Larache
14
50
500
75 Km de Larache vers Ttouan
15
40
550
62 Km de Larache vers Ttouan
16
610
1000
1 Km avant le branchement TangerTtouan - Sidi Yamani
17
1000
380
5 Km de bab Taza vers Chefchaouen
18
60
600
8 Km de babTaza vers bab Berred
19
600
600
1 Km de Cherafat vers bab Taza
20
600
600
Dardara
21
60
600
point 154 Km de Rabat Larache
22
55
600
191
.
Annexes
ANNEXE 2
Composition du milieu YEM
Mannitol
: 2,5g
Extrait de levure : 0,35g

K2HPO4, 3H2O : 0,46g
KH2PO4
: 0,12g
MgSO4, 7H2O
: 0,46g
NaCl
: 0,1g
Agar
: 15g
Striliser 121C pendant 20min.
ANNEXE 3
Coloration de gram
1- Dposer une goutte deau sur une lame bien propre
2- Prlever un chantillon de colonie laide dun pique en bois et mlanger avec la
goutte deau, strier et scher par passage rapide sur la flamme dun bec benzne
3- Couvrir le frottis par du violet de gentiane pendant 60 secondes
4- Laver lexcs du colorant avec de leau distille
5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes
6- Laver leau distille pendant 5 secondes
7- Rincer immdiatement le frottis avec le mlange alcool - actone ou avec de lthanol
en inclinant la lame et par goutte goutte jusqu disparition complte de la coloration
violette
8- Laver leau distille pendant 5 secondes
9- Couvrir avec de la fuschine (ou safranine) pendant 60 secondes
10- Laver leau distille pendant 10 secondes et mettre la lame incline sur du papier
absorbant
11- Dposer une goutte dhuile immersion sur le frottis et observer au microscope un
fort grossissement.
Les cellules Gram+ absorbent la couleur du violet de gentiane et demeurent bleues
violettes en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement
rostres.
192
.
Annexes
ANNEXE 4
Composition du milieu TY
Tryptone
: 2,5g
CaCl2
: 0,35g
Extrait de levure : 1,5g

Agar
: 12g
Striliser 121C pendant 20min.
ANNEXE 5
Prparation des solutions du tampon de lyse
- Solution de SDS 10% : dissoudre 2g de SDS dans 16ml H2O sous agitation magntique,
complter 20ml avec du H2O.
- Solution de NaOH 5N : dissoudre 5g de NaOH dans 16ml H2O sous agitation magntique,
complter 20ml avec du H2O.
Prparer une solution de NaOH 0,1N et 0,5% SDS en prlevant 10l de NaOH 5N et 25l de
SDS 10% et complter avec de leau bidistille strile 500l.
Le mlange doit tre chaque fois frachement prpar.
ANNEXE 6
Composition du tampon Tris-EDTA (10 :1)
Prparer des solutions de 1M Tris (pH 8,0) et 0,5M EDTA.
Pour une solution TE (10 :1), mlanger - 1ml de Tris 1M
-
200l du EDTA 0,5M
988l deau bidistille strile
Striliser 121C pendant 20min. et conserver temprature ambiante.
193
.
Annexes
ANNEXE 7
Composition du tampon de charge
Prparer en mlangeant les composs suivants :
-
0,25% bleu de bromophnol
50% glycrol
50% TE (10 :1)
Conserver -20C.
ANNEXE 8
Composition du tampon Tris Borate EDTA (solution 10x concentre)
Prparer en mlangeant:
- 109g de Tris
- 55,7g dacide borique
- 9,3g du EDTA
Mlanger les diffrents poids dans 1 litre H2O bidistille, Striliser 121C pendant 20min. et
conserver temprature ambiante.
ANNEXE 9
Prparation du Bromure dEthidium (1mg/ml)
Dissoudre 10mg de Br Eth. Dans 10ml deau bidistille. Mettre la prparation dans une
bouteille noire ou envelopper avec du papier aluminium.
Conserver temprature ambiante ou 4C.
Attention : ce produit est trs cancrigne, mettre des gants et un masque avant toute
manipulation en vitant les courants dair car la poudre est trs lgre.
194
.
Annexes
ANNEXE 10
Composition de la solution nutritive sans azote
Solution
Produit
Elment
Quantit (g/l)
CaCl2, 2H2O
Calcium
294,10
KH2, PO4
Phosphore
136,10
MgSO4, 7H2O
Magnsium
194,21
K2SO4
Potassium
87,00
MnSO4, H2O
Manganse
0,338
H3BO3
Bore
0,247
ZnSO4, 7H2O
Zinc
0,288
CuSO4, 5H2O
Cuivre
0,1
CoSO4, 7H2O
Cobalt
0,056
Na2MoO4, 2H2O
Molybdne
0,048
Na2FeEDTA
Fer
6,48
Prendre 5ml de chaque solution 1 5 et les mlanger dans 5 litres deau distille. Le pH doit
tre ajust entre 6,6 et 6,8 avec du NaOH 1N. Complter ensuite le volume jusqu 10 litres.
Pour la solution nutritive azote, ajouter du KNO3 0,05% (w/v) de la solution nutritive
prpare.
ANNEXE 11
Prparation de la solution du BTB
Mlanger 0,5g de BTB dans 100ml dthanol, puis striliser le mlange par filtration.
Conserver cette solution 4C.
Ajoutez 5ml de la solution dans 1 litre de YEM pralablement strilis.
La concentration finale du BTB dans le milieu est de 25ppm.
195
.
Annexes
ANNEXE 12
Mthode de prparation des solutions dantibiotiques et leur mode daction
Antibiotique
Solubilit dans
Stockage
Mode daction
Ttracycline
70% Ethanol
-20C
Inhibe llongation en
bloquant lattachement de
lARNt au ribosome
Spectinomycine
H2O
0 5C
bloquant la translocation
peptidique par lARNt
Streptomycine
H2O
0 5C
Inhibe la synthse des

protines par attachement au
niveau des sous units
ribosomiques 12/30S
Chloramphnicol
Mthanol
Temprature
ambiante
ou 0 5C
bloquant ltape de la
transpeptidation
Kanamycine
H2O
0 5C
Inhibition de la translocation
par attachement au niveau des
sous units ribosomiques
30/70S
Erythromycine
70% Alcool
Temprature
ambiante
Inhibition au niveau de ltape

de transpeptidation
Ampicilline
H2O
0 5C
Inhibition de la synthse de la
paroi bactrienne
Acide nalidixique
0,35 N NaOH
0 5C
Inhibition de la synthse de
lADN par inhibition de la
gyrase
196
.
Annexes
ANNEXE 13
Profil dassimilation de 49 substrats carbons par les souches nodulant le lupin
Control
Glycrol
Erythritol
D-Arabinose
L-Arabinose
Ribose
D-Xylose
L-Xylose
Adonitol
-Methyl Xylose
Galactose
D-Glucose
D-Fructose
D-Mannose
L-Sorbose
Rhamnose
Dulcitol
Inositol
Mannitol
Sorbitol
-Methy D-mannoside
-Methy D-glucoside
N acetyl glucosamine
Amygdaline
Arbutine
Esculine
Salicine
Cellobiose
Maltose
Lactose
Mellibiose
Saccharose
Trehalose
Inuline
Melezitose
D-raffinose
Amidon
Glycogene
Xylitol
-Gentiobiose
D-turanose
D-lyxose
D-tagatose
D-fucose
L-fucose
D-arabinose
L-arabitol
Gluconate
2ceto-gluconate
5ceto-gluconate
MSMC511
MSMC513
MSMC514
MSMC515
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
MSMC516 MSMC517 MSMC518
0
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
197
.
Annexes
MSMC5110 MSMC5111 MSMC5112 MSMC5113 MSMC5114 MSMC5115 MSMC5116 MSMC5119
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
198
.
Annexes
MSMC5123 MSMC5126 MSMC5127 MSMC5133 MSMC5142 MSMC5143 MSMC5150 MSMC5155
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
1
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
1
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
199
.
Annexes
MSMC5156 INRAL15 INRAL16 INRAL17 INRAL21 INRAL23 INRAL29 INRAL211 INRAL212 MSMC532
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
200
.
Annexes
MSMC536 MSMC539 MSMC5319 MSMC5326 MSMC5328 INRAL32 MSMC549 MSMC5416 MSMC5419
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
0
0
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
201
.
Annexes
MSMC547 MSMC541 MSMC5425 INRAL43 INRAL44 MSMC554 MSMC556 INRAL51 INRAL52 INRAL61
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
0
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
1
0
1
1
0
1
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
1
0
1
1
0
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
0
1
1
0
0
0
1
1
1
0
0
1
1
0
1
1
1
202
.
Annexes
ANNEXE 14.
Tolrance des rhizobia nodulant le lupin diffrentes concentrations du NaCl.
L. luteus
Souches
MSMC 511
MSMC 512
MSMC 513
MSMC 514
MSMC 515
MSMC 516
MSMC 517
MSMC 518
MSMC 519
MSMC 5110
MSMC 5111
MSMC 5112
MSMC 5113
MSMC 5114
MSMC 5115
MSMC 5116
MSMC 5117
MSMC 5118
MSMC 5119
MSMC 5120
MSMC 5121
MSMC 5122
MSMC 5123
MSMC 5124
MSMC 5125
MSMC 5126
MSMC 5127
MSMC 5128
MSMC 5129
MSMC 5130
MSMC 5131
MSMC 5132
MSMC 5133
MSMC 5134
MSMC 5135
MSMC 5136
MSMC 5137
MSMC 5138
MSMC 5139
MSMC 5140
MSMC 5141
MSMC 5142
0
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
170
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
340
++
++
++
+
+++
+
+++
+++
++
++
+++
+++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+
+
+++
++
++
++
+++
+
++
+++
+++
+
+++
+++
+++
+++
+++
+++
510
+
+
+
+
+++
+
+++
+++
++
++
+++
+++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+
+
+++
+
+
+
+++
+
+
++
++
+
++
+++
++
+++
+++
+++
NaCl (mM)
680 850 1020 1190 1360 1530 1700
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+++ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++ ++
+
+
+
+
++ ++
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+
+
+++ +
+
+
+
++
+
+
++
+
+
+
+
++
+
++
+
+
+
++
+
+
+
+
+++ :trs bonne croissance ; ++ : bonne croissance ; + : croissance normale ; -: pas de croissance
203
.
Annexes
NaCl (mM)
L. albus
L. luteus
Souches
0
170
340
510
680
MSMC 5143
MSMC 5144
MSMC 5145
MSMC 5146
MSMC 5147
MSMC 5148
MSMC 5149
MSMC 5150
MSMC 5151
MSMC 5152
MSMC 5153
MSMC 5154
MSMC 5155
MSMC 5156
MSMC 5157
MSMC 5158
MSMC 5159
MSMC 5160
INRA L11
INRA L12
INRA L13
INRA L14
INRA L15
INRA L16
INRA L17
INRA L18
INRA L19
850 1020 1190 1360 1530 1700

+++ +++ ++
+
+
+
+++ +++ +++ ++

+
+
+
+
+++ +++ +++ ++

+
+
+
+
+++ +++ ++
+
+
+
+++ +++ +
+
+
+
+++ +++ ++ ++ ++
+
+
+
+
+++ ++
+
+
+++ ++
+
+
+++ ++ ++ ++ ++
+
+
+
+
+++ +
+++ +
+
+++ +
+++ +
+++ +++ +++ ++ ++

+
+
+
+++ ++
+
+++ +++ +++ +

+
+
+++ +++ +++ ++

+
+
+
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++ ++
+++ +++ +++ +++ ++
+++ +++ +++ +++ ++ ++
+++ +++ ++ ++ ++
+++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
+++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++
+++ +++ +++ ++ ++
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
MSMC 521
MSMC 522
INRA L21
INRA L210
INRA L211
INRA L212
INRA L213
INRA L23
INRA L24
INRA L26
INRA L27
INRA L28
INRA L29
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
++
++
+++
+++
+++
++
+++ ++ ++
+
+++ ++ ++
+
+++ +++ ++
+++ +++ +++ +++

+++ ++ ++
+++ +++ ++
++
++
++
++
++
204
.
Annexes
NaCl (mM)
Souches
L. angustifolius
0
MSMC 531
MSMC 532
MSMC 533
MSMC 534
MSMC 535
MSMC 536
MSMC 537
MSMC 538
MSMC 539
MSMC 5310
MSMC 5311
MSMC 5312
MSMC 5313
MSMC 5314
MSMC 5315
MSMC 5316
MSMC 5317
MSMC 5318
MSMC 5319
MSMC 5320
MSMC 5321
MSMC 5322
MSMC 5323
MSMC 5324
MSMC 5325
MSMC 5326
MSMC 5327
MSMC 5328
MSMC 5329
MSMC 5330
MSMC 5331
MSMC 5332
MSMC 5333
MSMC 5334
INRA L31
INRA L32
INRA L33
INRA L34
INRA L35
INRA L36
INRA L37
INRA L38
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
170
340
510
680
850 1020 1190 1360 1530 1700
++
+
++
+
++
+
+
++
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+
++
+
+
++
+
+
++
+
++
+
++
+
+
++
+
+
+
+
++
+
++
+
+
++
+
+
++ ++ ++
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+
+
+
++ ++
+
+
+
++ ++
+
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
++
+
+
+
++
+
+
++
+
+
+
+
++ ++
+
+
+
++ ++
+
+
+
++ ++ ++
+
+
++ ++
+++ +++ +++ ++
+++ ++
+++ +++ +++ +++ ++

+++ ++ ++
+++ +++ +++ +++ +++

+++ ++
++
-
++
++
-
+
+
+
++
++
-
++
-
205
.
Annexes
L. atlanticus
L. pilosus
L. cosentinii
Souches
NaCl (mM)
MSMC 541
MSMC 542
MSMC 543
MSMC 544
MSMC 545
MSMC 546
MSMC 547
MSMC 548
MSMC 549
MSMC 5410
MSMC 5411
MSMC 5412
MSMC 5413
MSMC 5414
MSMC 5415
MSMC 5416
MSMC 5417
MSMC 5418
MSMC 5419
MSMC 5420
MSMC 5421
MSMC 5422
MSMC 5423
MSMC 5424
MSMC 5425
INRA L41
INRA L42
INRA L43
INRA L44
0
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
170
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
++
+
+
+++
++
+++
++
++
++
+++
340
++
+
+
++
++
++
+
+
++
++
++
++
+
++
+++
+++
+++
++
++
+
+
+++
+
++
++
++
++
MSMC 551
MSMC 552
MSMC 553
MSMC 554
MSMC 555
MSMC 556
MSMC 557
MSMC 558
MSMC 559
MSMC 5510
MSMC 5511
MSMC 5512
INRA L51
INRA L52
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++ +++ ++
+
+
+
+
+++ ++ ++
+
+
+++ ++ ++
+
+
+++ ++ ++
+
+
++
+
+++ +++ ++ ++
+
+++ ++ ++
+++ ++ ++
+++ ++ ++
+
+
+++ ++ ++
+
+++ ++ ++
+
+
+++ +++ +++ +++ +++
-
INRA L61
+++
++
510
+
+
+
++
++
++
+
+
+
+
+
++
+
+
+++
+++
+++
+
+
+
+++
+
+
++
++
-
680
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+++
+++
+
+
+
++
+
+
++
-
850 1020 1190 1360 1530 1700

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++ ++ ++
+++ +++ ++ ++
+
+++ +++ ++ ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Annexes
206
.

1 PDF

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

1 PDF

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

UNIVERSIT MOHAMMED V AGDAL

FACULT DES SCIENCES

Professeur, Facult des Sciences, Rabat

UNIVERSIT MOHAMMED V AGDAL

Mots-clefs : Lupinus rhizobium Biodiversit REP ARDRA

UNIVERSITE MOHAMMED V AGDAL

Professeur, Facult des Sciences, Rabat

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. Etude de la

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2005.

Communications dans les Collogues, Seminaires et Congrs

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2002.

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2002.

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. AND FILALI-MALTOUF A. 2003.

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004. Diversity

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2003. Etude de

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004.

EL HILALI I., BRHADA F., THAMI ALAMI I. ET FILALI-MALTOUF A. 2004.

LISTE DES ABREVIATIONS

LISTE DES FIGURES

Rduction de lazote molculaire et conversion du NH3 en formes dacides 14

Organisation de lopron de lADN ribosomique observ chez les 34

Rsolution taxonomique des diffrentes techniques utilises pour ltude 41

Arbre phylogntique des rhizobiums et des espces apparentes 44

Position gographique des zones de prospection

Extraction de lADN gnomique par la mthode de la lyse alcaline

Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP de quelques souches 69

Dendrogramme rsultant de lanalyse par PCR/REP des souches nodulant 71

Coupe longitudinale de lamas nodulaire

Figure 10 : Electrophorse des amplifiats obtenus par PCR/REP des souches de 76

Figure 17 : Assimilation de diffrents substrats carbons par les souches nodulant le 94

Figure 21 : Tolrance des souches de lupin diffrentes concentrations en NaCl

Figure 22 : Tolrance aux pH des souches nodulant le lupin

Figure 23 : Tolrance des souches nodulant le lupin diffrentes tempratures

Figure 26 : Profils lectrophortiques de la restriction par RFLP de lADNr 16S 138

LISTE DES TABLEAUX

Classification actuelle des diffrentes espces de rhizobia

Liste des diffrents sites gographiques de prlvement

Analyse minrale et granulomtrique des sols collects

Nombre des isolats obtenus partir de chaque espce de lupin et dans 62

Liste des souches slectionnes partir des diffrents clusters dlimits 73

Temps de gnration des souches nodulant le lupin et pH final du milieu 89

Raction des souches nodulant le lupin sur le milieu YEM+BTB

Pourcentage dassimilation de diffrents types de carbohydrates par les 95

Hydrolyse de lure et rduction du nitrate par les souches nodulant le 99

Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin diffrents types 103

Rsistance intrinsque des souches nodulant le lupin aux mtaux lourds

Marge de tolrance des rhizobia nodulant le lupin au NaCl, au pH et la 113

Souches slectionnes pour les inoculations

Rsultats des tests phnotypiques diffrenciant entre les souches 125

Liste des souches de rfrences utilises

Squences des deux amorces utilises pour lamplification de lADNr 135

Tableau indiquant le site de clivage de la squence nuclotidique 137

Groupes de ribotypes des souches de rfrences utilises dtermins par 143

Groupes ribotypes des souches nodulant le lupin dtermins par 144

Groupes de souches nodulant le lupin formant les diffrents clusters 150

LISTE DES ANNEXES

Paramtres climatiques des sites chantillonns

Composition du milieu YEM

Prparation des solutions du tampon de lyse

Composition du tampon de charge

Composition du tampon TBE

Prparation du Bromure dEthidium

Composition de la solution nutritive sans azote