Vectores de Expresin

Los Vectores de Expresin son utilizados para introducir secuencias de ADN en

el interior de bacterias respectivas y amplificar la secuencia deseada,
permitiendo que el ADN exgeno se inserte en su interior, pero conservando su
capacidad de replicacin normal en la clula anfitriona bacteriana o eucariota.
Tipos de Vectores de Expresin:
Vectores Plasmdicos
Los plsmidos son molculas de DNA circulares que existen naturalmente en
las bacterias se suelen utilizar como vectores para la clonacin de fragmentos
de DNA en estos microorganismos. Contienen orgenes de replicacin y por eso
pueden replicarse de manera independiente del cromosoma bacteriano. Los
plsmidos utilizados en forma habitual en clonacin se construyeron a partir de
los plsmidos bacterianos ms grandes que aparecen en la naturaleza, y tienen
mltiples sitios de restriccin, un sitio de origen de la replicacin y marcadores
de seleccin.
El mtodo ms simple para insertar un gen en un plsmido vector es cortar el
DNA extrao (que contiene el gen) y el plsmido con la misma enzima de
restriccin. Si la enzima de restriccin produce cortes escalonados en el DNA,
se generan extremos cohesivos complementarios con el DNA ajeno y en el
plsmido. El DNA y el plsmidos se mezclan juntos; algunos de los fragmentos
de DNA extrao aparecern sus extremos con los del plsmido. Se utiliza el
DNA ligasa para sellar las uniones en el esqueleto de azucares fosfatados, por
lo que se genera un plsmidos recombinante que contiene al fragmento de
DNA ajeno.

Transformacin: Una vez colocado el gen dentro de un plsmido

este debe introducirse en las clulas bacterianas. Esto se realiza
mediante la transformacin, que es la capacidad de las clulas
bacterianas de captar el DNA del ambiente externo. Dentro de la
clula, los plsmidos se replican y se multiplican.
Uso de marcadores de seleccin: Las clulas que portan plsmidos
recombinantes pueden detectarse mediante el empleo de
marcadores de seleccin en el plsmido. Un tipo de marcador de
seleccin utilizado frecuentemente es una copia del gen lacZ.

Vectores Bacterifagos
Los vectores construidos a partir de bacterifago son alrededor de mil
veces ms eficientes de los plsmidos para clonar grandes cantidades de
fragmentos de DNA. Por esta razn, los vectores fago se utilizan
ampliamente para generar genotecas de DNA, colecciones extensas de
fragmentos de DNA que representan el genoma o los expresados de un
organismo. Dos factores dan cuenta de esta mayor eficiencia del fago
como vector de clonacin: la infeccin de las clulas husped por viriones
tiene lugar a una frecuencia alrededor de mil veces superior que la
transformacin por plsmidos, y muchos ms clones que colonias
transformadas.
Un virus que infecta y se replica en bacterias, es un vector ideal para
insertos de ADN de aproximadamente 15 kb de longitud. El fago infecta
bacterias selectivamente y se puede replicar tanto como una ruta ltica
como por una no ltica (lisigenica). El fago contiene una cola
autocomplementaria de cadena sencilla de 12 bases (extremos cohesivos)
en ambos extremos de su molcula de ADN de doble cadena de 50 kb. Tras
la infeccin de la bacteria, los extremos cohesivos (sitios cos) de una misma
molcula de DNA de fago se asocian por complementariedad y la de ADN
ligasa de la clula husped los uno covalentemente.

Vectores Csmidos
Los Csmidos son vectores plasmdicos en los cuales pueden ser clonados
fragmentos ms grandes de DNA. El nombre de csmido deriva de la presencia
de sitios terminales cohesivos internos (cos), que han sido insertados en un
plsmido. Cos son secuencias de nucletidos de bacterifago lambda, entre los
cuales las secuencias de los nucletidos, que entonces pueden ser expresados
y concentrados in vitro.
Las partculas que contienen DNA del csmido son tan infectadas como los
fagos reales pero, una vez dentro de la clula, el csmido no se pueden
dirigir la sntesis de nuevas partculas de fago y, en su lugar, se replica como
un plsmido. Por lo tanto, se obtiene DNA recombinante de colonias, ms que
de placas.
Un csmido puede medir 8kb o menos, de manera que es posible insertar 44kb
de DNA nuevo antes de alcanzar el lmite de empaquetamiento del fago .