DEF PCR: La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica

"in vitro" que imita la habilidad natural de la clula de duplicar el ADN.

Se trata de una tcnica usada para crear un gran nmero de copias de
un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin,
apareamiento con cebadores y extensin por una ADN polimerasa
termoresistente.
HISTORIA: Hasta la dcada de 1980, el nico mtodo para obtener
grandes cantidades de un fragmento de ADN era clonndolo en vectores
adecuados e introducindolo y multiplicndolo en bacterias. En el ao
1985, un investigador norteamericano, Kary Mullis (acreedor del Premio
Nobel en Qumica 1993 por este aporte), desarroll un mtodo que
permite, a partir de una muestra muy pequea de ADN, obtener millones
de copias de ADN in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar
clulas vivas. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), requiere conocer la secuencia de nucletidos de los extremos del
fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para
disear dos oligonucletidos sintticos de ADN complementarios a una
porcin de cada una de las dos cadena de la doble hlice.
Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicacin in vivo del ADN: el
ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se
vuelve a
enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de:
desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin
de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario;
unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como
cebadores, al ADN
diana;
extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir
de los
cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de
iones
Mg2+.
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias
relativamente cortas,
que son diferentes entre s y complementarias de los sitios de
reconocimiento que

flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases

de
desnaturalizacin del ADN molde, anillamiento del cebador y extensin
del cebador
constituyen un ciclo del mtodo de amplificacin por PCR. La figura 5
ilustra las tres fases principales del proceso de amplificacin por PCR.

Tras cada ciclo, las hebras de ADN recin sintetizadas pueden servir de
ADN molde
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto
principal de esta
reaccin exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos
extremos vienen
definidos por los extremos 5 de los oligonucletidos cebadores y cuya
longitud viene
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera
ronda de
amplificacin efectiva son molculas de ADN de diferentes tamaos,
cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unin de los
dos
cebadores. En la segunda ronda, estas molculas generan hebras de
ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas
posteriores de
amplificacin y constituyen los productos dominantes de la reaccin. As,
la
amplificacin, que es el nmero final de ejemplares de la secuencia
diana, se
expresa con la siguiente ecuacin:
(2n-2n)x (1)
donde n es el nmero de ciclos, 2n es el nmero de molculas del primer
producto
obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras
el segundo

ciclo con longitud indefinida, x es el nmero de ejemplares del ADN

molde original.
Tericamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habr una amplificacin de
220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El
rendimiento de una
PCR vara de un ADN molde a otra y depende del grado de optimizacin
que se
haya conseguido.
En los prrafos siguientes se encuentra una descripcin pormenorizada
de las tres
fases de la amplificacin por PCR (desnaturalizacin del ADN molde,
anillamiento
del cebador y extensin) (Sambrook et al., 1989).

TIPOS DE PCR:
PCR anidada: consigue amplificar muestras mnimas de ADN a
miles de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar
trazos minsculos.
PCR in situ: permite la deteccin de ADN en el mismo lugar de la
muestra, sin tener que procesarla primero con tcnicas de laboratorio.
Se suele utilizar para biopsias o raspados de clulas.

PCR mltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios

trazos de ADN a la vez y con una sola muestra.
PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas
de ARN para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa
inversa, la misma que utiliza el VIHentre otros virus.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se aade un componente
fluorescente que permite medir la luz. A ms luz, ms cantidad del ADN
detectado

La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable,

nombrada de esta forma debido a que es producida por
labacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue aislada en el
ao 1968 por Thomas D. Brock1 A menudo suele abreviarse como
"Taq Pol" (o simplemente como "Taq"), y es frecuentemente utilizada
en las tcnicas de PCR, un mtodo que se utiliza para amplificar
secuencias cortas de ADN.
T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes
hidrotermales, y la polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido
caracterizada1 como una extremoenzima capaz de soportar las
condiciones de alta temperatura requeridas durante el proceso de PCR
sin desnaturalizarse.2 Por esta razn ha reemplazado a la ADN
polimerasa proveniente de E. coli (Eco pol) que era la que originalmente
se utilizaba en esta tcnica, pero que requera ser reemplazada luego de
cada ciclo de calentamiento aumentando las probabilidades de
contaminacin y prolongando los tiempos.3 La temperatura ptima de
funcionamiento de la Taqes de 7580C, con una semivida mayor a las
dos horas a 92,5C, 40 minutos a 95C y 9 minutos a 97,5C. Esta
enzima puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en
menos de 10 segundos funcionando a 72C de temperatura.4
Uno de los inconvenientes de la Taq es su relativamente baja fidelidad.
Carece de actividad correctora de errores 5'3'exonucleasa,4 y posee

una tasa de introduccin de errores de aproximadamente 1 cada 9.000

nucletidos.5 Sin embargo los dos dominios restantes pueden actuar en
coordinacin por medio del movimiento acoplado de dominios.6 Se han
aislado algunas otras polimerasas de ADN de otras bacterias termoflicas
y arqueas, tales como la polimerasa Pfu (aislada de Pyrococcus furiosus)
que s poseen actividad correctora de errores; estas polimerasas se
utilizan solas o combinadas con la Taq cuando se requiere una
amplificacin de alta fidelidad.
La polimerasa Taq produce ADNs que poseen una adenina terminal no
apareada colgando de su extremo 3'. Esto puede resultar til en tcnicas
de clonacin TA, donde unvector de clonacin (tal como por ejemplo
un plsmido) que posee una timina 3' sobresaliente puede ser utilizado
para complementar la adenina sobresaliente del producto de la PCR,
permitiendo de esta forma ligar el producto de PCR dentro del vector
plsmido.
PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION ADN

Etapas en la extraccin de ADN Los pasos necesarios para una correcta

extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico
son:
1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotr- picas ayudan a romper la
estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los
cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un
detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las
membranas.
2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue
mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el
acetato sdico.
3. Purificacin. Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se
puede precipitar etanol fro o isopropanol i recuperar mediante una

centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas

previamente.
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse
Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn
Tris tras ser secado completamente. La confirmacin de la presencia de
ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa i
posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o
directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de
200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar con un
espectrofluormetro mediante el uso de fluorforos especficos
(Picogreen, Molecular Probes)
Componentes. Una molcula de ADN consta de dos cadenas en hlice,
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de
cido
fosfrico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases pricas y
pirimidnicas,
lo que constituye una estructura helicoidal dextrgira, y lleva la
informacin gentica
codificada en la secuencia de las bases. En las clulas eucariticas, la
mayor parte
del ADN se encuentra en el ncleo y se conoce como ADN cromosmico.
Est
separado del resto de la clula (citoplasma) por una membrana de dos
capas
(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN
extracromosmico en las
mitocondrias y cloroplastos.
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucletidos, son los
siguientes:
dATP, desoxiadenosina-trifosfato;
dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;
dTTP, desoxitimidina-trifosfato;
dCTP, desoxicitidina-trifosfato.
Para mayor facilidad, estos cuatro nucletidos se denominan dNTP (por
las siglas en
ingls de desoxinuclesido-trifosfato). Un nucletido est formado por
tres grandes
partes: una base prica (adenina, A, o guanina, G), o una base
pirimidnica (citosina,

C, o timina, T), un azcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato.

Como se
muestra en la figura 1, una base prica o pirimidnica est unida a un
anillo de
pentosa por un enlace N-glucosdico, y un grupo fosfato est unido al
tomo de
carbono 5' del azcar por un enlace dister. En el cido ribonucleico,
ARN, la timina
est sustituida por el uracilo (U) y la molcula de desoxirribosa por la
ribosa

La replicacin del ADN es el proceso en que se basa la amplificacin por PCR, y

se
va a describir en detalle.
Durante la replicacin, la molcula de ADN se desenrolla y cada cadena se
convierte
en un ADN molde para la sntesis de una cadena complementaria nueva. Cada
molcula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una
copia
exacta de la molcula madre.
Figura 4.