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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJAN

EVALUACIN DE LA EFICACIA DE LA
FAGOTIPIA COMO MARCADOR
EPIDEMIOLGICO COMPLEMENTARIO PARA
CEPAS DE SALMONELLA ENTERITIDIS
AISLADAS EN LA CIUDAD DE LUJN

Autor: Ricardo J. Anselmo


Directora: Hebe A. Barrios

2012

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Hebe Alicia Barrios por su apoyo, estmulo y direccin


en el trabajo.
A la Doctora Mara Ins Caffer por su colaboracin en el diseo del
plan de esta tesis y por la identificacin antignica de las cepas de
Salmonella.
A la Doctora Mariana Pichel por la caracterizacin molecular de las
cepas.
A las Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto, Florencia Sparapani y
Susana Ferrarotti por el aporte de cepas de presuntas Salmonella
Enteritidis procedentes de enfermos.
A todos mis compaeros de las asignaturas de Microbiologa
General y Agrcola de la Universidad Nacional de Lujn por los aos de
trabajo compartidos.
Y muy especialmente a Ricardo, que me ha apoyado siempre y por
su ayuda en la toma de muestras.

A todos ellos muchas gracias.

INDICE
Pgina
INTRODUCCIN

1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis

11

1.1. La enfermedad: Salmonelosis

11

1.1.1. Historia

11

1.1.2. Ecologa

14

1.1.3. Salmonelosis humana

15

1.2. Epidemiologa de la salmonelosis

16

1.2.1. Distribucin geogrfica

16

1.2.2. Prevalencia

17

1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en


Argentina

19

1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella

21

1.3.1. Caractersticas generales

21

1.3.2. Aislamiento

22

1.3.3. Caracterizacin fenotpica

23

1.3.3.1. Perfil bioqumico

23

1.3.3.2. Serotipo

25

1.3.3.3. Fagotipia

26

1.3.3.4. Antibiorresistencia

27

1.3.4. Caracterizacin genotpica

28

1.3.4.1. Perfil plasmdico

28

1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica

29

1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin

30

1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado

30

1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa

32

2. Bacterifagos: propiedades generales

33

2.1. Clasificacin de los virus

34

2.2. Estructura de los bacterifagos

35

2.3. Ciclo de vida

37

2.3.1. Ciclo ltico

37

2.3.2. Ciclo lisognico

43

2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis

44

2.5. Evolucin fgica

45

2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis

46

OBJETIVOS

48

MATERIALES Y MTODOS

50

1. Toma de muestras de agua

51

2. Cepas de Salmonella Enteritidis

51

3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes

57

4. Confirmacin

57

5. Criterio de seleccin de bacterifagos

58

6. Purificacin de los bacterifagos

59

7. Determinacin del ttulo del bacterifago

60

8. Conservacin de los cultivos

61

9. Tcnica de fagotipia

61

10. Determinacin de grupos de especificidad entre las


cepas de Salmonella Enteritidis y los fagos hallados

62

11. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis

62

12. Morfologa de los bacterifagos aislados

62

ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO E HISOPO DE MOORE

63

RESULTADOS

65

1. Bacterifagos de procedencia salvaje

66

1.1. Aislamiento de bacterifagos salvajes

66

1.1.1. Cepas de Salmonella Enteritidis

66

1.1.2. Muestras de agua

66

1.1.3. Aislamiento de bacterifagos salvajes

66

1.2. Criterio de eleccin de los bacterifagos salvajes


aislados

66

1.2.1. Primera seleccin

66

1.2.2. Segunda seleccin

75

1.2.3. Tercera seleccin

76

1.2.4. Cuarta seleccin

80

1.2.5. Seleccin final de los bacterifagos salvajes

81

2. Determinacin del ttulo del bacterifago

82

3. Fagotipificacin

83

4. Grupos de especificidad

83

5. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis

94

6. Morfologa de los bacterifagos aislados

95

DISCUSIN

98

CONCLUSIONES

105

BIBLIOGRAFA

107

FOTOGRAFAS

123

NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las
infecciones humanas, Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS)

17

Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella


spp. de origen humano, Argentina, 2000 2006

20

Figura 3. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella


spp. de origen animal, Argentina, 2000 2006

20

Figura 4. Flix d`Herelle. Science News 14:44-59, 1949

33

Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas


vricas, virus desnudos y virus con envoltura

36

Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos

36

Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano

41

Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la


pared celular de E. coli e inyeccin del DNA

42

Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago)

42

Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago)

43

Figura 11. Distribucin de fago tipos de Salmonella Enteritidis


notificados en Suecia , 1997 a 2002

45

Figura 12. Electroforesis en campo pulsado de las cepas


de Salmonella Enteritidis seleccionadas

95

NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella
y subgrupos correspondientes

14

Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas


antignicas

26

Tabla 3. Grupo primero. Datos Epidemiolgicos

53

Tabla 4. Grupo segundo. Datos Epidemiolgicos

54

Tabla 5. Grupo tercero. Datos Epidemiolgicos

54

Tabla 6. Grupo cuarto. Datos Epidemiolgicos

55

Tabla 7. Grupo quinto. Datos Epidemiolgicos

56

Tabla 8. Grupo sexto. Datos Epidemiolgicos

56

Tabla 9. Grupo sptimo. Datos Epidemiolgicos

57

Tabla 10. Primera seleccin de bacterifagos salvajes


con estabilidad ltica

69

Tabla 11. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes:


Grupo A

78

Tabla 12. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes.


Bacterifagos seleccionados

79

Tabla 13. Seleccin final de bacterifagos salvajes

82

Tabla 14. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Primero

84

Tabla 15. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Segundo

86

Tabla 16. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Tercero

87

Tabla 17. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Cuarto

89

Tabla 18. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Quinto

90

Tabla 19. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sexto

91

Tabla 20. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sptimo

92

Tabla 21. Contitucin de los grupos de especificidad

93

INTRODUCCIN

El Ro Lujn nace en la confluencia de los arroyos Durazno y Los Leones en la


localidad de Suipacha, a los 59

37 de long. Oeste y a los 34

43 54 de lat. Sur,

y luego avanza, encauzado en una cuenca, atravesando las zonas de Mercedes,


Lujn, Pilar y Dique Lujn, desaguando en el Ro de la Plata al norte de la localidad
de Tigre. Segn un informe elevado por la Municipalidad de Mercedes, provincia de
Buenos Aires, de un relevamiento de la cuenca del Ro Lujn realizado en 2005 las
causas ms frecuentes de contaminacin del Ro Lujn se deben a: surgencia de
lquidos cloacales y saturacin de pozos negros, microbasurales no autorizados,
efluentes industriales, inundaciones, efluentes cloacales sin tratamiento, proliferacin
de roedores y perros vagabundos (Municipalidad de Mercedes, Informe 2005).

Este trabajo es la continuacin de ocho estudios realizados desde 1987 a 1993


(Anselmo y col., 1989; 1990; 1991a; 1991b; 1991c; 1993; 1995; 1999), donde en total
se aislaron e identificaron bioqumica y antignicamente 95 cepas de Salmonella
Enteritidis. La serotipificacin se realiz en el Servicio Enterobacterias, Departamento
Bacteriologa, del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (I.N.E.I), de la
Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (A.N.L.I.S.) Dr. Carlos
G. Malbrn.

En lo que respecta a la determinacin de salmonelas a partir de aguas del ro


Lujn, se pueden resumir en tres estudios realizados desde 1987 a 1990, el primero
se bas en un anlisis comparativo de tcnicas de deteccin de Salmonella en aguas
superficiales donde se determin la presencia de serovariedades de Salmonella en
aguas del Ro Lujn, en la zona urbana de la ciudad homnima, de la provincia de
Buenos Aires. En el mismo se realiz un estudio comparativo de cuatro mtodos de
deteccin a partir de 200 muestras de dicho ro. Las muestras fueron tomadas a
travs de la tcnica de la torunda de Moore en tres sitios de muestreo: uno en la
planta urbana, otro a 2 Km. aguas arriba de la misma y el ltimo a 2 Km. aguas abajo
de la ciudad. Las torundas se sumergieron en el ro hasta 20 cm de la superficie
durante 60 min, 1 da y 7 das. La mejor combinacin de medios de enriquecimiento y
de aislamiento estuvo dada por el caldo Rappaport-Vassiliadis y agar verde brillante
con 0,25% de desoxicolato de sodio, luego de preenriquecer las muestras en agua
peptona fosfato. As mismo, el mayor rendimiento en lo que respecta al nmero de

10

muestras recuperadas y la frecuencia de aislamientos de Salmonella se logr a los 60


min de exposicin de las torundas en el curso de agua (Anselmo y col., 1989).

El segundo consisti en cuantificar esta enterobacteria en aguas del Ro Lujn


a fin de tener una estimacin del grado de contaminacin del ro mencionado donde
se analizaron 36 muestras de agua desde junio 1989 a mayo 1990, el 75 % de las 36
muestras contenan esta enterobacteria mediante la tcnica del Nmero Ms
Probable; la ms alta incidencia de Salmonella se hall en el sitio de muestreo
localizado en el centro de la ciudad, con 460 NMP/L y se encontraron 19
serovariedades, la ms frecuente fue S. Enteritidis, siguiendo en orden decreciente S.
Anatum, S. Bovismorbificans y S. Lindenburg (Anselmo y col., 1991).

En el tercer trabajo publicado, se determinaron las serovariedades de


Salmonella predominantes en el Ro Lujn durante el perodo febrero de 1988 a
diciembre de 1989 donde se analizaron 690 muestras de agua de tres sitios de
muestreo, las mismas se obtuvieron segn la tcnica de Moore y se aislaron
Salmonella spp. en 434 muestras (62,9 %). La serovariedad predominante fue S.
Anatum, siguiendo en orden decreciente S. Montevideo, S. Newport y S. Bredeney.
Se encontr un nmero de serovariedades que se aslan con muy baja frecuencia y
muy espordicamente en el pas: S. Westhampton, S. Poona y S. Saintpaul (Anselmo
y col., 1999).

1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis

La exposicin del microorganismo Salmonella serotipo Enteritidis se har, en


este trabajo, de forma global con el resto de los serotipos que constituyen el gnero
Salmonella, ya que este serotipo no presenta ninguna excepcin a las caractersticas
generales del gnero al que pertenece.
1.1. La enfermedad: Salmonelosis

1.1.1. Historia

11

Salmonella spp fue observada inicialmente en el ao 1880 por Karl Joseph


Eberth (1835-1926) en cortes histolgicos de muestras de bazo y ndulos linfticos
mesentricos procedentes de personas fallecidas por fiebre tifoidea. Posteriormente,
fue descrita por Daniel Elmer Salmon (1850-1914) y Theobald Smith (1859-1934), en
el ao 1885, a partir de una cepa aislada de cerdo con Peste Porcina Clsica (Salmon
y col., 1886). El bacterilogo francs Joseph Lon Marcel Lignires (1868-1933)
sugiri en 1900 que estas bacterias se llamaran Salmonella, en honor a Salmon.

La clasificacin y consiguiente nomenclatura del gnero Salmonella es an, hoy


en da, muy controvertida, utilizndose distintos sistemas para referirse a los
miembros de este gnero. La terminologa introducida por White en 1929 y modificada
por Kauffmann en 1966, estableca un tipo especfico para cada cepa de Salmonella
que fuera distinguible antignicamente (equivalente al actual serotipo), teniendo en
cuenta el polimorfismo de los antgenos somticos (O) y flagelares (H), atribuyendo en
un inicio a cada tipo el nombre del lugar donde se aisl por primera vez. La propuesta
de Kauffmann implicaba que cada tipo era en realidad una nueva especie. La primera
lista publicada contena unos 20 nombres, hoy el nmero de serotipos sobrepasa
ampliamente los 2000.

Mediante mtodos de hibridacin ADN-ADN se demostr que las cepas de


Salmonella formaban un solo grupo de hibridacin, con 7 subgrupos o subgneros
(Crosa y col., 1973), distinguibles entre s fenotpicamente. Los subgneros
propuestos pertenecan as a una misma especie, que posteriormente recibi el
nombre de Salmonella choleraesuis (Le Minor y col., 1982, 1986). Esta denominacin
sin embargo se prestaba a confusin, debido a la existencia del serotipo Choleraesuis
que adems mostraba un perfil bioqumico distinto al de la mayora. Le Minor y Popoff
en en ao 1987 propusieron que los 7 subgneros (I, II, IIIa, IIIb, IV, V y VI) definidos
12

anteriormente, fueran considerados subespecies. Recomendaron adems, el cambio


de nombre de la especie Salmonella choleraesuis por el de Salmonella enterica
(publicado por Penner, 1988). La propuesta fue denegada por parte de la Comisin
Judicial del Comit Internacional de Bacteriologa Sistemtica, al considerarse que
Salmonella Typhi podra pasar desapercibida. En 1989, Revees y col. elevaron al
rango de especie a la hasta entonces Salmonella choleraesuis subespecie bongori,
pasando a ser as, la segunda especie del gnero (Tabla 1). Euzby, en el ao 1999,
propuso una enmienda para adoptar la nomenclatura de especie enterica que tuviera
en cuenta la excepcin del serotipo Typhi, pasando a denominarse Salmonella typhi.
Al da de hoy, esta propuesta contina pendiente de resolucin.

Aunque contina sin definirse una frmula concreta para la nomenclatura de


Salmonella, la Organizacin Mundial de la Salud adopt la denominacin de
Salmonella enterica y Salmonella bongori como nicas especies del gnero, y la
subsiguiente divisin en subespecies (o subgrupos fenotpicamente distintos) de S.
enterica como: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV)
e indica (VI). Los serotipos o serovariedades, siguiendo el esquema de KauffmannWhite, se escriben al final sin cursiva y con la inicial en mayscula, o bien si carecen
de nombre, aadiendo su frmula antignica.

13

Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella


correspondientes (Crosa y col., 1973, Popoff y col., 2001)

subgrupos

1. Salmonella enterica
1.1 Salmonella enterica subesp. enterica
1.2 Salmonella enterica subesp. salamae
1.3 Salmonella enterica subesp. arizonae
1.4 Salmonella enterica subesp. diarizonae
1.5 Salmonella enterica subesp. houtenae
1.6 Salmonella enterica subesp. indica
2. Salmonella bongori

(subgrupo I)
(subgrupo II)
(subgrupo IIIa)
(subgrupo IIIb)
(subgrupo IV)
(subgrupo VI)
(subgrupo V)

*International Journal of Systematic and Evolutionari Microbiology


1.1.2. Ecologa

El principal hbitat de Salmonella es el tracto intestinal de humanos y animales


homeotermos y poiquilotermos (puede formar parte de la flora natural de reptiles y
anfibios). Existen serotipos adaptados al husped como S. Typhi (hombre), S. Abortus
ovis

(oveja) o S. Gallinarum (aves), entre otros, aunque la mayora son ubiquitarios.

Los principales reservorios son los animales de abasto (tanto de carne roja como
aves), y en menor medida las aves silvestres, roedores, insectos, peces, moluscos,
tortugas y otros. En general, todo alimento es susceptible de ser contaminado por
efluentes fecales. Salmonella se disemina en el medio natural a travs de excreciones
humanas y animales, sin multiplicarse de forma significativa, aunque puede sobrevivir
durante semanas en agua y durante aos en suelo en condiciones favorables de
temperatura, humedad y pH (Acha y col., 2001, Betancor y col., 2010, Janda y col.,
2006).

El gnero Salmonella es uno de los principales causantes de enfermedades


transmitidas a travs de agua y alimentos. Es comn encontrar Salmonella en aves de
corral, en la cscara de huevos crudos, y en carne roja. En concreto, el problema que
supone la presencia de Salmonella en las aves de corral y en las cscaras de huevo
se atribuye bsicamente a las prcticas utilizadas en este tipo de explotaciones.
Salmonella es adems un posible contaminante en operaciones de transporte de
animales de abasto, y consecuentemente de la carne durante el sacrificio.
14

Uno de los serotipos de Salmonella ms importantes transmitidos a travs del


agua es Salmonella Typhi, aunque con frecuencia son salmonelas no tifoideas,
productoras de procesos patolgicos menos graves, las responsables de los brotes
epidmicos por esta va de transmisin (Madigan y col., 1996). El tratamiento del agua
destinada al consumo pblico ha disminuido la incidencia de Salmonella en todo el
mundo. As, los brotes epidmicos estn a menudo relacionados con fallas en la
depuracin, por contaminacin cruzada entre tuberas de la red y aguas residuales,
inundaciones, efluentes de industrias crnicas o explotaciones ganaderas.

1.1.3. Salmonelosis humana

La salmonelosis puede presentar variedad de cuadros clnicos en funcin del


serotipo implicado en el proceso y de la especificidad de husped (Pier y col., 1998),
entre ellos cuadros de gastroenteritis, fiebre entrica, septicemia, y raramente
encefalitis (Martin y col., 1994). Los nios, ancianos, enfermos y/o personas
inmunodeprimidas son los que presentan las manifestaciones clnicas ms graves. A
ello hay que aadir la existencia de portadores asintomticos. En general, los
serotipos Typhi y Paratyphi A, B y C producen fiebre entrica en humanos (fiebre
tifoidea y paratifoidea, respectivamente); el serotipo Choleraesuis produce septicemia
o infecciones localizadas en cerdo; los serotipos Enteritidis, Typhimurium o Newport
producen gastroenteritis en humanos y animales, frecuentemente agudas pudiendo
variar de leves a fulminantes (Caffer., 2007).

La fiebre entrica o tifoidea, la ms grave de las salmonelosis humanas, cursa


con fiebre, malestar, anorexia, mialgias, cefalea, dolor abdominal y/o diarrea
dependiendo de la magnitud del inculo ingerido. Puede aparecer tambin tos y
epistaxis. Los sntomas se agravan y se presenta fatiga, letargia y desorientacin,
pudiendo aparecer a la semana exantema maculoso o maculopapuloso. Sin
tratamiento la letalidad llega al 10% (Maskalyk, 2003, Parry y col., 2002). En el caso
de las salmonelas no tifoideas, la gastroenteritis, es el ms comn de los cuadros
clnicos. La infeccin sobreviene por la ingestin de alimentos contaminados y es
clnicamente indistinguible de otras gastroenteritis producidas por otros patgenos
gastrointestinales. Aproximadamente 48 h despus de la ingestin se inicia un cuadro
15

de dolor abdominal con vmito y diarrea en cantidad moderada, con sangre, moco y
tenesmo rectal, acompaado de fiebre y/o cefaleas y mialgias. Normalmente se
autolimita al cabo de 4-8 das. Ocasionalmente requiere rehidratacin parental y
hospitalizacin (Abe y col., 2004, Grisaru-Soen y col., 2004).

1.2. Epidemiologa de la salmonelosis

1.2.1. Distribucin geogrfica

La salmonelosis es la toxiinfeccin alimentaria transmitida a travs de


productos y subproductos de origen animal ms importante en los pases
desarrollados. Su seguimiento y control se ha convertido en una cuestin prioritaria de
salud pblica. En Europa se declaran una media de 73 casos por cada 100.000
habitantes, con una variacin de entre 1,8 a 136 casos dependiendo del mtodo
diagnstico, la comunicacin de los datos y los hbitos culinarios de cada pas. Se
estima sin embargo que la cifra real est alrededor de los 450 casos por cada 100.000
habitantes (Berends y col., 1998), causando 3 muertes por cada milln de habitantes.
El CDC en Estados Unidos comunic en 2001 una media de 400 muertes por
salmonelosis al ao (Voetsch y col., 2004).

En el ao 2000, la OMS fund la Global Salm-Surv (WHO-GSS) para reducir el


peso y a la vez, el efecto global que representan las enfermedades de origen
alimentario, mediante la recopilacin de la informacin obtenida en los laboratorios de
referencia de cada pas. Estos datos se analizaron para detallar la distribucin global
de los serotipos de Salmonella en muestras tanto humanas como no humanas.
Cuarenta y siete de los 138 pases pertenecientes a esta organizacin en todo el
mundo enviaron datos del perodo 2000-2002, de un total de casi 300.000 casos de
salmonelosis humanas y poco ms de 65.000 no humanas (Espaa, Francia,
Holanda, Gran Bretaa, e Irlanda fueron algunos de los ausentes a nivel Europeo). En
general, los serotipos ms comunes distribuidos en los 5 continentes son Enteritidis
(63%), Typhimurium (14%) y Newport (2,6%) en muestras de origen humano y
Typhimurium (22,3%), Heidelberg (9,3%) y Enteritidis (8,9%) en las de origen no
humano. Salmonella Typhimurium en muestras humanas es el serotipo ms frecuente
en Oceana, frica y Amrica del Norte, mientras que Enteritidis lo es en Europa,
16

Amrica del Sur y Asia (Galanis y col., 2004). En la Argentina, al igual que en el resto
de Latinoamrica y el Caribe, los serotipos ms frecuentes son Enteritidis (39%) y
Typhimurium (17%) (WHO, 2000-2005).

Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las infecciones humanas


Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS)

Tomado de: (Almeida, 2001)

1.2.2. Prevalencia

La infeccin debida a serovariedades no tficas de Salmonella spp. representa


un problema de salud pblica nacional e internacional, que se ha agudizado con la
apertura econmica y la globalizacin, debido a que el consumo de carne de pollo,
huevos y subproductos se ha incrementado en todo el mundo, existe sustancialmente
un mayor riesgo de infeccin (Le Minor, 1992). Casi todas las canales de aves pueden
estar infectadas; el nmero de microorganismos puede ser bajo en un principio y
aumentar como resultado del manejo. Los huevos se pueden contaminar por
transmisin vertical (transovrica), durante la postura o durante la manipulacin o el
almacenamiento. La infeccin en los seres humanos se adquiere por consumo de

17

pollo, huevo crudo o parcialmente cocido, o alimentos preparados con estos (Lax y
col., 1995).

Un dramtico incremento de la salmonelosis en humanos producida


especficamente por S. Enteritidis, ocurri a finales de la dcada de 1980 y principios
de la dcada de 1990 (Rodrigue

y col., 1990). En 1995 del total de informes

recopilados por los sistemas de vigilancia de los pases miembros de la OMS se


encontr que 76.1% de los aislamientos correspondieron a la S. serovariedad
Enteritidis, Typhimurium, y Typhi. S. Enteritidis fue ms frecuente en 35 pases
seguido por S. Typhi (12 pases) y S. Typhimurium (8 pases). Las principales
serovariedades aisladas globalmente para 1995 incluyeron Enteritidis, Typhimurium,
Hadar, Infantis, Newport, Typhi, Agona, Virchow y Heidelberg. Los aislamientos de S.
Enteritidis se aumentaron de 25.6% en 1990 a 36.5% para el ao de 1995 (Herikstad
y col., 2002). En Mxico, en un estudio retrospectivo, se identificaron 199
serovariedades, fue la ms frecuente en muestras clnicas S. Enteritidis (20.4%) y, en
segundo lugar, S. Typhimurium (18.3%) (Gutirrez-Cogco y col., 2000).

El incremento de stas y de otras serovariedades es el resultado de una


combinacin de factores que se relacionan con el desarrollo en la industrializacin en
todas las fases de produccin de alimentos en lo que se destacan cambios en las
prcticas de manejo, almacenamiento, distribucin y preparacin. Estas variaciones
han tenido como consecuencia nuevos problemas en la higiene de los alimentos al
originar una fcil diseminacin de Salmonella spp., as como de otros grmenes
patgenos (Acha y Szyfres, 2001).

El aumento del comercio y distribucin de productos de origen avcola


posiblemente han contribuido al incremento de la diseminacin y transmisin de
Salmonella. Los alimentos contaminados con este microorganismo tienen un impacto
directo sobre la salud de las colectividades, no slo debido al patgeno, sino
frecuentemente por la presencia de antimicrobianos que pueden contribuir a la
aparicin de cepas resistentes a estos antimicrobianos (Prat y col., 2001).

En Dinamarca el programa de control de Salmonella en ponedoras comerciales


y pollos parrilleros entre 1996 y 2002 logr reducir la incidencia de Salmonella en
18

humanos y aves. La incidencia de la infeccin en ponedoras comerciales declin de


13.4% en 1998 hasta 2.6% en 2002; para el ao 2003 la incidencia fue 2.3%. Los
estudios de Weneger y col., 2003 estimaron que para el ao 2001 el programa de
control de Salmonella en Dinamarca permiti ahorrar alrededor 25,5 millones de
dlares.

1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en Argentina

En la Argentina, segn el Boletn Epidemiolgico Peridico de 2006, las 5


serovariedades prevalentes, en el perodo 2004-2005 fueron: Salmonella Enteritidis
(36.0%), S. Typhimurium (20.5%), S. Infantis (8.7%), S. Newport (5.3%) y S. Agona
(4.9%); siguiendo la misma tendencia que en los aos 2002-2003, donde S. Enteritidis
(30,3 %) ocup tambin el primer lugar, seguida por S. Typhimurium (12.8%) y S.
Infantis (11.5 %), mientras que se invirti el orden de frecuencia con respecto a S.
Agona (11.3%) y S. Newport (6.5%).

Entre todos los aislamientos analizados, se identificaron 43 serovariedades,


entre las cuales S. Enteritidis (36.0%) fue la ms ampliamente distribuida y se
encontr con mayor frecuencia en la mayora de las jurisdicciones. S. Typhimurium
(20.5%) ocup el primer lugar en Crdoba, fue la segunda serovariedad en Buenos
Aires, Ciudad Autnoma de Buenos Aires, Mendoza, Ro Negro y Santa Fe y se
encontr tambin, en menor frecuencia en otras provincias. Tanto S. Newport como S.
Agona estuvieron distribuidas en el pas, en 12 y 11 jurisdicciones respectivamente.

19

Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen


humano, Argentina, 2000 - 2006

Tomado de: Caffer, 2007

Figura 3. Serovariedades mas frecuentes de Salmonella spp. de origen


animal, Argentina, 2000-2006

Tomado de: Caffer, 2007

20

1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella

1.3.1. Caractersticas generales

El gnero Salmonella se sita dentro de la familia Enterobacteriaceae, Phylum


Proteobacteria. Salmonella es un bacilo acapsular, de 2-4 m de largo por 0,6 m de
ancho, que muestra colonias de entre 2 y 3 mm de dimetro, de color blanco-gris y
textura viscosa, cuando se aslan en placas de agar-sangre durante 24 h a 37C.

Este gnero se caracteriza por tener requerimientos nutricionales muy


sencillos, siguiendo un modelo de fermentacin cido-mixta. La mayora de cepas son
prototrficas, aunque algunas cepas principalmente husped-especficas, necesitan la
adicin en el medio de factores de crecimiento (auxotrficas): uno o ms aminocidos
o vitaminas.

Los miembros del gnero Salmonella, si bien acordes con las caractersticas
que definen la familia a la que pertenecen, se caracterizan por no formar butilenglicol,
producir cido y eventualmente gas a partir de la fermentacin de la glucosa, de
manitol y casi siempre de sorbitol. Tambin por ser ureasa y fenilalanina desaminasa
negativos, aunque positivos para lisina y ornitina descarboxilasas. Son indol negativo
y citrato positivo, y no fermentan ni la sacarosa ni el adonitol. En medio TSI (Triple
Sugar Iron) Salmonella produce normalmente H2S. No crece en medio con cianuro de
potasio y salvo pocas excepciones (S. Gallinarum, S. Pullorum) Salmonella es mvil
por disponer de flagelos pertricos, mostrando la mayora de las cepas variacin
difsica de los antgenos flagelares (Madigan y col., 1996).

La temperatura ptima de crecimiento para Salmonella es de 35 a 37C,


aunque crece dentro de un intervalo de 7 a 54C, y el pH ptimo se sita entre 7-7,5,
pudiendo crecer entre 4,1 y 9. Salmonella crece en alimentos con valores de actividad
de agua del 0,93, aunque el valor ptimo se sita en 0,995. No crece a valores por
debajo de 0,93, aunque el tiempo de supervivencia puede durar meses. Sobrevive a
la refrigeracin, a la congelacin y a ambientes secos. Es sensible a la mayora de

21

desinfectantes y se destruye a altas temperaturas (60C durante 2 3 minutos).


Puede sobrevivir meses fuera de su hospedador.

1.3.2. Aislamiento

El aislamiento de Salmonella se realiza mediante mtodos de cultivo


tradicionales, que consisten en pre-enriquecimiento en medio lquido no selectivo,
enriquecimiento en medios lquidos selectivos y aislamiento sobre medios slidos
selectivos.

Los medios de pre-enriquecimiento, como pueden ser el agua de peptona


tamponada (APT), el caldo universal (UB) o el medio M9 (APS) son necesarios para
muestras con una carga bacteriana presumiblemente baja (portadores tratados,
muestras ambientales, entre otros). La eficacia de estos medios vara dependiendo de
su capacidad tampn (Hoofar y col., 1998). Por otro lado, el uso de estos medios en
muestras fecales no est tan claro, incluso se cree que pueden ser contraproducentes
(Aho, 1992). Hoy, sin embargo el uso de pre-enriquecimiento se propone como
prctica comn en el aislamiento de Salmonella en muestras fecales de cerdo,
aunque su eficacia no est suficientemente probada (Davies y col., 2000, Hoofar y
col., 1998).

El enriquecimiento en medios lquidos selectivos permite, de forma competitiva,


la proliferacin de Salmonella hasta niveles que la hacen detectable en medios
slidos al cabo de aproximadamente 24 h. Ejemplos de caldos enriquecidos son
Rappaprt-Vassiliadis (RV), Caldo selenito o Caldo tetrationato. El caldo RV es
posiblemente el ms utilizado, y hay que tener en cuenta que los caldos selenito y
tetrationato pueden inhibir el crecimiento de algunos serotipos auxotrficos de
Salmonella. La eleccin de uno u otro mtodo en funcin de su mayor eficacia o
sensibilidad, contina siendo hoy tema de estudio (Michael y col., 1999, Nollet y col.,
2001). Tambin se han desarrollado medios semislidos como posible alternativa al
caldo de enriquecimiento, como el medio semislido Rappaport-Vassiliadis modificado
(MSRV), o el medio DIASALM. Ambos medios aprovechan, por un lado, la propiedad
selectiva de RV y, por otro, la motilidad que caracteriza a la mayora de cepas de

22

Salmonella (Davies y col., 2001, Hoofar y col., 2000, Nollet y col., 2001, Voogt y col.,
2001).

Los medios slidos selectivos y/o diferenciales para Salmonella, se basan tanto
en la inhibicin del crecimiento de otras bacterias entricas, como en la discriminacin
visual de las colonias. A menudo se utilizan tanto la produccin de H 2S como la no
fermentacin de lactosa como caractersticas diferenciales para dicha discriminacin
visual. Dentro de este grupo, existe una variedad de medios, con mayor o menor
especificidad para aislar cepas de Salmonella. Podemos destacar los siguientes como
los ms comnmente utilizados: agar MacConkey, xilosa-lisina-desoxicolato (XLD),
xilosa-lisina-tergitol 4 (XLT4), Hektoen-Enteric (HE), Rambach (Ra), SalmonellaShigella (SS), agar verde brillante novobiocina-glicerol-lactosa (NBGL), identificacin
de Salmonella SM-ID (SM), CHROMagar (CAS), ABC mdium, o COMPASS
Salmonella agar, entre otros.

Existen numerosos estudios que comparan la sensibilidad y especificidad de


unos medios con otros. En cualquier caso los mejores resultados se dan, para
cualquier medio, despus del proceso de enriquecimiento (Dusch y col., 1995, Gaillot
y col., 1999, Maddocks y col., 2002, Ruz y col., 1996,).

1.3.3. Caracterizacin fenotpica

Como ya es sabido, el fenotipo es la expresin del genotipo y ello es lo que lo


convierte en un mtodo til para caracterizar las distintas especies de un mismo grupo
de microorganismos. Aunque el desarrollo de la biologa molecular ha abierto nuevas
y mejores posibilidades para la caracterizacin y el posterior estudio de la taxonoma
y epidemiologa bacteriana, los resultados obtenidos con tcnicas de caracterizacin
fenotpica como pueden ser el perfil bioqumico, el serotipo, el fagotipo, o el perfil de
antibiorresistencia, les confieren un valor como herramientas complementarias tiles
para el marcaje epidemiolgico.

1.3.3.1. Perfil bioqumico

23

El perfil bioqumico confirma la identidad de Salmonella frente a otras


enterobacterias que hayan podido ser aisladas, conjuntamente, en los medios
selectivos. La determinacin del perfil bioqumico se establece como tcnica de
identificacin, ya que se trata de una caracterstica distintiva y estable, capaz de
diferenciar a la mayora de gneros del grupo de las enterobacterias (Farmer y col.,
1985). As pues, la determinacin del perfil bioqumico es el paso siguiente al
aislamiento.

Las pruebas bioqumicas tradicionalmente se han llevado a cabo mediante una


serie de medios especficos como son: agar hierro tres azcares, agar citrato de
Simmons, medio SIM (Sulfhdrico-Indol-Movilidad), pruebas de Ureasa, Oxidasa,
Catalasa, Voges-Proskauer, fenilalanina desaminasa, entre otras, para detectar y
visualizar en ellos una serie de resultados clave en la identificacin de Salmonella.

Las tcnicas sistematizadas de identificacin de microorganismos se basan


principalmente en la realizacin simultnea de determinadas pruebas bioqumicas en
formato miniaturizado. As, tenemos por ejemplo procedimientos manuales como el
sistema API (bioMrieux Inc., Durham, NC), con un perodo de identificacin estimado
de 21 horas, y los sistemas automticos de identificacin, como puede ser Vitek
(bioMrieux), con tiempos de identificacin de entre 4 y 18 horas. Estas tcnicas, que
han evolucionado rpidamente desde su aparicin (Stager y col., 1992), han
aumentado la eficacia de la identificacin de los mtodos tradicionales, introduciendo
un mayor nmero de pruebas bioqumicas especficas. As, en el caso de Vitek se
pueden alcanzar porcentajes de entre el 98 y el 99% de identificacin positiva a las 8
horas (OHara y col., 1993, Visser y col., 1992), frente a identificaciones positivas con
un error estimado de ms del 20% en el caso de mtodos tradicionales.

El perfil bioqumico de Salmonella es estable para la mayora de los serotipos


pertenecientes a los 7 subgrupos identificados. El subgrupo I (subespecie enterica)
que engloba aproximadamente al 60% de los serotipos descritos, los cuales
representan prcticamente la totalidad de los aislamientos de muestras clnicas
(Brenner y col., 2000), se caracteriza bioqumicamente por utilizar el citrato como
nica fuente de carbono, y ser argininadihidrolasa, lisina y ornitina positivo. Este
subgrupo consta de al menos 5 excepciones al perfil tpico: los serotipos Typhi,
24

Choleraesuis, Paratyphi A, Gallinarum y Pullorum. Ninguno de estos 5 serotipos es


capaz de utilizar el citrato, con la excepcin del serotipo Choleraesuis, con un 25 % de
cepas positivas. Con respecto a la presencia de enzimas, el serotipo Paratyphi A es
negativo para lisina decarboxilasa. Todos son prcticamente negativos para arginina
dihidrolasa, exceptuando el serotipo Choleraesuis en el que est presente en un 55 %
de los casos. Los serotipos Typhi y Gallinarum son ambos negativos para ornitina
decarboxilasa (Farmer y col., 1985). Se observan, adems, diferencias en el
porcentaje de fermentacin de algunos azcares entre estos serotipos y los del resto
del subgrupo I de Salmonella.

1.3.3.2. Serotipo

El serotipado permite diferenciar cepas del gnero Salmonella mediante la


determinacin de su composicin antignica: antgenos somticos (O), antgenos
flagelares (H), que mayoritariamente constan de 2 fases (H1 y H2), siendo sta una
caracterstica exclusiva del gnero, y para ciertos serotipos, el antgeno capsular (Vi)
(Tabla 2).

La identificacin de los serotipos se basa en el esquema propuesto por


Kauffman y White (Popoff y col., 1997), incluyendo slo los antgenos de superficie de
importancia diagnstica (Le Minor y col., 1984). As, a cada Salmonella se le asigna
una frmula antignica determinada, habindose identificado un total de 2.541
serotipos hasta el ao 2002 (Centers for Disease Control and Prevention, 2004).

La frmula antignica se representa mediante una combinacin de nmeros y


letras. A modo de ejemplo, la frmula antignica de Salmonella Typhimurium es
1,4,5,12:i:1,2. En primer lugar, aparecen los antgenos O separados por comas. En
ocasiones alguno de estos nmeros figura entre corchetes, lo que significa que no
siempre est presente. A continuacin, para aquellos serotipos que lo presentan,
aparece el antgeno capsular, separado de los anteriores tambin por comas. Y,
finalmente separados de los anteriores mediante dos puntos, los antgenos flagelares,
cuyas fases se separan asimismo por dos puntos. La primera fase (H1) se representa
con letras minsculas, aunque los nuevos antgenos descubiertos tienen asignados
valores del tipo: z6, z10, etc. La segunda fase (H2) se represent inicialmente con
25

nmeros arbigos, aunque hoy los nuevos antgenos se representan con letras
(Popoff y col., 2001). Los antgenos flagelares pueden presentarse de forma
monofsica en algunas cepas, de manera que no expresan la segunda fase flagelar y
se representa con el signo -. Existen cepas monofsicas que pueden presentar
ocasionalmente la segunda fase flagelar, opcionalmente en la frmula figura el signo
- bien el antgeno entre corchetes. Aunque el serotipado no es una tcnica
rutinaria en los laboratorios de diagnstico, es una referencia obligada en los estudios
de salmonelosis.

Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas antignicas (CDC, 2004,


Espigares y col., 2002)
Serotipos

Antgenos Somticos y flagelares

H1

Frmula Antignica

H2

S. Paratyphi A

1,2,12

[1,5]

S. I(1) 1,2,12:a:- 1,2,12:a:[1,5]

S. Paratyphi B

1,4,[5],12

1,2

S. I

1,4,[5],12:b:1,2

S. Typhimurium

1,4,[5],12

1,2

S. I

1,4,[5],12:i:1,2

6,7

1,2

S. I

6,7:r:1,2

9,12,[Vi]

S. I

9,12,[Vi]:d:-

S. Enteritidis

1,9,12

g,m

[1,7]

S. I

1,9,12:g,m:- 1,9,12:g,m:[1,7]

S. Pullorum(2)

1,9,12

S. I

1,9,12:-:-

S. Virchow
S. Typhi

(1)

abreviatura de Salmonella enterica subespecie enterica (o subgrupo I)

(2)

serotipo inmvil

1.3.3.3. Fagotipia

Las cepas pertenecientes a un mismo serotipo de Salmonella, pueden


diferenciarse en funcin de sus patrones de sensibilidad, frente a un grupo
seleccionado de bacterifagos. El fagotipo o lisotipo es de gran valor en el estudio
epidemiolgico de Salmonella, ya que existe un alto porcentaje de correlacin entre
fagotipo y origen epidmico. Aunque algunos de los recursos serolgicos pueden
utilizarse para distinguir cepas de serotipos como Typhimurium, las diferencias se
26

evaluarn con mayor precisin mediante el fagotipado (Rabsch y col., 2002),


permitiendo ampliar la informacin necesaria para establecer posibles relaciones
epidemiolgicas.

Los serotipos Typhi, Paratyphi A y B, Typhimurium y Enteritidis han sido los


ms fagotipados desde un inicio. Existen ms de 100 fagotipos distintos de S. Typhi
(Craigie y col., 1938) y se han identificado hasta el momento ms de 300 para S.
Typhimurium (Anderson y col., 1977, Callow, 1959), de los cuales ms de 200 son
fagotipos definitivos (DTs) (Liebana y col., 2002). Se han desarrollado, adems,
esquemas de fagotipado para otros serotipos de importancia clnica: Braenderup
(Sechter y col., 1968), Newport (Petrow y col., 1974), Virchow (Chambers y col., 1987)
o Agona (Tyc, 1990) entre otros.

En general, al igual que el serotipado, la tcnica de fagotipado, no se lleva a


cabo de forma rutinaria en todos los laboratorios, pero se establece como marcador
epidemiolgico complementario al serotipado. De hecho, a raz de la caracterizacin
de la cepa pentarresistente de S. Typhimurium DT104 en el Reino Unido (Low y col.,
1997, Threlfall y col., 1994) y los EEUU (Angulo F, 1997, Glynn y col., 1998), el
fagotipo ha pasado a formar parte de la taxonoma de este serotipo para la mayora
de estudios de caracterizacin de cepas (Briggs y col., 1999, Lan y col., 2003,
Libana y col., 2002, Wray y col., 1998).

1.3.3.4. Antibiorresistencia

La aparicin de antibiorresistencias en Salmonella, y otras bacterias


zoonticas, est ligada al abuso de antibiticos como tratamiento teraputico y
promotor de crecimiento en el ganado (Schroeder y col., 2002, Witte, 1998). Esto ha
producido una inevitable seleccin de cepas resistentes de la flora comensal y
patgena de los animales. Posiblemente por ello, los niveles de antibiorresistencia de
la flora comensal del intestino en humanos se han visto tambin incrementados (van
den Bogaard y col., 2000).

En la adquisicin de resistencias frente a antimicrobianos estn implicados


numerosos mecanismos relacionados con elementos genticos mviles (de
27

transmisin horizontal): plasmidos, transpsones e integrones, jugando estos un papel


importante en la diseminacin (Davies, 1994).

Conocer los niveles de resistencia a antimicrobianos de Salmonella es de


inters tanto sanitario como epidemiolgico. Las tcnicas utilizadas para determinar
antibiorresistencias se clasifican en general, en manuales (mtodos de difusin y
mtodos de dilucin) y semiautomticas/automticas (Ej. MiniAPI, Vitek System o
Walkway System). La mayora de estas tcnicas determinarn si la bacteria es
resistente o sensible frente a la accin de un determinado antimicrobiano, existiendo
adems un valor de sensibilidad intermedio, cuya interpretacin en clnica supondr la
adopcin de distintas actuaciones frente a la infeccin como por ejemplo las dosis a
suministrar. Las pruebas de sensibilidad por mtodos de dilucin adems, permiten
determinar las concentraciones mnimas inhibitorias (CMI), con lo cual se obtiene una
medida in vitro ms precisa de la actividad de un antimicrobiano.

Establecer un perfil de antibiorresistencia es una prctica comn, sencilla,


rpida y accesible para la caracterizacin de cepas de Salmonella en estudios
epidemiolgicos. Un patrn de resistencias similar puede indicar cierta clonalidad,
siempre y cuando las cepas en estudio sean geogrficamente cercanas. Aunque las
resistencias hayan sido transferidas de forma horizontal, se ha demostrado en
Salmonella Typhimurium DT104 la integracin de ciertas antibiorresistencias a nivel
cromosmico (Briggs y col., 1999, Threlfall y col., 1994).

1.3.4. Caracterizacin genotpica

La ingeniera gentica y la biologa molecular nos permiten conocer y estudiar


el genoma de las bacterias para su ordenacin y clasificacin, de acuerdo a un criterio
mucho ms amplio que el obtenido a travs de los mtodos de caracterizacin
fenotpica. Los mtodos de caracterizacin genotpica disponen en general de mayor
poder de discriminacin, reproducibilidad y tipabilidad que los mtodos fenotpicos,
aunque estos ltimos sean de gran inters por su mayor sencillez, rapidez, y en
general, menor costo.

1.3.4.1. Perfil plasmdico


28

Los plsmidos son fragmentos de ADN circular, que pueden replicarse


autnomamente dentro de la bacteria, funcionando como vectores de clonacin y
permitiendo la transmisin horizontal de resistencias o de factores de virulencia, entre
otros.

El perfil plasmdico (nmero y tamao de plsmidos) de un microorganismo


permite su caracterizacin y la deteccin de similitudes y diferencias entre cepas,
pudiendo utilizarse como marcador epidemiolgico.

La mayora de mtodos utilizados para la extraccin de plsmidos son kits


comerciales de purificacin (Gibco BRL, QIAGEN, etc.) basados, mayoritariamente,
en los mtodos descritos por Birnboim y col. en 1979 y Kado y col. en 1981.

Para la caracterizacin, el estudio y la vigilancia epidemiolgica de Salmonella,


la determinacin del perfil plasmdico es casi rutinaria junto a determinados mtodos
fenotpicos y, como mnimo, a algn otro mtodo genotpico de anlisis cromosmico
(Echeita y col., 2001, Gebreyes y col., 2002, Libana y col., 2002, Lindqvist y col.,
2004, Ridley y col., 1998).

1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica

La tcnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) descrita por Kan


y Dozy en 1978, se basa en la deteccin de fragmentos de ADN de distinto peso
molecular, despus de someterlo a un proceso de digestin con una enzima de
restriccin determinada. Dependiendo de si la enzima utilizada es de corte frecuente o
no, obtendremos mayor o menor nmero de fragmentos. Inicialmente se utilizaron
enzimas de restriccin de corte frecuente que proporcionaban patrones de restriccin
electroforticos con un gran nmero de bandas. La tecnologa RFLP se utiliza como
primer paso en los mtodos de hibridacin como el IS200-RFLP (Jeoffreys y col.,
2001) entre otros y se considera variante del mtodo PCR, cuando se aplica a una
secuencia conocida de ADN amplificada, es decir, PCR-RFLP (Allen y col., 2002,
Kisiela y col., 2005, Lauri y col., 2011).

29

1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin

En general, para la caracterizacin de cepas de Salmonella las tcnicas de


hibridacin ms utilizadas son el ribotipado y la deteccin de la secuencia de insercin
IS200. El ribotipado se basa en el estudio del polimorfismo de patrones de restriccin
de genes muy conservados de ARN ribosmico y secuencias asociadas. El ADN se
extrae de la bacteria y se corta, mediante enzimas de restriccin, en fragmentos de
distintos tamaos. Posteriormente se transfieren a una membrana y son detectados
con una sonda de la regin del opern del ADNr (sonda universal). El patrn de
bandas obtenido (ribotipo) variar, en funcin de la cepa en estudio y de las enzimas
utilizadas (De Cesare y col., 2001, Esteban y col., 1993), aumentando as el poder de
discriminacin cuando se utilizan un mayor nmero de enzimas. Esta tcnica, se
estableci a principios de los 90, como una de las ms elegidas para la
caracterizacin genotpica de Salmonella (Fontana y col., 2003, Lagatolla y col., 1996,
Pasquali y col., 2004).

Las secuencias de insercin son elementos repetitivos y conservados de ADN


que se encuentran tanto en bacterias como en clulas eucariotas. La secuencia de
insercin IS200 se encuentra en ms del 90% de los aislamientos del gnero
Salmonella, a excepcin de Salmonella enterica serotipo Agona. Tambin se han
detectado en algunas cepas del gnero Shigella. Al igual que el ribotipado, la
deteccin de la secuencia de insercin IS200 especfica de Salmonella (Gibert y col.,
1990), se basa en la tcnica de hibridacin, en la cual los fragmentos de restriccin se
hibridan con un fragmento de dicha secuencia (Echeita y col., 2001, Sanderson y col.,
1993, Threlfall y col., 1994, Lindqvist y col., 2004, Liu y col., 2003).

1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado

En 1982, Schwartz y Cantor introdujeron el concepto de que molculas de ADN


mayores de 50kb hasta ms all de 10 Mb, podan separarse mediante el uso
alternado de dos campos elctricos (Schwartz y col., 1982, 1984). Hasta ese
momento slo fragmentos de ADN de entre 100 a 200 pares de bases hasta 50kb
eran separados rutinariamente a travs de tcnicas convencionales de electroforesis.
La capacidad de separar fragmentos de pesos distintos en un campo elctrico esttico
30

y continuo, se pierde cuando se trata de separar molculas de gran tamao. Si el


ADN se fuerza a cambiar de direccin durante la electroforesis, fragmentos de
distintos pesos empezarn a separarse entre ellos. Con cada reorientacin del campo
elctrico, los fragmentos de ADN ms pequeos se movern hacia la nueva direccin
ms rpidamente que los fragmentos mayores. Estos se quedarn atrs separndose
de los primeros. Se han descrito distintos modelos que explicaran el comportamiento
del ADN durante la PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis). Entre estos se
encuentran el chain model el bag model (Chu y col., 1991).

La manipulacin del ADN intacto se lleva a cabo mediante la fijacin de todo el


material celular dentro de pequeos bloques de agarosa de bajo punto de fusin. Tras
eliminar los restos celulares, el ADN es digerido por enzimas de restriccin
especficas de corte poco frecuente. La PFGE nos permite analizar un nmero
pequeo de grandes fragmentos frente a un nmero elevado de fragmentos pequeos
con la electroforesis convencional.

Los distintos sistemas utilizados para llevar a cabo la electroforesis en campo


pulsado se pueden clasificar en 2 categoras. La ms sencilla est basada en la
inversin peridica de la polaridad de los electrodos durante la electroforesis, as el
ADN se somete a un ngulo de reorientacin de 180 (Field Inversin Gel
Electrophoresis, FIGE) (Carle, 1986), asegurando la linealidad de los resultados y
simplificando as las comparaciones de los patrones obtenidos. La segunda categora
implica instrumental que reorienta los fragmentos de ADN en ngulos oblicuos (96
hasta 165) resultando en un movimiento en zigzag y hacia delante, produciendo una
separacin ms rpida con un rango mayor de fragmentos en un mismo gel (Birren y
col., 1988). Para asegurar la linealidad de los patrones resultantes, se han diseado
sistemas como el de Contour-clamped Homogeneus ElectricField electrophoresis
(CHEF) (Chu et y col., 1986) o el de Rotating Gel Electrophoresis (RGE) (Serwer y
col., 1990, Southern y col., 1987). El primero utiliza varios electrodos dispuestos
hexagonalmente, con un campo elctrico homogneo y con cambios de direccin del
campo llevados a cabo electrnicamente. En el segundo el campo elctrico est fijado
y se hace rotar el gel para cambiar la direccin del ADN.

31

Esta tcnica fue estandarizada por el CDC (Centers for Disease Control and
Prevention) en el ao 1996, para el programa de vigilancia conocido como PulseNet,
The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance, por
su capacidad en la obtencin de patrones de restriccin, su alta especificidad y
reproducibilidad entre los distintos laboratorios permitiendo caracterizar prcticamente
la totalidad de cepas patgenas estudiadas con gran poder de discriminacin
(Swaminathan y col., 2001). Actualmente, se establece como el mtodo de eleccin
para los estudios epidemiolgicos de patgenos, y entre ellos, de Salmonella
Baggesen y col., 2000, Eriksson y col., 2005, Garaizar y col., 2000, Gerri y col.,
2004, Kariuki y col., 1999, Lailler y col., 2002, Lawson y col., 2004, Lindstedt y col.,
2000, Liu y col., 2003, Ridley y col., 1998, Threlfall y col., 1996).

1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), descrita por Kary B. Mullis en


1983 (Mullis y col., 1987) y perfeccionada por Saiki y col. en 1985 y White y col. en
1989, se basa en el reconocimiento y la amplificacin de una fraccin de ADN in vitro
mediante la accin de una ADN-polimerasa termoestable.

La PCR se utiliza para obtener la suficiente cantidad de ADN para su anlisis,


siendo su aplicacin principal el diagnstico. Sin embargo, la PCR per se, no es til
como marcador molecular, aunque es la base de un nmero cada vez mayor de
tcnicas que, a partir de pequeas cantidades iniciales de ADN, permiten amplificar
secuencias al azar (Random Amplified Polymorphic DNA RAPD, Arbitrarily PrimedPCR AP-PCR, Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP), las ms utilizadas
para la caracterizacin de Salmonella especficas (Simple Sequence Repeats SSR,
Cleaved Amplified Pollymorphic Sequence CAPS).

Entre las PCR de secuencias al azar, el RAPD utiliza oligonucletidos cortos


(10 pb) de secuencias arbitrarias y de baja especificidad, que permiten amplificar
fragmentos pequeos de ADN (Welsh y col., 1990, Williams y col., 1990). La AP-PCR
es esencialmente parecida a la anterior, con la salvedad de que el oligonucletido es
mayor (>20pb), y que combina un ciclo de baja especificidad con ciclos de alta
astringencia. En el caso de la AFLP se utilizan dos enzimas, una de corte frecuente y
32

otra de corte poco frecuente. Los fragmentos obtenidos posteriormente se amplifican


utilizando primers de extremos compatibles con el punto de corte enzimtico
(Janssen y col., 1997). En este caso se utilizan geles de poliacrilamida para la
resolucin de los fragmentos obtenidos.
2. Bacterifagos: propiedades generales
Los bacterifagos fueron descubiertos de forma independiente por los
microbilogos Frederick W. Twort (1915) y Flix dHrelle (1917), siendo la ltima
clase principal de virus en ser descubierta. Los virus de plantas fueron descubiertos
en 1892 por Ivanowski y los animales en 1902 por Loeffler y Frsch. Twort y dHrelle
fueron los primeros en reconocer virus especficos para las bacterias, por lo que
dHrelle los denomin bacterifagos (comedores de bacterias).

The next morning, on opening the, I experienced one of those moments of intense emotion which
reward the research worker for all his pains: at the first glance I saw that the culture which the night
before had been very turbid, was perfectly clear: all the bacteria had vanished, they had dissolved away
like sugar in water. As for the agar spread, it was devoid of all growth and what caused my emotion was
that in a flash I had understood: what caused my clear spots was in fact an invisible microbe, a filterable
virus, but a virus which is parasitic on bacteria.
Figura 4. Flix dHerelle. Science News 14:4459, 1949

33

A partir de la dcada de 1930, virlogos pioneros como Salvador Luria, Max


Delbrck y muchos otros, utilizaron los fagos como modelo para investigar muchos
aspectos de la Virologa; en general como la estructura de los viriones, la
morfognesis, la gentica y la replicacin. Adems los fagos tambin han sido
tomados como modelo para el estudio de la gentica bacteriana y los mecanismos de
control de la expresin gnica, debido a que los huspedes bacterianos son
fcilmente cultivables y manejables en el laboratorio.
En esta poca preantibitica, se prest una notable atencin a su posible uso
como agentes teraputicos, aunque la terapia fgica slo llego a ser usada de forma
habitual en la Unin Sovitica y Europa del Este (Sulakvelidze y col., 2005). En la
actualidad, debido a la aparicin de patgenos multirresistentes a los antibiticos se
estn retomando los estudios sobre fagoterapia clsica iniciados por Flix dHerelle
(Bruttin y Brssow, 2005), aunque tambin se estn desarrollando nuevas
aproximaciones derivadas directamente del estudio de los sistemas virales
(Sulakvelidze y col., 2005).

Se han descrito cerca de 5500 bacterifagos Caudovirales (fagos con cola)


capaces de infectar a una gran diversidad de huspedes bacterianos (Ackermann,
2006). Los bacterifagos constituyen el sistema biolgico ms simple y abundante de
la naturaleza. Desde un punto de vista estrictamente numrico, los fagos son la forma
de vida ms exitosa, se estima que su poblacin global es de aproximadamente 1031
partculas fgicas sobre la Tierra, coexistiendo en relacin 10/1 con las bacterias a las
que infectan. Se han descubierto fagos capaces de infectar a todos los procariotas
descritos hasta el momento y se han adaptado a todos los nichos ecolgicos. Tal
magnitud de fagos ejerce un importante papel ecolgico, regulando, mediante
transferencia gentica, la evolucin de sus hospedadores y afectando, incluso, los
niveles de materia orgnica en la biosfera. (Brssow y Hendrix, 2002, ChibianiChennoufi y col., 2004, Prescott y col., 1996).

2.1. Clasificacin de los virus (Madigan y col., 2009)

Los virus pueden clasificarse en funcin de los hospedadores que


pueden infectar. As, tenemos virus animales, virus vegetales y virus bacterianos o
34

tambin conocidos como bacterifagos, y tambin segn el cido nucleico que


posean y si la cpside presenta o no una envuelta. (Figura 5).

ADN doble cadena, envueltos:


Lipothrixviridae
Rudiviridae
Fuselloviridae
Sulfolobus SNDV
ADN doble cadena, desnudos:
Podoviridae
Tectiviridae
Corticoviridae
Myoviridae
Siphoviridae
ADN monoctenario, desnudos:
Inoviridae
Microviridae
ARN doble cadena, envueltos:
Cystoviridae
ARN monocatenario, desnudos:
Leviviridae

2.2. Estructura de los bacterifagos

El material gentico se encuentra contenido en la cpsida, de morfologa


polidrica en la mayora de los casos, aunque tambin aparecen cpsidas esfricas y
filamentosas. Muchos bacterifagos poseen una morfologa caracterstica, en la que
la cpsida icosadrica se une a una cola filamentosa. La cola de naturaleza proteica,
sirve como orgnulo de anclaje a la superficie de la clula hospedadora (Figura 6).

Durante la infeccin de una clula bacteriana, la partcula vrica no penetra al


interior celular. El bacterifago inyecta el material gentico a travs de las envolturas
externas de la clula bacteriana.

35

Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas vricas, virus desnudos y


virus con envoltura (Ilustracin de Microsoft)

Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos (Ilustracin de Microsoft)


36

2.3. Ciclo de vida (Figura 7)

2.3.1. Ciclo ltico

Una vez que se produce la interaccin entre un bacterifago y su clula


hospedadora, se introduce el material gentico al interior y se induce la sntesis de los
componentes necesarios para fabricar ms partculas vricas. Posteriormente, los
diferentes componentes han de ser ensamblados en una secuencia determinada. Por
ltimo, las partculas vricas saldrn al exterior de la clula hospedadora por lisis de la
misma.

Esta serie de acontecimientos ocurre en varias etapas que conforman el


denominado ciclo ltico o productivo:

1. Adsorcin
2. Penetracin
3. Sntesis de protenas tempranas
4. Replicacin del material gentico
5. Maduracin
6. Liberacin de los viriones maduros

1. Adsorcin

La infeccin de la clula hospedadora comienza cuando interaccionan al azar


una partcula vrica y una clula. Si esta clula tiene receptores especficos para el
fago, se produce la adsorcin irreversible (Figura 8).
.

Los receptores son molculas que suelen estar situadas a nivel de la pared
celular, aunque tambin hay receptores para fagos situados en apndices, como
flagelos y fimbrias.

37

Los receptores fgicos para la adsorcin varan entre los diferentes grupos de
fagos. Las colas suelen ser los rganos de adsorcin (ms concretamente, las fibras
de la cola).

2. Penetracin

Este proceso ha sido muy estudiado en los fagos de la serie Tpar. Una vez que
se produce la adsorcin de las fibras de la cola, se produce la fijacin de las espculas
de la placa basal a la superficie de la clula bacteriana. Se produce la contraccin de
la vaina y el tubo es empujado hacia abajo.

Cuando el tubo penetra la membrana citoplasmtica, el cido nuclico


contenido en la cabeza del fago es inyectado, quedando la cpsida vaca fuera de la
clula.

3. Sntesis de protenas tempranas

Una vez que el ADN fgico ha llegado al citoplasma bacteriano, se ve sometido


a las enzimas de Restriccin-Modificacin de la bacteria. Parte del ADN se transcribe
hasta ARNm gracias a la ARN Polimerasa de la bacteria.

El ARNm es traducido en los ribosomas bacterianos y los productos (protenas


tempranas, por ser los primeros productos fgicos en aparecer), inhiben la sntesis
macromolecular de la clula.

Ms tarde, se transcriben y traducen otros genes del fago, que originan las
protenas de la cpsida, del tubo, de la cola, etc., adems de ciertas enzimas lticas.

4. Replicacin del acido nuclico del fago

La replicacin del fago depende del tipo de cido nuclico que posea (ADN o
ARN, lineal o circular, bicatenario o monocatenario). En la mayora de los casos, los
ADN lineales se circularizan al entrar en la clula. Esto se logra gracias a la existencia
de extremos cohesivos o por repeticin terminal.
38

La replicacin inicial de un cromosoma vrico circular comienza en un sitio


especfico y se lleva a cabo en ambas direcciones segn el modelo que en un
proceso semejante al de replicacin del cromosoma bacteriano, originndose
cromosomas circulares.
Ms tarde, la replicacin ocurre de acuerdo con el modelo

o del crculo

rodante. Se origina una molcula de doble cadena que puede ser mucho ms larga
que el cromosoma viral (concatmeros).

Posteriormente una terminasa corta por las secuencias cos y los cromosomas
vricos se empaquetan en las cpsidas.

En el caso de fagos cuyo material gentico est constituido por ARN, una vez
que ste ha penetrado al interior celular, se copia formando una molcula de doble
cadena (forma replicativa).

La cadena de ARN paterna est marcada como + (se comporta como un


ARNm). La ARN replicasa del virus convierte la cadena paterna en un Intermediario
replicativo bicatenario. La replicasa utiliza el Intermediario bicatenario para la sntesis
de ms cadenas de ARN+

La cadena paterna desplazada y las cadenas de la descendencia, o bien son


incorporadas a los nuevos viriones, o bien son utilizadas por la replicasa para formar
nuevos intermediarios replicativos bicatenarios.

5. Maduracin

Ocurre poco despus de iniciada la replicacin del material gentico. Se


acumulan subunidades de la cpsida y del resto de componentes virales. Las
molculas de cido nuclico se condensan y son encapsidadas. Se produce el
autoensamblaje dirigido por los genes del virus.

6. Liberacin de los viriones maduros


39

Al final de la infeccin, aparece en la clula una protena tarda. Esta protena


(enzimtica) se denomina lisozima fgica. La lisozima acta sobre el glucopptido de
la pared celular, rompiendo enlaces glucosdicos y permitiendo la rotura de la misma.
Una vez rota la pared celular bacteriana, se liberan los fagos recin ensamblados.

El ciclo de infeccin puede volver a iniciarse inmediatamente, por interaccin al


azar de un virin con una clula hospedadora susceptible. Los bacterifagos
virulentos solo pueden realizar el Ciclo ltico o productivo.

40

Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano (Ilustracin de Microsoft)

41

Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la pared celular de E. coli e


inyeccin del DNA (a) Interaccin al azar, (b) Accin de receptores y (c) Fijacin
(Ilustracin de Microsoft)

Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)

42

Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)

2.3.2. Ciclo lisognico

Los fagos temperados pueden llevar a cabo, adems del ciclo ltico, el
fenmeno de la lisogenia (Figura 9). Estos fagos, una vez inyectado el ADN en el
interior de la clula hospedadora, pueden integrar su material gentico en el
cromosoma de la bacteria, replicndose en sincrona con el hospedador, el cual
sobrevive y se divide normalmente. En este caso los genes vricos integrados en el
cromosoma bacteriano, estn reprimidos y no se expresan. El ADN fgico integrado
en el cromosoma bacteriano recibe el nombre de profago. En circunstancias
adecuadas, se produce la desrepresin de los genes vricos y se produce un ciclo
ltico.

En una clula infectada por un fago temperado ocurren tres procesos muy
ligados en el tiempo:
1. Transcripcin y traduccin del genoma vrico. Esta fase origina la sntesis de
protenas tempranas, entre las cuales hay uno o ms tipos de represores que inhiben
la replicacin y la expresin gnica de los virus, lo que permite el ciclo lisognico.
2. Comienzo de la replicacin del virus.
3. Entrada en estado de profago de uno de los genomas replicados.
El que una clula hospedadora sufra un ciclo ltico o un ciclo lisognico depende del
pulso entre el represor y el proceso de maduracin del fago. Si se producen viriones
43

maduros (y lisozima fgica) antes de que el represor pueda actuar, la clula se lisar.
Si por el contrario, se acumula el represor bloqueando la expresin gnica y la
replicacin del virus, la clula quedar Lisogenizada (Figura 10).

Caractersticas de las clulas lisogenizadas

A partir de una clula lisogenizada, se origina un clon lisognico. En cada una


de las clulas de este clon se encuentra el fago en forma de profago.
Mientras dura el estado de lisogenia, las clulas no eliminan viriones, ni presentan
ninguna protena estructural del virin.

Las clulas infectadas (lisogenizadas) por un fago (Profago) son inmunes a la


infeccin por el mismo fago. Si las clulas lisognicas adsorben partculas vricas de
un fago diferente, se dice que estn superinfectadas.

Bajo determinadas condiciones ambientales el profago se escinde, pasando a


un estado independiente, multiplicndose y originando la lisis celular. A este
fenmeno se le conoce como Induccin y como consecuencia del mismo se origina un
ciclo ltico.

Pueden aparecer fenmenos de conversin fgica debido a que algunos de los


genes virales no quedan reprimidos, y por tanto se expresan, confiriendo a la bacteria
algunas caractersticas fenotpicas que antes no tena. Esto mismo puede ocurrir en el
caso de que la insercin del profago haga que se expresen genes bacterianos que
antes no lo hacan (genes crpticos).

2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis

Desde 1997 al 2001 han sido fagotipados 10.049 aislamientos de Salmonella


Enteritidis de origen humano en Europa. Los fagotipos ms comunes en este perodo
fueron PT4 y PT1 (Figura 11), considerando el 35% y 16% de todos los casos,
respectivamente. En los viajeros que vuelven de la mayora de los pases de Europa
Occidental, PT4 era el fagotipo dominante. En Europa Oriental, PT1 era el
dominante, y este fagotipo tambin era comn entre viajeros que vuelven de la
44

Pennsula ibrica. PT8 pareca ser ms comn entre los viajeros que vuelven de los
pases europeos centrales (Nygrd y col., 2004).

Figura 11. Distribucin de fagotipos de Salmonella Enteritidis notificados en Suecia,


1997 a 2002 (Nygrd y col., 2004)

2.5. Evolucin fgica

Los fagos pudieron haber evolucionado de organismos auto-replicativos que


hubieran perdido la maquinaria necesaria para llevar a cabo la traduccin y con ella la
posibilidad de realizar procesos metablicos, obligndolos a convertirse as en
parsitos estrictos. Otra teora alternativa hace referencia a un ancestro comn, que
se hubiera desarrollado como un elemento gentico extracelular proveniente del
hospedador, y que habra adquirido los genes necesarios para proteger su DNA de la
degradacin, primero dentro de la clula y posteriormente fuera de ella. Este origen
bacteriano de algunos fagos, est respaldado por la existencia de secuencias de DNA
en los genomas de las bacterias que parecen tener caractersticas comunes en
cuanto a estructura y organizacin genmica al DNA fgico.

Si bien el origen de los fagos es incierto, el mecanismo por el cual evolucionan


es ms conocido. La forma clsica de evolucin gentica, por medio de mutaciones
45

puntuales en genes que dan como resultado protenas adaptables a distintas


funciones, es la ms aceptada. Pero podra existir adems, otro poderoso mecanismo
de evolucin fgica que se conoce con el trmino de evolucin modular. Esta teora,
propuesta por Botstein (1980), considera que los genomas de los bacterifagos,
incluidos los que nos ocupan, estn organizados en unidades funcionales
multignicas conocidas como mdulos. Estos mdulos codifican funciones biolgicas
concretas, como puede ser la construccin de la cpsida o el establecimiento de la
lisogenia y seran intercambiables, de forma que pueden ser traspasados de unos
fagos a otros potenciando as el proceso evolutivo (Botsein, 1980; Brssow y Desiere,
2001).

2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis

Los estudios epidemiolgicos de esta infeccin, han determinado la


clasificacin de los diferentes aislamientos de Salmonella Enteritidis en fagotipos (FT),
tomando en consideracin ciertas caractersticas como su virulencia y patogenicidad.
La metodologa de fagotipificacin es la misma en todo el mundo, ya que utiliza los
mismos bacterifagos y es ampliamente utilizada para la clasificacin de aislamientos
de Salmonella que pertenecen a la misma serovariedad. La utilizacin de la
fagotipificacin para propsitos epidemiolgicos, se basa en asumir que los
aislamientos que pertenecen al mismo fagotipo tienen relacin epidemiolgica entre
s, mientras que aislamientos de diferente fagotipo carecen de esa relacin; adems
las serovariedades deben demostrar una alta estabilidad dentro de la poblacin y con
el paso del tiempo (Mancera Martnez y col., 2004).

Actualmente, el mtodo de tipificacin bacteriana de Salmonella Enteritidis ms


utilizado corresponde a la tipificacin fgica, lo que se explica por su estandarizacin,
la facilidad de montaje y porque la mayor parte de los aislados son tipificables y,
adems, los resultados son fcilmente reproducibles. Su limitacin ms importante
radica en su baja capacidad discriminatoria debido a la predominancia de unos pocos
fagotipos en una poblacin bacteriana.

La tipificacin fgica de aislados nacionales de S. Enteritidis es de inters


debido a que esta tcnica de marcacin ha estado restringida a unos pocos pases,
46

en su mayor parte desarrollados. Ello ha impedido conocer cules poblaciones


bacterianas estn involucradas en las nuevas zonas afectadas. Ms an, esta tcnica
de marcacin podra indicar si solo unos pocos fagotipos estn asociados con la
actual epidemia o si, como se sospecha, varios tipos podran estar circulando a partir
de diferentes fuentes infectantes. Adems, la comparacin de aislados clnicos,
alimentarios y avcolas podra mostrar la relacin epidemiolgica de estos. Por ltimo,
la comparacin de los fagotipos que actualmente circulan con los que se han
observado en pocas anteriores podra indicar el posible origen local de la epidemia o
su importacin del exterior (Prat y col., 2001).

Existen, fundamentalmente, dos tipos de bacterifagos: los salvajes o silvestres


que se encuentran en la naturaleza. Dentro de stos existe una variedad que son los
bacterifagos adaptados. Estos ltimos son especficos para un tipo determinado de
Salmonella. Se pens, en un principio, que stos eran mutadores de la clula
husped, pero ms tarde se vio que eran los propios fagos los que sufran
modificaciones al ser enfrentados en varias ocasiones a una misma cepa, de forma
que se hacan activos frente a cepas que en un principio no lisaban (Ward y col.,
1987). Otro tipo son los conocidos como Lisognicos que forman parte de la
estructura gentica de la bacteria. La situacin de lisogenia es una forma especial de
interaccin virus-husped, basada en la asociacin ntima del ADN vrico y bacteriano.
Existe un entrecruzamiento entre el ADN del virus y el ADN bacteriano, empleando el
mismo mecanismo de rotura y recombinacin observado en la recombinacin
gentica. Slo presentan poder ltico frente a su clula husped si sufren algn tipo de
modificacin gentica.

Existen, fundamentalmente, dos tcnicas de fagotipia (ISO, 1995; 2000; 2001):


- Directa: Consistente en el aislamiento de bacterifagos salvajes de la naturaleza y
su posterior aplicacin a un conjunto de cepas que se desean estudiar.
- Indirecta: Consistente en la induccin de bacterifagos de las propias cepas y, una
vez transformados en lticos, formar con ellos un juego de fagotipia para las cepas a
estudiar.

47

OBJETIVOS

48

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la eficacia de la fagotipia como


complementario para cepas de Salmonella Enteritidis.

marcador

epidemiolgico

OBJETIVOS COMPLEMENTARIOS

1. Aislar y purificar bacterifagos de cepas de Salmonella Enteritidis de aguas del ro


Lujn.

2. Determinar los ttulos de los bacterifagos a travs de Routine Test Dilution (RTD)

3. Establecer los correspondientes grupos de especificidad entre las cepas de S.


Enteritidis y los fagos hallados.

4. Evaluar los perfiles genticos, por PFGE, de S. Enteritidis representativas de los


grupos de especificidad surgidos a fin de evaluar los clones circulantes.

49

MATERIALES
Y
MTODOS

50

1. Toma de muestras de agua

Se tomaron un total de 120 muestras de agua, a razn de 10 mensuales,


durante un ao. Las mismas se obtuvieron segn la tcnica del hisopo de Moore con
60 minutos de exposicin a la corriente de agua (Anselmo y col., 1999; Guinea y col.,
1979). Fueron cultivadas dentro de las 2 h del momento de su extraccin.
Simultneamente se determin la temperatura del agua en cada toma de muestra.

Cuatro puntos de los mrgenes del ro Lujn, confinados en los de mayor


poblacin urbana fueron los sitios de muestreo elegidos. Surgieron de la evaluacin
estadstica de los resultados obtenidos durante investigaciones anteriores realizadas
en el ro Lujn durante los aos 1987 a 1993 donde se obtuvo mayor positividad de
muestras as como mayor cantidad de serovariedades detectadas / muestra.

2. Cepas de Salmonella Enteritidis

Procedencia y origen de las cepas

Las cepas de Salmonella Enteritidis seleccionadas para este trabajo


procedieron de la coleccin de cepas de Salmonella existentes en el Laboratorio de
Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn conservadas en caldo nutritivo con
7 g/L de agar-agar a temperatura ambiente. Las mismas han sido aisladas en trabajos
anteriores desde 1987 a 1993 e identificadas en su oportunidad.

Distribucin de las cepas en grupos

Se seleccionaron un total de 86 cepas de Salmonella Enteritidis, pertenecientes


a siete grupos. Estos son:
-

GRUPO PRIMERO: Formado por 23 cepas de Salmonella Enteritidis


seleccionadas entre todas las serovariedades de Salmonella existentes en
el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn. Fueron
aisladas de aguas del ro Lujn durante el perodo comprendido de 1987 a

51

1990, de investigaciones anteriores (Anselmo y col., 1989; 1991a; 1999).


Tabla 3.

GRUPO SEGUNDO: Formado por 6 cepas de Salmonella Enteritidis


procedentes de vescula biliar de uno de cinco terneros fallecidos en el
tambo

de

la

Universidad

Nacional

de

Lujn,

con

sintomatologa

caracterstica de salmonelosis, de noviembre de 1988 (Anselmo y col.,


1991c). Tabla 4.

GRUPO TERCERO: Formado por 25 cepas procedentes de la investigacin


de un brote de origen alimentario ocurrido en un comedor escolar de la
ciudad de Lujn, provincia de Buenos Aires, con unas cuarenta personas
afectadas, en marzo de 1990 (Anselmo y col., 1990). Tabla 5.

GRUPO CUARTO: Formado por 8 cepas provenientes del estudio de otro


brote de origen alimentario acontecido en una panadera y confitera de la
ciudad de Gral. Rodrguez, provincia de Buenos Aires, con unas diecisis
personas afectadas, por ingesta de mayonesa casera utilizada para la
confeccin de sndwiches de miga, en octubre de 1990 (Anselmo y col.,
1991b). Tabla 6.

GRUPO QUINTO: Integrado por 13 cepas procedentes de una intoxicacin


masiva en una rotisera de la ciudad de Lujn al confeccionarse ensalada
rusa y mayonesa de ave, ambas con mayonesa de elaboracin casera, con
unas 200 personas afectadas, en diciembre de 1991 (Anselmo y col., 1993).
Tabla 7.

GRUPO SEXTO: 6 cepas provenientes del estudio de un brote familiar en la


ciudad de Lujn, debido a mayonesa casera utilizada para confeccionar
ensalada rusa, con nueve personas afectadas, en setiembre de 1993
(Anselmo y col., 1995, Viora y col., 1994). Tabla 8.

GRUPO SPTIMO: 5 cepas de Salmonella Enteritidis procedentes de casos


espordicos sucedidos en la ciudad de Lujn desde noviembre de 2009 a
52

diciembre de 2010, provistas por la Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto,


Florencia Sparapani y Susana Ferrarotti de sus Laboratorios de Anlisis
Clnicos as como del Hospital Nuestra Seora de Lujn y de la Clnica
Gemes de la ciudad de Lujn.

Tabla 3. Grupo Primero. Datos Epidemiolgicos


N cepa

Ao aislamiento

Sitio de muestreoa

12988

1987

13088

1987

42188

1988

42288

1988

47088

1988

47188

1988

84788

1988

175588

1988

175688

1988

176688

1988

176788

1988

176888

1988

176988

1988

180988

1988

174790

1989

175390

1989

177290

1990

32195

1989

32495

1989

53

32595

1989

40995

1989

Arroyo El Haras

41195

1989

Arroyo El Haras

49195

1989

A = 2 Km aguas arriba de la zona urbana, B = Planta urbana y C = 2 Km aguas


abajo de la zona urbana.
Tabla 4. Grupo Segundo. Datos Epidemiolgicos
N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Brote

177088

1988

Vescula biliar

Tambo U.N.Lu.

177188

1988

Vescula biliar

Idem

177288

1988

Vescula biliar

Idem

177388

1988

Vescula biliar

Idem

177488

1988

Vescula biliar

Idem

177588

1988

Vescula biliar

Idem

Tabla 5. Grupo Tercero. Datos Epidemiolgicos

N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Brote

60490

1990

Heces asintom. 1

Comedor escolar

60590

1990

Heces asintom. 1

Idem

60690

1990

Heces asintom. 2

Idem

60790

1990

Heces asintom. 2

Idem

60890

1990

Heces enf. 3

Idem

60990

1990

Heces enf. 4

Idem

61090

1990

Heces enf. 5

Idem

61190

1990

Heces enf. 6

Idem

54

61290

1990

Heces enf. 7

Idem

61390

1990

Canilla bao

Idem

61490

1990

Canilla bao

Idem

61590

1990

Inodoro

Idem

61690

1990

Inodoro

Idem

61790

1990

Freezer

Idem

61890

1990

Freezer

Idem

61990

1990

Mesada cocina

Idem

62090

1990

Mesada cocina

Idem

62190

1990

Mesa cocina

Idem

62290

1990

Mesa cocina

Idem

62390

1990

Mesa comedor

Idem

62490

1990

Mesa comedor

Idem

62590

1990

Helado c/envoltorio

Idem

62690

1990

Helado c/envoltorio

Idem

62790

11990

Pata pollo cocido

Idem

62890

1990

Pata pollo cocido

Idem

Tabla 6. Grupo Cuarto. Datos Epidemiolgicos

N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Brote

183490

1990

Jamn cocido

Panaderia

183590

1990

Jamn cocido

dem

183690

1990

Mayonesa casera

dem

183790

1990

Mayonesa casera

dem

183890

1990

Paredes int. Heladera

dem

55

183990

1990

Paredes int. Heladera

dem

184090

1990

Estantes cm. Frigor.

dem

184190

1990

Estantes cm. Frigor.

dem

Tabla 7. Grupo Quinto. Datos Epidemiolgicos

N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Brote

230791

1991

Inodoro

Rotiseria

230891

1991

Inodoro

Idem

230991

1991

Inodoro

Idem

231091

1991

Vaso Licuadora

Idem

231191

1991

Vaso Licuadora

Idem

231291

1991

Vaso Licuadora

Idem

231391

1991

Heces cocinera asintom.

Idem

231491

1991

Heces cocinera asintom.

Idem

231591

1991

Heces enf. 1

Idem

231691

1991

Heces enf. 1

Idem

231891

1991

Heces enf. 2

Idem

231991

1991

Heces enf. 3

Idem

232091

1991

Heces enf. 3

Idem

Tabla 8. Grupo Sexto. Datos Epidemiolgicos

N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Brote

182693

1993

Clara de huevo

Familiar

182793

1993

Clara de huevo

Idem

182893

1993

Heces enf. 1

Idem

56

182993

1993

Heces enf. 1

Idem

183093

1993

Heces enf. 2

Idem

183193

1993

Heces enf. 2

Idem

Tabla 9. Grupo Sptimo. Datos Epidemiolgicos

N cepa

Ao aislamiento

Origen muestra

Casos
espordicos

706

2009

Heces enf. 1

Lujn

756

2009

Heces enf. 2

Lujn

6182

2010

Heces enf. 3

Lujn

508091

2010

Heces enf. 4

Lujn

194110

2010

Heces enf. 5

Lujn

3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes

3.1. Se evaluaron 36 cepas de Salmonella Enteritidis (todas las del grupo


primero y un 22% de las cepas representativas de los grupos segundo al sexto), un
pool de 3 mensuales (McLaughlin y col., 2006). A cada uno de los 10 hisopos de
Moore se les adicion 100 mL de Phage Assay Broth (PAB) (Kott, 1966; Oliver Graves
1964) y 1 mL de cultivo en PAB de cada una de las tres S. Enteritidis de 24 h a 35C
y se incub durante 15 horas a 35C (McLaughlin y Brook, 2008).

3.2. Para la descontaminacin se trasvasaron 10 mL de cultivo a un tubo de


15 x 150 mm con tapa a rosca y se aadieron 5 mL de cloroformo. Se agit
enrgicamente 60 segundos y se conservaron a 4C (Daz y col., 1995).

4. Confirmacin (Adams, 1959)

Para comprobar la presencia de bacterifagos, en 5 mL de PAB blando (0,7%


agar) fundido y templado a 50 2C se incorpor 0,5 mL de un cultivo de la cepa
57

propagadora en 10 mL de PAB de 24 h a 35C. Se homogeniz en vortex (Fbr by


Decalab S.R.L.) y se verti en placa de 15 cm de dimetro, conteniendo 15 mL de
PAB slido (1,3% agar) desparramando la mezcla uniformemente sobre la superficie
del agar y evitando la presencia de burbujas de aire. Se dej solidificar y se sec la
superficie de la placa a 35C durante 30 minutos, con la tapa sacada y la superficie
del agar hacia abajo e inclinada. A continuacin se colocaron 10 L del cultivo
enriquecido de bacterifago. Se dej la placa sin invertir 30 min a temperatura
ambiente para que se absorba la alcuota. Se incub en la habitual posicin invertida
durante 4 a 15 horas a 35C efectuando lecturas a intervalos frecuentes (McLaughlin y
Brook, 2008). La presencia del bacterifago se visualiza en la aparicin de calvas o
placas de lisis.

5. Criterio de seleccin de bacterifagos

Se realiz de acuerdo a los criterios propuestos por (Anderson y Williams, 1956).

Estos se basan fundamentalmente en tres factores:

a) El tamao de las placas de lisis:


1. Placas grandes l.
2. Placas normales n.
3. Placas pequeas s.
4. Placas diminutas m.
5. Placas micro visibles tan solo con lupa de 10 aumentos.

b) El nmero de placas de lisis:


1. De O a 5 placas, se indica el nmero de las mismas.
2. De O a 20 placas, se pone
3. De 21 a 40 placas, se pone +
4. De 41 a 60 placas, se pone + +
5. De 61 a 80 placas, se pone + +
6. De 81 a 120 placas, se pone + + +
7. Ms de 120 placas, se pone + + +

58

c) Ej. tipo de lisis:


1. Lisis semiconfluente scl
2. Lisis confluente cl
3. Lisis menor que semiconfluente <scl o lisis menor que confluente <cl, que
representan grados intermedios de lisis.
4. Lisis opaca 01, que se debe a un sobrecrecimiento posterior de la misma
cepa

6. Purificacin de los bacterifagos

La purificacin es un proceso encaminado a confirmar la presencia de uno o


ms bacterifagos en las placas de lisis que estos producen en las bacterias, con la
finalidad de aislarlos y utilizarlos posteriormente teniendo la certeza de que cada
placa de lisis se debe a la accin de un slo bacterifago.

Se realiza por pases sucesivos mediante la tcnica de doble capa de agar. Se


deben realizar, como mnimo, tres pases. Para considerar a un bacterifago purificado
es necesario poder distinguir claramente la morfologa de las placas de lisis aisladas
que produce en su cepa propagadora despus del tercer pase. Si no es as, se debe
realizar algn pase ms.

En caso de existir varias placas de lisis de distinta morfologa en cualquiera de


los pases, se deben aislar por separado cada una de ellas y ser tratadas como fagos
distintos, inicindose el proceso de purificacin en cada una de ellas.

Los pases de purificacin de los bacterifagos aislados, se realizan de la


siguiente manera:

- PRIMER PASE: se considera como primer pase el proceso de aislamiento del


bacterifago en su cepa propagadora (en caso de aparicin de placas de lisis
aisladas).

- SEGUNDO PASE: se toc con un asa de rulo una placa de lisis bien aislada del
pase anterior, se descarg en 10 mL de PAB, se agit en vortex, luego se dej 10 min
59

a temperatura ambiente. Se incorporaron 5 mL de cloroformo, se agit durante 60 seg


y se conserv a 4C. A partir de esta suspensin se hicieron diluciones decimales
hasta 10-8 inclusive en 9 mL de PAB. En 5 mL de PAB blando (0,7% agar) fundido y
templado a 50 2C se incorporaron 0,5 mL de un cultivo de la cepa propagadora en
10 mL de PAB de 24 h a 35C y; 0,1 mL de las ltimas cinco diluciones decimales. Se
homogeneiz en vortex y se verti en placas individuales, de 15 cm de dimetro,
conteniendo 15 mL de PAB slido (1,3% agar) desparramando la mezcla
uniformemente sobre la superficie del agar y evitando la presencia de burbujas de
aire. Se dej solidificar y se se sec la superficie de las placas a 35C durante 30
minutos, con la tapas sacadas y la superficie del agar hacia abajo e inclinada. Se
incubaron las placas en la habitual posicin invertida a 35C durante 4 a 15 horas
efectuando lecturas a intervalos frecuentes. La presencia del bacterifago se visualiza
en la aparicin de calvas o placas de lisis.

- TERCER PASE: se realiza de igual forma que el pase anterior, partiendo de una
placa de lisis aislada del segundo pase y as sucesivamente, tantos pases como
fueran necesarios hasta conseguir el aislamiento del bacterifago. Generalmente, tres
o cuatro pases fueron suficientes.

7. Determinacin del ttulo del bacterifago

Routine Test Dilution (RTD) es la mayor dilucin del bacterifago que produce
una lisis confluente o completa sobre su cepa propagadora. Su uso minimiza la
aparicin de reacciones cruzadas confusas.

Cada bacterifago aislado se titula frente a su cepa propagadora. En 5 mL de


PAB blando (0,7% agar) fundido y templado a 50 2C se incorporaron 0,5 mL de un
cultivo de la cepa propagadora en 10 mL de PAB de 24 h a 35C y; 0,1 mL de las
diluciones decimales del bacterifago a titular, cada una por duplicado. Dichas
diluciones se hicieron previamente en PAB, partiendo del cultivo puro de fago. Se dej
solidificar y se sec la superficie de las placas a 35C durante 30 minutos, con la
tapas sacadas y la superficie del agar hacia abajo e inclinada. Se incub a 35 C
durante 4 a 15 h. Se calcul el RTD o ttulo del bacterifago (Ward y col., 1987).

60

8. Conservacin de los cultivos

Salmonella Enteritidis: En agar blando (caldo nutritivo con 7 g/L de agar-agar)


y en caldo tripticasa de soja con el agregado de glicerol estril al 15 % a 70C.

Bacterifagos: A partir de un bacterifago aislado y purificado, se lleva a cabo


su propagacin con el fin de disponer de una cantidad suficiente para su uso
posterior.

Se realiza por el medio de agar semislido descrito por Swanstrom y Adams,


1951. El agar semislido repartido en tubos de 6 mL se funde en bao mara en
ebullicin, se templa a 45 C y se aaden 0,5 mL de caldo crecido con la cepa
propagadora, 0,6 mL de bacterifago a su RTD y 0,25 mL de cloruro clcico, a una
concentracin de 0,4 g/mL. Todo ello se vierte sobre una placa de agar nutritivo (de
15 cm de dimetro) y se incuba a 35 C, durante 18 a 24 h. Una vez propagado el
bacterifago, se inunda la placa con 15 mL de caldo nutritivo y se recoge, mediante
arrastre, con pipeta Pasteur doblada. Tras centrifugar durante 1 h, se recoge el
sobrenadante y se filtra por membrana Millipore de 0,20 m. El filtrado, que es el fago
ya propagado, se titula de nuevo en su cepa propagadora. Finalmente, los
bacterifagos se guardan a 4C para su conservacin.

9. Tcnica de fagotipia

La tipificacin fgica se llev a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito


por la doctora L. R. Ward del Centro Colaborador de la OMS de Referencia e
Investigacin de Salmonella en Londres. Esta metodologa se ha estandarizado y su
descripcin se ha publicado previamente (Ward y col., 1987).
Para realizar la fagotipificacin, cada aislamiento se sembr en 5 mL de caldo
nutritivo adicionado de 0,85 % de cloruro de sodio (NaCl) (Difco Laboratories, Detroit,
Michigan, USA), en tubos de ensayo con tapn de rosca. Los tubos se incubaron en
agitacin continua (150 rpm) a 37 C en una incubadora con agitacin durante 3 h
(Gyratory Water Bath Shaker Model G76 New Brunswick Scientific Co., Inc. Edison
N.J. USA). Posteriormente cada tubo se vaci por separado en una caja de Petri
61

conteniendo agar nutritivo adicionado de 0,85 % de NaCl y 1,3 % de Bacto-Agar


(Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). El caldo nutritivo con la bacteria se
esparci por la superficie de la caja de Petri con movimientos circulares, retirando el
exceso de lquido al final. A continuacin se depositaron 10 L de cada uno de los 24
bacterifagos (cuatro por placa) sobre la superficie del agar conteniendo el
aislamiento de S. Enteritidis, evitando la mezcla entre ellos. Siempre se sigui el
mismo orden en la aplicacin de los bacterifagos, del 1 al 24, con la intencin de
evitar confusiones en la interpretacin de lisis producida por cada uno de ellos. Las
cajas de Petri se incubaron a 37 C durante 18 h, para posteriormente interpretar la
lisis producida.

10. Determinacin de grupos de especificidad entre las cepas de Salmonella


Enteritidis y los fagos hallados

Se han evaluado los resultados obtenidos en el tem 9 a fin de determinar las


correlaciones entre todas las cepas de S. Enteritidis estudiadas con los bacterifagos
detectados en este trabajo. As mismo se han corroborado las variabilidades de
especificidad en cada uno de los siete grupos.

11. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis

Se ha realizado utilizando la tcnica de electroforesis en campo pulsado


(PFGE) (Bio-Rad Laboratories, USA) a representantes de S. Enteritidis de los grupos
de especificidad surgidos en el tem 10, en el Servicio Enterobacterias del Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas Dr. Carlos G. Malbrn.

12. Morfologa de los bacterifagos aislados

Se ha evaluado la morfologa de los bacterifagos hallados mediante


microscopio electronico de transmisin (JEOL EX II TEM 1200, USA) en el Sector de
Microscopa Electrnica del Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria., Castelar.
Para ello se ha utilizado la tcnica de tincin negativa con cido fosfotngstico para
resaltar estas estructuras.

62

ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO E HISOPO DE MOORE

Phage Assay Broth (PAB)


Frmula

g/L

Caldo nutritivo deshidratado (Difco)

Cloruro sdico (Merck)

Sulfato de magnesio heptahidratado (Merck)

0,2

Sulfato de manganeso (Merck)

0,05

Agua destilada

1000

Cloruro clcico (Merck)


(Aadido como solucin estril luego del autoclavado)

0,15

Preparacin:
Disolver las cantidades arriba indicadas en 1 litro de agua destilada. Disolver por
agitacin. Autoclavar 15 minutos a 121C.

PAB slido
Frmula
Medio PAB y 1,3% de agar-agar (Merck)
Preparacin:
Se calienta hasta la ebullicin con agitacin suave para disolverlo por completo. Se
esteriliza en autoclave 15 minutos a 121C se deja enfriar hasta 45 + 2C y se reparte
en placas de Petri en cantidades de 20 mL por placa.

PAB blando
Frmula
Medio PAB y 0,7% de agar-agar (Merck)
Preparacin
Se calienta hasta la ebullicin con agitacin suave para disolverlo por completo. Se
reparte en cantidades de 5 mL en tubos de ensayo de 15 x 150 mm con tapa a rosca
y se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121C.

Caldo nutritivo (Difco)


63

Frmula

(g/L)

Extracto de carne

Peptona

pH final aprox. 6,8


Preparacin:
Disolver 8 g en 1 L de agua destilada. Autoclavar 15 minutos a 121C.

Hisopo de Moore
Los hisopos se preparan plegando o enrollando una tira a lo largo de gasa de 90 a
120 cm de largo por 15 cm de ancho atando firmemente el centro con hilo resistente a
la esterilizacin.
Se colocan en frascos de vidrio de boca ancha y tapa a rosca de 350 mL de
capacidad teniendo la precaucin que el extremo del hilo salga del frasco por un
borde de su tapa. Se esteriliza en autoclave a 121C, 30 minutos.

64

RESULTADOS

65

1. Bacterifagos de procedencia salvaje

1.1. Aislamiento de bacterifagos salvajes

1.1.1. Cepas de Salmonella Enteritidis

Las cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas para el aislamiento de


bacterifagos salvajes son todas las pertenecientes al grupo primero y un 22% de
las cepas representativas de los grupos segundo al sexto. La distribucin de las
cepas de Salmonella Enteritidis en grupos y su descripcin viene expuesta en el
apartado de Materiales y Mtodos.

1.1.2. Muestras de agua

Las 120 muestras de agua usadas para el aislamiento de bacterifagos


salvajes, fueron tomadas desde enero a diciembre de 2008. La forma y sitio de
muestreo est descrita en el apartado de Materiales y Mtodos.

1.1.3. Aislamiento de bacterifagos salvajes

De las 120 muestras de agua, 60 (50%) dieron resultado positivo las que
constituyeron la base para el aislamiento de este tipo de bacterifagos. La
temperatura del agua oscil desde 11 a 29C. Cada muestra se enfrent a cepas de
los grupos primero al sexto, aislndose en este primer paso 600 bacterifagos con
morfologa de placa de lisis diferente.

Este elevado nmero de aislamientos fue sometido a diferentes pruebas, que


se explicarn a continuacin, a lo largo de las cuatro selecciones que se hicieron
hasta conseguir un grupo de bacterifagos salvajes con caractersticas de marcador
epidemiolgico.

1.2. Criterio de seleccin de los bacterifagos salvajes aislados

66

1.2.1. Primera seleccin

Se hizo a partir de los 600 bacterifagos salvajes aislados en el primer


enfrentamiento entre las cepas y las muestras de agua.

Cepas de Salmonella Enteritidis

Para esta primera seleccin se usaron las 36 cepas de los grupos primero al
sexto.

Se emplearon para el aislamiento y purificacin de los bacterifagos salvajes y,


posteriormente, para fagotipia con los bacterifagos seleccionados.

Los 600 bacterifagos aislados fueron enfrentados en tres ocasiones a sus


cepas propagadoras.

Criterios de seleccin

Esta primera seleccin se hizo atendiendo al criterio de estabilidad ltica de


los bacterifagos aislados.

Al enfrentar de nuevo los 600 bacterifagos aislados a sus cepas propagadoras


se pudo apreciar que slo 75 mostraban estabilidad en sus patrones lticos durante
los tres enfrentamientos. Como consecuencia se rechazaron todos aquellos
bacterifagos que no mantenan su lectura. Los 75 bacterifagos seleccionados
fueron numerados correlativamente del 1 al 75. En la tabla 10 vienen reflejados los
datos epidemiolgicos de estos bacterifagos seleccionados.

En este grupo de 75 bacterifagos, algunos proceden de la misma muestra de


agua y de la misma cepa propagadora, debido a que una placa de lisis en ocasiones
estaba producida por ms de un bacterifago. Esto se evidenci por medio de los tres
pases de purificacin.

67

Para explicar de forma ms clara esta primera seleccin se expone a


continuacin, a modo de ejemplo, el trabajo realizado con tres muestras de agua
tomadas dos en julio y una en setiembre de 2008.

Salmonella Enteritidis identificada 174790 en el mes de julio, la misma muestra


de agua manifest tres bacterifagos diferentes rotulados 710a11; 710b1 y 710b21
que fueron los seleccionados.

Salmonella Enteritidis 175588 tambin en el mes de julio una muestra de agua


present dos bacterifagos distintos rotulados 79a y 79b.

Asimismo Salmonella Enteritidis 32195 en el mes de setiembre la misma


muestra de agua manifest dos bacterifagos diferentes rotulados 98a y 98b.

El resto de las placas de lisis no presentaron modificaciones durante los tres


pases de purificacin.

En un principio, al enfrentar las tres muestras de agua a las cepas del Grupo
Primero, se aislaron y posteriormente purificaron un total de 30 bacterifagos con
placas de morfologa diferente. Muchos de ellos procedentes de la misma cepa y
muestra de agua.

Para facilitar la exposicin del largo proceso que condujo a la primera seleccin
de bacterifagos aislados, se tom como modelo los aislamientos obtenidos al
enfrentar la cepa del primer grupo 174790 en el mes de julio de 2008.

Al efectuar el primer pase de purificacin de las placas de lisis aisladas que


aparecieron tras este primer enfrentamiento, se visualizaron tres nuevas placas con
morfologa diferente entre s. Se las denomin 710a; 719b1 y 710b2 (Esquema 1).

A cada nueva placa de lisis se le practic un segundo pase de purificacin,


apareciendo la 710a2 y la 710b22, nuevas placas de lisis morfolgicamente distintas
(Esquema 2).

68

En el tercer pase de purificacin solamente de la placa 710a1 se obtuvieron


dos placas de lisis 710a11 y 710a12 morfolgicamente distintas (Esquema 3). El resto
de las placas de lisis conservaron su morfologa en el tercer pase de purificacin.

El esquema 4 muestra el estudio completo de la cepa 174790 enfrentada a la


muestra de agua procedente de julio de 2008.

TABLA 10. PRIMERA SELECCIN DE BACTERIFAGOS SALVAJES. DATOS


EPIDEMIOLGICOS

BACTERIFAGO

RTD

CEPA
PROPAGADORA

10-5

12988

10-5

12988

10-5

175588

10-6

180988

10-5

180988

10-8

180988

10-6

47088

10-5

177088

10-9

47088

10

10-5

84788

11

10-7

60490

12

10-8

175588

13

10-6

175588

14

10-5

84788

15

10-7

176688

16

10-8

60690

17

10-8

40995

69

18

10-8

42188

19

10-8

42188

20

10-7

42188

21

10-7

42288

22

10-5

42288

23

10-5

42288

24

10-4

47188

25

10-4

47188

26

10-9

174790

27

10-5

174790

28

10-8

42188

29

10-8

61190

30

10-9

176688

31

10-5

175390

32

10-8

175390

33

10-8

175390

34

10-8

175688

35

10-9

175688

36

10-9

175688

37

10-8

32495

38

10-8

177290

39

10-8

177290

40

10-8

177290

41

10-9

32495

42

10-9

32495

43

10-8

32195

70

44

10-8

32195

45

10-9

176788

46

10-8

176788

47

10-8

32195

48

10-9

32595

49

10-8

32595

50

10-8

32595

51

10-9

40995

52

10-5

176788

53

10-8

176888

54

10-8

40995

55

10-8

176888

56

10-8

183490

57

10-9

49195

58

10-8

184190

59

10-5

49195

60

10-9

176988

61

10-8

176988

62

10-8

176988

63

10-7

62790

64

10-8

62790

65

10-9

62890

66

10-8

230791

67

10-9

231391

68

10-8

62890

69

10-8

62890

71

70

10-8

41195

71

10-8

42195

72

10-9

232091

73

10-5

183093

74

10-5

84788

75

10-4

176688

Esquema 1. AISLAMIENTO DE BACTERIFAGOS SALVAJES EN UNA MUESTRA


DE AGUA DE JULIO DE 2008: PRIMER PASE DE PURIFICACIN

AISLAMIENTO
BACTERIFAGO

PRIMER PASE
DE
PURIFICACIN

PLACAS DE
LISIS
AISLADASa

CARACTERES
MORFOLGICOS
DE LAS PLACAS
DE LISIS

710a

Grande,
confluente, no
halo

Cepa
174790 Placa de lisis

710b1

Pequea,
confluente, no
halo

+
Muestra de
agua de
julio de
2008
710b2

72

Grande,
semiconfluente,
halo

Los bacterifagos estn rotulados de la siguiente forma: la primera parte del nmero
corresponde al mes, seguido por el nmero de muestra. Ejemplo: el fago 710 significa
que la muestra se tom en julio de 2008 y dio positivo la muestra 10.

Esquema 2. BACTERIFAGOS SALVAJES AISLADOS EN UNA MUESTRA DE


AGUA DE JULIO DE 2008: SEGUNDO PASE DE PURIFICACIN

PLACAS DE
LISIS PRIMER
PASE

SEGUNDO
PASE DE
PURIFICACIN

NUEVAS
PLACAS DE
LISIS
AISLADAS

CARACTERES
MORFOLGICOS
DE LAS PLACAS
DE LISIS

710a1

Grande,
confluente, no
halo

710a

710a2

710b1

Pequea,
confluente, no
halo

710b1

Pequea,
confluente, no
halo

710b21

Grande,
semiconfluente,
halo

710b2

710b22

73

Pequea,
confluenteno halo

Esquema 3. BACTERIFAGOS SALVAJES AISLADOS EN UNA MUESTRA DE


AGUA DE JULIO DE 2008: TERCER PASE DE PURIFICACIN

PLACA DE LISIS
SEGUNDO PASE

TERCER PASE
DE
PURIFICACIN

NUEVAS
PLACAS DE
LISIS
AISLADAS

CARACTERES
MORFOLGICOS DE
LAS PLACAS DE LISIS

710a11

Grande, confluente, no
halo

710a12

Pequea, confluente, no
halo

710a1

El resto de las placas de lisis conservaron su morfologa en el tercer pase de


purificacin.

74

ESQUEMA 4. BACTERIFAGOS SALVAJES AISLADOS EN UNA MUESTRA DE


AGUA DE JULIO DE 2008. ESTUDIO COMPLETO

PRIMER PASE
DE
PURFICIACIN

SEGUNDO
PASE DE
PURIFICACIN

TERCER PASE
DE
PURIFICACIN

710a11
710a1
710a12
710a

710a2

710a2

710b1

710b1

710b21

710b21

710b22

710b22

Cepa
+

Placa de lisis

Muestra

(Bacterifago)

710b1

de
agua

710b2

Fagotipia Grupo Primero

En un principio, como ya se ha indicado con anterioridad, se aislaron 600


bacterifagos. Estos, al ser enfrentados tres veces a las cepas de los Grupos
Primero al sexto mostraron estabilidad ltica solamente 75 bacterifagos (tabla 10).

1.2.2. Segunda seleccin

Se hizo a partir del grupo de 75 bacterifagos obtenidos en la primera


seleccin.

Cepas de Salmonella serotipo Enteritidis

Las cepas usadas en esta seleccin fueron las pertenecientes a los Grupos
Primero al sexto.

75

Se emplearon fundamentalmente para la propagacin y confirmacin del RTD


de los 75 bacterifagos obtenidos en la primera seleccin y, posteriormente, para su
fagotipia con los nuevos bacterifagos seleccionados.

Criterios de seleccin

La segunda seleccin se basa fundamentalmente en los criterios de


reproducibilidad y conservacin del RTD de los bacterifagos.

Los 75 bacterifagos previamente seleccionados fueron propagados y,


posteriormente, se verific su RTD en sus cepas propagadoras. Los resultados
obtenidos fueron los siguientes:

9 bacterifagos presentaban anomalas durante el proceso de propagacin:


4 no eran reproducibles, moran en la propagacin, 3 modificaban
completamente su patrn ltico con respecto al que tenan antes de ser
propagados y 2 presentaban un ttulo muy bajo (menor de 10-2). Al no
cumplir las condiciones de marcador epidemiolgico, este grupo de 9
bacterifagos fue rechazado. Dichos bacterifagos fueron: 21, 31, 36, 42,
44, 45, 52, 61 y 69.

8 bacterifagos que en un principio presentaban buena capacidad de


propagacin y elevado RTD, fueron rechazados porque perdan ttulo al ser
conservados a 4C para su uso posterior. Esto se comprob enfrentando
estos bacterifagos a sus cepas propagadoras en tres ocasiones. Se pudo
ver que la lectura disminua considerablemente en cada enfrentamiento e
incluso algunos no presentaban lisis en la tercera ocasin. Los
bacterifagos rechazados por este motivo fueron: 3, 5, 7, 14, 34, 55, 74 y
75.

Tras esta segunda seleccin el nmero de bacterifagos se vio reducido a 58.

1.2.3. Tercera seleccin

76

Se hizo a partir del grupo de 58 bacterifagos obtenidos de la seleccin


anterior.

Cepas de Salmonella Enteritidis

Las cepas usadas en este paso fueron de los Grupos Primero al sexto.

Se emplearon fundamentalmente para fagotipia con los bacterifagos


resultantes de la seleccin anterior.

Criterios de seleccin

Esta seleccin se basa en la diferencia de lectura de los resultados entre los


distintos bacterifagos seleccionados.

Los 58 bacterifagos seleccionados se enfrentaron a sus cepas propagadoras


tres veces consecutivas. Tras un anlisis muy detallado de la lectura de los
resultados, se comprob que haba bacterifagos que presentaban caractersticas
similares entre s.

Para poder realizar un mejor estudio comparativo entre ellos se decidi reunir
los bacterifagos en grupos homogneos. Finalmente, se establecieron tres grupos:

GRUPO A: Bacterifagos con patrn ltico estable.


Formado por 26 bacterifagos reunidos, a su vez, en 8 grupos, cada uno de
ellos incluyendo aquellos bacterifagos que presentaban igual patrn ltico. Este
grupo viene reflejado en la tabla 11.

77

TABLA 11. TERCERA SELECCIN DE BACTERIFAGOS SALVAJES: GRUPO A.

SUBGRUPOS

BACTERIFAGOS

1, 2, 47, 50, 63

6, 51, 54, 59

9, 10, 12

13, 64

26, 65, 68

27, 28, 30

32, 38

40, 41, 43, 46

GRUPO B: Bacterifagos con lectura baja.


Formado por 19 bacterifagos que presentaban un patrn ltico similar a otros,
pero con lectura considerablemente ms baja. Se comprob su semejanza con otros
bacterifagos probando estos al 10 RTD (10 veces concentrada su dilucin de uso).
En estas condiciones, los bacterifagos aumentaban su lectura siendo, como se
prevea, similar a la de otros. Se comprob tambin que, probados los bacterifagos
al 100 RTD (100 veces concentrada su dilucin de uso) la lectura no sufra
modificaciones. A estos bacterifagos se les denomin de baja sensibilidad. Fueron
rechazados por no tener capacidad de discriminacin. Estos bacterifagos fueron: 8,
11, 16, 18, 20, 22, 23, 29, 33, 56, 57, 58, 62, 66, 67, 70, 71, 72, 73.

GRUPO C: Bacterifagos con lectura diferente.


Formado por 13 bacterifagos con lectura totalmente diferente entre s y a la de
los bacterifagos de los otros grupos. Estos bacterifagos son: 4, 15, 17, 19, 24, 25,
35, 37, 39, 48, 49, 53, 60.

78

El nmero final de bacterifagos que qued tras esta tercera seleccin fue de
39, estando formado por 26 bacterifagos del grupo A y 13 del grupo C. El grupo B
fue enteramente rechazado. La tabla 12 muestra los bacterifagos seleccionados.

TABLA

12.

TERCERA

SELECCIN

DE

BACTERIFAGOS

SALVAJES.

BACTERIFAGOS SELECCIONADOS

BACTERIFAGO

RTD

CEPA
PROPAGADORA

10-5

12988

10-5

12988

10-6

180988

10-8

180988

10-9

47088

10

10-5

84788

12

10-8

175588

13

10-6

175588

15

10-7

176688

17

10-8

40995

19

10-8

42188

24

10-4

47188

25

10-4

47188

26

10-9

174790

27

10-5

174790

28

10-8

42188

30

10-9

176688

32

10-8

175390

35

10-9

175688

79

37

10-8

32495

38

10-8

177290

39

10-8

177290

40

10-8

177290

41

10-9

32495

43

10-8

32195

46

10-8

176788

47

10-8

32195

48

10-9

32595

49

10-8

32595

50

10-8

32595

51

10-9

40995

53

10-8

176888

54

10-8

40995

59

10-5

49195

60

10-9

176988

63

10-7

62790

64

10-8

62790

65

10-9

62890

68

10-8

62890

1.2.4. Cuarta seleccin

Se realiz a partir del grupo de 39 bacterifagos seleccionados en el proceso


anterior.

Cepas de Salmonella Enteritidis


80

Las cepas utilizadas en esta seleccin fueron las pertenecientes al Grupo


Primero y dos cepas del Grupo Tercero.

Se emplearon para fagotipia con el grupo de bacterifagos anteriormente


seleccionados. La fagotipia se repiti tres veces.

Criterios de seleccin

Se basan en la tipabilidad y poder discriminatorio de los bacterifagos


seleccionados.

Los resultados de la fagotipia se estudiaron detalladamente, repitiendo en


ocasiones la fagotipia de aquellas cepas que presentaban fagotipos diferentes, para
su comprobacin definitiva. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

9 bacterifagos presentaban, en las 23 cepas, diferencias muy pequeas en


su lectura, (lecturas entre scl y cl). Su poder discriminatorio no era bueno.
Estos fueron: 4, 15, 17, 19, 24, 25, 35, 37 y 38. Su lectura era semejante al
bacterifago 1.

4 bacterifagos: 39, 46, 48 y 49 presentaban lectura semejante al 27 pero


ms baja.

2 bacterifagos presentaban lectura semejante al 63 pero ms baja. Estos


fueron: 53 y 60. Su lectura, probados al 10 RTD, no variaba.

Todos estos bacterifagos quedaron eliminados del juego final por no aportar
mayor discriminacin al grupo.

1.2.5. Seleccin final de los bacterifagos salvajes

El juego de bacterifagos de procedencia salvaje finalmente constituido consta


de 24 bacterifagos. Se les design con nmeros romanos correlativamente del I al
XXIV. Esta seleccin final aparece reflejada en la tabla 13.

81

2. Determinacin del ttulo del bacterifago

El ttulo observado del juego de 24 bacterifagos de procedencia salvaje se


muestra en la tabla 13.

TABLA 13. SELECCIN FINAL DE BACTERIFAGOS SALVAJES

NMERO
ANTERIOR

NMERO ACTUAL

RTD

CEPA
PROPAGADORA

10-5

12988

II

10-5

12988

III

10-8

180988

IV

10-9

47088

10

10-5

84788

12

VI

10-8

175588

13

VII

10-6

175588

26

VIII

10-9

174790

27

IX

10-5

174790

28

10-8

42188

30

XI

10-9

176688

32

XII

10-8

175390

40

XIII

10-8

177290

41

XIV

10-9

32495

43

XV

10-8

32195

47

XVI

10-8

32195

50

XVII

10-8

32595

51

XVIII

10-9

40995

54

XIX

10-8

40995

82

59

XX

10-5

49195

63

XXI

10-7

62790

64

XXII

10-8

62790

65

XXIII

10-9

62890

68

XXIV

10-8

62890

3. Fagotipificacin

En las tablas 14 a 20 se pueden observar los resultados de la fagotipificacin


de las 86 Salmonella Enteritidis de los Grupos Primero al Sptimo. Se considera un
resultado positivo cuando presenta algunos de los tipos de lisis siguientes es decir
semiconfluente, confluente, menor que semiconfluente, menor que confluente y lisis
opaca.

4. Grupos de especificidad

En la tabla 21 se muestran los grupos de especificidad surgidos despus de la


evaluacin de los resultados de la fagotipia de las 86 cepas de Salmonella Enteritidis
al enfrentarlas con el juego de 24 bacterifagos y las caractersticas morfolgicas de
las placas de lisis observadas.

83

TABLA 14. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO PRIMERO


Fago

12988

13088

42188

42288

47088

47188

84788

175588

175688

176688

176888

176788

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

+: Algn grado de positividad


: Negativo

84

TABLA 14. FAGOTIPIA


(CONTINUACIN)

DE

S.

ENTERITIDIS

DEL

GRUPO

PRIMERO

Fago

176988

180988

174790

175390

177290

32195

32495

32595

40995

41195

49195

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

+: Algn grado de positividad


: Negativo

85

TABLA 15. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO SEGUNDO


Fago

177088

177188

177288

177388

177488

177588

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

+: Algn grado de positividad


: Negativo

86

TABLA 16. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO TERCERO


Fago

60490

60590

60690

60790

60890

60990

61090

61190

61290

61390

61490

61590

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

+: Algn grado de positividad


: Negativo

87

TABLA

16.

FAGOTIPIA

DE

S.

ENTERITIDIS

DEL

GRUPO

TERCERO

(CONTINUACIN)
Fago

61690

61790

61890

61990

62090

62190

62290

62390

62490

62590

62690

62790

62890

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

+: Algn grado de positividad


: Negativo

88

TABLA 17. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO CUARTO


Fago

183490

183590

183690

183790

183890

183990

184090

184190

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

+: Algn grado de positividad


: Negativo

89

TABLA 18. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO QUINTO


Fago

230791

230891

230991

231091

231191

231291

231391

231491

231591

231691

231891

231991

232091

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

+: Algn grado de positividad


: Negativo

90

TABLA 19. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO SEXTO


Fago

182693

182793

182893

182993

183093

183193

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

+: Algn grado de positividad


: Negativo

91

TABLA 20. FAGOTIPIA DE S. ENTERITIDIS DEL GRUPO SPTIMO


Fago

706

756

6182

508091

194110

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

+: Algn grado de positividad


: Negativo

92

TABLA 21. CONSTITUCIN DE LOS GRUPOS DE ESPECIFICIDAD


Fagos

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Total

ol

ol

ol

84

II

cl

ol

ol

cl

86

III

ol

ol

ol

84

IV

ol

ol

ol

84

ol

ol

ol

84

VI

ol

ol

ol

84

VII

ol

ol

ol

84

VIII

cl

cl

cl

84

IX

ol

ol

ol

84

ol

ol

ol

84

XI

ol

ol

ol

84

XII

<scl

<scl

<scl

84

XIII

ol

ol

ol

84

XIV

ol

ol

scl

84

XV

scl

scl

cl

XVI

<scl

<scl

<scl

84

XVII

<scl

<scl

<scl

84

XVIII

<scl

scl

<scl

84

XIX

scl

scl

ol

84

XX

scl

ol

ol

84

XXI

ol

ol

XXII

cl

XXIII

ol

ol

XXIV

cl

N de cepas
patrones

81

86

Tipo de lisis: lisis semiconfluente scl; lisis confluente cl; Lisis menor que
semiconfluente <scl; lisis menor que confluente <cl; lisis opaca ol.

93

5. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis

Se seleccionaron cepas representativas de cada uno de los 4 grupos de


especificidad hallados es decir:
Cepa 231591

Grupo 1

Cepa 47088

Grupo 2

Cepa 32195

Grupo 3

Cepa 62790

Grupo 4

Las cuatro cepas de Salmonella Enteritidis, dos aisladas de aguas del ro


Lujn, una de un alimento cocido y la restante de un enfermo de un brote, se
caracterizaron genticamente mediante macrorrestriccin genmica utilizando la
tcnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis).
Esto es posible gracias al sistema que utiliza 3 sets de electrodos distribuidos
hexagonalmente alrededor del gel, que aplican corriente primero desde uno de los
sets de electrodos, luego desde el segundo en un corto periodo de tiempo (pulso) y
luego desde el tercero. Esto causa que el DNA se mueva en el gel hacia adelante y
hacia atrs consecutivamente, aumentando el poder de resolucin de la electroforesis
y permitiendo as separar fragmentos de ms de 1000 Kb. El genoma bacteriano, que
contiene entre 2000 y 5000 Kb, es clivado con enzimas de restriccin de bajo nmero
de sitios de corte, generando entre 10 y 30 fragmentos de 10 a 800 Kb que se
resuelven en un gel de agarosa sometido a campo pulsado.
En el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - A.N.L.I.S. Dr. Carlos G.
Malbrn se compararon los patrones de bandas obtenidas al digerir el ADN total con
una enzima Xbal y aplicar la tcnica PFGE. Se sigui el protocolo descrito por Ribot y
col., 2006. Los perfiles de bandas obtenidos con esta enzima permitieron comparar
sus perfiles genticos con los de aislamientos correspondientes a casos espordicos
y de brotes del pas, disponibles en la Base Nacional de Datos (Figura 12). Las cepas
de Salmonella Enteritidis 47088 y 231591 que corresponden al patrn de PFGE
identificado ARJEGX01.0001 pertenecen al subtipo predominante (70,5 %) de S.
Enteritidis en todo el pas, que ha sido asociado a brotes de enfermedad transmitida
por alimentos en diferentes provincias, es decir

Fagotipo PT4. Las cepas de

Salmonella Enteritidis 32195 y 62790 que corresponden a los patrones identificados


94

ARJEGX01.0033 y ARJEGX01.0034 respectivamente, no se encontraban presentes


en la Base Nacional de Subtipificacin molecular, que cuenta con 31 patrones de
XbaI-PFGE, correspondientes a 288 aislamientos como as tampoco en la base
latinoamericana.

32195
62790

47088
231591

Fig.12. Electroforesis en campo pulsado de las cepas de Salmonella Enteritidis


seleccionadas

6. Morfologa de los bacterifagos aislados

Al observar diferentes preparados de los bacterifagos investigados previa


tincin negativa con cido fosfotngstico se han obtenido varias micrografas de las
que fueron rescatables dos, en una escala de 50 nm.

95

DISCUSIN

96

Los pases desarrollados poseen sistemas de informacin epidemiolgica que


permiten conocer la situacin de las principales enfermedades humanas con bastante
aproximacin (WHO Global Salm-Surv (WHO-GSS)).

Segun el Boletn Epidemiolgico Peridico de 2006, Salmonella Enteritidis es


uno de los principales agentes causales de gastroenteritis agudas en Argentina
(Caffer, 2007), por lo que se hacia imprescindible un estudio epidemiolgico ms
profundo para esta serovariedad.

Las nuevas metodologas han mejorado tanto la rapidez en el diagnstico como


la capacidad de realizar estudios epidemiolgicos. Entre ellas se destacan el perfil
plasmdico, los patrones de digestin de ADN por endonucleasas (como los patrones
de restriccin cromosmica y la electroforesis en campo pulsado (PFGE)), el revelado
de fragmentos especficos mediante hibridacin con sondas (como el ribotipado y la
presencia de la secuencia de insercin IS200) y los mtodos basados en la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR).

Un elemento clave de ambos procesos, diagnstico y epidemiolgico, radica en


la posibilidad de caracterizar el microorganismo y de determinar que este est
asociado con la aparicin de la enfermedad o brote epidmico, para lo que se
requiere el conocimiento de aquellos atributos nicos que le distingue de los dems,
este es el objetivo esencial que tienen los marcadores epidemiolgicos.

En este sentido se eligi la fagotipia, debido a que su eficacia ha sido


sobradamente probada en otras serovariedades de Salmonella

como Salmonella

Typhi (Craigie y col., 1938; Parry y col., 2002) y Salmonella Typhimurium (Anderson y
col., 1977; Callow, 1959; Liebana y col., 2002). Si bien en la actualidad ya existe una
coleccin de fagos estndares para Salmonella Enteritidis (Ward y col., 1987),
lamentablemente todava estn solo disponibles para los organismos nacionales e
internacionales por su elevado costo.

97

La fagotipia permite desarrollar un mejor sistema de control, tanto de las


fuentes de infeccin, de la cadena de transmisin de la enfermedad y de la posible
persistencia de determinadas cepas en individuos (portadores asintomticos) y
poblaciones (Mancera Martnez y col., 2004; Prat y col., 2001; Rabsch y col., 2002).

El esquema de fagotipia desarrollado para Salmonella Enteritidis en esta tesis


doctoral est formado por bacterifagos salvajes. Dicho esquema presenta una total
tipabilidad de las cepas estudiadas (100%) y poder de discriminacin. Adems es un
marcador reproducible y sus bacterifagos presentan buena capacidad ltica y
elevado titulo.

Se ha demostrado en la literatura (Billing, 1970) que un adecuado ambiente


inico resulta importante para una adsorcin rpida del fago a su husped y, algunos
necesitan un requerimiento especfico de cationes divalentes tales como calcio o
magnesio. Las concentraciones ptimas de cationes no son similares para cada
sistema fago-hospedador y adems, para su aislamiento una provisin especial es
raramente contemplada al emplearse un medio de cultivo comercial, logrndose una
concentracin no necesariamente ptima de cationes. Por tal motivo, esto podra
causar en un procedimiento de enriquecimiento que, aquellos fagos ms exigentes
esten en desventaja con respecto a otros menos exigentes, que van a terminar siendo
los dominantes.

Teniendo en cuenta lo mencionado precedentemente, para la ejecucin de toda


esta tesis doctoral se utiliz la versin lquida, slida y semislida del Phage Assay
Broth (PAB) ya empleado en otra tesis doctoral (Oliver Graves, 1964) y publicada su
frmula dos aos ms tarde (Kott, 1966). Este medio se basa en la complementacin
del caldo nutritivo con cloruro sdico, cloruro clcico, sulfato de magnesio y
manganeso. Generalmente la bibliografa (Adams, 1959; normas ISO 1995; 2000 y
2001; Ward y col., 1987) recomienda un medio de cultivo complementado con
cloruros de sodio y calcio sin contemplar los cationes divalentes de magnesio y
manganeso. Los resultados obtenidos, demuestran que la utilizacin de un medio
enriquecido en cationes favoreci el aislamiento de fagos.
98

La eleccin de la tcnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE: Pulsed


Field Gel Electrophoresis) para estudiar los perfiles genticos de las cepas de
Salmonella Enteritidis a analizar surgi debido a que es el mtodo habitualmente
utilizado por la Red PulseNet de Latinoamrica, Caribe y Europa; a fin de lograr
resultados comparables entre s (Peters y col., 2007).

Betancor y col., 2009, investigaron mediante electroforesis en campo pulsado


la divergencia genmica y el potencial patognico en aislamientos de Salmonella
Enteritidis antes, durante y despus de una epidemia acontecida en Uruguay. De 266
cepas analizadas el 96% correspondi tambin como en mi estudio, al fagotipo PT4 y
el 4% restante presentaron perfiles genticos que tampoco se hallaban registrados en
la base de datos de Latinoamrica y, estos investigadores concluyeron que los fagos
juegan un rol crucial en la generacin de la diversidad gentica en Salmonella
Enteritidis.

Fernndez y col., 2003, en su trabajo evaluaron 441 cepas de S. Enteritidis de


origen chileno y de otros pases latinoamericanos, aisladas entre 1975 y 2000,
mediante PFGE y fagotipificacin. Hallaron que predominaba el fagotipo 1 en el norte
y el fagotipo 4 en el centro y sur chileno. As mismo concluyeron que su anlisis
filogentico revelo un origen clonal comn para todas las cepas estudiadas.

McLaughlin y col., 2006, basaron su estudio en el aislamiento de bacterifagos


salvajes de sedimento de lagunas de Misisipi, Estados Unidos, contra cepas de
coleccin de Salmonella Typhimurium, Enteritidis, Agona y Montevideo. Concluyeron
que su hallazgo podra evidenciar la presencia de estas serovariedades de
Salmonella vivas o muertas en dichas aguas as como se podran utilizar los
bacterifagos encontrados como agentes de biocontrol contra esta enterobacteria.

Se ha demostrado en la literatura (Pang y col., 2005) que de un total de 187


aislamientos de S. Enteritidis estudiados, ms del 80% presentaba similaridad
99

gentica por electroforesis en campo pulsado y el fagotipo predominante era PT4 y,


concluyeron que las variantes seran derivadas de una linea clonal nica pero su
genoma se hallara altamente conservado en el perodo de relevamiento de cepas de
13 aos (1990 2002).

Prat y col., 2001, para conocer la diversidad de fuentes infectantes y las


relaciones epidemiolgicas entre aislamientos clnicos, alimentarios y avcolas de
origen chileno, realizaron la tipificacin fgica de 310 muestras de S. Enteritidis
obtenidas entre 1975 y 1996. Los tipos fgicos que se identificaron con mayor
frecuencia fueron el 1 (56,8%) y el 4 (31,3%) y, concluyeron que la tipificacin fgica
de S. Enteritidis sera de gran utilidad para orientar el anlisis epidemiolgico de las
infecciones por este agente patgeno.

En las tablas 14 a 20 se muestran las cepas de Salmonella Enteritidis que


manifestaron algn grado de lisis para el juego de 24 bacterifagos estudiados.

De la tabla 14 surge que de las 23 cepas de Salmonella Enteritidis del Grupo


Primero (Anselmo y col., 1989; 1991a; 1999), 20 cepas (87,0 %) dieron resultado
negativo con los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV. En cambio las cepas 47088 y
47188 (9,0 %) los negativos fueron con los fagos XXI; XXII; XXIII y XXIV. Mientras
que la cepa 32195 (4,0 %) solo se obtuvieron resultados negativos con los fagos XXII
y XXIV.

Con respecto a la tabla 15, las 6 cepas de Salmonella Enteritidis del Grupo
Segundo (Anselmo y col., 1991c), el 100,0 % sigui un mismo patrn es decir con
resultados negativos para los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV; coincidiendo con el
87,0 % de las cepas de Salmonella del Grupo Primero.

Analizando la tabla 16 se establece que de las 25 cepas de Salmonella


Enteritidis estudiadas del Grupo Tercero (Anselmo y col., 1990), 23 (92,0 %)
coincidieron con las integrantes del Grupo Segundo. En cambio las cepas 62790 y
100

62890 (8,0 %) dieron resultados totalmente diferentes a la mayora de las cepas de


esta tesis doctoral dando nicamente algun tipo de lisis con los fagos II; XV; XXI; XXII;
XXIII y XXIV.

En lo que respecta a las tablas 17 y 18; 8 cepas de Salmonella Enteritidis


(100,0 %) de las cepas de Grupo Cuarto (Anselmo y col., 1991b), y 13 cepas (100,0
%) del Grupo Quinto (Anselmo y col., 1993), se comportaron en forma similar a los
integrantes del Grupo Segundo.

As mismo, las 6 cepas de Salmonella Enteritidis constituyentes del Grupo


Sexto (Anselmo y col., 1995, Viora y col., 1994) y las 5 del Grupo Sptimo, tambin
mostraron idnticos patrones a los del Grupo Segundo como puede apreciarse en
las tablas 19 y 20 respectivamente.

Analizando los resultados hallados, como se puede observar en la tabla 21,


surgieron cuatro grupos de especificidad que fueron identificados 1; 2; 3 y 4.

El grupo de especificidad 1 constituido por 81 cepas de Salmonella Enteritidis


que dieron resultado negativo los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV, integrado por la
mayora de cepas de S. Enteritidis provenientes de aguas del ro Lujn, de los brotes
analizados y los casos espordicos. Los resultados obtenidos a travs de
electroforesis en campo pulsado demostraron pertenecer a S. Enteritidis Fagotipo
PT4. Cabe sealar que coinciden con el subtipo predominante (70,5%) de S.
Enteritidis en todo el pas que ha sido asociado a brotes de enfermedad transmitida
por alimentos en diferentes provincias argentinas.

El grupo de especificidad 2 abarca las cepas 47088 y 47188 provenientes del


Grupo Primero y de la misma muestra de agua, difiere del grupo de especificidad 1
en que ambas cepas dieron adems resultado positivo el fago XV. Sus perfiles
genticos revelaron que ambas cepas tambin pertenecen al Fagotipo PT4.

101

El grupo de especificidad 3 constituye una excepcin de las 23 cepas de S.


Enteritidis procedentes del Grupo Primero, la cepa 32195, que dio negativo
solamente los fagos XXII y XXIV. Cabe destacar que dicha S. Enteritidis fue utilizada
como hospedador original para detectar el fago XV a partir de aguas del ro Lujn. Su
patrn de PFGE identificado ARJEGX01.0033 no se encontraba presente en la Base
Nacional de Subtipificacin molecular, que cuenta con 31 patrones de Xbal-PFGE,
correspondientes a 288 aislamientos ni en la latinoamericana.

El grupo de especificidad 4 integrado por dos cepas de S. Enteritidis, la


62790 y 62890, del Grupo Tercero correspondientes al brote de origen alimentario
acontecido en un comedor escolar de la ciudad de Lujn, provincia de Buenos Aires,
con unas cuarenta personas afectadas, en marzo de 1990 (Anselmo y col., 1990).
Tabla 5. Ambas cepas fueron aisladas de una presa de pollo cocido que provena de
un servicio de viandas situado en la Ciudad Autnoma de Buenos Aires. Dieron
resultado positivo solamente en los fagos II; XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV. Cabe
destacar que los ltimos cuatro fagos mencionados fueron aislados utilizando como
hospedadores originales estas dos cepas de S. Enteritidis, no as los fagos II y XV.
Adems, sus patrones genticos tampoco se hallaban en la Base Latinoamericana de
Subtipificacin molecular al igual que el grupo de especificidad precedente.

102

CONCLUSIONES

103

El juego de 24 bacterifagos salvajes obtenido a travs de esta tesis doctoral


permiti:

1. Fagotipificar las 86 cepas de Salmonella Enteritidis estudiadas (100%).

2. Localizar las 83 cepas que correspondieron al fagotipo PT4 (96,5%) y concordaron


con las prevalecientes en Latinoamrica.

3. Detectar las 3 cepas atpicas (3,5%) es decir no halladas en Latinoamrica segn


los resultados obtenidos mediante los fagos XV; XXI; XXII; XXIII y XXIV y; confirmado
por electroforesis en campo pulsado.

4. Evidenciar un origen clonal para la mayora de las cepas de S. Enteritidis


analizadas y sus variantes podran atribuirse a la accin de bacterifagos sobre su
genoma bacteriano, concordando con los resultados de otros investigadores.

Asimismo dicho juego de bacterifagos permitir saber en menos de 24 horas


si una Salmonella an no identificada antignicamente y aislada de distintas fuentes
como enfermos espordicos, brotes alimentarios acontecidos, muestras de alimentos,
ambientales, etc., se trata de la serovariedad Enteritidis. Cabe destacar que la
fagotipficacin de presuntas Salmonella Enteritidis podra solamente realizarse a
aislamientos procedentes de la zona de Lujn y sus alrededores y, resultara ineficaz
para cepas provenientes de otros sitios.

104

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FOTOGRAFAS

121

Hisopo de Moore

122

Panormica de los cuatro sitios de muestreo

123

Sitio de muestreo 1

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Sitio de muestreo 2

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Sitio de muestreo 3

126

Sitio de muestreo 4

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Formacin de placas a partir de fagos aislados de aguas del Ro Lujn

Se observan calvas o placas de lisis con distintas caractersticas morfolgicas, lo cual


implicara que se trata de diferentes bacterifagos. Esto se confirma si mantiene dicha
morfologa.

128

Fotografa. Micrografa electrnica que muestra bacterifagos de placas de lisis


en doble capa de agar. Se utiliz una tcnica de tincin negativa con cido
fosfotngstico para resaltar estas estructuras. Tomada en Microscopia electrnica
del I.N.T.A., Castelar, Argentina. Escala: 50 nm.

129

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131