BIOTECNOLOGIA

ENGENHARIA GENTICA

Manual de apoio s
Prticas Laboratoriais

2013-2014

Carlos Sinogas
www.ensino.uevora.pt/biotec

www.ensino.uevora.pt/engen

NDICE
PROCEDIMENTOS DE SEGURANA ................................................................................................................................................................. 3
Vesturio e comportamentos ................................................................................................................................................................... 3
Riscos fsicos .................................................................................................................................................................................................... 3
Riscos qumicos .............................................................................................................................................................................................. 4
Riscos biolgicos ............................................................................................................................................................................................ 5
Planeamento .................................................................................................................................................................................................... 5
Procedimentos gerais .................................................................................................................................................................................. 5
REGISTOS E RELATRIOS .................................................................................................................................................................................... 6
TCNICAS LABORATORIAIS BSICAS EM MICROBIOLOGIA ................................................................................................................ 7
Meios de cultura ............................................................................................................................................................................................. 7
Esterilizao .................................................................................................................................................................................................... 8
Tubos de cultura e Placas de Petri ......................................................................................................................................................... 8
Instrumentos para transferncia de culturas ................................................................................................................................... 8
Cmaras de cultura ....................................................................................................................................................................................... 9
Frigorfico ......................................................................................................................................................................................................... 9
MTODOS DE ESTERILIZAO ....................................................................................................................................................................... 10
A. Esterilizao por calor hmido ....................................................................................................................................................... 10
B. Esterilizao por calor seco .............................................................................................................................................................. 11
C. Esterilizao por gases ........................................................................................................................................................................ 11
D. Radiaes .................................................................................................................................................................................................. 11
E. Filtrao estril ...................................................................................................................................................................................... 11
F. Desinfectantes e antisspticos ......................................................................................................................................................... 11
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ..................................................................................................................................................................... 12
1. PIPETAGENS, SOLUES E DILUIES ....................................................................................................................................... 12
2. CULTURA DE BACTRIA RECOMBINANTE (E.coli) ................................................................................................................ 17
3. PREPARAO DE DNA PLASMDICO - Lise Alcalina .............................................................................................................. 18
4. PREPARAO DE DNA PLASMDICO - MiniPrep ..................................................................................................................... 19
5. DIGESTO COM ENZIMAS DE RESTRIO ................................................................................................................................. 20
6. ANLISE DE DNAS EM GEL DE AGAROSE .................................................................................................................................. 21
7. PREPARAO DE BACTRIAS COMPETENTES ........................................................................................................................ 22
8. TRANSFORMAO ................................................................................................................................................................................ 23
9. SELEO DE RECOMBINANTES ...................................................................................................................................................... 24
10. ANLISE DE PROTENA RECOMBINANTE Induo da Expresso ............................................................................. 25
11. ANLISE DE PROTENA RECOMBINANTE PAGE .............................................................................................................. 26
ANEXOS ..................................................................................................................................................................................................................... 28
Plasmdio pSK+ ........................................................................................................................................................................................... 28
Plasmdio pCS11 ......................................................................................................................................................................................... 29
Plasmdio pCS62 ......................................................................................................................................................................................... 30
Plasmdio pCS71 ......................................................................................................................................................................................... 31
Plasmdio pCS84 ......................................................................................................................................................................................... 32
Enzimas de Restrio ................................................................................................................................................................................ 33
Tabela Peridica ......................................................................................................................................................................................... 34
TRABALHO AUTNOMO .................................................................................................................................................................................... 35

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14

PROCEDIMENTOS DE SEGURANA
(Adaptado de Biotechnology Explorations, ASM Press)
Ensinar e aprender no laboratrio de Biotecnologia envolve sempre um certo nvel de risco para o operador e
companheiros. Novos equipamentos, reagentes e materiais biolgicos so parte integrante dos trabalhos
experimentais que envolvem cidos nucleicos e protenas. Os estudantes esto a aprender novas tcnicas, usando
reagentes e materiais biolgicos e novos equipamentos que apresentam algum risco no contexto da sua utilizao
laboratorial. No sendo possvel fazer a experimentao sem usar os equipamentos, os reagentes e o material
biolgico, espera-se dos estudantes que adoptem as atitudes adequadas para minimizao dos riscos associados.
Alerta permanente, um conceito importado dos pilotos de avio, cria o enquadramento para a manuteno da
segurana apropriada face aos riscos inerentes. Tal como o piloto deve estar alerta para a sua envolvente, com
constante vigilncia para a sua segurana e a dos outros, assim os estudantes de biotecnologia devem fazer no
laboratrio. O piloto tem sempre de saber onde est, para onde vai e como l chegar. Traduzido para o ambiente
laboratorial, os estudantes devem estar concentrados nas tarefas que desenvolvem, compreender o equipamento, os
reagentes e os materiais biolgicos que usam, devendo seguir os passos adequados conduo da experincia. Ao
mesmo tempo cada estudante deve conhecer o que os seus colegas fazem e os protocolos que seguem.
Neste enquadramento so quatro as principais questes de segurana que se colocam:

Vesturio e comportamentos
Riscos fsicos
Riscos qumicos
Riscos Biolgicos

Vesturio e comportamentos
Reduzir ao mnimo os pertences pessoais e outros materiais na bancada de trabalho. Casacos, sacos e outros
pertences devero ser depositados no bengaleiro entrada do laboratrio.
Uso de bata obrigatrio (Sempre), para evitar sujar ou contaminar a roupa.
Cabelo, quando comprido, devidamente apanhado para evitar a sua ignio na chama ou a contaminao qumica ou
biolgica.
Sapatos fechados so recomendados, pois os abertos no protegem de eventuais respingos que possam cair.
Proteo dos olhos e pele nua aquando da utilizao de UV
Luvas descartveis so exigveis quando se manipulam certos reagentes ou microrganismos.
desaconselhado o uso de joias, em especial anis e pulseiras que impedem o adequado uso das luvas.
Comer, beber, mascar pastilhas elsticas, aplicar cosmticos proibido no laboratrio, para que eventuais
contaminaes no sejam dirigidas para zonas no protegidas. Roer as unhas, lpis, canetas e dedos na boca
igualmente proibido, pelas mesmas razes.
Os estudantes devem conhecer e compreender bem o trabalho a fazer. Uma boa programao meio caminho para
uma boa execuo. O docente dever ser questionado sempre que surjam dvidas sobre os procedimentos a seguir.
As mos devem ser sempre lavadas antes de iniciar o trabalho e depois de concluda a experimentao, para que
contaminantes no sejam introduzidos nem transportados para fora do laboratrio.
As bancadas de trabalho devem ser sempre limpas e sanitarizadas com lcool antes do incio do trabalho e depois
deste concludo. No se conhece o que outros estudantes possam ter deixado no laboratrio, nem se pretende deixar
contaminaes para quem vier a seguir.

Riscos fsicos
U

Fogo

Identificar a localizao do chuveiro, dos extintores e dos baldes de areia.

Identificar a localizao dos quadros elctricos e da torneira geral do gs.
Aquecer produtos a altas temperaturas pode provocar queimaduras.
As solues aquecidas no micro-ondas, em especial as agaroses, podem ficar sobreaquecidas e entrar em ebulio
explosiva aps agitao, provocando queimaduras graves.

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14


Bicos de gs e lamparinas
Conhecer como se deve acender o bico de gs.
Nunca abandonar um bico ou lamparina acesa. Evitar moviment-los quando acesos.
Flamejar os instrumentos e os tubos com cuidado para evitar formao de aerossis.
No usar material facilmente inflamvel nas proximidades da chama (ateno ao lcool).
Autoclave
Evitar exposio aos vapores da autoclave aquando da sua abertura. Podem provocar queimaduras.
Usar luvas isolantes para remover materiais da autoclave
Vidros partidos e material cortante
Os vidros partidos devero ser removidos com auxlio de pina ou luvas, nunca com as mos desprotegidas.
No colocar vidros partidos no lixo comum.
Se apropriado recolher para descontaminao.
Usar lminas cortantes com auxlio de pinas ou luvas.
Equipamento elctrico e de electroforese
Verificar os cabos elctricos dos equipamentos e nunca usar cabos defeituosos.
Evitar o uso de material elctrico prximo de gua.
Desligar o equipamento (boto OFF) antes de o ligar corrente. Nunca ligar ou desligar um aparelho de electroforese
sem antes cortar a corrente (boto OFF).
Nunca abrir uma tina de electroforese sem antes desligar a corrente elctrica.
Transiluminador de UV
Ao usar o transiluminador de UV, nunca o ligue antes de baixar a tampa protectora.
Desligue a luz antes de levantar a tampa e remover o gel.

Riscos qumicos
Prestar ateno s notas dos protocolos sobre os riscos associados a alguns reagentes e seguir as instrues do
docente.
Nunca pipetar boca. Usar pipetadores mecnicos.
Os restos de produtos qumicos no devem ser rejeitados para o esgoto.
Localizar o chuveiro e o sistema de lavagem de olhos.
A roupa atingida por reagentes qumicos dever ser de imediato removida e a pele em contacto ser abundantemente
lavada.
No remover produtos qumicos do laboratrio.
Alguns reagentes qumicos a usar nas experincias tm associados riscos particulares. O uso de reagentes em soluo
ou pr-misturados reduz o nvel de exposio e o tempo da sua utilizao. A quantidade manipulada tambm
importante. Alguns reagentes com riscos especficos a utilizar nas sesses laboratoriais:
Acrilamida e bis-acrilamida Mutagnico, carcinognico e neurotxico quando inalado ou ingerido. Usar apenas
solues previamente preparadas e com luvas.
Persulfato de amnio Oxidante potente. Manter afastado de materiais combustveis e de fontes de calor.
Clorofrmio Potente solvente orgnico
DTT (Ditiotreitol) - Provoca irritao nos olhos, pele, membranas das mucosas e trato respiratrio.
Etanol Inflamvel.
Brometo de etdio (solues) Mutagnico. Usar luvas.

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SDS (lauril sulfato de sdio) Irritante dos olhos e da pele.
cidos e bases concentrados Corrosivos. Provocam queimaduras ao contacto.

Riscos biolgicos
Desinfectar a rea de trabalho antes e depois de manipular microrganismos.
Usar lixvia diluda (10% de hipoclorito de sdio) para descontaminar reas e instrumentos eventualmente
contaminados.
Evitar as mos na boca ou nos olhos.
Flamejar cuidadosamente instrumentos e tubos para evitar a formao de aerossis.
No remover microrganismos do laboratrio.
Tratar todas as amostras de DNA, plasmdeos e bactrias como material contaminado.
Rejeitar as culturas e outro material contaminado no tabuleiro para autoclavar.
No juntar material no contaminado no tabuleiro para autoclavar.
No rejeitar no lixo comum o que quer que seja que tenha contactado bactrias.
Se bem que os microrganismos a usar na experimentao (E. coli) no coloquem riscos biolgicos particulares deve
ter-se sempre em mente que so criadas condies de crescimento dos mesmos. O risco naturalmente aumenta com a
quantidade de bactrias e outros microrganismos, eventualmente patognicos, podem contaminar as culturas e ser
amplificados.

Planeamento
No iniciar qualquer experincia sem o conveniente planeamento. O conhecimento e compreenso prvios dos
procedimentos experimentais, grelhas adequadas para registo dos resultados e a efetiva disponibilidade de todos os
recursos materiais necessrios constituem elementos importantes para o sucesso das experincias. O tempo
"perdido" num planeamento inicial largamente compensado pelo nvel da aprendizagem conseguido e pela
preveno da necessidade de repetio de experincias eventualmente bloqueadas.

Procedimentos gerais
Todos os procedimentos devero ser efectuados tendo em mente a minimizao dos riscos associados manipulao,
numa perspectiva de proteo do prprio operador e de terceiros. Mais importante que um conjunto de regras a
obedecer a utilizao do bom senso do operador nos trabalhos a realizar.
U

muito importante usar a cabea antes das mos.

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REGISTOS E RELATRIOS
conveniente usar um bloco ou caderno para registo de todas as ocorrncias e dos resultados da experimentao.
Sugere-se o uso de caderno de laboratrio, de preferncia com folhas no amovveis, para que no sejam eliminadas
notas ou registos considerados irrelevantes na altura, como sucede com frequncia quando se passam os
apontamentos "a limpo", mas de grande utilidade para consulta futura na elaborao do relatrio final ou para a
eventual repetio da experincia. O rigor e pormenor dos registos efectuados durante a execuo do trabalho
experimental facilitaro a aprendizagem e a interpretao dos resultados obtidos, em especial quando estes so
inesperados.
Um qualquer relatrio de uma experincia laboratorial dever documentar de forma to completa quanto possvel o
procedimento executado e os resultados obtidos. Para alm disso dever ser tambm objectivo do relator redigir um
documento compreensvel para o leitor e susceptvel de apoiar a eventual repetio da mesma experincia em
idnticas condies. Para a elaborao dos relatrios sugerem-se, como orientao, as seguintes seces:

Ttulo

Identificador do contedo do relatrio

Resumo

Pequeno texto de que constem os objectivos almejados e as concluses

obtidas

Objectivo

Razo de ser do trabalho realizado

Introduo

Dados conhecidos que justificam a realizao da experincia empreendida

Palavras-chave

Termos diretamente relacionados com o trabalho

Material e reagentes

Listagem exaustiva do equipamento, reagentes e outro material usado

Protocolo
experimental

Marcha geral dos procedimentos aplicados. Devero ser relatados os

procedimentos concretos executados, com referncia a eventuais desvios
relativamente ao procedimento recomendado / descrito

Resultados

Registo das observaes efectuadas e dos dados recolhidos

Discusso

Comentrio crtico aos resultados obtidos

Concluso

Descrio do cumprimento ou incumprimento do objectivo, decorrente dos

resultados obtidos

Nota crtica

Comentrio globalidade da experincia, com recomendaes para a sua

repetio ou outras consideradas adequadas

Bibliografia

Referncias consultadas ou utilizadas para a realizao do trabalho

Dependente do tipo do trabalho executado, da forma do relatrio e da sensibilidade do relator,

algumas das seces descritas podero ser fundidas, como "Resultados e discusso" ou "Discusso e
concluses", por exemplo

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TCNICAS LABORATORIAIS BSICAS EM MICROBIOLOGIA

Ao desenvolvimento dos trabalhos em Biotecnologia fundamental recorrer s tcnicas prprias da Microbiologia
para a manipulao, crescimento e manuteno de bactrias e outros hospedeiros de DNAs recombinantes.
Os microrganismos so ubquos. Podem encontrar-se no solo, no ar, na gua, na comida, nos esgotos e nas superfcies
corporais, entre outros locais. Ou seja, existem por todo o lado nossa volta, o nosso ambiente est repleto de
microrganismos. Para estudar qualquer tipo de microrganismo necessrio separar estas populaes mistas, de
forma a manipular no laboratrio as chamadas culturas puras, culturas de uma nica estirpe. Apesar do fornecimento
de estirpes bacterianas puras para a realizao dos trabalhos, as culturas podem vir a ser contaminadas.
Para isolar e estudar os microrganismos em cultura pura, o experimentador necessita de alguns equipamentos
laboratoriais bsicos e da aplicao de tcnicas especficas usando materiais particulares. Nas prticas que
aplicaremos no decurso desta disciplina, ter-se- de recorrer s tcnicas base de microbiologia/bacteriologia com
utilizao dos equipamentos e materiais especficos que se indicam:

Equipamento

Materiais

Autoclave e dispositivos de filtrao estril

Ansas e agulhas. Pipetas e micropipetas
Banhos de gua e estufas
Frigorfico
Fluxo laminar (conveniente)
gua destilada de qualidade
Meios de cultura (bactrias)
Lquido
Semisslido
Slido
Tubos para cultura
Placas de Petri

Meios de cultura
A sobrevivncia e o suporte de vida dos microrganismos dependem do fornecimento adequado de nutrientes e
convenientes condies para o seu crescimento. Quanto aos nutrientes, grande parte dos microrganismos apenas
necessitam de substncia solveis de baixo peso molecular, usualmente originadas pela degradao enzimtica de
outros nutrientes mais complexos. Uma soluo contendo estes nutrientes designada como meio de cultura. Em
geral, os meios de cultura so lquidos, semisslidos ou slidos. Um meio lquido sem agente solidificante designado
por caldo nutritivo. Um caldo nutritivo suplementado com um agente solidificante, usualmente o agar, origina um
meio slido ou semisslido. O agar um extracto de algas marinhas, um carbo-hidrato complexo que contem
maioritariamente galactose e possui muito pouco valor nutritivo. O agar muito adequado como agente solidificante
porque se liquefaz a cerca de 100C e solidifica a 40C. Devido a estas propriedades, os microrganismos, em especial
os patognicos, podem ser cultivados a temperaturas da ordem dos 37C sem receios de liquefaco do meio
solidificado. Um meio de cultura bem solidificado exige uma concentrao de agar da ordem dos 1,5 a 1,8%. Uma
concentrao inferior a 1% resulta num meio semisslido.
Para alm das necessidades nutritivas, vrios outros factores ambientais precisam de ser controlados para o sucesso
da cultura dos microrganismos, como sejam o pH, a temperatura, o ambiente gasoso ou a presso osmtica.

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Esterilizao
A esterilizao um dos pontos-chave para o sucesso do trabalho em microbiologia. Para trabalhar em condies de
esterilidade fundamental o uso de material estril e a aplicao de tcnicas adequadas. A esterilizao processo
pelo qual so eliminadas todas as formas de vida de qualquer meio ou material. As principais tcnicas para a
esterilizao de rotina em laboratrio so as seguintes:

Calor

Filtrao
Produtos qumicos

Calor seco (ar quente)

160C a 180C durante 1/2 hora a 3 horas
Material de vidro em vazio
Calor hmido (vapor)
Circulao de vapor a 100C. Esterilizao intermitente (solues termo-lbeis)
Autoclave. Vapor sob presso, temperaturas acima dos 100C (meios de cultura, solues
termo-estveis)
Membranas filtrantes com poros de 0,05 m a 0.8 m
Remoo de microrganismos de solues termo-lbeis por filtrao
xido de etileno
Material de plstico
Beta-propiolactona
Tecidos vivos, materiais biolgicos

Tubos de cultura e Placas de Petri

Tubos de ensaio em vidro e placas de Petri em vidro e plstico constituem os principais suportes para o
desenvolvimento das culturas de microrganismos. Um meio nutritivo adequado na forma de caldo nutritivo ou de agar
usado em tubos de ensaio, enquanto nas placas de Petri apenas se usa meio slido. Um ambiente estril
preservado nos tubos de cultura por vrios tipos de tampas. Historicamente o rolho de algodo hidrfobo,
desenvolvido por Schroeder e von Dusch no sculo dezanove. Hoje em dia, a maior parte dos laboratrios usam
tampas em forma de manga, em metal ou plstico resistente ao calor. A vantagem destas tampas reside no facto de
no exigirem tanto trabalho na sua preparao e serem mais facilmente removidas e reintroduzidas nos tubos
durante a manipulao. Mantem-se, contudo, a prtica de proteger uma das extremidades das pipetas com rolho de
algodo cardado.
As placas de Petri disponibilizam uma maior superfcie para cultura e crescimento dos microrganismos. So
compostas por uma base circular inferior, onde colocado o meio e por uma tampa do mesmo formato e ligeiramente
maior que se encaixa na base. Existem placas de Petri de vrias dimenses para diferentes exigncias laboratoriais. Na
rotina so usadas placas de cerca de 10 cm de dimetro. O meio nutritivo estril, contendo agar, num volume de 15 a
20 mL vertido nas placas quando ainda quente aps fuso do agar e deixado arrefecer a temperatura inferior a 40C.
Depois de inoculadas com os microrganismos as placas so incubadas em posio invertida para evitar que as gotas de
condensao, formadas na tampa durante o arrefecimento do agar, tombem sobre a superfcie do agar.

Instrumentos para transferncia de culturas

Existe a necessidade de transferir os microrganismos de um meio de cultura para outros, desde culturas de
armazenamento a manuteno para culturas de anlise. o processo de subcultura que tem de necessariamente ser
efectuado com tcnica estril para evitar potenciais contaminaes das subculturas.
As ansas e agulhas, usualmente fabricadas com metais inertes como a platina e inseridas em cabos prprios para a
manipulao, so instrumentos muito durveis de fcil utilizao. So facilmente esterilizveis no momento da sua
utilizao por incinerao chama, numa posio quase vertical at o metal ficar ao rubro. Importar depois deixar
arrefecer entre 10 a 20 segundos, fora da chama, mas na sua proximidade, onde a carga de microrganismos
ambientais viveis inferior. Depois de arrefecidos, para no inativar os microrganismos a transferir, podem ser
usadas para "picar" uma cultura slida ou lquida e inocular outro meio. Uma vez esterilizada, a ansa dever ser de
imediato utilizada antes de ser de novo colocada na bancada.
As pipetas so outros dos instrumentos de transferncia de culturas de uso muito generalizado. So calibradas e
permitem a transferncia de quantidades de culturas lquidas preestabelecidas. So de vidro ou plstico, com uma
extremidade afilada e outra para a aspirao e expulso do lquido que contenham. Podem ser esterilizadas por calor
seco ou hmido, conforme o tipo de material de que so constitudas. Apesar de tradicionalmente serem instrumentos
para "pipetar boca" proibido usar a boca para aspirar microrganismos. Existem auxiliares mecnicos disponveis
para o efeito, como peras de borracha ou corpos de seringa que se adaptam na extremidade larga da pipeta.
As pipetas Pasteur, tubos de vidro no graduados com uma das extremidades afiladas so tambm de uso muito
frequente em trabalhos de microbiologia, tambm pela sua facilidade de esterilizao extempornea.

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Cmaras de cultura
Das condies para crescimento dos microrganismos, uma das mais relevantes a sua temperatura ptima de
crescimento. As estufas so usadas para a manuteno da temperatura ptima dos microrganismos em crescimento
durante o perodo de cultura. So cmaras em que a temperatura ambiente interior controlada por termstato, para
que a mesma seja mantida dentro de limites apropriados para o crescimento celular. Usam em geral um sistema de
circulao de ar aquecido e, para evitar a desidratao dos meios em incubao, devero conter tambm uma fonte de
vapor de gua (um recipiente com gua no seu interior, quando no venham preparadas para o efeito de origem).
Os banhos de gua (banho-maria) com gua a temperatura controlada por termstato constituem outro dos
instrumentos frequentemente empregues para a criao das condies de temperatura ptima de crescimento dos
microrganismos. O ntimo contacto da gua a temperatura controlada com o recipiente onde crescem os
microrganismos apresenta a vantagem de permitir uma mais rpida e eficaz transferncia do calor. Alm disso, os
banhos com agitao facilitam tambm o arejamento das culturas, de grande importncia para o crescimento dos
microrganismos aerbios. A desvantagem do banho de gua reside no facto de s poder ser usado para as culturas em
meio lquido, ao contrrio das estufas de ar, que servem tanto para culturas em meio lquido como em meio slido.

Frigorfico
O frigorfico outra das peas fundamentais em laboratrio de microbiologia. O ambiente de baixa temperatura que
disponibiliza da maior relevncia para a manuteno e armazenamento das culturas celulares em fase de no
crescimento entre os perodos de subcultura e para a conservao dos meios esterilizados e outros reagentes.
Tambm as solues e compostos termo-lbeis tm perodos de conservao mais alargados quando armazenados a
baixas temperaturas.

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MTODOS DE ESTERILIZAO
Esterilizao um processo que elimina todos os organismos vivos que se encontrem superfcie ou no interior de
um material, podendo ser alcanado pela exposio do material a agentes letais fsicos ou qumicos ou, no caso dos
lquidos, pela separao mecnica dos organismos atravs de filtraes. Existem muitas formas de esterilizar
materiais e meios, e a sua escolha depende da natureza dos materiais a serem esterilizados bem como da
disponibilidade de meios de trabalho.
A noo de esterilidade (estril = infecundo) encontra-se frequentemente associada a duas outras: a de assepsia
(ausncia de sepsis = putrefaco) e a de desinfeco (livrar da infeco). Estes significados literais correspondem, de
facto, s noes tcnicas destas terminologias. Em microbiologia referimo-nos a esterilizao quando se pretende
impedir a propagao de microrganismos; a assepsia quando se pretende trabalhar em ambiente desprovido de
microrganismos e a desinfeco quando se aplicam tcnicas destinadas a eliminar microrganismos potencialmente
patognicos para o operador.
Destas noes, a aprofundar no exerccio da experimentao que se desenvolver na disciplina, importa considerar
em particular as tcnicas que se utilizam em microbiologia para a eliminao de microrganismos viveis: a
esterilizao.

A. Esterilizao por calor hmido

O aparelho mais usado para esterilizar materiais e meios de cultura a autoclave, com um princpio de funcionamento
idntico s panelas de presso domsticas. As autoclaves de laboratrio operam normalmente sob uma presso de
1,02 Bar a uma temperatura de 121C. A autoclave esteriliza a maioria dos materiais em 15-30 minutos, sendo a
variao do tempo de esterilizao devida relao superfcie/volume dos materiais a serem esterilizados.
Temperatura
Os endoesporos das bactrias so as formas de vida mais resistentes ao calor, e a sua destruio pode ser conseguida
se for aplicado vapor sobre presso. Uma temperatura de 121C oferece uma boa margem de segurana se for
mantida durante um espao de tempo apropriado.
Humidade
A coagulao do protoplasma bacteriano em temperaturas moderadas requer humidade e h medida que esta
removida a temperatura necessria para haver coagulao aumenta rapidamente. Se o vapor for sobreaquecido ficar
mais "seco" o que ocasiona um aumento da temperatura e do tempo de exposio para a esterilizao, que na situao
extrema de esterilizao em calor seco ser de 170C durante uma hora. Em concluso, vapor excessivamente quente
perde alguma da sua eficcia como agente letal para alm de poder ser lesivo para os materiais a serem tratados.
Presso
A presso, nos valores usados na autoclave, por si s no exerce qualquer efeito na esterilizao, sendo til apenas
para elevar a temperatura do vapor acima dos 100C.
Tempo
O tempo necessrio para que o vapor tenha a oportunidade de penetrar e aquecer os materiais a serem esterilizados.
Mesmo quando as temperaturas de esterilizao so atingidas, os agentes virais ou microbianos no so todos
inativados de uma vez. A velocidade de morte uma constante a uma dada temperatura e por cada unidade de tempo
de exposio ao agente letal, uma proporo que constante para uma dada populao. Normalmente demora 11 a 12
minutos a 121C (calor hmido) para eliminar os endosporos das bactrias termoflicas, os agentes mais resistentes
nas manipulaes do dia-a-dia.
Purga
O ar relativamente frio na cmara de esterilizao muito mais pesado que o vapor temperatura de esterilizao. Se
no for permitida a sada do ar cria-se uma estratificao na autoclave que conduz a uma falta de uniformizao das
temperaturas desenvolvidas. Uma vez que o ar e o vapor so lentos a misturar-se, as diferenas de temperatura entre
camadas pode ser muito grande, por isso a necessidade de se substituir todo o ar por vapor de gua (purga).
Natureza do carregamento
Geralmente, os materiais mais volumosos requerem mais tempo de esterilizao, sendo prefervel esterilizar
pequenos volumes de cada vez ( mais eficaz esterilizar 5 bales de um litro que um balo de cinco litros). Os frascos
devem ser tapados com algodo ou papel. Se for necessrio usar tampas roscadas, estas devem ir pouco apertadas

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para a autoclave de modo a permitirem a sada de ar e entrada de vapor e a no criao de grandes diferenciais de
presso que podem levar ao rebentamento dos frascos na autoclave.

B. Esterilizao por calor seco

O calor seco usado para esterilizar material de vidro, outros materiais slidos termo-estveis e alguns componentes
de meios ou alimentos que ficariam imprprios se expostos ao vapor. Trata-se tambm de um dos mtodos de
esterilizao mais usados e de muito fcil aplicao. O equipamento indispensvel apenas uma estufa de alta
temperatura (160 - 200C). Para alm de ter de ser tida em conta a resistncia trmica dos materiais a esterilizar por
esta tcnica, a outra precauo a considerar prende-se com a minimizao da possibilidade de contaminar esses
materiais depois da esterilizao.

C. Esterilizao por gases

O incremento do uso de material de plstico de utilizao nica como seringas, caixas de Petri, tubos de cultura, filtros,
etc., levou ao desenvolvimento de uma nova forma de esterilizao que usa gases txicos para a eliminao dos
microrganismos de materiais termo-sensveis. A aplicao desta tcnica requer a utilizao de equipamentos prprios
que forcem a circulao do gs txico atravs de todas as superfcies dos materiais, o que a torna de difcil utilizao
em laboratrios de tipo no industrial.
O xido de etileno o gs usado com maior frequncia neste tipo de esterilizaes. Este gs, ao contrrio de muitos
produtos qumicos txicos, pouco corrosivo e no altera os materiais a serem esterilizados, sendo facilmente
removido por arejamento. As suas desvantagens incluem a necessidade de longos perodos de exposio para se obter
a esterilizao (vrias horas), a reatividade com componentes dos meios e certos tipos de plsticos e a necessidade de
equipamentos prprios e disponibilidade do gs.

D. Radiaes
Alguns processos comerciais usam as radiaes para a esterilizao a frio de certos materiais como produtos
farmacuticos, por exemplo. Radiaes ionizantes de alta energia que incluem raios gama produzidos a partir de
cobalto-60 ou csio-139 e de raios catdicos produzidos em geradores e aceleradores de electres so as mais
utilizadas.
A irradiao com luz ultravioleta no uma forma muito satisfatria de esterilizao dada a sua fraca capacidade de
penetrao nos materiais e produtos a esterilizar. , contudo, de utilizao frequente na diminuio do nvel de
contaminao de espaos confinados, como salas estreis ou pequenos ambientes, sendo particularmente teis
tambm para a reduo da infeciosidade viral devido s alteraes induzidas no material gentico das partculas virais
expostas.

E. Filtrao estril
O principal mtodo para a esterilizao de lquidos que contenham componentes termo-sensveis como vitaminas,
protenas e antibiticos, por exemplo, a filtrao. Tradicionalmente os microbiologistas esterilizavam estes produtos
recorrendo a filtros feitos a partir de terra de diatomceas e fibras de asbesto, previamente esterilizados em
autoclave. Presentemente estes filtros foram substitudos por filtros de acetato de celulose ou policarbonatos nos
quais os tipos de poros desenvolvidos permitem filtraes com elevados graus de preciso. Existem atualmente
disponveis no mercado filtros de vrios poros e capacidades filtrantes. Os mais frequentes e, por isso, mais acessveis
so filtros de poros de 0,45 m ou 0,2 m de dimetro, que retm os microrganismos presentes nas solues.
Para esterilizar uma soluo por filtrao, no h mais que passar essa soluo atravs de um destes filtros pela
aplicao de uma presso positiva no lquido a filtrar (filtros de seringa, por exemplo) ou na rarefaco do ar no
contentor que recebe o filtrado. Em qualquer dos casos esta tcnica requer a recolha do filtrado em condies de
assepsia para impedir a contaminao do lquido esterilizado.
Salvo raras excees, a filtrao estril no retm as partculas virais. No podendo ser considerado como mtodo de
"esterilizao de vrus". A filtrao estril mesmo uma tcnica frequentemente usada em virologia para a purificao
de suspenses virais por eliminao de bactrias potencialmente contaminantes.

F. Desinfectantes e antisspticos
Mltiplos reagentes qumicos so diariamente utilizados para controlo da disseminao de microrganismos. Os
produtos usados na "limpeza" de utenslios diversos, frequentemente demasiado txicos para ser usados diretamente
no Homem, so chamados de desinfectantes. Os produtos que aplicamos na pele, com o mesmo objectivo de eliminar
eventuais microrganismos, so antisspticos. Particularmente eficaz e muito til no laboratrio, para eliminao de
vrus e microrganismos a soluo de hipoclorito de sdio (lixvia) com que se tratam os materiais de laboratrio
aps exposio a agentes infecciosos.

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14

11

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
1. PIPETAGENS, SOLUES E DILUIES

Introduo
O rigor nas diluies a efetuar com alguns materiais biolgicos e reagentes, no contexto de vrios dos trabalhos
experimentais que aqui se incluem, crtico e fundamental para o sucesso e para a fiabilidade dos resultados.
Porque se observa com frequncia alguma inabilidade dos estudantes para a manipulao adequada das micropipetas
e para um raciocnio operacional tanto das diluies expressas como potncias de 10 como na forma de preparar
solues tituladas, introduz-se este trabalho preliminar.

Material e reagentes

Soluo concentrada de azul-de-metileno

Soro fisiolgico (salino)
Micropipetas diversas
Tubos de ensaio
Espectrofotmetro

Procedimento (por grupo)
Diluies decimais
1.

Marque 6 tubos de ensaio (de 1 a 6)

2.

A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno proceda, s seguintes diluies sequenciais:

Tubo

Solvente (mL)

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

Corante (mL)

5,0

0,5

Soluo precedente (mL)

0,5

0,5

0,5

0,5

Diluio (10 x )

3.

Completar o preenchimento da tabela acima com as diluies em cada tubo.

4.

Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

5.

Determine a absorvncia das solues a 600-660 nm (ler da mais diluda para a mais concentrada, usando a
mesma cuvete).

6.

Elabore um grfico com os resultados obtidos

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12


Diluies de trs em trs
1.

Marque 9 tubos de ensaio (de 1 a 9)

2.

A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno proceda, s seguintes diluies sequenciais:

Tubo

Solvente (mL)

Corante (mL)

5,0

2,5

Soluo precedente (mL)

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

Diluio (10 x )

3.

Completar o preenchimento da tabela acima com as diluies em cada tubo.

4.

Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

5.

Determine a absorvncia das solues preparadas a 600-660 nm (ler da mais diluda para a mais concentrada,
usando a mesma cuvete).

6.

Elabore um grfico com os resultados obtidos.

TPC
Diluies milesimais
Estabelea o protocolo para a realizao de um exerccio idntico aos anteriores, mas com diluies milesimais.

Diluio nica
A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno como procederia para a preparao de 5 mL de cada uma das
seguintes diluies:
Diluio de 5x10 2
Diluio de 5x10 -2

P

Preparao de solues
Pretendendo-se obter 100 mL de cada uma das solues que se listam, indique as quantidades de produtos a misturar
para a sua preparao no laboratrio:
NaOH 0,1 N
SO 4 H 2 0,1 N
NaCl 0,1 M
NaCl 100 mM
Glicerol 10% (frmula C 3 H 8 O 3 )
Glucose 10% (frmula C 6 H 12 O 6 )
Etanol 70% (frmula C 2 H 6 O 2 )
B

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13


Registo de observaes e Resultados
PIPETAGENS E DILUIES

Operador:

Data:

____/____/____

Diluies decimais

Tubo

Amostra

Concentrao
calculada

DO 600nm / mL
B

Observaes

Diluies de trs em trs

Tubo

Amostra

Concentrao
calculada

DO 600nm / mL
B

Observaes

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14

Grficos

Notas:

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14

15


SOLUES

Operador:

Data:

____/____/____

Componentes

Peso / volume

Diluio

5 X 10 2

Diluio

5 X 10 -2

NaOH 0,1 N
(100 mL)

SO 4 H 2 0,1 N
(100 mL)

NaCl 0,1 M
(100 mL)

NaCl 100 mM
(100 mL)

Glicerol 10%
(100 mL)

Glucose 10%
(100 mL)

Etanol 70%
(100 mL)

Notas:

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16

2. CULTURA DE BACTRIA RECOMBINANTE (E.COLI)

Material e Reagentes

Bactria recombinante

LB 10X:
Bacto-triptona
100 g
Extracto de levedura
50 g
NaCl
100 g
H2O destilada at
1000 mL
pH 7,5.
Autoclavar. Conservar estril a 4C.
Diluir extempornea e esterilmente a 1:10 com gua estril.
Ampicilina 1000X
50 mg/mL em gua.
Esterilizar por filtrao, conservar a 20C

Protocolo Experimental
1.

Preparar 50 mL de meio LB 1X contendo ampicilina (50 g/mL).

2.

Inocular com bactria contendo o plasmdeo a preparar.

3.

Incubar 37C durante uma noite sob agitao.

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17

3. PREPARAO DE DNA PLASMDICO - LISE ALCALINA

Material e Reagentes

Bactria recombinante

LB 1X com ampicilina.
Lisozima (p)
Isopropanol
5 M NaCl
Etanol puro e 70 %
TE pH 8,0
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM EDTA)
Pronase 20 mg/mL em gua
Auto-digerida durante 2 horas a 37C.
Conservar a 20C
Pronase Mix:
Pronase 50 L
10 % SDS 86 l
H2O
860 l
RNAse A 10 mg/mL em:
10 mM Tris-HCl pH 7,5
15 mM NaCl
Incubada por 15 minutos a 100C e
arrefecimento lento. Conservar a 20C

RNAse mix:
RNAse A
40 l
TE pH 8,0
10 mL
Soluo I:
25 mM Tris-HCl pH 8,0
50 mM Glucose
10 mM EDTA
Soluo II:
0,2 N NaOH
1 % SDS
Soluo III:
5 M KOAc
60 mL
Ac.actico glacial
11,5 mL
H2O destilada
28,5 mL
pH 4,8
Fenol:clorofrmio:
Fenol destilado
50 mL
Clorofrmio
50 mL
Alcool isoamlico
1 mL
8-hidroxiquinolena
0,1 g
TE pH 8,0
15 mL
(usar apenas a fase orgnica, de cor amarela, no
agitar)

Protocolo Experimental
1.

Usar 20 mL de cultura saturada de bactria

recombinante.

19. Lavar o precipitado com etanol a 70%.

2.

Centrifugar 4.000 X G durante 15 minutos a 4C.

21. Secar o precipitado.

3.

Lavar o sedimento de bactrias com 5 mL de LB.

22. Dissolver com 500 L de RNAse-mix.

4.

Decantar e escorrer o sobrenadante.

23. Incubar a 37C durante 60 minutos.

5.

Ressuspender o sedimento com 2 mL de Soluo I.

24. Adicionar 100 L de Pronase-mix.

6.

Adicionar 10 mg de lisozima. Misturar.

25. Incubar a 37C durante 30 minutos.

7.

Repousar 10 minutos temperatura ambiente.

8.

Adicionar 4 mL de Soluo II.

26. Extrair 2 vezes com fenol:clorofrmio (igual

volume).

9.

Misturar por inverso.

27. Tomar a fase aquosa, sem interfase.

10. Repousar 10 minutos no gelo.

20. Lavar o precipitado com etanol a 96%.

11. Adicionar 3 mL de Soluo III.

28. Adicionar 0,04 vol. de 5 M NaCl (24 L) e 2 vol. de

etanol puro (1,2 mL).

12. Misturar. Repousar 10 minutos no gelo.

29. Precipitar durante uma noite a 20C.

13. Centrifugar 7.000 X G durante 30 minutos a 4C.

30. Recuperar DNA plasmdico por centrifugao

(7.000 X G durante 30 minutos).

14. Filtrar o sobrenadante por gaze hidrfila.

15. Adicionar 0,6 volumes de isopropanol.
16. Repousar 10 minutos temperatura ambiente.
17. Centrifugar 7.000 X G durante 30 minutos.
18. Decantar.

31. Dissolver com 50 L de TE pH 8,0.

32. Avaliar a concentrao de uma alquota por leitura
da DO a 260 nm
(50 g/mL = 1 UDO)

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18

4. PREPARAO DE DNA PLASMDICO - MINIPREP

Material e Reagentes
(mesmos da tcnica da Lise Alcalina)

Protocolo Experimental
1.

Inocular 5 mL de LB com cada colnia a analisar.

2.

Incubar a 37C durante uma noite com agitao.

3.

Pipetar 2 x 1,5 mL de suspenso para dois microtubos, da mesma cultura

4.

Centrifugar 1 minuto na microcentrfuga. (sobrenadante transparente)

5.

Decantar e escorrer completamente o sobrenadante.

6.

Ressuspender o sedimento do primeiro tubo com 100 L de Soluo I, homogeneizando com a micropipeta

7.

Transferir a suspenso para o segundo tubo e ressuspender o sedimento, homogeneizando com a micropipeta

8.

Adicionar 200 L de Soluo II

9.

Misturar por inverso.

10. Adicionar 150 L de Soluo III

11. Misturar por inverso
12. Agitar fortemente mo para partir DNA cromossomal.
13. Centrifugar 5 minutos na microcentrfuga.
14. Pipetar 400 L de sobrenadante lmpido (sem interface nem precipitado sobrenadante).
15. Adicionar 250 L de isopropanol.
16. Repousar 10 minutos temperatura ambiente.
17. Centrifugar 20 minutos na microcentrfuga.
18. Decantar.
19. Lavar o precipitado com etanol puro.
20. Centrifugar 5 minutos na microcentrfuga, se o sedimento tiver sido descolado do tubo ou no for visvel.
21. Decantar, escorrer e secar.
22. Dissolver com 50 L de RNAse-mix ou TE
23. Incubar a 37C durante 30 minutos.
24. Usar 10 L para digesto com enzima de restrio
25. Conservar remanescente congelado a -20C em tubo devidamente marcado

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19

5. DIGESTO COM ENZIMAS DE RESTRIO

Material e Reagentes

Soluo de DNA a analisar

Enzimas de restrio:
Bam HI (10 U / L)
Eco RI (20 U / L)
Sal I (20 U / L)

Fenol:clorofrmio
Tampo de enzima 10X (do fabricante)
Exemplo de tampo:
1M KOAc
250 mM Tris/Acetato, pH 7,6
100 mM MgOAc
5 mM -Mercaptoetanol
100 g/mL BSA

Protocolo Experimental
1.

Em microtubo, adicionar sequencialmente:

a.

H 2 O estril

b.

Soluo de DNA

1 L

c.

T. enzima 10X

2,5 L (1 X final)

d.

Soluo de enzima

1 L

20,5 L (ad. 25 L final)

(1 g)
(10 Unidades)

2.

Misturar no vortex.

3.

Centrifugar brevemente para levar tudo para o fundo do tubo.

4.

Incubar a 37C durante 1 hora.

5.

Desproteinizar pelo fenol:clorofrmio:

6.

a.

Adicionar 25 L de fenol:clorofrmio.

b.

Misturar bem.

c.

Centrifugar 1 minuto na microcentrfuga.

d.

Pipetar fase aquosa para novo tubo.

Tomar 10 L para anlise em gel.

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20

6. ANLISE DE DNAS EM GEL DE AGAROSE

Material e Reagentes

Soluo de DNA a analisar

DNA marcador: lambda X Bst EII
TBE 10X
890 mM Tris
890 mM cido brico
20 mM EDTA
pH 8,0
Agarose mdia ou baixa EEO (Sigma Tipo II ou V)
Brometo de etdio 10 mg/mL
Dye-DNAs (Indicador de Migrao):
25 % Ficoll 400
0,25 % Orange G

Protocolo Experimental
1.

Preparao do gel
a.

Preparar o molde para o gel (com o pente inserido)

b.

Pesar a agarose necessria para balo apropriado ao volume final (marcar no balo o volume final
pretendido)

c.

Fundir a agarose (0,7%) em cerca de 90 % volume final, com gua destilada

d.

Arrefecer a cerca de 50C.

e.

Adicionar 5 % de TBE 10X (0,5 X final).

f.

Adicionar 0,005 % Brometo de etdio (0,5 g/mL final)

g.

Completar o volume final com gua destilada

h.

Misturar e verter no molde

i.

Deixar solidificar

2.

Colocar o gel no aparelho, apenas submerso em TBE 0,5X.

3.

Aplicar as amostras de DNA contendo 10 a 20% de Dye-DNAs.

4.

Aplicar uma amostra de DNA marcador (0,5 a 1 g)

5.

Proceder separao electrofortica (75 V), at conveniente migrao.

6.

Visualizar no transiluminador sob luz UV (300 a 320 nm).

7.

Observar o gel

8.

Registar as bandas (desenhar)

9.

Fotografar o gel com filtro vermelho de gelatina.

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21

7. PREPARAO DE BACTRIAS COMPETENTES

Material e Reagentes

E. Coli XL1B

LB 10X
Tetraciclina 1000X:
12,5 mg/mL em 50 % etanol. Conservar a 20C.
100 mM CaCl 2 (filtrao estril)
Glicerol 50 % (v/v) (filtrao estril)

Protocolo Experimental
1.

Inocular 10 mL de LB 1X (Tetraciclina opcional) com colnia de E.coli XL1B (ou equivalente).

2.

Incubar a 37C sob forte agitao, durante uma noite.

3.

Usar 2 mL da cultura saturada para inocular 10 mL de LB pr-aquecido a 37C.

4.

Incubar a 37C sob forte agitao at 0,2 UDO a 600 nm (cerca de 2 X 10 7 bactrias/mL) - 2 a 4 horas.
P

5.

Arrefecer os 10 mL da cultura durante 20 minutos, em banho de gelo.

6.

Centrifugar 3.000 X G durante 15 minutos a 4C.

7.

Decantar.

8.

Ressuspender o sedimento de bactrias em 5 mL de 100 mM CaCl 2 .

9.

Repousar 20 minutos no gelo.

10. Centrifugar 3.000 X G durante 10 minutos a 4C.

11. Decantar.
12. Ressuspender o sedimento de bactrias com 2 mL de 100 mM CaCl 2 .
B

13. Adicionar 20% de glicerol a 50% (10% final)

14. Repartir alquotas de 500 L por microtubos
15. Repousar durante 1 hora a 4C
16. Conservar congelado a -80C
17. Testar a eficcia de transformao com 50 L de bactrias competentes1

As bactrias competentes podero ser usadas, sem congelao, imediatamente antes da adio do glicerol.

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22

8. TRANSFORMAO

Material e Reagentes

Bactrias competentes
Soluo de DNAs plasmdico (pDNA)
LB 10X
Ampicilina 1000 X
Placas de Agar/LB/Amp:
Bacto-Agar
7.5 g
LB 10X
50 mL
H 2 O at
500 mL
Autoclavar, Deixar arrefecer a 50C. Adicionar 500 L de Ampicilina 1000X. Repartir de imediato
pelas placas de petri.
B

Protocolo Experimental
1.

Pipetar para um microtubo 5 L de soluo de pDNA.

2.

Pipetar para outro microtubo 5 L de soluo de pDNA diluda a 1:100.

3.

Adicionar 50 L de bactrias competentes a cada tubo.

4.

Homogeneizar no vortex.

5.

Repousar 10 minutos no gelo.

6.

Incubar a 37C durante 5 minutos.

7.

Adicionar 1 mL de meio LB pr-aquecido (sem antibitico).

8.

Incubar a 37C durante 1 hora.

9.

Centrifugar 1 minuto na microcentrfuga (sobrenadante lmpido).

10. Decantar.
11. Ressuspender as bactrias em 200 L de meio LB.
12. Espalhar uniformemente sobre placa de petri com Agar/LB/Amp at secar.
13. Incubar a 37C em estufa durante uma noite.
14. Picar colnias.

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23

9. SELEO DE RECOMBINANTES
Depois de efectuado uma transformao, vrios tipos de bactrias podem surgir na placa de petri. Sendo apenas
interessantes as bactrias transformadas com o DNA pretendido, necessrio eliminar eventuais contaminantes no
relacionados, bactrias no transformadas ou transformadas com outros DNAs

Material e Reagentes

Placas de petri com colnias transformadas isoladas

Tubos de ensaio com 5 mL de LB/Amp
Palitos esterilizados

Protocolo Experimental
1.

Identificar uma dzia de colnias na placa com as bactrias transformadas

2.

Marcar os tubos de ensaio para identificao das bactrias a analisar

3.

Picar cada colnia individualmente com um palito (No remover a totalidade da colnia)

4.

Mergulhar o palito no respectivo tubo de ensaio

5.

Incubar a 37C em estufa durante uma noite, sob agitao.

6.

Observar a turvao da suspenso bacteriana.

7.

Tomar de cada cultura 1,5 mL para tubo eppendorf

8.

Extrair o DNA plasmdico pela tcnica da MINIPREP

9.

Analisar pelo processo adequado

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14

24

10. ANLISE DE PROTENA RECOMBINANTE INDUO DA EXPRESSO

NB.- A partir de colnia de bactria transformada, que exprima uma protena recombinante, extrair e analisar em gel
de electroforese os perfis proteicos da bactria induzida e no induzida.
O subclone pCS938.15 um sistema de expresso em E.coli que contem a sequncia do gene B646L inserida a jusante
do promotor Lac Z e alinhada com o codo de iniciao ATG. Este sistema induzido com um anlogo da lactose, o IPTG,
sintetiza uma protena com o pesos molecular correspondentes p73 fundida com a enzima Galactosidase (170 KDa).

Material e Reagentes

Bactria recombinante (pCS938.15)

LB/Amp
IPTG 100 mM

Protocolo experimental

1.

Ressuscitar cultura de bactria recombinante em meio de cultura LB/Amp/Agar (slido)

2.

Expandir uma colnia em 10 mL de meio LB/Amp (lquido)

3.

Incubar 37C, sob agitao, durante uma noite

4.

Adicionar 4 mL de LB/AMP pr-aquecido a 2 erlenmeyers esterilizados

5.

Inocular 1 mL de cultura bacteriana a cada erlenmeyer

6.

Adicionar a um dos tubos (INDUZIDO) 50 L de IPTG 100 mM

7.

Incubar as duas culturas a 37C durante 30 minutos, sob agitao

8.

Tomar, de cada cultura, para 2 microtubos, 1 mL de suspenso (4 tubos)

9.

a.

Centrifugar 2 minutos

b.

Decantar e rejeitar sobrenadantes

c.

Congelar -20C um tubo de bactria induzida e outro de bactria no induzida

Ressuspender os sedimentos dos outros tubos com 1,5 mL de salino

a.

Avaliar e registar a DO a 550 nm

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25

11. ANLISE DE PROTENA RECOMBINANTE PAGE

Material e Reagentes

Extractos de bactria recombinante (pCS938.15) com expresso induzida e no induzida

Acrilamida a 50% (esterilizada por filtrao)
Tampo de amostra (2X):
Tris 125 mM pH 6.8
Bisacrilamida a 1,25%
SDS 4%
Tris 1,5M pH 8.8
Glicerol 20%
Tris 1,5M pH 6.8
BME 10%
SDS 10%
Azul de bromofenol 0,2%
TEMED 10%
Soluo de colorao:
Persulfato de amnio 10% (extemporneo)
Azul de Coomassie 0,2%
Tampo Laemmli 10X:
Metanol 50%
Tris 250 mM
cido actico glacial 10%
Glicina 1,92 M
Soluo de diferenciao
SDS 1%
Metanol 10%
pH 8.3
cido actico glacial 10%
Tampo de elctrodos:

T. Laemmli 1X

Protocolo Experimental
Preparao do gel
1.

Montar o molde para o gel

2.

Preparar gel de separao (em erlenmeyer):

a.

Acrilamida 50%

b.

Bisacrilamida 1,25%

6 mL

c.

Tris 1,5M pH 8.8

7,5 mL

d.

SDS 10%

300 L

e.

H2O

f.

TEMED 10%

150 L

g.

Persulfato de amnio a 10%

150 L

4,5 mL

11,4 mL

3.

Homogeneizar sem introduzir muito ar

4.

Verter no molde

5.

Adicionar pequeno volume de gua na superfcie do gel (sem misturar)

6.

Deixar polimerizar (20 a 30 min)

7.

Preparar gel de stacking (em erlenmeyer):

a.

Acrilamida 50%

750 L

b.

Bisacrilamida 1,25%

800 L

c.

Tris 1,5M pH 6.8

625 L

d.

SDS 10%

e.

H2O

f.

TEMED 10%

75 L

g.

Persulfato de amnio a 10%

75 L

75 L
5,1 mL

8.

Remover a gua sobrenadante do gel de separao

9.

Colocar o pente

10. Verter o gel de stacking

11. Deixar polimerizar (10 a 20 minutos)

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26


Electroforese
1.

Montar o gel na tina de electroforese

2.

Encher as cmaras dos elctrodos com o tampo de electroforese

3.

Preparar as amostras de protenas:

4.

Medir, para microtubo, 50 L de soluo de protena

5.

Adicionar 50 L de tampo de amostra

6.

Homogeneizar

7.

Incubar em banho de gua fervente durante 10 minutos

8.

Aplicar 50 L de amostra por poo do gel, registando a localizao de cada amostra

9.

Ligar a corrente elctrica (70 volts) at ao indicador de migrao se posicionar no fim do gel (5 horas)

10. Desmontar o sistema recuperando o gel

Colorao das protenas
1.

Mergulhar o gel em abundante soluo de colorao

2.

Corar durante 30 minutos com agitao

3.

Passar o gel para soluo de diferenciao.

4.

Mergulhar em abundante soluo de diferenciao

5.

Diferenciar com agitao at contraste conveniente (mudar soluo quando necessrio)

6.

Observar em transiluminador do visvel

7.

Registar os resultados (desenhar as bandas). Fotografar

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ANEXOS
Plasmdios susceptveis de ser usados nos trabalhos laboratoriais.

Plasmdio pSK+

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Plasmdio pCS11

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29

Plasmdio pCS62

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30

Plasmdio pCS71

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31

Plasmdio pCS84

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Enzimas de Restrio
Caractersticas das enzimas de restrio disponveis para a realizao dos trabalhos laboratoriais.
U

BamH I
Origem: Bacillus amyloliquefaciens H
Reao Enzimtica:
150 mM NaCl
10 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM dithiothreitol
100 g/mL BSA.
pH 7.9
Incubao a 37C.

5 ... G^G A T C C ... 3

3 ... C C T A G^G ... 5

Inativao pelo calor: No

U

Eco RI
Origem: E. coli RY 13
Reao Enzimtica:
50 mM NaCl
100 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
0.025% Triton X-100
pH 7.5
Incubao a 37C

5 ... G^A A T T C ... 3

3 ... C T T A A^G ... 5

Inativao pelo calor: 65C X 20 minutos

U

Sal I
Origem: Streptomyces albus G
Reao Enzimtica:
150 mM NaCl
10 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM dithiothreitol
100 g/mL BSA
pH 7.9
Incubao a 37C.

5 ... G^T C G A C ... 3

3 ... C A G C T^G ... 5

Inativao pelo calor: 65C X 20 minutos

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Tabela Peridica

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TRABALHO AUTNOMO

Cada grupo receber um DNA plasmdico no identificado, em quantidade vestigial

Problema:
Identificar o plasmdeo
Relatar a estratgia adoptada, os procedimentos utilizados e os resultados obtidos

Estratgia sugerida
1.

Preparar bactrias competentes

2.

Transformar com o DNA desconhecido

3.

Selecionar recombinante adequado

4.

Preparar DNA plasmdico em quantidade adequada

5.

Digerir com enzimas de restrio

6.

Analisar fragmentos em gel

7.

Comparar os perfis obtidos com os dos plasmdeos includos neste manual, para identificao.

NOTAS / Registo de resultados

Carlos Sinogas

Biotecnologia / Engenharia Gentica 2013/14

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