Inhibición Enzimática

Ingeniera de las enzimas 2014
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Cintica de las reacciones
Las mediciones cinticas de reacciones catalizadas enzimticamente estn entre las tcnicas ms poderosas
para elucidar los mecanismos catalticos de las enzimas. La cintica enzimtica es una rama de la cintica
qumica por tanto comparte rasgos de la cintica qumica.
D|
Las reacciones bisustrato siguen una de varias ecuaciones de velocidad
Hasta aqu hemos estado preocupados con las reacciones simples de un solo sustrato que obedecen el
modelo de Michaelis-Menten. No obstante, las reacciones enzimticas que requieren mltiples sustratos y
rinden mltiples productos son muy comunes. En verdad, aquellas que involucran dos sustratos y rinden
dos productos
suman aproximadamente el 60% de las reacciones bioqumicas conocidas. Casi todas ellas llamadas
reacciones bisustrato son reacciones de transferencia en las cuales la enzima cataliza la transferencia de un
grupo funcional especfico, X, de uno de los sustratos al otro:
O reacciones de xido-reduccin en las cuales equivalentes reductores son transferidos entre dos sustratos.
Por ejemplo, la hidrlisis de un enlace peptdico por la tripsina es la transferencia del grupo carbonilo del
tomo de N del pptido al agua (a), mientras que en la reaccin de la alcohol deshidrogenasa, un ion
hidruro es formalmente transferido del etanol al NAD+ (b). A pesar de que las reacciones bisustrato pueden,
en principio, ocurrir a travs de una vasta variedad de mecanismos, solamente se observan comnmente
unos pocos tipos.
Traducido por: Cecilia Carpio
Las reacciones secuenciales ocurren va desplazamientos simples. Las reacciones en las cuales todos
los sustratos deben combinarse con la enzima antes de que pueda ocurrir la reaccin y sean liberados los
productos se conocen como reacciones secuenciales. En tales reacciones, el grupo que est siendo
transferido, X, es pasado directamente desde A (=P-X) a B, rindiendo P+Q (=B-X). As, tales reacciones se
llaman tambin reacciones de desplazamiento simple.
Las reacciones secuenciales se pueden subclasificar en aquellas con un orden obligatorio de adicin de
sustrato a la enzima, a las cuales se dice que tienen un mecanismo ordenado, y aquellas sin preferencia por
el orden de adicin de sustrato, las cuales se describen como que tienen un mecanismo al azar. En el
mecanismo ordenado, el enlazamiento del primer sustrato aparentemente se requiere para formar el sitio de
enlazamiento para el segundo sustrato, mientras en el mecanismo al azar, ambos sitios de enlazamiento
estn presentes en la enzima libre.
En la notacin desarrollada por W.W. Cleland, los sustratos se designan mediante las letras A y B en el
orden en el cual se aaden a la enzima, los productos se designan como P y Q en el orden que dejan la
enzima, la enzima est representada por una lnea horizontal, y las adiciones sucesivas de sustrato y
liberaciones de productos son designados por flechas verticales.
Una reaccin bisustrato ordenada se diagrama por tanto:
donde A y B se dice que son los sustratos lider y siguiente, respectivamente. Muchas deshidrogenasas que
requieren NAD+ y NADP+ siguen un mecanismo bisustrato ordenado en el cual el coenzima es el sustrato
lder.
Una reaccin bisustrato al azar se diagrama:

Algunas deshidrogenasas y quinasas operan a travs de mecanismos bisustrato al azar (las quinasas son
enzimas que transfieren grupos fosforilo del ATP a otros compuestos o viceversa).
Las reacciones ping pong ocurren va doble desplazamiento. Las reacciones de transferencia de grupo
en las cuales uno o ms productos son liberados antes de que todos los sustratos hayan sido aadidos se
conocen como reacciones ping pong. La reaccin ping pong bisustruato se representa por:
Aqu, un grupo funcional X del primer sustrato A (=P-X) es desplazado desde el sustrato mediante la
enzima E para rendir el primer producto P y una forma estable de la enzima F (=E-X) en la cual X est
fuertemente (con frecuencia covalentemente) enlazado a la enzima (Ping). En la segunda etapa de la
reaccin, X es desplazada desde la enzima por el segundo sustrato B para rendir el segundo producto Q
(=B-X), regenerando por tanto la forma original de la enzima, E (Pong). Tales reacciones son, por tanto,
conocidas como reacciones de doble desplazamiento. Note que en las reacciones ping pong, los sustratos
A y B no se encuentran el uno al otro en la superficie de la enzima. Muchas enzimas, incluyendo la tripsina
(en la cual F es el intermediario acil-enzima), transaminaciones y algunas flavoenzimas, reaccionan con
mecanismos Ping Pong.
Los mecanismos bisustrato se pueden distinguir mediante mediciones cinticas. Las ecuaciones de
velocidad que describen los mecanismos bisustrato foregoing son considerablemente ms complicadas que
la ecuacin para una reaccin de un solo sustrato. De hecho, las ecuaciones para mecanismos bisustrato
contienen tantas constantes cinticas como 4 versus 2 (V mx y KM) para la ecuacin de Michaelis-Menten.
No obstante, se pueden usar las medidas cinticas en estado estacionario para distinguir entre los varios
mecanismos bisustrato.
Las ecuaciones de velocidad para mecanismos ping pong son claramente complejas de derivar y se requiere
usualmente varias aproximaciones a fin de obtener expresiones cinticas coherentes. Una expresin
simplificada de velocidad ha sido propuesta por Marangoni basada en el hecho de que el paso limitante de
la velocidad es la transicin desde el complejo secundario EB a EQ.
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Inhibicin de enzimas
Muchas sustancias alteran la actividad de una enzima combinndose con ella de forma que influye el
enlazamiento del sustrato y/o el nmero de recambio.Las sustancias que reducen la actividad de la enzima
en esta forma se conocen como inhibidores.Gran parte del arsenal farmacutico moderno consta de
inhibidores de enzimas. Por ejemplo, el SIDA es tratado casi exclusivamente con drogas que inhiben las
actividades de una variedad de enzimas virales.
Los inhibidores de enzimas actan a travs de una variedad de mecanismos. Los inhibidores irreversibles
de enzimas, o inactivadores, se ligan a la enzima tan fuertemente que bloquean permanentemente la
actividad de la enzima. Los reactivos que modifican qumicamente residuos de aminocidos especficos
pueden actuar como inactivadores. Por ejemplo, los compuestos usados para identificar los residuos
catalticos de Ser e His de las serinproteasas son inactivadores de estas enzimas.
Los inhibidores de enzima reversibles disminuyen la actividad de la enzima interactuando reversiblemente
con ella. Algunos inhibidores de enzima son sustancias que se parecen estructuralmente a los sustratos de
las enzimas pero bien sea que no reaccionan o reaccionan muy lentamente. Estas sustancias se usan
comnmente para probar la naturaleza qumica y conformacional del sitio activo de una enzima en un
esfuerzo por aclarar el mecanismo cataltico de las enzimas. Otros inhibidores afectan la actividad cataltica
sin interferir con el enlazamiento del sustrato.
A|
La inhibicin competitiva involucra el enlazamiento del inhibidor en el sitio activo de la
enzima
Una sustancia que compite directamente con un sustrato normal por el sitio de enlazamiento del sustrato de
la enzima se conoce como inhibidor competitivo. Tal inhibidor usualmente se parece al sustrato de modo
que se enlaza especficamente al sitio activo pero difiere del sustrato de modo que no puede reaccionar
como el sustrato lo hace. Por ejemplo, la succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo del cido ctrico
que convierte el succinato a fumarato, es inhibida competitivamente por el malonato, el cual se parece
estructuralmente al succinato pero no puede ser deshidrogenado:
La efectividad del malonato como inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa fuertemente

sugiere que el sitio de enlazamiento del sustrato de la enzima est diseado para ligar ambos grupos
carboxilato del sustrato, presumiblemente a travs de la influencia de residuos positivamente cargados
colocados apropiadamente.

Principios similares son responsables para la inhibicin por producto. En este fenmeno, un producto de
la reaccin, el cual necesariamente es capaz de enlazarse al sitio activo de la enzima, puede acumularse y
competir con el sustrato para el enlazamiento a la enzima en ciclos catalticos subsecuentes. La inhibicin
por producto es una va mediante la cual las clulas controlan las actividades de sus enzimas.
Los anlogos del estado de transicin son inhibidores particularmente efectivos. Esto es porque la
catlisis efectiva depende de la capacidad de la enzima para ligarse a y estabilizar el estado de transcin de
la reaccin. Un compuesto que imite el estado de transicin explota estas interacciones de enlazamiento en
formas que un sustrato o anlogo de sustrato no puede. Por ejemplo, la adenosin desaminasa convierte el
nuclesido adenosina a inosina como sigue:
La KM de la enzima para el sustrato adenosina es 3 x 10-5M. El producto adenosina acta como un inhibidor de la
reaccin, con una constante de inhibicin (KI, la constante de disociacin del enlazamiento enzima-inhibidor) de 3 x
10-4. Sin embargo, un anlogo del estado de transicin, inhibe la reaccin con una KI de 1.5 x 10-13 M.
El grado de inhibicin competitiva vara con la fraccin de enzima que ha enlazado al inhibidor. El modelo general
para la inhibicin competitiva est dado por el siguiente esquema de reaccin:
Aqu, I es el inhibidor, EI es el complejo enzima-inhibidor inactivo, y se asume que el inhibidor se enlaza

reversiblemente a la enzima y est en rpido equilibrio con ella de modo que
Un inhibidor competitivo por tanto reduce la concentracin de la enzima disponible para el enlazamiento
con el sustrato.
La ecuacin de Michaelis-Menten para una reaccin inhibida competitivamente se deriva como antes, pero
con un trmino adicional para incluir la fraccin de la [E]T que se enlaza a I para formanar EI ([E]T = [E] +

[ES] + [EI]). La ecuacin resultante, es la ecuacin de Michaelis que ha sido modificada por un factor, ,
que se define como
12-31
12-32
Note que , una funcin de la concentracin del inhibidor y su afinidad por la enzima, no puede ser menos
de 1. La comparacin de las ecuaciones 12-25 y 12-31 indica que
donde
es la KM
aparente, esto es, el valor de KM que se medira en ausencia del conocimiento de que el inhibidor est
presente. La figura 12-6 muestra los grficos hiperblicos de la ecuacin 12-31 para valores crecientes de
. La presencia de I hace que [S] parezca ser menor que lo que realmente es (hace que K M parezca ser ms
grande de lo que realmente es), una consecuencia del enlazamiento de I y S a E que es mutuamente
excluyente. Sin embargo, incrementando [S] puede overwhelm al inhibidor competitivo. De hecho, es el
factor por el cual [S] se debe incrementar a fin de superar el efecto de la presencia del inhibidor.
Conforme [S] se aproxima a infinito, v0 se aproxima a Vmx para cualquier valor de (que es, para
cualquier concentracin del inhibidor). As, el inhibidor no afecta el nmero de recambio de la enzima.
La inhibicin competitiva es el principio detrs del uso de etanol para tratar el envenenamiento por
metanol. El metanol por s mismo es solo ligeramente txico. Sin embargo, la enzima heptica alcohol
deshidrogenasa convierte el metanol a formaldehdo altamente txico, que con solo pequeas cantidades
causa la seguera y muerte. El etanol compite con el metanol por el enlazamiento al sitio activo de la alcohol
deshidrogenasa heptica, enlenteciendo por tanto la produccin de formaldehdo a partir de metanol (el
etanol es convertido a acetaldehdo rpidamente metabolizable):
As, a travs de la administracin de etanol, una gran porcin del metanol ser excretada del cuerpo sin
peligro en la orina antes de que pueda ser convertido a formaldehdo. El mismo principio subyace el uso de
etanol para tratar el envenenamiento por el anticongelante (etilen glicol, HOCH2 CH2OH), el cual debido a
su sabor dulce, con frecuencia aflige a perros y gatos.
KI puede ser medido. Replanteando la ecuacin 12-31 en la forma de dobles recprocas rinde:
12-33

Un grfico de esta ecuacin es lineal y tiene una pendiente de KM/Vmx, un intercepto en 1/S de -1/KM y
un intercepto en 1/v0 de 1/Vmx (Fig. 12-7). Los grficos de doble recproco para un inhibidor competitivo a
varias concentraciones de I intercepta en 1/Vmx sobre el eje 1/v0, una propiedad que es diagnstico de la
inhibicin competitiva.
El valor de KI para un inhibidor competitivo se puede determinar a partir del grfico de
vs [I]; su intercepto sobre el eje [I] es KI. KI tambin puede ser calculada a partir de la ecuacin
12-32 si
se determina a una [I] conocida para una enzima de
conocido. El comparar los
valores de KI de inhibidores competitivos con diferentes estructuras puede proporcionar informacin sobre
las propiedades de enlazamiento de una enzima al sitio activo y por tanto su mecanismo cataltico. Por
ejemplo, para determinar la importancia de los varios segmentos de la molcula de ATP para enlazarse al
sitio activo de las enzimas que requieren ATP, uno, debe determinar la K I, dgase para ADP, AMP, ribosa,
trifosfato, etc. Dado que muchos de estos componentes no son reactivos, los estudios de inhibicin son los
mtodos ms convenientes de monitorear su enlazamiento a la enzima.
Los estudios de inhibicin competitiva tambin se usan para determinar las afinidades de los anlogos del
estado de transicin para el sitio activo de una enzima. Por ejemplo, los inhibidores de la proteasa del VIH
han sido diseados para imitar el estado de transicin y as enlazarse a la enzima con alta afinidad. Los
estudios de los inhibidores son los pilares fundamentales del desarrollo de tales drogas.

B|
La inhibicin incompetitiva involucra el enlazamiento del inhibidor al complejo EnzimaSustrato.
En la inhibicin incompetitiva, el inhibidor se enlaza directamente al complejo enzima-sustrato pero no a la
enzima libre:
En este caso, el paso de enlazamiento del inhibidor tiene la constante de disociacin
El enlazamiento del inhibidor incompetitivo, el cual no necesita parecerse al sustrato, presumiblemente

distorsiona el sitio activo, rindiendo por tanto la enzima catalticamente inactiva.
La ecuacin de Michaelis-Menten para la inhibicin incompetitiva y la ecuacin para sus dobles recprocos
estn dadas en la Tabla 12-2. El grfico de doble recprocos consiste de una familia de lneas paralelas (Fig
12-8) con pendiente KM /Vmx, el intercepto de 1/v0 de /Vmx, y el intercepto de 1/[S] de -/KM. Note que
en la inhibicin incompetitiva, ambos
disminuyen, pero que
. En contraste al caso para la inhibicin competitiva, la adicin de sustrato no revierte el efecto de

del inhibidor incompetitivo porque el enlazamiento del sustrato no interfiere con el enlazamiento del
inhibidor incompetitivo.

El inhibidor incompetitivo requiere que el inhibidor afecte la funcin cataltica de la enzima pero no su
enlazamiento del sustrato. Esto es difcil de imaginar para enzimas de un solo sustrato. En realidad, la
inhibicin incompetitiva es significativa solamente paa enzimas multisustrato.
C|
La inhibicin mezclada involucra el enlazamiento del inhibidor a ambos a la enzima libre y al
complejo Enzima-sustrato
Muchos inhibidores reversibles interactan con la enzima en forma que afecta el enlazamiento al sustrato
as como la actividad cataltica. En otras palabras, ambas, la enzima y el complejo enzima-sustrato enlazan
al inhibidor, dando como resultado el siguiente modelo:
Este fenmeno se conoce como inhibicin mezclada (alternativamente, inhibicin no competitiva).

Presumiblemente, un inhibidor mezclado se enlaza a los sitios de la enzima que participan en ambos: el
enlazamiento al sustrato y la catlisis. Por ejemplo, los iones metlicos, los cuales no compiten
directamente con los sustratos por el enlazamiento al sitio activo de la enzima, como lo hacen los
inhibidores competitivos, pueden actuar como inhibidores mezclados. Las dos constantes de disociacin
para el enlazamiento al inhibidor no son necesariamente equivalentes.
12-25
La ecuacin de Michaelis-Menten y la ecuacin de doble recprocos correspondiente para la inhibicin
mezclada estn dadas en la Tabla 12-2. Como en la inhibicin incompetitiva, los valores aparentes de KM y
Vmx estn modulados por la presencia del inhibidor. El nombre inhibicin mezclada proviene del hecho de
que el denominador de la ecuacin de Michaelis-Menten tiene el factor multiplicando a la KM como en la
inhibicin competitiva y el factor multiplicando a la concentracin de sustrato [S] como en la inhibicin
incompetitiva. As KMapp = (/) KM y Vmxapp = Vmx/.
Dependiendo de los valores relativos de y (y por tanto KI y KI), KMapp puede incrementar (como en la
inhibicin competitiva) o disminuir. Si la enzima y el complejo enzima-sustrato se enlazan a I con igual
afinidad, entonces = y el valor de KMapp no cambia con relacin a KM para la reaccin en ausencia de
inhibidor. En este caso, solamente V mx es afectado, un fenmeno que se llama inhibicin no competitiva
pura.
Los grficos de doble recproco para la inhibicin mezclada consta de lneas que tienen la pendiente KM/
Vmx, un intercepto de /Vmx y un intercepto en 1/S de / KM. Las lneas para valores crecientes de [I]
(que representan saturacin creciente de E y ES con I) intersectan a la izquierda del eje 1/V 0. Para la
inhibicin no competitiva pura, las lineas intersectan sobre el eje 1/S a -1/ KM. Como con la inhibicin
incompetitiva, el enlazamiento del sustrato no revierte los efectos de la inhibicin mezclada.
La cintica de un inactivador de enzima (inhibidor irreversible) se parece a aquella de un inhibidor no

competitivo puro porque el inactivador reduce la concentracin de la enzima funcional a todas las
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concentraciones de sustrato. Consecuentemente, Vmx disminuye y KM no cambia. Los grficos de doble
recproco para inactivacin irreversible se parecen por tanto a aquellos de la inhibicin no-competitiva pura
(las lneas intersectan sobre el eje 1/[S].
REFERENCIA
Voet,D., Voet, J.G. and Pratt, C.W. . 2008. Fundamentals of Biochemistry. Life at the molecular level.
pp. 377-393.
Determinacin de los parmetros cinticos para reacciones monosustrato bajo

inhibicin
Una forma conveniente de expresar las ecuaciones de velocidad para reacciones sujetas a inhibicin es en
trminos de parmetros aparentes:
Donde los parmetros VAP y KAP son funciones de la concentracin del inhibidor.
Para la inhibicin competitiva: KAP> K y VAP = V.
Para inhibicin no competitiva pura: KAP = K y VAP < V
Para el tipo de inhibicin mezclada hay tres casos:
i.
ii.
iii.
KAP > K y VAP < V

KAP > K y VAP > V
KAP < K y VAP < V
En la inhibicin mezclada, caso i, el efecto neto ser negativo independientemente de los valores de KAP y
VAP. En los otros dos casos el efecto neto podra ser negativo (inhibicin) o positivo (activacin)
dependiendo de los valores de KAP y VAP. Si Kap<K y VAP>V el efecto neto ser positivo (activacin)
independientemente de los valores de KAP y VAP. La activacin por productos de la reaccin no es tan
frecuente como la inhibicin, pero se han reportado casos donde la activacin por producto es significativa.
Excepto para el caso de inhibicin incompetitiva por alta concentracin de sustrato, todos los mecanismos
de inhibicin pueden ser representados mediante la ecuacin 3.45 la cual es una expresin muy conveniente
para determinar los parmetros cinticos de las ecuaciones de velocidad correspondientes.
La determinacin experimental de los parmetros cinticos para los mecanismos de inhibicin siguen el
mismo patrn como en la cintica simple de Michaelis-Menten. Los mtodos de linealizacin son
particularmente tiles para determinar el mecanismo de inhibicin como un paso previo para la
cuantificacin de los parmetros cinticos. El diseo experimental consiste de una matriz en la cual los
datos de velocidad inicial son obtenidos a diferentes concentraciones de sustrato y de inhibidor (S e I,
respectivamente). El inhibidor se considera aqu en trminos generales como cualquier sustancia que ejerce
inhibicin, sea sta el producto de la reaccin, o un compuesto catalticamente inerte. Por supuesto la
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inhibicin por productos y/o por sustrato es ms tecnolgicamente relevante, puesto que a los inhibidores
catalticamente inertes simplemente se los puede mantener fuera del medio de reaccin.
Si se linealizan los datos usando el grfico de dobles recprocas de Lineweaver-Burk:
La representacin grfica de la ecuacin 3.46 para todos los mecanismos est en la Fig 3.5. Los grficos de
Lineweaver-Burk son muy tiles para determinar los mecanismos cinticos. La inhibicin competitiva se
representar mediante lneas rectas con un intercepto comn en el eje Y, mientras la inhibicin no
competitiva pura se representar mediante lneas rectas con un intercepto comn en el eje X. La inhibicin
incompetitiva se representar mediante lneas paralelas (no si el sustrato mismo es el inhibidor puesto que
en ese caso no se obtienen lneas rectas). La inhibicin mezclada se representar mediante lneas que se
interceptan en algn lugar del segundo cuadrante lejos de los dos ejes. Los resultados tienen que ser
juiciosamente analizados y validados estadsticamente para determinar apropiadamente el mecanismo que
ms cercanamente representa los datos experimentales.
Una vez que se ha identificado el mecanismo de inhibicin, las expresiones para los parmetros cinticos
aparentes para cada mecanismo de inhibicin se obtienen a partir de la ecuacin 3.41 y la Tabla 3.4. Sus
valores se determinan experimentalmente a partir de los interceptos de los grficos de dobles recprocos,
como se muestra en la Fig. 3.5 y luego, usando grficos lineales secundarios, se pueden determinar las
constantes cinticas correspondientes como se muestra en la Fig. 3.6.
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Los mecanismos totales y parciales no se discriminan fcilmente en grficos de dobles recprocos. Para
evaluar la naturaleza total o parcial de la inhibicin, un grfico de V AP vs I es adecuado dado que en el
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primer caso V tender a cero conforme I se incrementa, mientras en el segundo caso tender a un valor
finito como se muestra en la Fig. 3.7. El parmetro V se puede determinar convenientemente como el
lmite de VAP cuando I tiende a infinito. De hecho:
donde KI representa K2, K2 y K para inhibicin no competitiva, mezclada e incompetitiva,

respectivamente. La regresin no lineal de los datos permite la determinacin directa de V a partir del
grfico. El error ser ms alto cuando el inhibidor es poco soluble y no son alcanzables valores altos de I.
Para la determinacin experimental de los parmetros cinticos de inhibicin es deseable usar no menos de
8 concentraciones de sustrato y 5 concentraciones iniciales de inhibidor (incluyendo cero), los puntos de
datos deben estar igualmente distribuidos y el rango de concentraciones de sustrato e inhibidor deben
contener los valores de las constantes de Michaelis-Menten e inhibicin respectivamente.
REFERENCIAS
Illanes (editor) Enzyme biocatalysis. Principles and Applications. Captulos 3.
3|
Control de la actividad enzimtica
Un organismo puede ser capaz de controlar las actividades enzimticas de sus enzimas componentes de
modo que pueda coordinar sus numerosos procesos metablicos, responder a cambios en su
medioambiente, y crecer y diferenciarse, todo ordenadamente. Hay dos formas que esto pueda ocurrir:
1. Control de la disponibilidad de enzima. La cantidad de una enzima dada en una clula depende de
ambas, su velocidad de sntesis y su velocidad de degradacin. Cada una de estas velocidades es
controlada directamente por la clula y est sujeta a cambios dramticos en el espacio de minutos (en
las bacterias) a horas (en organismos superiores).
2. Control de la actividad enzimtica. La actividad cataltica de la enzima puede ser controlada
directamente a travs de alteraciones estructurales que influyen la afinidad de enlazamiento del sustrato
de la enzima o el nmero de recambio. Justo como la afinidad de enlazamiento del oxgeno de la
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hemoglobina es regulado alostricamente mediante el enlazamiento de ligandos tales como el O2, CO2,
H+ y BPG , la afinidad de enlazamiento del sustrato de la enzima puede igualmente variar con el
enlazamiento de pequeas molculas, llamadas efectores alostricos. Los mecanismos alostricos
pueden causar grandes cambios en la actividad enzimtica. Las actividades de muchas enzimas estn
similarmente controladas mediante modificacin covalente, usualmente fosforilacin y
desfosforilacin de residuos especficos de Ser, Thr o Tyr.
A|
El control alostrico involucra el enlazamiento a un sitio diferente al sitio activo de la enzima

El control alostrico de la actividad enzimtica considerando el ejemplo de la aspartato transcarbomilasa
(ATCasa) de E. coli.
Esta reaccin es el primer paso nico para la biosntesis de pirimidinas. El comportamiento alostrico de la
ATCasa de E. coli ha sido estudiado por John Gerhart y Howard Schachman, quienes demostraron que ambos
sustratos se unen cooperativamente a la enzima. Ms an, la ATCasa es inhibida alostricamente por citidina
trifosfato (CTP), un nucletido de pirimidina, y es activada alostricamente por adenosina trifosfato (ATP), un
nucletido de purina.
La curva de v0 versus [S] para la ATCasa (Fig 12-10) es sigmoidal, antes que hiperblica como en las enzimas
que siguen el modelo de Michaelis-Menten. Esto es consistente con el enlazamiento cooperativo del sustrato. Los
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efectores alostricos de la ATCasa desvan la curva completa hacia la derecha o hacia la izquierda: A una
concentracin de sustrato dada, la CTP disminuye la velocidad cataltica de la enzima, mientras el ATP la
incrementa.
La CTP, la cual es el producto de la va de biosntesis de pirimidina, es un ejemplo de un inhibidor por
retroalimentacin, puesto que inhibe un paso de los primeros de su propia biosntesis (Fig. 12-11). As, cuando
los niveles de CTP son altos, CTP se liga a la ATCasa, reduciendo, por tanto, la velocidad de sntesis de CTP. A
la inversa, cuando la [CTP] disminuye, la CTP se disocia de la ATCasa y la biosntesis de CTP se acelera.
Inhibicin por retroalimentacin
Es un fenmeno en el cual un
metabolito, generalmente el producto
final de una ruta metablica, inhibe la
actividad de una enzima anterior que
generalmente es la primera de la
secuencia.
En la inhibicin por retroalimentacin
Inhibicin alostrica, el inhibidor
(producto final) no se parece en tamao,
forma o carga al sustrato de la enzima.
El significado metablico de la activacin del ATP por la ATCasa es que tiende a coordinar las velocidades de
sntesis de nucletidos de purina y pirimidina, los cuales se requieren en cantidades aproximadamente iguales en
la biosntesis de cidos nucleicos. Por ejemplo, si la concentracin de ATP es mucho ms grande que aquella de
CTP, la ATCasa es activada para sintetizar nucletidos de pirimidina hasta que las concentraciones de ATP y
CTP se lleguen a balancear. A la inversa, si la concentracin de CTP es ms grande que la ATP, la inhibicin de
la ATCasa por la CTP permite la biosntesis de nucletidos de purina para balancear las concentraciones de ATP
y CTP.
Los cambios alostricos alteran los sitios de unIn al sustrato de la ATCasa. La ATCasa de E. coli (300 kD)
tiene una composicin c6r6, donde c y r representan sus subunidades catalticas y regulatorias. Las subunidades
catalticas estn arregladas como dos grupos de trmeros (c3) en complejo con tres grupos de dmeros regulatorios
(r2). Cada dmero regulatorios une dos subunidades cataltcias en trmeros c3 diferentes. Los trmeros catalticos
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aislados son catalticamente activos, tienen una mxima velocidad cataltica que aquella de la ATCasa intacta,
exhiben una curva de saturacin de sustrato hiperblica no cooperativa, y no son afectadas por la presencia de
ATP o CTP. Los dmeros regulatorios aislados enlazan a los efectores alostricos pero carecen de actividad
enzimtica. Evidentemente, las subunidades alostricamente reducen la actividad de las subunidades catalcas en
la enzima intacta.
Como la teora alostrica produce, el activador ATP preferencialmene enlaza al estado activo de la ATCasa (R
relajada o de alta actividad), mientras el inhibidor CTP se enlaza preferencialmente al estado de la enzima
inactiva (T tensa o sustrato de baja afinidad). Similarmente, el anlogo anlogo bisustrato no negativo N al estado
R pero no al estado T de la ATCasa.
El enlazamiento de los modificadores alostricos causa cambios estructurales en la ATCasa. La base estructura
para los efectos de la CTP y APT sobre la actividad de la ATCasa han sido develados parcialmente. Ambos el
inhibidor CTP y el activador ATP se ligan al mismo sitio sobre el filo ms externo de la subunidad regulatoria,
alrededor de 60 lejos del sitio catltico ms cercano. CTP se liga preferencialmente al estado T, incrementando
su estabilidad, mientras el ATP se enlaza preferencialmente al estado R, incrementando su estabilidad.
El enlazamiento de CTP y ATP a sus estados de la enzima menos favorecidos tambin tienen consecuencias
estructurales. Cuando CTP se enlaza al estado R de la ATCasa, induce a la contraccin en el dmero regulatorio
que causa que los trmeros catalticos se unan alrededor de 0.5 (volvindose ms parecido al estado T, menos
activo). Este, a su vez, reorienta residuos claves en los sitios activos de la enzima, decreciendo por tanto la
actividad cataltica de la enzima. El ATP tiene esencialmente efectos opuestos cuando se enlaza al estado T de la
enzima: esto causa que los trmeros catalticos se separen 0.4 (volvindose ms parecido a R, que es, ms
activo), reorientando por tanto residuos claves en los sitios catalticos de la enzima como para incrementar la
actividad cataltica de la enzima.
B|
El control por modificacin covalente usualmente involucra fosforilacin de la protena
Adems de las interacciones alostricas, muchas enzimas pueden estar sujetas a control por modificacin
covalente. En eucariotes, la ms comn de tales modificaciones es la fosforilacin y desfosforilacin (en
enlazamiento y remocin de un grupo fosforilo) del grupo hidroxilo de residuos de Ser, Thr o Tyr.
Tales procesos enzimticos de modificacin/desmodificacin, los cuales son catalizados por enzimas conocidas como
protenquinasas y protenfosfatasas, alteran las actividades de las protenas modificadas. En verdad, 30% de
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protenas humanas, que colectivamente participan en casi todos los procesos biolgicos, estn sujetos a control por
fosforilacin reversible.
Como ejemplo de una enzima cuya actividad es controlada por modificacin covalente, est la glucgeno fosforilasa
(o simplemente fosforilasa), la cual catliza las fosforlisis (ruptura del enlace mediante sustitucin de un grupo
fosfato) del glucgeno (polisacrido similar al almidn que consiste principalmente de residuos de glucosa unidos por
enlace (1-4); para rendir glucosa-1-fosfato (G1P):
Este es el paso que controla la velocidad en la va metablica de ruptura del glucgeno, un suminstrador importante de
combustible para actividades metablicas.
Los mamferos expresan tres isozimas (catalticamente y estructuralmente similares pero genticamente distintas a
partir del mismo organismo; tambin llamadas isoformas) de glucgeno fosforilasa, aquellos del msculo, cerebro e
hgado. La glucgeno fosforilasa del msculo, es un dmero de unidades idnticas de 842-residuos. Est regulada tanto
por interacciones alostricas y por fosforilacin y desfosforilacin. La forma fosforilada de la enzima, la fosforilasa a,
tienen un grupo fosforilo esterificado a su Ser 14. La forma desfosfo se llama fosforilasa b.
Las dos fosforilasas a y b tienen un dominio N-terminal (484 residuos; el dominio conocido ms grande) y un dominio
C terminal pequeo. El dominio N-terminal contiene el sitio de fosforilacin (Ser 14), un sitio para efector alostrico,
un sitio de enlazamiento a glucgeno (llamado el sitio de almacenamiento del glucgeno), y todos los contactos
intersubunidades en el dmero. El sitio activo de la enzima est localizado al centro.
La desfosforilacin y desfosforilacin pueden alterar la actividad enzimtica que se parece a control alostrico. La
glucgeno fosforilasa tiene dos estados conformacionales, la forma R y (residuos 282-284) que bloquea el acceso del
sustrato a su sitio de enlazamiento. En contraste, en el estado R de la enzima, la cadena lateral de la Arg 569 se ha
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orientado como para ligar el ion fosfato sustrato y el lazo 282-284 no bloquea ms el sitio activo, permitiendo, por
tanto, que la enzima se ligue al sustrato y catalice efectivamente la fosforlisis del glucgeno.
La fosforilacin de la Ser 14 promueve el cambio de la conformacin de la fosforilasa T(inactiva) R (activa). Ms
an, estas diferentes formas enzimticas responden a diferentes factores alostricos (Fig. 12-16). As el ATP y la G6P;
a la cual el producto G1P de la reaccin de la reaccin de la glucgeno fosforilasa es convertido preferencialmente se
ligue al estado T de la fosforilasa b y, al hacer esto, inactive a la enzima, mientras el AMP se liga preferencialmente al
estado R de la fosforilasa b y por tanto la inactive. En contraste, el efector de solo la fosforilasa a es la glucosa, la cual
se enlaza al estado tenso T e inactiva la enzima. Note que ATP, G6P y glucosa estn presentes en concentraciones
relativamente altas en el msculo bajo condiciones de bajo ejecicio, un estado cuando la degradacin del glucgeno
sera superficial, mientras el AMP est presente en concentracin relativamente alta en los msculos bajo condiciones
de alto ejercicio, un estado cuando la G1P, producto de la reaccin de la fosforilasa ayuda a proveer combustible a la
contraccin muscular.
El grupo fosfato, con su doble carga negativa (una propiedad no compartida con los residuos de aminocido que se
producen normalmente) y su acoplamiento covalente a la protena, puede inducir dramticos cambios
conformacionales. En la fosforilasa a, el grupo fosfato de la Ser 14 forma pares inicos con dos cadenas laterales
catinicas de la Arg, enlazando por tanto el sitio activo, la interfase de la subunidad, y la regin N-terminal, habiendo
sufrido la ltima una gran desviacin conformacional desde su posicin en el estado T de la enzima. Estas
interacciones de enlazamiento causa que las hlices de la torre de la glucgeno fosforilasa se desven y tiren separando
como para empacar ms favorablemente, lo cual a su vez dispara una transicin T R, la cual consiste
principalmente de una rotacin relativa de las dos subunidades de 10. As el fosfato de la Ser 14 funciona como una
clase de efector alostrico interno que desva el equilibrio TR de la enzima a favor del estado R.
Las cascadas de las proten-quinasas hacen posible respuestas sensibles a necesidades metablicas. Las enzimas que
catalizan la fosforilacin y desfosforilacin de la glucgeno fosforilasa se llaman fosforilasa quinasa y fosfoprotenfosfatasa (Fig. 12-16). Las actividades de estas enzimas posteriores se controlan a s mismas, de ambas formas
alostricamente o por fosforilacin. As, secuencias de proten-quinasas y proten-fosfatasas, ambas se enlazan en
forma de casacadas (Ej. la protena quinasa X fosforila a la proten-quinasa Y, la cual fosforila a la proten-quinasa Z),
tienen mucha mayor capacidad para la amplificacin de la seal (un pequeo cambio fraccional en la concentracin
del efector causa un cambio fraccional ms grande en la actividad de la enzima) y flexibilidad en respuesta a un mayor
nmero de efectores alostricos (la actividad de cada protena en la cascada puede ser influenciada por diferentes
grupos de efectores) que una enzima alostrica simple. En verdad, justo tales cascadas permiten a la glucgeno
fosforilasa responder con mayor sensibilidad a las necesidades metablicas del organismo.
REFERENCIAS
Voet,D., Voet, J.G. and Pratt, C.W. . 2008. Fundamentals of Biochemistry. Life at the molecular level.
pp. 377-393.
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El enlazamiento del inhibidor incompetitivo, el cual no necesita parecerse al sustrato, presumiblemente

disminuyen, pero que

. En contraste al caso para la inhibicin competitiva, la adicin de sustrato no revierte el efecto de

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