Istologia 01 Nozioni di microscopia e preparazione dei campioni

Caratteristiche di un microscopio
Locchio umano ha una risoluzione massima di 0,2 mm (riesce a vedere due punti separati fino alla distanza
minima di 0,2 mm). Lo studio delle cellule e dei tessuti quindi impossibile ad occhio nudo.
C bisogno di uno strumento adatto: il microscopio.
Sono due le sue caratteristiche principali:
1. Potere di ingrandimento: massimo ingrandimento che possibile ottenere;
2. Potere di risoluzione: distanza minima che ci deve essere tra due punti per vederli ancora separati
tra loro.
Tipi di microscopia
I principali tipi microscopi sono:
1. Ottico: il pi usato in istologia. Ha una risoluzione di 0,25 m. Necessita sempre di una
colorazione del campione (vedi dopo), in quanto le cellule non colorate sono trasparenti e quindi
non osservabili.
2. A contrasto di fase: per osservare cellule in vivo, senza alterarne la struttura. Infatti, il processo di
colorazione utilizzato per la microscopia ottica uccide le cellule.
3. A fluorescenza: per osservare campioni naturalmente fluorescenti o resi tali mediante il legame
con alcune sostanze, dette fluorocromi.
4. Confocale: permette di osservare, in diversi piani, i vari strati costituenti il preparato in esame.
5. Elettronico: per lo studio dei dettagli cellulari (risoluzione 0,4 nm).
6. A forza atomica: per studiare gli atomi (risoluzione 0,25 nm).
7. In campo oscuro: in cui viene colorato di nero lo sfondo per far risaltare gli elementi cellulari.
utilizzato in quei casi in cui non possibile effettuare una colorazione del campione.
8. A luce polarizzata: molto utilizzato per studiare le rocce e la loro composizione.

Ottico

Elettronico

A contrasto di fase

A fluorescenza

Confocale

A forza atomica

In campo oscuro

A luce polarizzata

Microscopio ottico
Il microscopio ottico consiste in un tubo con lenti di vetro a ciascuna estremit; dal momento che contiene
diverse lenti, il microscopio moderno detto microscopio composto.
La luce passa sia attraverso il campione, che attraverso le lenti. Le lenti, grazie alla loro disposizione,
permettono lingrandimento dellimmagine un po come un binocolo al contrario.

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Struttura

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1. Oculari: le lenti attraverso le quali si effettua losservazione. Da un lato hanno inciso un numero che
rappresenta il loro fattore dingrandimento.
2. Obiettivo: ciascun microscopio ha tre o quattro obiettivi. Insieme, lobiettivo e loculare formano
l'immagine ingrandita che viene osservata. Nella parte centrale del corpo di ciascun obiettivo
indicato il fattore dingrandimento.
3. Tavolino portapreparati: il piano su cui si appoggia il vetrino da osservare; ad esso attaccato il
tavolino traslatore, che permette di spostare facilmente il vetrino in maniera controllata.
4. Condensatore: situato sotto il tavolino portapreparati. Serve a focalizzare nel miglior modo
possibile la luce sul campione ed estremamente necessario ad alti ingrandimenti (ad esempio
oltre i 400x).
5. Accensione: permette di accendere e spegnere la lampada.
Regolatore luce: permette di variare lintensit della luce.
6. Fonte luminosa: rappresenta la sorgente della luce. La lampada pu essere a led o ad
incandescenza. In passato la fonte luminosa era rappresentata da uno specchio.
7. Vite macrometrica: la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco.
8. Vite micrometrica: pi piccola della precedente; disposta sopra quella macrometrica (coassiale
con essa). Permette la regolazione fine della messa a fuoco.
9. Terzo occhio per la telecamera: permette linserimento di una telecamera.
Modalit di utilizzo
1. Preparare il vetrino (vedi paragrafo Preparazione di un campione)
2. Posizionare il vetrino sul tavolino portaoggetti (bloccandolo con le molle ferma-vetrino).
3. Scegliere lobiettivo a minimo ingrandimento e mettere a fuoco (prima con la vita macro- e poi con
quella micrometrica facendo attenzione a non sfondare il vetrino con lobiettivo).
4. Regolare a luce ed il condensatore.
5. Spostare il tavolino (e quindi anche il vetrino) ed osservare gli altri campi.
6. Aumentare lingrandimento (girando il tamburo porta obiettivi).

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Preparazione di un campione
La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:
1. Fissazione
2. Disidratazione e diafanizzazione
3. Inclusione e/o sezionamento
4. Colorazione
Fissazione
La fissazione consiste nellimmobilizzare e conservare tutte le componenti del campione da esaminare per
impedire ai tessuti di perdere le loro propriet a causa delle variazioni di temperatura e pH e a causa dei
microrganismi che attaccano, invadono e distruggono il materiale biologico.
La fissazione pu essere:
Chimica: vengono aggiunti al campione dei fissativi che variano a seconda dei componenti che si
intendono visualizzare meglio. Le sostanze pi comunemente usate sono:
Alcol etilico (o etanolo): causa la perdita del 95% dei lipidi del campione;
Aldeidi (formaldeide, paraformaldeide); non sciolgono i lipidi del campione;
Fisica: viene utilizzata per conservare la reattivit enzimatica del tessuto. Questo tipo di fissazione
viene effettuata tramite congelamento rapido del tessuto, mediante immersione in azoto liquido,
alla temperatura di -170 C. In questo caso, i campioni passeranno direttamente alla fase di
sezionamento, saltando disidratazione ed inclusione.
Disidratazione e diafanizzazione
Dopo essere stato lavato accuratamente con acqua, il
campione viene immerso in soluzioni contenente alcol
etilico a concentrazioni via via maggiori (50%, 70%,
90%, 95%, 100%). Questo processo porta alla
disidratazione del campione.
Il campione viene quindi messo nello xilolo che ha una
duplice funzione: a) rimuovere lalcool perch non
miscibile con la paraffina (che viene utilizzata nel
passaggio successivo); b) rendere trasparente il
campione (diafanizzazione).
Inclusione
Per poter essere osservato al microscopio, il campione in esame deve essere tagliato in fettine cos sottili
da poter essere attraversate dalla luce.
Nel caso della fissazione chimica, il tessuto non presenta una consistenza tale da poter consentire
laffettamento. Per ovviare a questo problema, si include (inserisce) il tessuto in un liquido che poi solidifica
e diventa duro. In questo modo, il blocchetto duro (formato dal liquido solidificato includente il campione)
cos ottenuto pu essere affettato. Nel caso della fissazione fisica, invece, questo passaggio non serve.
La sostanza maggiormente usata per includere un campione la paraffina. Il campione viene immerso nella
paraffina fusa e poi si lascia solidificare a temperatura ambiente.
Unaltra sostanza impiegata comunemente la resina epossidica, che viene preferita per i preparati della
microscopia elettronica. Essendo pi rigida permette il taglio di sezioni ancora pi sottili rispetto a quelle
dei campioni inclusi in paraffina.
Sezionamento
Il sezionamento permette di ottenere fettine dello spessore adatto per essere viste al microscopio.
La procedura diversa a seconda del tipo di campione:
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Campioni fissati chimicamente (e quindi inclusi in paraffina): il taglio viene effettuato con il
microtomo, che permette di ottenere sezioni di 3-10 m. Le sezioni vengono poi messe su un
vetrino portaoggetti su cui precedentemente era stata messa una sostanza adesiva, e si lasciano ad
asciugare.
Prima di procedere alla colorazione, le fettine vengono immerse nuovamente nello xilolo per
rimuovere la paraffina e vengono reidratate attraverso soluzioni con concentrazioni via via
decrescenti di alcol etilico (100%, 95%, 90%, 70%).
Campioni fissati fisicamente: il sezionamento avviene solitamente con il criostato-microtomo. Si
tratta di un dispositivo formato da un microtomo inserito in una camera fredda (criostato), in cui la
temperatura varia dai -20 C fino ai -45 C.
Le sezioni vengono trasferite su vetrini precedentemente raffreddati, successivamente portati a
temperatura ambiente per poter procedere alla colorazione.

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