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Descripcin Macroscpica y Microscpica de Bacterias

OBJETIVO GENERAL
Conocer tinciones y formas como se describe microscpicamente las bacterias y
macroscpicamente sus colonias.

MARCO TERICO
Aunque los microorganismos puede ser examinados directamente en los microscopios de
luz, con frecuencia deben ser fijados y coloreados para aumentar la visibilidad y el detalle
de sus estructuras. Estas coloraciones o tinciones son tcnicas que permiten observarlos en
funcin de la capacidad de los mismos para retener determinadas sustancias, dependiendo
de naturaleza del colorante y su interaccin con la clula.
Cuando se realizan estos montajes, se parte de lo que se conoce como frotis bacteriano, el
cual tan solo es un extendido de bacterias que se hace a partir de un cultivo sobre una
lmina para as poder ser visto en el microscopio. Su elaboracin permite que las
estructuras internas y externas de la clula se preserven, evitando de este modo que enzimas
y otras reacciones se presenten, impidiendo ver correctamente lo que se est buscando.
Tincin de Gram
Dentro de las tinciones que comnmente se usan en microbiologa, encontramos una
descubierta en 1883 por Christian Gram, denominada Tincin de Gram. Hace parte del
grupo de las Tinciones Selectivas, las cuales se basan en el hecho que los tipos de clulas
tienen distinta composicin qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a un
colorante. Esta tincin permite clasificar las bacterias por las caractersticas de la pared
celular, logrando clasificarlas en dos tipos:
Bacterias Gram positivas: Presentan una pared celular con una capa gruesa de
peptidoglicano y dos clases de cidos tecoicos.

Bacterias Gram negativas: Presentan una pared celular con una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas.

El primer paso de la tincin de Gram debe ser siempre la fijacin de la muestra de bacterias
con calor. Lo que va sucediendo al nivel microscpico cuando se adiciona cada uno de los
colorantes o reactivos es:
Cristal violeta: Tanto las bacterias Gram (+) como las Gram (-) se tien, al entrar este
colorante fcilmente a la clula.
Lugol: Este entra en las clulas y forma un complejo insoluble con el cristal violeta,
complejo que por su tamao ya no puede salir de la clula.
Alcohol acetona: Esta sustancia afecta la pared celular llevando a que los poros de esta
se abran. Este efecto es el que diferencia los dos tipos de bacterias, debido a que las
Gram (-) al tener una pared delgada dejaran salir el complejo anteriormente formado
quedando incolora, mientras las Gram (+) al tener una pared gruesa, por mas que
sufran dao, van a retener el complejo.
Fuscina: Este colorante tie el citoplasma bacteriano de un tono rosado en las Gram (-)
pues al haberse salido el complejo permite que esta nueva sustancia entre y tia. En el
caso de las Gram (+), estas permanecen teidas del tono morado del complejo pues al
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no haber salido este de las clulas no permite que la fuscina entre. Como resultado final
las bacterias Gram (+) se observaran al microscopio de color MORADO y las bacterias
Gram (-) lo harn de color ROSADO (Madigan et al 2004).

Grafica 1. Principio de la Tincin de Gram.

Tincin de Simple
Existen otros tipos de tinciones, entre las que encontramos las denominadas Tinciones
Simples. A diferencia de la Tincin de Gram, en la tincin simple solo puede describir la
forma de las bacterias pues aunque el color resultante en similar al que se podra observar
en una bacteria Gram (+) observara el mismo resultado si tuviera una bacteria Gram (-)
pues no influye la composicin de la pared celular en este caso pues aqu tan solo se aplica
un colorante, el cual fcilmente entra a la clula y la tie.
Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su
entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante.
Ejemplo de estas esta la tincin con azul de metileno o con el cristal violeta.

Formas de las bacterias


Varias son las formas que usted puede encontrar al observa
microscpicamente una bacteria (coco, bacilo, bacilo corto, espirilos,
etc.) y relacionando la terminologa de Cultivo Puro se esperara que si
observa uno de estos, solo encontrar un tipo de forma, el encontrar
otra significara que hay tambin otro tipo de bacteria all por
consiguiente no est puro.
Las colonias bacterianas son la forma macroscpicamente como usted
puede ver un grupo de bacterias en un medio solido, gran variedad de
formas, color, elevaciones y hasta textura se puede observar cuando se
caracteriza esta estructura. A continuacin encontrara una gua grafica
3

para describir las bacterias microscpicamente


macroscpicamente (colonia bacteriana, Grafica 3):

(Grafica

Grafica 2. Principales morfologas microscpicas de las bacterias.


Tomado de Madigan et al. (2004). Brock: Biologa de los Microorganismos. 10 edicin. Pgina 64.

Grafica 3. Principales morfologas macroscpicas (colonia bacteriana).

2)

PROCEDIMIENTO

INSTRUMENTAL BSICO

Portaobjetos (Lminas)
Microscopio.
Asas Redondas.
Mechero.

SOLUCIONES
Cristal violeta
Lugol
Alcohol-acetona
Fuscina de Gram.
Aceite de Inmersin.
Azul de Metileno.
Agua.

Como primera medida lvese las manos y tenga puesto los elementos de proteccin.
Desinfecte el rea de trabajo y finalizado el laboratorio desinfecte de nuevo.
Antes de comenzar a describir microscpicamente las bacterias, dedquese a describir
detalladamente la morfologa de la colonia (Macroscpica). Descrbala segn la forma, tipo
de elevacin y tipo de borde.
Tenga en cuenta que nunca debe abrirse la caja de Petri mas de un tercio y debe trabajar
siempre cerca al mechero.

1. Tincin Simple con Azul de Metileno o Cristal Violeta

Tome una lamina, mrquela en un extremo por debajo con el nombre de la bacteria
que va a teir, la marca debe ser muy pequea para no afectar la visin en el
microscopio. Sobre la lmina coloque una pequea gota de agua.
Caliente el asa redonda en el mechero. Tome la caja de la bacteria escogida, enfre
el asa caliente tocando una parte del medio de cultivo donde no tenga bacteria.
Tome la bacteria raspando suavemente, sin arrancar medio de cultivo.
Mezcle la bacteria con la gota de agua y extindala por toda la lmina. Djela secar
al aire.
Fje la muestra pasando la lamina dos o tres veces por la llama del mechero.

Cubra completamente la muestra con azul de metileno o cristal violeta durante un


minuto.
Lave suavemente con agua y escurra. Deje secar al aire.
Observe la lmina con objetivo de inmersin (100x), no olvide que tiene que usar
una gota de aceite de inmersin sobre la muestra. Dibuje lo observado.

2. Tincin de Gram

Tome una lamina, mrquela en un extremo por debajo con el nombre de la bacteria
que va a teir, la marca debe ser muy pequea para no afectar la visin en el
microscopio. Sobre la lmina coloque una pequea gota de agua.
Caliente el asa redonda en el mechero. Tome la caja de la bacteria escogida, enfre
el asa caliente tocando una parte del medio de cultivo donde no tenga bacteria.
Tome la bacteria raspando suavemente, sin arrancar medio de cultivo.
Mezcle la bacteria con la gota de agua y extindala por toda la lmina. Djela secar
al aire.
Fje la muestra pasando la lamina dos o tres veces por la llama del mechero.
Agregue a continuacin la serie de reactivos. Tenga presente que todos estos son pasos
consecutivos y siempre debe respetar el tiempo que se le indica.
Cubra la lamina con el colorante cristal violeta (colorante primario) durante un
minuto. Lave suavemente con agua y escurra la lamina.
Cubra la lmina con lugol durante un minuto. Lave suavemente con agua y escurra
la lamina.
Cubra la lamina con alcohol acetona (decolorante) durante 30 segundos. Lave
suavemente con agua y escurra la lamina.
Cubra la lamina con fuscina de Gram (colorante de contraste) durante 15 segundos.
Lave suavemente con agua y escurra la lamina.
Observe la lamina con objetivo de inmersin (100x), no olvide que tiene que usar
una gota de aceite de inmersin sobre la muestra. Dibuje lo observado.

BIBLIOGRAFIA

Forbes, B.A., et al. 1998. Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology, 10th ed. C.V. Mosby
Company, St. Louis, MO.
Madigan, M ; Martinko, J & Parker, J. (2004). Brock: Biologa de los Microorganismos.
10 edicin. Prentice Hall. (Pag. 64, 688 - 700).
Murray, P.R., et al. 1995. Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.