Food Research International

Disponible en lnea 25 de junio 2013

En prensa, corregido Prueba - Nota para los usuarios

Comparacin de los polifenoles, metilxantinas y la

actividad antioxidante en Theobroma cacao frijol de
diferentes zonas de cultivo del cacao en Colombia

Luis C. Carrillo ,
Julin Londoo Londoo ,
Andrs Gil ,

Grupo de Investigacin en Sustancias bioactivas, Sede de Investigacin Universitaria de la

Universidad de Antioquia, Carrera 53 # 61-30 Lab 229, AA 1226 Medelln, Colombia

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2013.06.019 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Reflejos

Se realiz la cuantificacin simultnea de catequinas y metilxantinas por HPLC.

El contenido de bioactivos cacao difera notablemente entre las plantaciones de

cacao de la muestra.

El anlisis multivariado mostr dos grupos principales en funcin de las zonas

de cultivo del cacao.

Abstracto
Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar la influencia de las reas
geogrficas en los contenidos de polifenoles y metilxantinas y la actividad
antioxidante en los granos de cacao de diferentes zonas productoras de cacao de
Colombia, y evaluar la posibilidad de establecer una clasificacin basada en las
reas geogrficas de las regiones de cultivo del cacao. Se analizaron dieciocho
plantaciones de cacao ubicadas en once zonas de cultivo del cacao. El anlisis
estadstico mostr diferencias significativas (p <0,05) en el contenido de
polifenoles totales (TPC), flavan-3-ol, epicatequina, catequina, el contenido de
cafena y teobromina, as como la relacin teobromina / cafena y la capacidad
antioxidante entre algunos de los diferentes granjas muestreadas, que muestran
un efecto significativo de la regin productora de cacao en estos parmetros. En
general, una relacin proporcional se ha propuesto que existe entre el contenido
de polifenoles con los cambios en la altitud de los cultivos de plantas, a pesar de
esto, nuestros resultados sugieren que cuanto menor sea la altitud, los ms
polifenoles, flavan-3-oles y epicatequina se producen por el cacao planta. Los
resultados del anlisis de componentes principales (PCA) indican que el contenido
de cafena y la relacin teobromina / cafena podra servir como parmetros para
establecer una clasificacin de granos de cacao de acuerdo a la zona geogrfica
de las regiones de cultivo del cacao.

Palabras clave

Anlisis de componentes principales ;

Las zonas de cra ;
Los polifenoles ;
Las metilxantinas ;
La actividad antioxidante

1. Introduccin
Nuevas tendencias en el mercado de alimentos muestran un aumento constante
en el consumo de productos de cacao, ya que tienen una gran aceptacin por los
consumidores, y tambin presentan mltiples beneficios para la salud debido a la
presencia de polifenoles, que poseen una alta capacidad antioxidante (Belscak,
Komes, Horzic, Ganic, y Karlovic, 2009 ).
Tres grupos principales polifenoles se pueden distinguir en el cacao: catequinas,
antocianinas y procianidinas, cuya caracterstica comn es una estructura de tipo
flavonoide ( Wollgast y Anklam, 2000 ).Estos compuestos generalmente han
recibido una especial atencin debido a sus funciones fisiolgicas, que incluyen la

modulacin de la sntesis de eicosanoides, aumento en la sntesis de xido ntrico,

la inhibicin de la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL), la
inhibicin de la activacin de las plaquetas, estimulacin de la produccin de
citoquina anti-inflamatoria, y la inhibicin de la produccin de citoquinas proinflamatorias ( Niemenak et al., 2006 y Othman et al., 2007 ). Adems, algunos
estudios epidemiolgicos han establecido una correlacin inversa entre la ingesta
de flavonoides y la aparicin de enfermedades crnicas, tales como
enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, cncer y otros trastornos,
tales como la diabetes y la artritis reumatoide ( Othman et al., 2007 y Wollgast y
Anklam, 2000 ).Aunque la mayora de los estudios indican que los beneficios para
la salud de cacao o cacao en subproductos son atribuibles a los polifenoles, debe
tenerse en cuenta que estos no son slo es rico en polifenoles, pero son tambin
ricos en metilxantinas, que representan aproximadamente el 3,2% de desgrasada
composicin de chocolate sin azcar ( Belscak et al., 2009 ). Los principales
metilxantinas de cacao son teobromina (3,7% sobre una base libre de grasa) y
cafena (aproximadamente 0,2%) y se han asociado con algunos efectos
fisiolgicos en diversos sistemas del cuerpo, incluyendo el sistema nervioso
central, gastrointestinal, respiratorio, renal y sistemas ( Li et al., 2012 ). Sin
embargo, las posibles interacciones sinrgicas entre los flavonoides y
metilxantinas en los productos de cacao sobre los beneficios de salud siguen
siendo poco claras y la demanda de nuevos estudios. Sin embargo, es evidente
que los compuestos de polifenol y metilxantina son responsables para el sabor
astringente y amargo y afectan a la estabilidad y digestibilidad de cacao
( Brunetto et al., 2007 y Li et al., 2012 ).
El cacao es uno de los cultivos de alto inters econmico en varios pases, como
Costa de Marfil, Ghana, Camern, Indonesia, Colombia, Venezuela y Ecuador. Es
nativa del Nuevo Mundo, con probable origen situada en la cuenca alta del ro
Amazonas ( Cuatrecasas, 1964 y Motamayor et al., 2002 ). En los ltimos aos,
se ha creado confusin en la clasificacin taxonmica de cacao comercial, debido
a su variabilidad gentica relacionada con las caractersticas fenotpicas tales
como el color, la forma y dimensin de las diversas partes de la flor, fruto y
semilla. Sin embargo, se acepta que la mayor parte del cacao comercial
pertenece a una sola especie ( Theobroma cacao L.), que incluye tres complejos
genticos: Criollo, Forastero / Amaznico, y Trinitario ( Cuatrecasas,
1964 , Motamayor et al, 2002. , y N 'Goran et al., 1994 ).
En la actualidad, el cultivo de cacao en Colombia tiene una alta variabilidad
gentica debido a la siembra de los ecotipos procedentes de cruces entre
Forastero / Amaznico y Trinitario clones. Por otra parte, las condiciones
ecolgicas varan mucho en Colombia y en las regiones de cultivo del cacao estn
muy dispersos a travs de su territorio. Adems, la gran variedad de microclimas
en todo el pas, conduce a la produccin de cacao con alta variabilidad en su
composicin qumica. Estos fenmenos se han observado en otros productos
alimenticios tales como aceite de oliva, la miel, y los aceites esenciales de pino

(Baltrusaityte et al., 2007 , Semiz et al., 2007 y Temime et al., 2006 ), en el que
la composicin qumica es influenciada por los cambios en las condiciones de
cultivo ambientales (climticas y edafolgicas). Esto significa que tanto el rea de
produccin y las variaciones genotpicas son en gran parte responsables de las
caractersticas de calidad de los productos alimenticios finales, entregados al
consumidor ( Criado, Morello, Motilva, y Romero, 2004 ), incluyendo el cacao
subproductos. Las ltimas caractersticas proporcionan Colombia con la capacidad
de producir diferentes ecotipos de cacao con diferente bioactivo y perfiles de
sabor. Sin embargo, hasta la fecha, las condiciones edafoclimticas ideales para
la produccin de granos de cacao de alta calidad, en trminos de composicin
qumica y propiedades organolpticas son desconocidos.El establecimiento de
estas condiciones podra contribuir a fortalecer el concepto de "Denominacin de
Origen" en los subproductos del cacao.
Por lo tanto, los objetivos de la corriente de trabajo fueron estudiar la influencia
de las zonas geogrficas sobre el comportamiento de los contenido de polifenoles
y metilxantina, as como la actividad antioxidante en los granos de cacao de
diferentes reas de cultivo de cacao, y para evaluar la posibilidad de establecer
una clasificacin de acuerdo a la zona geogrfica de las regiones de cultivo del
cacao, tratando as de contribuir a una trazabilidad del cacao colombiano.

2. Materiales y mtodos
2.1. Productos qumicos y reactivos
Todos los disolventes fueron de grado analtico o HPLC y suministrados por Merck
KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua desionizada se obtuvo con un sistema de
purificacin de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Compuestos
estndar, tales como (+)-catequina, (-)-epicatequina, y teobromina fueron
adquiridos de ChromaDex (Irvine, California, EE.UU.); cafena, cido glico y Trolox
(6-hidroxi-2, 5,7,8-tetramethylchromane cido-2-carboxlico) se obtuvieron de
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), as como otros reactivos, tales como
fluorescena, DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), AAPH (2,2 ' -azobis (2metilpropionamidina) dihidrocloruro) y el reactivo de Folin-Ciocalteu. La vainillina
y cido sulfrico tambin se compraron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).

2.2. Muestras
Para este estudio, se utilizaron granos de cacao secados al sol disponibles
comercialmente. El muestreo aleatorio en dieciocho explotaciones (muestras) con
las prcticas agrcolas similares se llev a cabo. Las fincas estn situadas en once
reas de cacao crecen dispersos en tres de las principales regiones productoras
de cacao en toda Colombia ( Tabla 1 y . Fig. 1 ). Se eligieron estas zonas
geogrficas ("Andina" (a), "Orinoco" (b) y "Pacfico" (c) regin) porque presentan
claras diferencias en sus condiciones edafolgicas y climticas, de acuerdo con el

Sistema de Zonas de Vida de Holdridge (un mundial sistema bioclimtico para la

clasificacin de las reas de tierra) estas zonas se pueden clasificar como bosque
hmedo tropical, bosque hmedo tropical y bosque hmedo tropical,
respectivamente ( Lugo, Brown, Dodson, Smith y Shugart, 1999 ). Slo los granos
sanos de la misma etapa de procesamiento de secado al sol, sin ningn tipo de
infeccin o dao fsico, fueron procesados. Durante el muestreo, se lavaron las
habas, se moli en un molino de cuchilla giratoria y el polvo obtenido finalmente
fue almacenado a - 20 C hasta la preparacin de muestras. En este estudio,
cada muestra se llev a cabo por triplicado utilizando los procedimientos
mencionados a continuacin, y cada valor se presenta en los Resultados y
discusinseccin es la media de seis a nueve de datos desviacin estndar
(SD).
Tabla 1. productor de cacao, la ubicacin geogrfica y las condiciones climticas regionales de
diferentes regiones de cultivo del cacao.
Cdigo de Cultivares

Zona

Latitud

Longitud

Altitud (msnm) una

Temperatura media ( C)

aL_1

un

6 13 '26 "N

073 48 '46 "W

968

20

aL_2

un

6 13 '26 "N

073 48 '46 "W

968

20

aL_3

un

6 13 '26 "N

073 48 '46 "W

968

20

ceniza

un

6 20 '0 "N

73 36 '0 "W

1426

20

AVC

un

05 19 '0 "N

74 54 '0 "W

750

26

ACA

un

5 21 '0 "N

74 30 '0 "W

1271

23

AGT

un

4 18 '0 "N

74 48 '0 "W

289

33

bS_1

6 53 '0 "N

71 54 '0 "W

800

25.6

bS_2

6 53 '0 "N

71 54 '0 "W

800

25.6

bAR

7 1 '0 "N

71 25 '0 "W

165

29

bTA_1

6 27 '0 "N

71 44 '0 "W

340

28

bTA_2

6 27 '0 "N

71 44 '0 "W

340

28

BVM

4 9 '0 "N

73 38 '0 "W

410

27

bGM_1

3 33 '0 "N

73 42 '0 "W

410

25

bGM_2

3 33 '0 "N

73 42 '0 "W

410

25

cCT_1

1 48 '0 "N

78 45 '0 "W

29

cCT_2

1 48 '0 "N

78 45 '0 "W

29

cCT_3

1 48 '0 "N

78 45 '0 "W

29

un
Metros sobre el nivel del mar.

Opciones de tabla

. Figura 1. mapa de las zonas de muestreo "a", "b" y "c" para los granos de cacao.
Opciones Figura

2.3. Preparacin de la muestra

Las muestras de cacao en polvo se extrajeron como sigue. La muestra seca y
molida se pes (100 mg), se desgrasa mediante la adicin de 2 ml de hexano y se
centrifug a 1565 g durante 10 min, se decant y otro 2 ml de hexano se aadi
repitiendo el procedimiento tres veces. El polvo de cacao sin grasa reducida se
extrajo a temperatura ambiente con 1,5 ml de 2-propanol acuoso (60%, pH 9,0)
durante 60 min en un bao de ultrasonidos. Despus de la extraccin, la mezcla
se centrifug durante 10 min a 391 g a 4 C. El sobrenadante se decanta y se
filtra a travs de una membrana de nylon (0,45 micras). Por ltimo, el
sobrenadante se coloc en un matraz y se llena hasta obtener 2 ml de extracto, y
se almacena en la oscuridad a - 20 C hasta su uso.

2.4. Determinacin del contenido total de polifenoles

El contenido de polifenoles totales (TPC) de extractos de cacao se determin
espectrofotomtricamente de acuerdo con un mtodo modificado propuesto
por Londoo, Montoya, Guerrero, Aristizabal y Arango (2006) .Brevemente, 30 l de
extracto previamente preparado, 15 reactivo de Folin-Ciocalteu l, 225 l de agua
destilada y 30 l de 20% de Na 2 CO 3 se mezclaron. Despus de 1 h se midi la
absorbancia del color azul a 760 nm frente a un blanco de muestra. Se produjo
una curva de calibracin con cido glico como estndar.El TPC se expresa como
miligramos equivalentes de cido glico (GAE mg) por gramo de material de
muestra seca (mg GAE / g de muestra seca). Todas las mediciones se realizaron
por triplicado.

2.5. Contenido Flavan-3-ol por vainillina ensayo

Cacao extractos se analizaron para determinar su contenido de flavan-3-ol usando
un
mtodo
descrito
porBelscak
et
al. (2009) ,
con
algunas
modificaciones. Extractos previamente preparadas (200 l) se llenaron hasta 1 mL
con metanol. El volumen total del medio de reaccin se fij en 1 ml, que
comprende 166,7 l de muestra (extracto de cacao) o estndar, 416,7 l de solucin
de trabajo vainillina 1% (preparado a diario en metanol) y 416,7 l de H 2 SO 4 9,0 N
en metanol. La mezcla se dej reaccionar durante 5 min, en un bao de hielo,
despus de lo cual se tomaron lecturas de absorbancia a 500 nm. Se prepararon
dos espacios en blanco: 1) sustitucin de la muestra por ms 1% de vainillina, y
2) la sustitucin de la solucin de vainillina mediante metanol. Absorbancia de los
espacios en blanco se sustrajo de la absorbancia del extracto correspondiente y la
muestra que contiene vainillina. Una curva de calibracin con catequina como se
produjo estndar. El contenido de flavan-3-oles se expresa como equivalentes de
catequina miligramos por gramo de muestra seca (mg EC / g de muestra
seca). Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

2.6. El anlisis por HPLC de catequinas y metilxantinas

Los anlisis de HPLC se llevaron a cabo usando un sistema Agilent Serie 1200 de
resolucin rpida Cromatografa Lquida (Agilent Technologies, Palo Alto, CA,
EE.UU.), equipada con un desgasificador de vaco, un muestreador automtico,
una bomba cuaternaria y un detector de red de diodos (DAD). Las muestras se
centrifugaron durante 15 min a 10581 g y 4 C y luego se filtr a travs de un
filtro de 0,45 micras (membranas de nylon, Supelco, Bellefonte, EE.UU.) antes del
anlisis por HPLC.
Para separar los compuestos, la velocidad de flujo usado vari entre 0,75 y 1,0
ml / min y el anlisis se llev a cabo a 30 C. Una columna Supelco Ascentis
C18 (25 cm x 4,6 mm, con un tamao de partcula 5 micras) se utiliz para la
separacin cromatogrfica. La fase mvil utilizada fue agua con cido actico al
0,1% como eluyente A y metanol como eluyente B. El mtodo ptimo
cromatogrfico consisti en el siguiente gradiente lineal: 0 min, 6% de A; 7 min,
25% de A; despus isocrticamente hasta 30 min , y finalmente un ciclo de
acondicionamiento de 3 min con las condiciones iniciales para el siguiente
anlisis. El volumen de inyeccin en el sistema de HPLC fue de 10 mL. Los
compuestos separados se monitorizaron con DAD ajustado a 280 nm y los
espectros de pico se registraron entre 200 y 400 nm. Las catequinas (catequina y
epicatequina) y metilxantinas (teobromina y la cafena) se identificaron
comparando los tiempos de retencin y los datos espectrales a las de los
estndares. Todos los anlisis se repitieron tres veces.

2.7. Determinacin de la capacidad antioxidante por ORAC

El ensayo de Capacidad de Absorcin de Radicales de Oxgeno (ORAC) se llev a

cabo de acuerdo con un procedimiento descrito por Ou, Hampsch-Woodill, y Prior
(2001) , ligeramente modificado. Para la evaluacin de ORAC, se prepararon todos
los reactivos en 10 mM de tampn de fosfato (pH 7,4), as como los extractos de
cacao originales que fueron diluidas segn sea apropiado. De muestra (25 l) y
fluorescena (150 l; 1 mM, concentracin final) soluciones se colocaron en el
pocillo de la microplaca. La mezcla se preincub durante 30 min a 37
C. Solucin AAPH (25 l, 250 mM, concentracin final) se aadi rpidamente
usando una pipeta multicanal. La microplaca se coloc inmediatamente en el
lector y la fluorescencia registr cada 2 min durante 120 min a longitudes de
onda de excitacin y emisin de 485 y 520 nm, respectivamente. La microplaca
se agit automticamente antes de cada lectura. Un espacio en blanco
(fluorescena + AAPH) usando tampn de fosfato en lugar de la solucin de
muestra y cinco soluciones de calibracin utilizando Trolox (0-200 mM,
concentracin final) como antioxidante tambin se llevaron a cabo en cada
ensayo. Las ecuaciones de regresin entre el rea bajo la curva de decaimiento
de la fluorescencia (AUC) y la concentracin de antioxidante se calcularon para
todas las soluciones estndar de Trolox. Todas las mezclas de reaccin se
prepararon por duplicado, y se realizaron al menos tres ensayos independientes
para cada muestra. Los valores finales de ORAC se expresan como equivalentes
de Trolox utilizando la curva de Trolox estndar calculada para cada ensayo (mmol
Trolox de equivalent/100 g de muestra seca de cacao).

2.8. El anlisis estadstico y la aplicacin quimiomtrico

Todas las pruebas se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como
medios SD. La significacin estadstica de las diferencias entre grupos se
evalu mediante ANOVA de una va utilizando el GraphPad Prism versin 5.0 para
Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Se evaluaron las
diferencias entre las medias utilizando el Newman-Keuls comparacin post-test
mltiple y el significado se identific a nivel de 5%.
Las variables que se tienen en cuenta durante el desarrollo de este estudio se
sometieron a anlisis multivariante (anlisis de componentes principales (PCA))
realiza utilizando Statgraphics Centurion XVI Software (versin 16.0.07 para
Windows, StatPoint Technologies, Inc). PCA se aplic para separar las muestras (n
= 18) de acuerdo con sus valores de contenido de polifenoles totales (TPC),
flavan-3-oles (FLV), epicatequina (EPI), catequina (CAT), la cafena (CAF) y la
teobromina ( TEO) contenidos, valores ORAC, as como la relacin teobromina /
cafena (TE / CA) y las condiciones agroclimticas de temperatura (TEMP) y la
altitud (ALT) de los cultivos. En el PCA, el conjunto de datos consisti en una
matriz de 18 10, donde los resultados obtenidos para cada parmetro se
adoptaron como columnas y las granjas de cacao (muestras) fueron utilizados
como las filas. Los anlisis se basan en correlaciones y las variaciones se calculan

como SS / (n - 1). Los valores propios mayores que 1,0 se adoptaron para explicar
la proyeccin de los ensayos en el factor de plano. Todos los datos se
autoescalados antes del anlisis, lo que significa que cada matriz de datos de la
columna fue de media-centrado y a escala en la unidad de varianza y evitar el
efecto de diferentes escalas de las variables ( Cruz et al., 2013 ).

3. Resultados y discusin
3.1. Contenido de polifenoles totales (TPC) y flavan-3-ol contenido de
extractos de cacao
La preparacin de la muestra fue diseado para obtener una fraccin enriquecida
en compuestos de polifenol y metilxantinas, de acuerdo con Niemenak et
al. (2006) . Estos autores establecen que el uso de acetona-agua al 60:40 v / v
como disolvente hace que sea posible para obtener la mxima recuperacin de
los polifenoles y xantinas presentes en los granos de cacao. A continuacin,
Nuestra etapa de extraccin fue optimizado con el fin de ser exhaustiva y
recuperar simultneamente las dos clases de metabolitos. Algunos cambios tales
como el tipo de disolvente, el pH del medio, la cantidad de muestra, as como la
duracin del procedimiento de extraccin y el uso de la extraccin asistida por
ultrasonidos, nos permitieron alcanzar las ms altas concentraciones de
polifenoles y xantinas presentes en extractos de granos de cacao y cacao en
productos secundarios (datos no presentados).
La Tabla 2 presenta el contenido de polvo de cacao desgrasado determinado en
los extractos de 2-propanol acuosas de dieciocho plantaciones de cacao
analizadas TPC y flavan-3-ol. El TPC de extractos vari de 44,940 1,174 a
70,090 1,988 mg GAE / g, mientras que el contenido flavan-3-ol de los mismos
extractos de cacao vari de 2,496 0,388 a 11,240 0,825 mg EC / g. El
contenido de TPC y flavan-3-ol en las diferentes fincas de cacao disminuy en el
orden: aL_1> Bar> cCT_1> cCT_2> AVC> bS_2> cCT_3> bGM_2> AGT> aL_3>
Ceniza> aL_2> bTA_2> bS_1> BVM> bGM_1 > Aca> bTA_1 y barra> aL_1>
cCT_2> cCT_1> bTA_2> bS_1> bS_2> AGT> cCT_3> bGM_2> AVC> aL_3>
Ceniza> BVM> aL_2> bGM_1> bTA_1> ACA para el contenido de TPC y flavan-3ol, respectivamente ( Tabla 2 ), que muestra que ambas variables estn
altamente correlacionados (r de Pearson = 0,897). Adems, los anlisis
estadsticos mostraron una diferencia significativa (p <0,05) en el TPC y flavan-3ol contenido entre algunas de las granjas muestreadas. Estos resultados son
consistentes con los reportados por Othman et al. (2007) , quien encontr un
efecto significativo de la regin productoras de cacao en el contenido de los
compuestos de polifenol que fue altamente correlacionado con su actividad
antioxidante. Otro estudio examin los diferentes contenidos de polifenoles en el
cacao de Costa de Marfil, Guinea Ecuatorial, Venezuela, Per, Repblica
Dominicana, Ecuador y Colombia ( Toms-Barbern et al., 2007 ). Estos autores

encontraron que el cacao colombiano fue el tercero ms rico de TPC (81,4 mg

GAE / g) entre los pases estudiados. Este valor es superior a los obtenidos en
nuestro estudio, pero se sabe que el TPC vara en funcin de la variedad de los
granos de cacao, el grado de madurez (poca de cosecha) y, ms importante an,
las condiciones de su origen geogrfico y post-cosecha, como fermentacin,
secado, tostado, procesamiento y almacenamiento ( Wollgast y Anklam, 2000 ),
que contribuyen a las principales discrepancias entre los resultados.
Tabla 2. Capacidad antioxidante y el contenido de compuestos de metilxantina y polifenoles
en los granos de cacao de diferentes cultivares.
Cdigo de
Cultivares

TPC (mg
GAE / g)

Flavan-3oles (CE
mg / g)

La epicatequina
(mg / g)

Catequina
(mg / g)

ORAC
valores
deun

Cafena
(mg / g)

Teobromina
(mg / g)

aL_1

70.090
1.988 a

11,240
0,825a

3,562 0,016a

1,297
0,031 a

61812
5042 ab

1,330
0,028 gh

8.863
0.119 cd

aL_2

52.880
2.062 def

3.842
0.739 cd

2.284 0.112cde

0.377
0.033 cd

40390
3784 b

1.230
0.021 hij

8.581
0.138 de

aL_3

53.410
3.679 de

5,245
0,520bcd

2.019 0.064de

0,245
0,008 d

42020
6553 b

1.096
0.038 jkl

8.777
0.142 cd

ceniza

53.170
0.165 de

4,405
0,714 cd

1.970 0.071de

0,346
0,013 d

51940
7472 ab

1.184
0.040 ij

8,306
0,119 def

AVC

56.540
1.507 cde

5.456
0.346bcd

2.516 0.156bcd

0,286
0,016 d

54027
5753 ab

1.073
0.009 jkl

8,242
0,057 def

ACA

45.320
1.152 efg

2.496
0.388 cd

1,405 0,080 f

0,323
0,012 d

50029
6453 ab

1,879
0,028 a

9.076
0.049 bcd

AGT

53.780
1.434 de

6.781
0.506aC

2.395 0.057cd

0.370
0.010 cd

50002
6868 ab

1,435
0,021 ef

8.639
0.094 cde

bS_1

52.690
3.325 def

7.407
0.945aC

2.342 0.126cde

0.431
0.023 cd

52718
3508 ab

1.014
0.075 kl

7,062 0,123 g

bS_2

56.340
3.399 cde

6.856
0.833aC

2.414 0.130cd

0.487
0.044 bcd

54020
6116 ab

0,724
0,025 m

8,024
0,177 ef

bAR

65.050
1.314 abc

11.290
0.451a

3,787 0,070a

0.493
0.031 aC

63951
7384 ab

1.148
0.016 IJK

9,679
0,273 ab

bTA_1

44.940
1.174 fg

3.763
0.411 cd

1,497 0,015 f

0.226
0.006 de

39130
3562 b

1.311
0.023 ghi

9.109
0.149 aC

bTA_2

52.860
1.194 def

7.439
0.692aC

2.516 0.112bcd

0.615
0.022 aC

49786
8320 ab

1.590
0.019 cde

8,274
0,209 def

BVM

47.590
1.947 efg

4.121
0.886 cd

2.150 0.141cde

0.569
0.027 aC

57189
3555 ab

1.126
0.042 jk

8,245
0,076 def

bGM_1

47.000
2.319 efg

3.765
0.553 cd

2.388 0.205cd

0.391
0.021 cd

38729
1084 b

1,517
0,024 def

8.824
0.155 cd

bGM_2

53.820
0.470 de

6.058
0.439aC

2.570 0.114aC

0,350
0,023 d

54339
4357 ab

1,435
0,023 ef

8.734
0.127 cd

cCT_1

61.930
3.558 bcd

7.775
1.399aC

2.862 0.190aC

0.355
0.033 cd

61511
7547 ab

1.630
0.022 cd

8,354
0,217 def

cCT_2

61.650
0.778 bcd

7.841
0.322aC

2.831 0.044aC

0,342
0,024 d

50837
4677 ab

1.730
0.040 b

9,510
0,237 abc

cCT_3

53.960
5.778 de

6.168
3.019aC

2.105 0.289de

0.468
0.158 cd

43879
4305 b

1.592
0.009 cde

8,217
0,048 def

Los datos se presentan como media SD ( n = 3). Los valores dentro de una columna
seguidas por las mismas letras de superndice no son significativamente diferentes en el nivel
0,05 de acuerdo con ANOVA ( p <0,05).

un

Expresado como (mol TroloxEq / 100 g).

Opciones de tabla

Algunos autores han propuesto que existe una relacin proporcional entre el
contenido y la actividad de los compuestos que forman parte del sistema de
defensa antioxidante de la planta (polifenoles) con los cambios en funcin de la
altura del crecimiento de los cultivos ( Criado et al., 2004 ), las variaciones que
tienen tambin ha demostrado que aumenta la sntesis de la fenilalanina amonio
liasa (PAL) en las plantas, lo que lleva a un aumento de la produccin de
compuestos fenlicos, incluyendo flavonoides ( Kishore, Ranjan, Pandey, y Gupta,
2010 ). En lo que a nosotros respecta, estos argumentos no parecen aplicarse a
los granos de cacao, ya que nuestros resultados ( Tabla 2 ) indican que a menor
altitud, ms polifenoles y flavan-3-oles son producidos por la planta. Este tema se
discute a continuacin.

3.2. Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) de los extractos

de cacao
HPLC con deteccin UV a 280 nm ha sido el principal mtodo analtico para la
cuantificacin de las catequinas y procianidinas en muestras de cacao ( Wollgast
y Anklam, 2000 ). De acuerdo con los datos de la literatura ( Liu et al.,
2006 y Markham y Bloor, 1998 ), la adicin de cidos a la fase mvil de HPLC
mejora la separacin de los polifenoles ya que reduce la ionizacin de los dos
grupos hidroxilo y carboxilo fenlicos.En este estudio, el uso de metanol y cido
actico diluido como disolvente, dos compuestos flavan-3-ol y dos metilxantinas
se identificaron por sus tiempos de retencin, espectros de HPLC-UV (280 nm), y
las comparaciones cromatogrficas con patrones primarios ( Fig. 2 ) . Los
resultados no mostraron diferencias cualitativas en los perfiles cromatogrficos
entre extractos de cacao de diferentes reas geogrficas de crecimiento. Sin
embargo, no se observaron diferencias cuantitativas significativas en catequinas
y metilxantinas.

. Figura 2. cromatograma HPLC de los extractos de grano de cacao, rico en polifenoles y

metilxantinas. Los tiempos de retencin de 13,13, 17,40, 23,59 y 31,05 min, corresponden a la
teobromina, (+)-catequina, la cafena y el (-)-epicatequina, respectivamente. Para las
condiciones cromatogrficas, ver seccin 2.6 .
Opciones Figura

En su conjunto, las metilxantinas (teobromina y la cafena) se encontraron en

mayor concentracin que el catequinas, teobromina siendo el compuesto
predominante en los extractos ( Tabla 2 ). El mayor contenido de teobromina fue
9.679 0.273, y la ms baja fue de 7.062 0.123 cacao en polvo sin grasa mg /
g de. El contenido de teobromina en las diferentes granjas de cacao en
crecimiento disminuy en el orden de la barra> cCT_2> bTA_1> Aca> aL_1>
bGM_1> aL_3> bGM_2> AGT> aL_2> cCT_1> Ceniza> bTA_2> BVM> AVC>
cCT_3> bS_2> bS_1 . En comparacin con la teobromina, el contenido de cafena
era ms bajo, que van desde 1.879 desde 0,028 hasta 0,724 0,025 mg / g de
polvos de cacao desgrasados, en el siguiente orden decreciente ACA> cCT_2>
cCT_1> cCT_3> bTA_2> bGM_1> AGT = bGM_2> aL_1> bTA_1> aL_2> Ceniza>
Bar> BVM> aL_3> AVC> bS_1> bS_2. Se ha propuesto que la zona de produccin
y las variaciones genotpicas, son en gran medida responsables de las
caractersticas de calidad de la de cacao final subproductos, en trminos de
compuestos bioactivos ( Belscak et al., 2009 ). Con respecto a esta posibilidad, la
alta variabilidad gentica del cacao colombiano, debido a la siembra de los
ecotipos procedentes de cruces entre Forastero / Amaznico y clones Trinitario se
convirti en un tema importante relativo a la clasificacin de los granos de cacao
utilizados durante este estudio. Sin embargo, es importante destacar que
anteriormente, los estudios llevados a cabo por Brunetto et al. (2007) , demostr
la existencia de una relacin entre el contenido en metilxantinas y el genotipo del
cacao. Estos estudios se han centrado en la relacin teobromina / cafena, lo que
permite su clasificacin en "Forastero", "Trinitario" y el cacao "criollo". En el
presente estudio, la correlacin entre el cacao extractos analiz y se examin la
relacin teobromina / cafena. Los resultados obtenidos se presentan en la
figura. 3 . La mayora de las granjas muestreadas producir cacao en grano
"Trinitario", excepto bS_2 que es claramente una "Forastero" cosecha de cacao,
que se caracteriza por un alto contenido de teobromina y la baja concentracin de
cafena, mientras que las otras muestras (Trinitario) contienen niveles de
teobromina / cafena intermedios. A pesar de que la ACA es una muestra
clasificada como cacao "Trinitario", con base en los resultados actuales, tambin
es claro que esta muestra es cerca de "Criollo" del cacao debido principalmente a
su baja relacin teobromina / cafena ( Fig. 3 ).

. Figura 3. Relacin entre metilxantina contenido y el genotipo de cacao. Los ejes X e Y

representan el coeficiente de concentracin de teobromina / cafena y el% de cafena en los
granos de cacao, respectivamente.
Opciones Figura

El flavan-3-oles, (-)-epicatequina y (+)-catequina (tambin conocidos como

catequinas) fueron identificados y cuantificados en extractos de cacao de varias
reas de cultivo de cacao, y los resultados se muestran enla Tabla 2 . Se
observaron variaciones considerables en las concentraciones de estos
compuestos en los extractos de cacao, dependiendo del origen geogrfico de las
muestras. (-)-Epicatequina domin entre flavan-3-oles, con las ms altas
concentraciones de 3,787 0,070 a 1,405 0,080 mg / g de cacao en polvo sin
grasa, y la disminucin en la siguiente barra orden> aL_1> cCT_1> cCT_2>
bGM_2> bTA_2 AVC> bS_2> AGT> bGM_1> bS_1> aL_2> BVM> cCT_3> aL_3>
Ceniza> bTA_1> ACA. Por otra parte, las concentraciones de (+)-catequina eran
bajos, oscilando entre 1,297 0,031 y 0,226 0,006 cacao en polvo sin grasa
mg / g de, y disminuyeron en el orden de aL_1> bTA_2> BVM> Bar> bS_2>
cCT_3> bS_1 > bGM_1> aL_2> AGT> cCT_1> bGM_2> Ceniza> cCT_2> Aca>
AVC> aL_3> bTA_1. La comparacin del contenido de flavan-3-ol en los granos de
cacao analizadas con los obtenidos por otros autores muestra algunas
diferencias. A saber, Niemenak et al. (2006) , determinado el contenido de
catequinas mediante cromatografa de fase inversa lquida de alto rendimiento
(RP-HPLC), utilizando acetona acuosa al 60% como disolvente en semillas recin
cosechadas de diferentes vainas de cacao de diferentes clones de extraccin, y se
encontr un mayor contenido de catequina (1,25 a 14,42 mg / g) y epicatequina
(14,43 a 43,90 mg / g) a los obtenidos en el presente estudio. Gotti, Furlanetto,
Pinzauti, y Cavrini (2006) , que se utiliza etanol acuoso al 71% como disolvente de
extraccin y modificado ciclodextrina para cuantificar catequinas en los granos de
cacao por cromatografa electrocintica micelar, y determina 0,06 0,008 mg / g

de catequina y 4,10 0,20 mg / g de epicatequina en los granos de cacao

venezolanos, que estn de acuerdo con nuestros resultados. Ortega et al. (2008) ,
preparado dos tipos de extractos fenlicos de cacao en grano, el extracto de
cacao fenol (CE), por extraccin slido / lquido, y el extracto purificado (PCE),
mediante extraccin en fase slida (SPE). Aunque no mencionaron el disolvente
de extraccin utilizado, los resultados son muy similares a los obtenidos aqu, sino
que informaron 0,335 0,083 y 0,434 0,055 mg / g de catequina para CE y el
PCE, respectivamente, mientras que para epicatequina los contenidos fueron
3,011 0,053 y 4,314 0,371 mg / g para el CE y el PCE, respectivamente.
Se sabe que cuanto mayor es la altitud, la menos densa es la atmsfera a travs
de la cual la radiacin UV debe pasar para llegar al suelo. (280-315 nm), la
radiacin UV-B es un componente menor del espectro solar, sin embargo, tiene el
potencial de afectar desproporcionadamente a los procesos metablicos en los
seres humanos, animales, microorganismos y plantas ( Jansen et al.,
2001 ). Investigaciones anteriores sobre las plantas silvestres y cultivadas,
mostraron correlaciones positivas significativas entre la altitud del lugar de
crecimiento y las cantidades de ciertos antioxidantes fenlicos ( Alonso-Amelot,
Oliveros-Bastidas, y Calcagnopisarelli, 2007 ). Tales variaciones con la altitud se
supone que se asocia con las enzimas implicadas en la sntesis de compuestos
fenlicos que se producen en mayores cantidades o muestran una mayor
actividad a baja temperatura ( Chalker-Scott & Scott, 2004 ). En condiciones
tropicales, la temperatura disminuye con el aumento de la altitud, pero la
radiacin UV solar tambin cambia, lo que aumenta con el aumento de la altitud y
la proximidad al mar. Cuantitativamente, se sabe que la radiacin UV-B aumenta
14-18% por 1,000 m de altura en aumento. Por lo tanto, con una mayor radiacin
UV en las zonas altas, se espera que las plantas de mostrar un mayor contenido
de polifenoles y mejores propiedades antioxidantes ( Kishore et al.,
2010 ). Nuestros resultados en cuanto a TPC, flavan-3-ol, catequina y
epicatequina contenidos sugieren que las plantas de cacao pueden experimentar
el efecto contrario, ya que las muestras como cCT_1, cCT_2, bar y AGT, que se
encuentran en el rango ms bajo de altitud se encuentran entre las muestras
cuyo contenido de estos compuestos bioactivos es la ms alta ( Tabla 2 ).Estos
resultados concuerdan con los obtenidos por Mateus, Marques Gonalves,
Machado y De Freitas (2001) , que investig la influencia de la altitud de los
viedos en los cambios en el desarrollo de las catequinas en las semillas y la piel
de dos variedades de uva. Los resultados mostraron que la altitud del viedo y su
clima son factores importantes para la madurez de la uva y la composicin
varietal flavan-3-ol.Al final de la madurez, baja altitud (mayor temperatura y
humedad) parece ser ventajosa para producir mayores concentraciones de
catequinas, bajo peso molecular flavan-3-ol, y oligmeros de procianidinas totales
extrables. Independientemente de la matriz vegetal, esto tambin podra estar
sucediendo en los granos de cacao se utilizan aqu, ya que los principales
compuestos de polifenol producidos por la planta son oligmeros flavan-3-ol y sus

polmeros (procianidinas). Sin embargo, se necesitan ms investigaciones para

concluir sobre este tema.
Finalmente, un estudio reciente ha propuesto la influencia del medio ambiente y
el genotipo de la patata nativo Andino, sobre el contenido de polifenoles y la
actividad antioxidante ( Andre et al., 2009 ). De acuerdo con los resultados
obtenidos, las plantas de patata pueden ajustar su contenido de polifenoles en
respuesta a las condiciones ambientales cambiantes, pero ms importante fue el
genotipo predominante en los efectos generados por el medio ambiente, en
relacin con las variaciones en el contenido de polifenol. Variacin en el genotipo
no fue tomada en cuenta en el estudio actual, en consecuencia, las diferencias
observadas en los resultados tambin pueden ser influenciados por esta
variable. Por lo tanto, se necesita ms investigacin con ecotipos de cacao
especficos para llegar a conclusiones absolutas.

3.3. La capacidad antioxidante de los extractos de cacao

El reconocimiento de muchos beneficios para la salud proporcionados por
compuestos de polifenol ha fomentado un aumento del inters cientfico en la
determinacin de la capacidad antioxidante de diversos productos derivados de
las plantas. Sin embargo, un mtodo normalizado para la determinacin de las
propiedades antioxidantes de ciertos alimentos y bebidas todava no se ha
establecido. El ensayo ORAC se ha convertido en un mtodo muy utilizado para
evaluar la capacidad antioxidante de las muestras biolgicas y los alimentos
( Prior et al., 2003 ) y se ha aplicado ampliamente como un mtodo de eleccin
por parte de acadmicos y la industria de alimentos y suplementos. Se realiz la
evaluacin de la capacidad antioxidante por el ensayo ORAC para extractos de
cacao de dieciocho plantaciones de cacao probadas y los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 2 . El orden decreciente de grano de cacao extractos basa
en la capacidad antioxidante evaluado con el ensayo ORAC, sigue de cerca la TPC,
flavan-3-ol y el contenido de epicatequina: bar> aL_1> cCT_1> BVM> bGM_2>
AVC> bS_2> bS_1> Ceniza> cCT_2> Aca> AGT> bTA_2> cCT_3> aL_3> aL_2>
bTA_1> bGM_1. Estos resultados se confirman tambin por los moderados
coeficientes de correlacin de Pearson obtenidos entre ORAC y estas tres
variables (r = 0,678, r = 0,685 y r = 0,677 para el TPC, flavan-3-ol y el contenido
de epicatequina, respectivamente). A pesar de ello, los resultados son muy
similares a los reportados por la base de datos ORAC del Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos para los granos de cacao y cacao en polvo seco
( Laboratorio de Datos de Nutrientes, 2010 ).

3.4. Anlisis de componentes principales (PCA)

El anlisis multivariado tradicionalmente se ha empleado para evaluar la calidad
de los alimentos, as como los vinos y otros productos. PCA es un mtodo de
anlisis estadstico empleado con frecuencia y se ha aplicado con xito a los

resultados analticos, tanto para los compuestos individuales y las combinaciones

de componentes ( Kallithraka et al., 2001 ). PCA puede comprimir los datos en
funcin de similitudes y diferencias, al reducir el nmero de dimensiones sin
mucha prdida de informacin, y definir el nmero de "componentes principales",
ofreciendo una "descripcin visual" de las diferencias de grupo o agrupacin y
valores atpicos ( Ieri et al ., 2011 y Rodrguez-Campos et al., 2011 ). Para
evaluar la posibilidad de diferenciar las muestras teniendo en cuenta su origen,
hemos aplicado esta herramienta estadstica. TPC, flavan-3-ol, epicatequina,
catequina, contenidos de cafena y teobromina, as como la relacin teobromina /
cafena, los valores ORAC, la temperatura y la altitud, se consideraron como
atributos para identificar los componentes principales. En general, los dos
primeros componentes principales (PCs) son suficientes para explicar la variacin
mxima en todos los datos originales. En nuestro caso, los tres primeros
componentes principales representados 79,60% de la variabilidad total, el total de
polifenoles, flavan-3-ol y el contenido de epicatequina son las caractersticas
dominantes en el PC1 (39,65% de la variabilidad total), mientras que la altitud,
teobromina / relacin de contenido de cafena y la cafena son las caractersticas
con mayor peso en el PC2 (25,68% de la variabilidad total). Temperatura
constituye el elemento ms importante en la tercera PC (14,28% de la
variabilidad total). figura. 4 muestra una representacin clsica de las
puntuaciones de PC1 y PC2 (65,32% de la varianza total). Los granos de cacao de
aL_1 y BAR contienen grandes cantidades de polifenoles, flavan-3ols y
epicatequina y es por eso PC1 los separa claramente de las otras muestras,
mientras que lo contrario ocurre para el ACA y bTA_1 frijoles. Examen de una
grfica de las puntuaciones de dos dimensiones en el espacio definido por la PC1
y PC2 muestra que la distribucin de muestras sigue un patrn que depende de
PC2 ( . Fig. 4 ). As, el primer grupo que comprende 7 reas de cultivo del cacao,
es un poco dominado por las caractersticas de la PC1, pero muy relacionada con
la altitud y la relacin teobromina / cafena (PC2). El segundo grupo est formado
por otras 7 reas de cultivo del cacao, y tambin es un poco dominado por las
caractersticas de la primera componente principal, pero muy vinculado al
contenido de cafena (PC2). Es importante destacar que las muestras dentro de
los grupos se diferencian claramente por orgenes regionales, como se muestra
en la figura. 1 . AVC, ACA, bS_1, bS_2, aL_1, aL_2, aL_3 y Ash fueron cultivados y
cosechados en las montaas andinas colombianas, mientras que las otras
muestras eran de llanuras.

. Figura . 4 Anlisis de componentes principales: Biplot (partitura y carga parcelas se

superponen) de los dos primeros componentes principales asociados con la diferenciacin de
las muestras de acuerdo a las zonas de crecimiento (TPC: contenido total de polifenoles, FLV:
flavan-3-oles, EPI: epicatequina, CAT : catequina, CAF: cafena, TEO: teobromina, TE / CA:
relacin teobromina / cafena, TEMP: temperatura, ALT: altitud, los valores ORAC). Las
abreviaturas de cacao en las zonas de cultivo se describen en la Tabla 1 .
Opciones Figura

Tcnicas quimiomtricas se han utilizado comnmente para asegurar la

autenticidad de los alimentos y de la calidad ( Cruz et al., 2013 y Souza et al.,
2011 ), as como para clasificar su origen geogrfico basado en la composicin
qumica ( Cheng et al., 2013 y Luykx y van -Ruth, SM, 2008 ). Es muy frecuente
encontrar investigaciones que aplican mtodos univariados para determinar las
relaciones entre los fenoles totales o individuales con las propiedades
antioxidantes de los granos de cacao y cacao en productos derivados. Sin
embargo, este enfoque unidimensional no garantiza la determinacin de
correlaciones simultneas entre todos los resultados. Para superar este problema,
el inters por los mtodos quimiomtricos, que son de naturaleza multifactorial,
ha sido reconocida como una herramienta valiosa en la ciencia de los alimentos
(Granato, Katayama, y Castro, 2010 ). Especficamente en el campo de cacao y
chocolates, mediante el uso de PCA y anlisis cluster jerrquico Niemenak et
al. (2006) , de anuncios diferentes clones de cacao de acuerdo con su contenido
de polifenoles y antocianinas; Miller et al. (2009) , establecido que la mayora de
las medidas de la qumica flavanoles, incluyendo epicatequina y la flavan-3-oles
oligomrico y polimrico (procianidinas), tienen una relacin predecible con el
grado de procesamiento de subproductos de cacao (cacao en polvo, bicarbonato
de chocolate, chocolate negro, chocolates de leche, entre otros), y ms
recientemente, Rodrguez-Campos et al. (2012) , que se utiliza PCA para
determinar el efecto de los tiempos de fermentacin y la temperatura de secado
de la composicin de compuestos voltiles en los granos de cacao. En lo que a
nosotros respecta, el trabajo actual es una de las primeras evaluar las posibles

relaciones entre los componentes principales de cacao (catequinas y

metilxantinas) y su origen geogrfico.
Hay varios factores internos y externos que afectan a la calidad y / o cantidad de
compuestos bioactivos en plantas de cacao. Estos incluyen la diversidad gentica
(varietal y regionales), as como muchas variables ambientales, es decir, las
condiciones de crecimiento tales como intensidad de la luz, la humedad, la
temperatura, el uso de fertilizantes, hiriendo, infecciones u otros factores de
estrs ( Niemenak et al., 2006 ).Ya sea o no el contenido de polifenol, flavan-3-ol y
la epicatequina en muestras de cacao son importantes para beneficios para la
salud, nuestros resultados indican que el contenido de cafena y la relacin
teobromina / cafena podran ser utilizados como parmetros para establecer una
clasificacin de granos de cacao de acuerdo con la geogrfica rea de las
regiones de cultivo de cacao, dependiendo principalmente de la altitud de los
cultivos.

Reconocimiento
Los autores agradecen a la Universidad de Antioquia para el apoyo logstico y
financiero del proyectoEstrategia de Sostenibilidad 2011/2012, y en especial a
Anne-Lise Haenni (Instituto Jacques Monod, CNRS - Universit Paris-Diderot) por
sus importantes contribuciones en el desarrollo de este trabajo .

Qumica de los Alimentos

Volume 100, Issue 4 , 2007, pginas 1523-1530

Capacidad antioxidante y contenido fenlico de los granos de

cacao

Azizah Othman

una

Amin Ismail una , , ,

Nawalyah Abdul Ghani
Ilham Adenan b

el

una

Departamento de Ciencias de la Nutricin y la Salud, Facultad de Medicina y Ciencias de la

Salud, Universidad Putra Malaysia, 43400 UPM, Serdang, Selangor, Malaysia

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.12.021 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Instituto de Investigacin Forestal de Malasia (FRIM) Kepong, 52109 Kuala Lumpur, Malasia

Abstracto
Este estudio investig la capacidad antioxidante y el contenido de fenoles totales de
los granos de cacao de diferentes pases, a saber, Malasia, Ghana, Costa de Marfil y
Sulawesi. La capacidad antioxidante de agua y extractos etanlicos preparados a partir
de granos de cacao se midi por tres ensayos diferentes. Para estimar el contenido
fenlico total, se utiliz el ensayo usando el reactivo de Folin-Ciocalteu. El extracto
acuoso mostr el valor ms alto de actividad antioxidante basado en ensayo de
blanqueo de -caroteno, mientras que el extracto etanlico mostr la mayor reduccin
de las actividades de barrido y frricos. Granos de cacao de Ghana pueden observar las
actividades de barrido, seguido por Costa de Marfil, Malasia y Sulawesian mayor
antioxidante y. Sin embargo, los granos de Malasia y Sulawesian exhibieron la
reduccin de la actividad ms alta frrico, en comparacin con los otros granos. El alto
contenido fenlico se encuentra en los granos de Malasia, seguido por Sulawesian,
Ghana y Costa de Marfil. Exista una correlacin positiva tanto para etanol ( r = 0,76) y
los extractos de agua ( r = 0.78) entre el contenido de compuestos fenlicos y
actividad reductora frrica. Nuestros resultados mostraron que la capacidad
antioxidante y el contenido fenlico de los granos de cacao de Malasia eran
comparables a los de Ghana, Costa de Marfil, y los frijoles Sulawesian.

Palabras clave

Los granos de cacao ;

La actividad antioxidante ;
Actividad de barrido ;
Actividad reductora frrico ;
El contenido fenlico

1. Introduccin

Componentes antioxidantes son los microelementos presentes en la dieta que puede

retrasar o inhibir la oxidacin de lpidos, mediante la inhibicin de la intiation o la
propagacin de reacciones de oxidacin de la cadena, y tambin estn involucrados en
los radicales libres. Alimentos, tales como frutas, verduras y granos se dice que
contiene una amplia variedad de componentes antioxidantes, incluyendo compuestos
fenlicos. Estos compuestos se encuentran para estar bien correlacionado con
potencial antioxidante (Katalinic, Milos, Modun, Msica, y Boban, 2004 ). Algunos
estudios epidemiolgicos indican una correlacin negativa entre la ingesta de
flavonoides de la dieta y la enfermedad coronaria del corazn ( Hertog et al.,
1993 y Knekt et al., 1996 ), cncer ( Sun et al., 2002 ) y el accidente cerebrovascular
( Keli, Hertog, Feskens , y Kromhout, 1996 ).
Los fenlicos o polifenoles han recibido una considerable atencin debido a sus
funciones fisiolgicas, incluyendo antioxidantes, actividades antimutagnicas y
antitumoral ( Kono et al., 1995 y saliva et al., 1991). Cacao en grano y sus productos
(licor de cacao, polvo de cacao y de chocolate negro) son fuentes de alimentos ricos en
compuestos fenlicos. Los granos de cacao tienen un alto contenido fenlico de
alrededor de 12-18% (peso seco) en granos no fermentados ( Kim y Keeney,
1984 ). Dreosti (2000) inform que el 60% de los fenoles totales en los granos de cacao
crudos son monmeros de flavanoles (epicatequina y catequina) y oligmeros de
procianidina (dmero a decmero). Estos compuestos se inform a ser un candidato
potencial para combatir los radicales libres, que son perjudiciales para los sistemas de
nuestro cuerpo y de alimentos ( Adamson et al., 1999 y Sanbogi et al., 1998 ). En
estudios in vitro demostraron que estos compuestos tienen varias actividades
biolgicas, tales como la capacidad de eliminar los radicales superxido y radicales
hidroxilo, reducir los radicales peroxilo lipdicos y de inhibir la peroxidacin lipdica
( Kanner et al., 1994 , Salah et al., 1995 y Vinson y Hontz , 1995 ).
Cacao ( Theobroma cacao L.) es un cultivo importante en la economa de varios pases,
como Ghana, Costa de Marfil, Nigeria, Indonesia y Malasia. Malasia es el quinto mayor
productor de cacao del mundo. Es uno de los principales fabricantes de productos a
base de cacao del mundo y el ms grande de Asia. Sin embargo, los granos de Malasia
se venden a un precio ms bajo en comparacin con los granos de frica occidental,
debido a algunas deficiencias en su calidad (bajo aroma de cacao, sabor astringente y
amargo). Uno de los factores que podran causar que esto podra ser una alta cantidad
de sustancias fenlicas. Un estudio realizado por Natsume et al. (2000) informaron de
que el contenido fenlico en licor de cacao variado con el pas de origen. Sin embargo,
no se ha publicado en la capacidad antioxidante del cacao en grano de diferentes
pases.
Los estudios han demostrado que el consumo de cacao o chocolate reduce el riesgo de
enfermedad cardiovascular ( Keen, 2001 y Osakabe et al., 1998 ). Por otra parte, los
extractos preparados a partir de polvo de cacao y granos de cacao, se mostr a exhibir

efectos antidiabticos en ratas diabticas inducidas con estreptozotocina ( Amin et al.,

2004b y Ruzaidi et al., 2005 ). Amin, Koh, y Asmah (2004a) demostr que un extracto
etanlico preparado a partir de licor de cacao de Malasia exhibi un potencial en la
disminucin de la gravedad de la hepatocarcinognesis en ratas. Una revisin realizada
por Duke (2000)supone que dos cucharas de cacao en una taza de agua o leche
podran ser utilizados como un tratamiento paliativo de la enfermedad de Parkinson, la
mastitis, enfermedades del hgado, la disfuncin sexual, la fiebre, la cistitis, el fro,
quemaduras, el asma y la bronquitis , la diabetes y la obesidad.
Por lo tanto, este estudio se llev a cabo para evaluar la capacidad antioxidante del
cacao en grano de diferentes pases de origen, por ejemplo, Malasia, Ghana, Costa de
Marfil y Sulawesi. Adems, tambin se determin la correlacin entre la capacidad
antioxidante y el contenido fenlico. Adems de la calidad del sabor, datos sobre la
capacidad antioxidante de los granos de cacao puede ser una informacin adicional a
considerar cuando se promueve el consumo de granos de cacao.

2. Materiales y mtodos
2.1. Granos de cacao
2.1.1. General
Cacao en grano en bruto (secado y fermentado) de Malasia, Ghana, Costa de Marfil y
Sulawesi fueron adquiridos de KL Kepong (Productos del Cacao) Sdn. Bhd, Selangor,
Malasia.

2.1.2. Productos Qumicos

-caroteno, cido linoleico, Tween 20, hidroxitolueno butilado (BHT), 2,2-difenil-2picrilhidrazil (DPPH), cido ascrbico, Tris-HCl, 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) y cido
ferlico se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.); reactivo de FolinCiocalteu, bicarbonato de sodio, acetato de sodio, cido actico glacial, cloruro frrico
(FeCl 3 6H 2 O), sulfato ferroso (FeSO 4 7H 2 O) y etanol fueron de Merck (Darmstadt,
Alemania), cloroformo era de Fisher Scientific (Loughborough, Reino Unido).

2.1.3. Preparacin de extractos

Cacao en grano sin procesar se desconchados manualmente antes de la molienda. El
extracto se prepar de acuerdo con el mtodo de Velioglu, Mazza, Gao, y Oomah
(1998) . Cotiledones cacao molido se extrajeron con agua destilada o etanol acuoso al
70% durante 2 horas a 50 C utilizando un agitador orbital (Unimax 1010, Heidolph,
Alemania). La relacin entre la muestra al medio de extraccin fue de 1:25. La mezcla

se filtr a travs de un papel de filtro (Whatman n 1) utilizando un embudo

Buchner. El filtrado se considera como extracto de cacao y se utiliza para los ensayos
de antioxidantes.

2.2. ensayo de blanqueo -caroteno-linoleato

La actividad antioxidante del extracto de cacao se ensay basado en el mtodo de
blanqueo -caroteno desarrollado por Velioglu et al. (1998) . BHT se utiliz como el
estndar. -caroteno (0,2 mg en 1 ml de cloroformo), cido linoleico (0,02 ml) y Tween
20 (0,2 ml) se transfirieron a un matraz de fondo redondo. A continuacin, la mezcla se
aadi a 0,2 ml de extracto de cacao o estndar o etanol (como control). El cloroformo
se elimin a temperatura ambiente bajo vaco a presin reducida utilizando un
evaporador rotatorio (Unimax 1010, Heidolph, Alemania). Despus de la evaporacin,
se aadieron 50 ml de agua destilada a la mezcla, a continuacin, se agita
vigorosamente para formar una emulsin. Dos alcuotas de un mililitro de la emulsin
se pipetearon en tubos de ensayo y se colocan inmediatamente en un bao de agua
(Techne, Cambridge Duxford, Reino Unido) a 50 C. La absorbancia se ley a intervalos
de 20 minutos durante 2 horas a 470 nm, usando un SECOMAM Anthelie avanzada 5
espectrofotmetro. Tasa de degradacin (DR) se calcul de acuerdo a la cintica de
primer orden, utilizando la siguiente ecuacin basada en Al-Saikhan, Howard, y Miller
(1995) :

Gire MathJax en

donde ln es logaritmo natural, una es la absorbancia inicial (470 nm) en el tiempo

0, b es la absorbancia (470 nm) a 20, 40, 60, 80, 100 o 120 min y t es la absorbancia
inicial (470 nm) en el tiempo 0.
La actividad antioxidante (AA) se expres como porcentaje de inhibicin con respecto
al control, utilizando la siguiente frmula:

Gire MathJax en

2.3. Ensayo de depuracin de radicales 2,2-difenil-2-picrilhidrazil

La actividad de eliminacin se estim de acuerdo con el mtodo de Lai, Chous, y Chao

(2001) . Una alcuota de extracto de cacao (200 l, 0,62 a 496 mg / ml en etanol) o cido
ascrbico (estndar) (0,16 a 1,28 mg / ml) se mezcl con 100 mM de tampn Tris-HCl
(800 l, pH 7,4). A continuacin, se aadi 1 ml de 500 mM de DPPH preparados
previamente en etanol. La mezcla se agit vigorosamente y se dej reposar durante 20
min a temperatura ambiente en una habitacin oscura. Se ley la absorbancia
utilizando un espectrofotmetro a 517 nm. El efecto de la basura en el radical de DPPH
fue calculado usando la siguiente ecuacin:

Gire MathJax en

CE 50 valor se determin a partir del grfico trazado de barrido de actividad frente a la

concentracin de extractos de cacao, que se define como el antioxidante total
necesario para disminuir la concentracin de radicales DPPH inicial en un 50%. Las
mediciones se llevaron a cabo por triplicado, y su efecto de barrido se calcul
basndose en el porcentaje de DPPH depurado.

2.4. Ensayo de alimentacin / antioxidante frrico reductor (FRAP)

Ensayo FRAP se determin sobre la base de la reduccin de Fe 3 + -TPTZ a un color azul
Fe 2 + TPTZ (Benzie y Strain, 1996 ). El reactivo FRAP se prepar mediante la mezcla de
300 mM de tampn de acetato (pH 3,6), 10 mM y 20 mM TPTZ FeCl 3 6H 2 O en una
proporcin de 10:01:01, en a 37 C. Reactivo FRAP (3 ml) se pipete en tubos de
ensayo. A continuacin se aadi un total de 100 l de muestra y 300 l de agua
destilada a los mismos tubos de ensayo, y se incub a 37 C durante 4 min. Cada
muestra se realiz por triplicado. Se midi la absorbancia a 593 nm. El valor FRAP se
calcul utilizando la ecuacin descrita porBenzie y Strain (1996) . En el ensayo FRAP, el
potencial antioxidante de la muestra se determin a partir de una curva patrn trazada
utilizando, FeSO 4 7H 2 O en un rango de concentracin entre 200 y 1000 mM.

2.5. Contenido de fenoles totales

Contenido fenlico total se determin segn el mtodo de Singleton y Rossi
(1965) . Una muestra (200 mg) se extrajo con 2 ml de agua destilada o etanol acuoso
al 70% a temperatura ambiente durante 2 h utilizando un agitador orbital a 200
rpm. La mezcla se centrifug (Protech, Malasia) a 1000 g durante 15 min. El
sobrenadante (200 l) se mezcl con 1,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu, y se dej
reposar a temperatura ambiente durante 5 min, a continuacin se aadi 1,5 ml de

solucin de bicarbonato de sodio (0,566 M) a la mezcla. Despus de 90 min, la

absorbancia se ley a 725 nm. Los resultados se expresaron como equivalentes de
cido ferlico. La concentracin utilizada era en un rango entre 0,02 y 0,1 mg / ml.

2.6. El anlisis estadstico

Todos los datos se expresaron como media desviacin estndar. Los datos fueron
analizados mediante ANOVA de una va con el programa SPSS 11.5. Nueva prueba de
rango mltiple de Duncan se utiliz para evaluar las diferencias entre las
medias. Prueba de correlacin de Pearson se utiliz para evaluar las correlaciones entre
las medias. Una diferencia significativa fue considerado en el nivel de p <0,05.

3. Resultados y discusin
3.1. blanqueo -caroteno-linoleato
En el ensayo de blanqueo -caroteno, cido linoleico produce hidroperxidos como los
radicales libres durante la incubacin a 50 C. La presencia de antioxidantes en el
extracto
reducir
al
mnimo
la
oxidacin
de
-caroteno
por
hidroperxidos. Hidroperxidos formados en este sistema sern neutralizados por los
antioxidantes de los extractos. Por lo tanto, la tasa de degradacin de -caroteno
depende de la actividad antioxidante de los extractos. Hubo una correlacin entre la
tasa de degradacin y la decoloracin de -caroteno; donde el extracto con la tasa de
degradacin de -caroteno ms bajo exhibi la actividad antioxidante ms alta. Todos
los extractos tenan una actividad antioxidante ms bajo que el BHT ( . Fig. 1 y . Fig.
2 ).

. Figura 1. tasa de degradacin de la materia prima del grano de cacao (extracto etanlico) se
ensay por el mtodo de blanqueo -caroteno ( n = 3). La concentracin de la muestra fue de
0,04 g / ml (40 000 ppm). BHT a 200 ppm se us como el estndar. Los coeficientes de
variacin (CV) estn a menos de 11%.

Opciones Figura

. Figura 2. tasa de degradacin de la materia prima del grano de cacao (extracto de agua) se
ensay por el mtodo de blanqueo -caroteno ( n = 3). Concentracin de la muestra fue de
0,04 g / ml (40 000 ppm). BHT a 200 ppm se us como el estndar. Los coeficientes de
variacin (CV) estn a menos de 18%.
Opciones Figura

En este estudio, se utilizaron dos medios de extraccin para la preparacin de los

extractos de cacao. Un estudio previo haba informado que la actividad antioxidante y
el rendimiento del contenido fenlico fue influenciado por diferentes solventes de
extraccin ( Sun & Ho, 2005 ). Por ejemplo, un extracto de agua deTerminalia
chebuta mostr una buena actividad antioxidante, en comparacin con los extractos
metanlicos de Lycopersicon esculentum ( Cai, Qiong, Mei, y Harold, 2004 ). Por otra
parte, desde un punto de vista toxicolgico, el etanol y el agua son ms seguras que
acetona, metanol y otros disolventes orgnicos (Oktay, Gulcin, y Kufrevioglu, 2003 ). La
actividad antioxidante de los extractos etanlicos de cacao sigui el orden de Ghana,
Costa de Marfil Malasia> Sulawesi ( Tabla 1 ). Hubo una diferencia significativa
( p <0,05) entre la actividad antioxidante de los granos de Sulawesian y otros
granos. No se encontr diferencia significativa entre Costa de Marfil y Ghana
frijoles. Extracto de cacao de Malasia mostr una diferencia significativa ( p <0,05) en
la actividad antioxidante en comparacin con todos los otros extractos excepcin de
Costa de Marfil.
Tabla 1. Actividad antioxidante (%) de los granos de cacao primas ensay por el blanqueo caroteno-linoleato

Pases de origen

La actividad antioxidante (%)

Etanol

Agua

Malasia

67,6 1,8 d

72,7 1.5bc

Ghana

74,1 2.5bc

74.9 2.4b

Costa de Marfil

71,02 1.53cd

83.69 1.07a

Sulawesi

26,1 1,8 E

51,4 3.0f

Concentracin de la muestra fue de 0,04 g / ml. Los valores se expresan como media
desviacin estndar ( n = 3).Medias con letras diferentes son significativamente diferentes al
nivel de p <0,05.
Opciones de tabla

Extractos de agua de Costa de Marfil, el cacao fue significativamente mayor ( p <0,05)

en la actividad antioxidante, seguido de Ghana, Malasia y Sulawesi. Sin embargo, el
anlisis de varianza no mostr ninguna diferencia significativa entre los granos de
Ghana y Malasia. Todos los extractos de agua de los granos de cacao mostraron
actividad antioxidante ms alta en comparacin a los extractos etanlicos.Compuestos
antioxidantes solubles en agua de los granos de cacao parecen inhibir la oxidacin de
-caroteno en un sistema de -caroteno-linoleato mejor que los compuestos solubles
en etanol. Esta conclusin fue apoyada por un estudio sobre hongos ( L. edodes y V.
volvacea ), que mostr extractos de agua que tienen actividad antioxidante ms alta
que los extractos metanlicos ( Cheung, Peter, y Vincent, 2003 ). Amin y Tan
(2002) reportaron que el agua extractos de algas marinas ( Laminaria sp.) tenan
mayor actividad antioxidante, en comparacin con extractos etanlicos. Componentes
antioxidantes presentes en los extractos de agua, tales como aminocidos, cidos
fenlicos y flavonoides en el propleo ( Nagai, Reiji, Hachiro, y Nobutaka, 2003 ),
pirocatecol en la ortiga ( Gulcin, Irfan, Oktay, y Mehmet, 2004 ), catequina en el t,
vino, uva, manzana, pera y melocotn ( Dreosti, 2000 , Nicolas et al., 1994 , Spanos y
Wrolstad, 1990 y Cheng y Crisoto, 1995 ) tienen alta actividad antioxidante. En los
granos de cacao, compuestos antioxidantes solubles en agua pueden ser (-)epicatequina, (+)-catequina, quercetina y ( Sanbogi, Suzuki, y Sakane, 1997 ). Otros
factores que tambin influyen en la actividad de los antioxidantes son la concentracin
de antioxidantes, medio de extraccin, temperatura, pH del medio ( Gazzani, Papetti,
Massolini, y Daglia, 1998 ), estructuras qumicas y la posicin en la molcula ( Antes,
Wu, y Schaich, 2005 ) .

El contenido fenlico total de los granos de cacao se muestra en la figura. 3 . Granos

de Malasia present el mayor contenido de polifenoles, seguido de Sulawesi, Ghana y
Costa de Marfil para el agua y extractos de etanol. Varios estudios han demostrado una
correlacin entre la actividad antioxidante y el contenido fenlico ( Nagai et al.,
2003 , Velioglu et al., 1998 y Yang et al., 2002 ). Sin embargo, sobre la base de
ensayo de blanqueo -caroteno, el estudio no mostr una correlacin entre la actividad
antioxidante y el contenido fenlico para ambos extractos. Nuestro hallazgo est de
acuerdo con Amarowicz, Wanasundara, Wanasundara, y Shahidi (1993) , que
informaron de que la linaza con el contenido fenlico ms bajo, exhibi la actividad
antioxidante ms alta. Adems, la actividad antioxidante de la nuez, anacardo ( Tsuda,
Makino, Kato, Osawa, y Kawakishi, 1993 ) y el trigo sarraceno ( Sun & Ho, 2005 ) fue
inversamente correlacionada con el contenido fenlico. Basado en el ensayo de
blanqueo -caroteno, compuestos fenlicos de cacao en grano inhibieron dbilmente la
oxidacin de -caroteno por hidroperxidos. Una alta actividad antioxidante tambin
podra ser debido a otros compuestos fenlicos adems de que son solubles en agua y
etanol.

. Figura 3. contenido de fenoles totales de cacao en grano extraer. Concentracin de la

muestra fue de 0,01 g / ml. Los resultados se expresan como equivalentes de cido
ferlico. Los valores se expresan como media desviacin estndar ( n = 3). Las medias con
letras diferentes son significativamente diferentes al nivel de p <0,05.
Opciones Figura

3.2. Actividad de barrido de 2,2-difenil-2-picrilhidrazil radical

La accin de barrido del radical de protones es conocido por ser uno de los diversos
mecanismos de la actividad antioxidante de medicin. DPPH es uno de los compuestos
que poseen un protn radical y muestra un mximo de absorcin a 517 nm
libre. Cuando se encuentra con eliminadores de radicales DPPH de protones, sus

prpura color se desvanece rpidamente. Este ensayo determina la compactacin de

especies de radicales estables de DPPH por los antioxidantes.
Para los extractos etanlicos, granos de Ghana mostraron el efecto de barrido ms alta,
mientras que los granos Sulawesian mostraron la actividad ms baja entre los granos
( . Fig. 4 ). Granos de Costa de Marfil mostraron un efecto de barrido ligeramente
mayor que los granos de Malasia. Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre
estos granos.

. Figura 4. Scavenging efecto del extracto etanlico sobre los radicales DPPH. Los valores se
expresan como media desviacin estndar ( n = 3). El cido ascrbico se usa como el
estndar. Los coeficientes de variacin (CV) estn a menos de 12%.
Opciones Figura

La actividad de eliminacin de los extractos acuosos se encontraba en el orden de

Ghana> Malasia> Costa de Marfil> Sulawesi. Hubo diferencias significativas ( p <0,05)
entre los granos. Granos de Malasia mostraron una significativa mayor ( p <0,05) en
comparacin con el efecto de barrido de granos de Costa de Marfil ( . Fig. 5 ).

. Figura 5. Scavenging efecto del extracto de agua sobre los radicales DPPH. Los valores se
expresan como media desviacin estndar ( n = 3). El cido ascrbico se usa como el
estndar. Los coeficientes de variacin (CV) estn a menos de 20%.
Opciones Figura

La actividad de eliminacin de ambos extractos de cacao en radicales DPPH aument

rpidamente desde 0,62 hasta 2,5 mg / ml. Los resultados mostraron que la actividad
de barrido se aument a medida que la concentracin de extracto aument hasta que
se alcanz una meseta despus de 2,5 mg / ml. A una concentracin de 4,96 mg / ml,
extractos etanlicos mostraron actividad de barrido ms alta que los extractos acuosos
( . Fig. 4 y fig. 5 ). Un estudio realizado por Cheung et al. (2003) en seta ( V. volvaco )
encontr que la actividad de eliminacin de los extractos metanlicos fue
significativamente mayor que los extractos acuosos.
CE 50 valor se determin a partir del grfico trazado de barrido de actividad frente a la
concentracin de extractos de cacao, que se define como la cantidad de antioxidante
necesario para disminuir la concentracin de radicales DPPH inicial en un 50% ( Tabla
2 ). La CE bajo 50 indica la capacidad ms fuerte de los extractos de actuar como
captadores DPPH. Para los extractos etanlicos, frijoles Malasia y Ghana tenan la
misma EC 50 , que fue ligeramente menor que el frijol de Costa de Marfil. Sin embargo,
no hubo diferencia significativa entre estos granos. La CE 50 no se obtuvo el valor de los
granos Sulawesian para ambos extractos etanlicos y agua.
Tabla 2. actividad captadora (CE

50

) de los granos de cacao sobre los radicales DPPH

Pases de origen

CE

50

(DPPH) mg / ml

Extractos etanlicos

Extractos de agua

Malasia

1,3 0.01B

2,4 0,1 d

Ghana

1,3 0.01B

1,7 0.01c

Costa de Marfil

1,5 0.1bc

2,9 0.0E

Sulawesi

ND

ND

Los valores se expresan como media desviacin estndar ( n = 3). El cido ascrbico se usa
como un estndar. CE50 valor se define como el antioxidante necesario para disminuir la
concentracin de radicales DPPH inicial en un 50% la cantidad. Las medias con letras
diferentes son significativamente diferentes ( p <0,05, ANOVA). ND = no detectado.
Opciones de tabla

De los extractos de agua, granos de Ghana mostraron la CE ms bajo 50 , en

comparacin con los otros granos. Granos de Malasia tenan una significativamente
mayor ( p <0,05) CE 50 en comparacin con granos de Ghana. El anlisis de varianza
revel una diferencia significativa ( p <0,05) entre la CE 50 valores de extractos
etanlicos y agua. Sun y Ho (2005) reportaron una correlacin significativa entre los
fenoles totales y la capacidad de eliminacin de los extractos de trigo sarraceno en
radicales DPPH. Sin embargo, nuestro estudio no mostr una correlacin entre la
capacidad de recoleccin de residuos y fenoles totales.Este hallazgo fue similar a los
resultados obtenidos a partir del ensayo de blanqueo -caroteno. Un estudio realizado
por Yu et al. (2002) no encontr ninguna correlacin entre la actividad de barrido y el
contenido de fenoles totales. Nuestros resultados indican que la capacidad de barrido
de alta en radicales DPPH no poda ser debido a los compuestos fenlicos en los
extractos de granos de cacao.

3.3. Actividad reductora frrico sobre la base de ensayo FRAP

El extracto etanlico de los granos de Sulawesian exhibi el potencial antioxidante ms
alta entre los extractos ( . Fig. 6 ), basado en el ensayo FRAP. Granos de Malasia y
Sulawesian tuvieron mayor potencial antioxidante en comparacin con el ghans y el
frijol de Costa de Marfil. Para los extractos de agua, frijoles Sulawesian tambin
mostraron el mayor potencial antioxidante, seguido de Ghana, Costa de Marfil y
Malasia. Todos los extractos de agua mostraron diferencia significativa ( p <0,05) en el
potencial antioxidante, excepto para los granos de Ghana y Malasia.

. Figura 6. potencial antioxidante de extractos de cacao ensayadas por el

ensayo

FRAP. Concentracin de la muestra fue de 0,04 g / ml. Los valores se expresan como media
desviacin estndar ( n = 3). Las medias con letras diferentes son significativamente
diferentes al nivel de p <0,05.
Opciones Figura

Ensayo FRAP mide el potencial reductor de un antioxidante reaccionar con un

tripyridyltriazine frrico (Fe 3 +-TPTZ) y la produccin de un complejo ferroso
tripyridyltriazine color (Fe 2 + -TPTZ) ( Benzie y Strain, 1996 y Benzie y Strain, 1999 ). En
general, las propiedades reductoras se asocian con la presencia de compuestos, que
ejercen su accin mediante la ruptura de la cadena de los radicales libres a travs de la
donacin de un tomo de hidrgeno ( Gordon, 1990 y Duh et al., 1999 ). De acuerdo
con Benzie y Strain (1996) , la reduccin de Fe 3 + complejo-TPTZ de color azul de Fe 2 + TPTZ se produce a un pH bajo.
Frijoles Sulawesian y Malasia son bien conocidos por tener un pH bajo cotiledones,
mientras que Ghana tiene un pH medio, y Costa de Marfil tiene un pH alto ( Misnawi,
Jinap, Nazamid, y Jamilah, 2002 ). El potencial antioxidante ms alta de los granos de
Malasia podra ser debido a la naturaleza altamente cida (pH bajo) de los cotiledones
de frijol, que muchos influencia del pH del medio de ensayo.
Adems, hubo una correlacin positiva entre el ensayo FRAP y el contenido fenlico
tanto para el etanlico (r = 0,764) y los extractos acuosos ( r = 0,782). Este resultado
est de acuerdo con Benzie y Stezo (1999) , que encontr una fuerte correlacin entre
el contenido de fenoles totales y el ensayo FRAP. Gardner, Blanco, McPhail y Duthie
(2000) han evaluado la nitrosodisulfonato potasio radicales libres sinttico (mediante el
uso de spin electrnico resonancia) y Fe 3 + (mediante el uso de FRAP) y encontraron
una fuerte correlacin con el contenido fenlico. En este estudio, los compuestos

fenlicos de cacao en grano exhiben alta potencia en la reduccin de Fe 3 + -TPTZ. RiceEvans, Miller, y Paganga (1997) inform que los compuestos fenlicos tienen
propiedades redox, que les permiten actuar como agentes reductores, donadores de
hidrgeno y extintores de oxgeno singlete. El potencial redox de compuestos fenlicos
juega un papel importante en la determinacin de la capacidad antioxidante ( RiceEvans et al., 1997 ). El anlisis de varianza mostr que los extractos etanlicos de
granos de cacao tuvieron significativo ms fuerte ( p alimentacin <0,05) la reduccin
de los extractos de agua. Esto podra ser debido a la alta cantidad de fenoles totales
presentes en los extractos etanlicos, en comparacin con los extractos
acuosos. Cheung et al. (2003) informaron de que la cantidad de compuestos fenlicos
en los extractos orgnicos fue mayor que en los extractos de agua.
Nuestros resultados revelaron que la capacidad antioxidante y el contenido fenlico de
los granos de cacao de Malasia fue comparable a Costa de Marfil, Ghana y granos de
Sulawesian, lo que indica que los granos de Malasia tienen una capacidad antioxidante
similar a otros granos. El disolvente de extraccin afect significativamente el
contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante del cacao en grano. Extractos
etanlicos mostraron la capacidad antioxidante ms alta cuando se determina
mediante los ensayos de DPPH y FRAP, mientras que los extractos acuosos mostraron
la actividad antioxidante ms alta cuando se evalu por el ensayo de blanqueo caroteno. Por otra parte, se encontr que la cantidad fenlico total ms alto en los
extractos etanlicos. Basado en los ensayos de antioxidantes, por lo tanto se sugiere
que los compuestos fenlicos presentes en los extractos de cacao tienen una fuerte
capacidad secuestradora y poder reductor frrico en lugar de -caroteno-blanqueo
actividad. Esto podra ser debido a los mecanismos antioxidantes de los compuestos
fenlicos hacia los radicales libres. Adems de los compuestos fenlicos, la presencia
de metil xantina (teobromina y la cafena) y antocianinas en los granos de cacao puede
influir en la capacidad antioxidante. Adems, estos compuestos son miscibles en agua
o agua-etanol.
Sin embargo, hay varias limitaciones metodolgicas para las determinaciones de
antioxidantes ( Kaur y Kapoor, 2001 ). Los mtodos ms ampliamente utilizados para la
actividad antioxidante de medicin son aquellos que implican la generacin de
especies de radicales, donde la presencia de antioxidantes determina la desaparicin
de los radicales ( Cao, Alessio, y Cutler, 1993 ). Es pertinente utilizar diferentes
ensayos en un medio de extraccin eficiente, en lugar de confiar en un solo ensayo
para evaluar y comparar la capacidad antioxidante.

Agradecimientos
Los autores desean agradecer la ayuda financiera proporcionada por el Ministerio de
Ciencia, Tecnologa e Innovacin de Malasia (IRPA Proyecto N 01-02-04-0013-

EA001). Tambin hacen extensivo su agradecimiento a la Universidad Putra Malaysia

para el uso de instalaciones de laboratorio.

Food Research International

Volume 33, Issue 6 , julio de 2000, Pages 423-447

Revisin de polifenoles en Theobroma cacao: cambios

en la composicin durante la fabricacin del chocolate
y de la metodologa para la identificacin y
cuantificacin

Ene Wollgast ,
Elke Anklam ,

Comisin Europea, Centro Comn de Investigacin, Instituto de Salud y Proteccin del

Consumidor, Productos Alimenticios y la Unidad de Bienes de Consumo, I-21020 Ispra (Va), Italia

http://dx.doi.org/10.1016/S0963-9969 (00) 00068-5 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Abstracto
Los polifenoles se han convertido en un foco intenso de inters en la investigacin
debido a su percepcin de los efectos beneficiosos para la salud, tales como anticancergenos anti-aterognicas antiinflamatorios antimicrobianos etc polifenoles,,,, en
el t verde y negro, semillas de uva, uvas y (rojo) de vino han aumentado mucho la
atencin, pero el chocolate no se ha investigado intensamente hasta ahora. Esta
opinin se refiere a los polifenoles en Theobroma cacao , el cambio en la composicin y
la cantidad durante la fermentacin, el secado, y la fabricacin de chocolate, as como
con mtodos analticos para el aislamiento, caracterizacin y cuantificacin. Los granos
de cacao son ricos en polifenoles en catequinas y proantocianidinas particulares. Sin
embargo, una fuerte disminucin de la cantidad se produce durante la fermentacin y
secado del cacao en grano y mayor retencin se ha informado durante el

tostado.Caracterizacin y, en particular, la cuantificacin de los polifenoles en el

chocolate slo se ha desarrollado relativamente recientemente. Este trabajo revisa
adems la literatura sobre la metodologa para el anlisis, cuantificacin, aislamiento,
purificacin y elucidacin estructural de los polifenoles en los componentes de cacao y
otros productos bsicos. En cuanto a los mtodos de anlisis se pone mayor nfasis en
HPLC, ya que suele ser el mtodo de eleccin debido a su alta resolucin, alta
eficiencia, alta reproducibilidad y tiempo de anlisis relativamente corto y sin
restricciones en la volatilidad de la muestra. Por otra parte, la HPLC puede ser acoplado
a una variedad de detectores tales como UV-Vis, matriz de fotodiodos (PDA),
fluorescencia, electroqumica (ECD), y espectrometra de masas (MS). Sin embargo, la
TLC como un mtodo de cribado y la electroforesis capilar (CE) como una herramienta
prometedora se toma en la consideracin tambin. La caracterizacin y cuantificacin
de la composicin de polifenoles es uno de los primeros pasos a realizar para evaluar
una supuesta contribucin del chocolate para la salud humana.

1. Introduccin
La importancia de los antioxidantes en la medicina preventiva se reconoce desde hace
varios aos. Las enfermedades que se cree que es causada o al menos mejorarse por
el estrs oxidativo incluyen las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares,
algunas formas de cncer y varios otros trastornos, tales como la diabetes y la
enfermedad reumatoide, muchos de los cuales puede ser relacionada con la
edad. Aunque la etiologa de estas enfermedades es compleja, se reconoce que la
dieta, o la ingesta de ciertos componentes de la dieta est jugando un papel esencial
en la prevencin o el tratamiento de estas enfermedades. La mayora de estas
enfermedades son vistos como resultado de un estilo de vida occidental excesiva en
torno a una dieta altamente refinados ricos en grasas saturadas y azcares extrnsecos
no lcteos y baja en hidratos de carbono complejos de plantas y algunas veces en
minerales y vitaminas (Zumbe, 1998 ).
Sin embargo, el aumento de inters se ha dedicado a compuestos de origen natural,
durante mucho tiempo se consider no nutritivo. Se producen en el metabolismo
secundario de muchas plantas y juegan un papel, por ejemplo, en la defensa contra los
microorganismos, como los compuestos de sealizacin, etc Por lo tanto, se les llama
"productos secundarios de las plantas" ( Watzl y Leitzmann, 1995 ), "fitoqumicos
"( 1 , 58 y 95 ), o "quimio-preventores" ( Zumbe, 1998 ). Tal quimio-preventores se
cree que tienen el potencial para retrasar, prevenir o incluso revertir muchas
condiciones desde el cncer a la caries dental. Ellos tienen el potencial para la inclusin
en los alimentos fabricados como un ingrediente aadido, o existen como un
ingrediente intrnseco de la comida en preguntas ( Zumbe ).
Los polifenoles son un tal clase de compuestos. Se presentan en una variedad de
frutas, verduras, nueces, semillas, flores, corteza, bebidas, e incluso algunos alimentos
manufacturados, como un componente de los ingredientes naturales utilizados. Los

polifenoles se han convertido en un foco intenso de inters en la investigacin debido a

su percepcin de los efectos beneficiosos para la salud. Ellos han sido reportados para
exhibir
anti-cancergenos
( 1 , 19 , 26 , 42 , 58 , 87 , 93 , 94 , 95 y 96 ),
antiaterognico ( 40 , 41 , 44 , 47, 63 y 66 ), anti- lcera ( Saito, Hosoyama, Ariga,
Kataoka y Yamaji, 1998 ), anti-trombtico ( Samman, Lyons Wall & Cook, 1998 ), antiinflamatorio ( 7 , 54 y 74 ), anti-alergnico ( 7 y 54 ), inmune (modulacin
de 74 y 79 ), (anti-microbianas 7 y 98 ), vasodilatadores ( Fitzpatrick, Bing y
Rohdewald, 1998 ), y analgsicos ( Benavente-Garca, et al., 1997 ) efectos. Los
polifenoles ejercen estos efectos como antioxidantes ( 11 , 24 , 35 , 77 , 83 , 91 y 93 ),
los quelantes de cationes divalentes ( Cook & Samman, 1996 ), inhibidores de la
actividad de enzimas, incluyendo ADN topoisomerasa II ( Romanczyk et al., 1997 ), la
protena quinasa C ( Huang y Ferraro, 1992 ) y las protenas tirosina quinasas ( agua
subterrnea, Solomons, Drewe y Munawar, 1996 ), inductores de heptica electrfilo de
procesamiento (Fase II), enzimas ( Prochaska y Talalay, 1992 ), y como moduladores de
la actividad de enzimas tales como citocromo P-450 isoenzima ( Huang y Ferraro,
1992 ), la sintasa de xido ntrico ( Romanczyk et al., 1997 ), ciclo-oxigenasa y
lipoxigenasa ( 13 y 75 ).
El cacao es inusualmente rico en polifenoles, pero caracterizacin precisa, por no
hablar de cuantificacin del contenido de polifenoles slo se ha desarrollado
relativamente recientemente ( Zumbe, 1998 ). Por otra parte, el chocolate como la
principal fuente de cacao consumida por los seres humanos ha sido el menos objeto de
investigacin.
Por lo tanto, esta revisin se centra en: (1) la qumica y la biosntesis de polifenoles, (2)
su incidencia en el cacao y el estado de conocimiento de los cambios en la composicin
y la cantidad de polifenoles durante la fabricacin del chocolate, y (3) un resumen de
los recursos disponibles metodologa para el aislamiento y la caracterizacin de los
polifenoles en los componentes de cacao y otras fuentes de alimentos con la
composicin de polifenoles similares.
La evaluacin del potencial de proteccin de la salud-polifenoles presentes en el
chocolate es un problema complejo y necesita un enfoque integrado. Adems de
anlisis cualitativo y cuantitativo, esto incluye una investigacin de la biodisponibilidad
de los polifenoles a partir de la matriz de chocolate de alimentos, el metabolismo de los
polifenoles absorbidos principalmente en los enterocitos y hepatocitos, la degradacin
de los polifenoles por la microflora (colon), dianas moleculares, la dosificacin eficaz en
vivo, y la interaccin con otros nutrientes como protenas, polisacridos, grasas y
algunos micronutrientes. Productos de cacao o polifenoles de cacao no se han
investigado intensamente en este contexto, hasta ahora, mientras que el t verde y
negro, as como el vino tinto que tiene una composicin de polifenoles bastante
similares han haba planteado la atencin para la investigacin.

2. Qumica y la biosntesis de polifenoles

Los compuestos fenlicos o polifenoles constituyen uno de los ms numerosos y

ampliamente distribuida grupos de sustancias en el reino vegetal, con ms de 8.000
estructuras fenlicas actualmente conocidos (Bravo, 1998 ).
Los polifenoles son productos del metabolismo secundario de las plantas. Surgen
biogenticamente a partir de dos principales rutas sintticas principales: la va de
shikimato y la va de etilo ( Bravo, 1998 ). Tanto el cido actico y el cido shikmico se
derivan del metabolismo de la glucosa ( 18 y 82 ). El cido actico en su forma activa
acetil-CoA reductasa o ms adelante en la va como malonil-CoA es el punto de partida
de la sntesis de cidos grasos en una va primaria, pero es tambin el punto de partida
en un camino secundario de la sntesis del anillo A de los flavonoides . Productos de la
va de shikimato primaria son los aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina), pero
su degradacin conduce tambin en la va fenilpropanoide considerada como una va
secundaria. Sin embargo, la va fenilpropanoide es presente de forma ubicua en las
plantas superiores que forman el ncleo de una serie de vas relacionadas que
conducen a diversos productos incluyendo flavonoides y stilbens. La va de
fenilpropanoides parece esencial para la supervivencia de las plantas terrestres que
proporcionan componentes de las plantas tales como la lignina con su funcin
mecnica y estructural importante. Adems, los compuestos derivados de
fenilpropanoides tienen distintas funciones en la fisiologa de las plantas (por ejemplo,
como compuestos de sealizacin dentro de la planta y, como factores que controlan la
esterilidad masculina y la regulacin de la actividad hormonal) y sus interrelaciones
con otros organismos (por ejemplo, como compuestos de defensa contra
microorganismos y compuestos entre plantas y otros organismos de sealizacin)
( Rhodes, 1998 ). La acumulacin de compuestos derivados de la ruta de los
fenilpropanoides se controla de una manera sensible al entorno de la planta que
implica una jerarqua de los controles en el nivel y la regulacin de un conjunto muy
especfico de protenas enzimticas genmico. Por otra parte, un compartition espacial
permite una serie de vas paralelas que conducen a productos especficos y para
diferentes sistemas de regulacin para operar. Por lo tanto, la distincin que se dibuja
entre un metabolismo primario y secundario es algo arbitrario y Rodas (1998) sugiri
que pensar en trminos de un metabolismo integrado que es nico y caracterstico en
las plantas.
Los polifenoles se pueden dividir en al menos 10 clases diferentes en funcin de su
estructura bsica. Tabla 1 ilustra la estructura qumica bsica de los principales
compuestos polifenlicos.
Tabla 1. Principales tipos de compuestos polifenlicos ( Bravo, 1998 )

Clase

Esquel
eto
bsico

Fenoles
simples

C6

Benzoquino
nas

C6

Los cidos
fenlicos

C 6 -C 1

Acetofenon
as

C 6 -C 2

Estructura bsica

Clase

Esquel
eto
bsico

Los cidos
fenilactico

C 6 -C 2

cidos
Hydoxycinn
amic

C 6 -C 3

Phenylprop
enes

C 6 -C 3

Cumarinas,
isocoumarin
es

C 6 -C 3

Estructura bsica

Clase

Esquel
eto
bsico

Cromonas

C 6 -C 3

Naftoquino
nas

C 6 -C 4

Estructura bsica

Clase

Esquel
eto
bsico

Xantonas

C 6 -C 1
-C6

Estilbenos

C 6 -C 2
-C6

Estructura bsica

Clase

Esquel
eto
bsico

Antraquino
nas

C 6 -C 2
-C6

Los
flavonoides

C 6 -C 3
-C6

Lignanos,
neolignanos

(C 6 -C
3 )2

Las ligninas

(C 6 -C
3 )n

Estructura bsica

Opciones de tabla

Los flavonoides, que constituyen el grupo ms importante, pueden ser divididos en 13

clases, con ms de 5.000 compuestos descritos en 1990 ( Tabla 2 ).
Tabla 2. Clasificacin de los flavonoides alimenticios ( Bravo, 1998 )
Flavonoides
Chalconas

Dihidrocalcon
as

Estructura bsica

Flavonoides
Aurones

Flavonas

Estructura bsica

Flavonoides
Los
flavonoles

Estructura bsica

Flavonoides
Dihidroflavon
oles

Estructura bsica

Flavonoides
Flavanones

Los flavanoles

Estructura bsica

Flavonoides
Flavandiol
orleucoanthoc
yanidin

Estructura bsica

Flavonoides

Estructura bsica

Antocianidina

Isoflavonoide
s

Biflavonoides

Proantocianidi
nas taninos
orcondensed

Opciones de tabla

Su estructura comn es el de diphenylpropanes (C 6 -C 3 -C 6 ) y consta de dos anillos

aromticos unidos a travs de tres carbonos que suelen formar un heterociclo
oxigenado ( . Fig. 1 ).

. Figura 1. Estructura bsica y el sistema de numeracin de los flavonoides.

Opciones Figura

Como se mencion anteriormente, el anillo A es biosintetizado por la condensacin de

tres moles de malonil-CoA derivados del metabolismo de la glucosa. Los anillos C y B
tambin se derivan de mecanismo de glucosa por medio de la va de shikimato y la va
fenilpropanoide, respectivamente, para producir C-9 cidos (por ejemplo, cido
cinmico, cido hidroxicinmico, y cido cumrico). Como CoA derivados de estos
cidos C-9 se condensan con el producto C-6 a partir de malonato para formar una C15 chalcona. Cierre del anillo subsiguiente hidratacin y da lugar a los diversos
flavonoides ( Formica y Regelson, 1995 ).
En resumen, la figura. 2 muestra una representacin de la biosntesis de flavonoides de
acuerdo con 18 , 71 ,70 y 82 .

. Figura 2. Esquema de la estructura de la biosntesis de los flavonoides y las interconexiones.

Opciones Figura

Junto con fenilpropanoides o derivados de cidos hidroxicinmicos, flavonoles y en

menor grado flavonas se encuentran en casi todas las plantas. Mientras flavanonas y

flavonas se encuentran a menudo juntos (por ejemplo, en las frutas ctricas) y estn
conectados por enzimas especficas, hay una cierta exclusin mutua entre flavonas y
flavonoles en muchas familias de plantas y antocianinas son casi ausente en las
plantas flavanona-ricos ( Rice-Evans et al., 1996 ).
Los flavonoides se presentan ocasionalmente en plantas como agliconas, aunque se
encuentra ms comnmente como derivados glucsidos ( 10 y 85 ). El sitio de
glicosilacin preferida es la posicin 3 y con menos frecuencia la posicin 7. La glucosa
es el residuo ms habitual de azcar, pero otros incluyen galactosa, ramnosa, y xilosa
( Rice-Evans et al., 1996 ).
Adems, las diferencias individuales dentro de cada grupo de flavonoides resultado de
la variacin en el nmero y la disposicin de los grupos hidroxilo con el que ocurre ms
comnmente siendo aquellos con dihidroxilacin en las posiciones 3 'y 4' ( Rice-Evans
et al., 1996 ).
Los flavonoides, en especial la flavan-3-oles catequina, epicatequina, galocatequina,
epigalocatequina, y son los constituyentes monomricos de los taninos condensados,
aunque tambin son muy comunes como monmeros libres ( 10 , 32 y 38 ).
Las antocianinas son el grupo ms importante de pigmentos vegetales solubles en
agua y son responsables para el color de las flores y los frutos de las plantas
superiores. El trmino antocianina se refiere a los glucsidos de antocianidinas (por
ejemplo malvidina, cianidina). Las antocianinas y pigmentos polimricos formados a
partir de antocianinas por condensacin con otros flavonoides son responsables para el
color de vino tinto ( Bravo, 1998 ).
A diferencia de los grupos descritos anteriormente de compuestos fenlicos vegetales,
taninos son compuestos de intermedio a alto peso molecular. Taninos con una masa
molecular de hasta 30.000 Da se han encontrado en las vainas de algarrobo. Los
taninos son molculas altamente hidroxilados y pueden formar complejos insolubles
con los hidratos de carbono y protenas. Esta funcin de los taninos de plantas es
responsable de la astringencia de los alimentos ricos en taninos, debido a la
precipitacin de las protenas salivales. El trmino "tanino" se deriva de la capacidad
de bronceado de estos compuestos en la transformacin de las pieles de animales en
el cuero mediante la formacin de complejos estables tanino-protena con colgeno de
la piel ( 10 , 31 , 50 y 49 ).
Taninos vegetales se pueden subdividir en dos grandes grupos: taninos hidrolizables y
condensados.Taninos hidrolizables consisten de cido glico y su producto de
condensacin dimrica, cido hexahydroxydiphenic, esterificados con un poliol, que es
principalmente glucosa. Como su nombre lo indica, estos taninos son fcilmente
hidrolizados con cido, lcali, y el agua caliente y por la accin enzimtica ceder a
alcohol polivalente y cido phenylcarboxic ( 10 y 31 ).
Taninos condensados o proantocianidinas son polmeros de alto peso molecular. La
unidad monomrica es un flavan-3-ol (por ejemplo, catequina, epicatequina y), con una
molcula de flavan-3 ,4-diol o leucoanthocyanidin como su precursor. Condensacin
oxidativa se produce entre el carbono C-4 del heterociclo y tomos de carbono C-6 o C8 de las unidades adyacentes. La mayor parte de la literatura sobre el contenido de

tanino condensado se refiere slo a las proantocianidinas oligomricas (dmeros,

trmeros, y tetrmeros), debido a la dificultad en el anlisis de molculas altamente
polimerizados. Las proantocianidinas, sin embargo, pueden ocurrir como polmeros con
un grado de polimerizacin de 50 aos y ms. Auto-polimerizacin oxidativa o
enzimtica de unidades flavan-3-ol y flavan-3 ,4-diol se han sugerido como el proceso
que conduce a la formacin de taninos condensados ( 10 , 31 , 38 y 75 ).
Vnculos Interflavanoid son lbiles cidos y ceden a antocianidinas durante la hidrlisis
cida en soluciones alcohlicas (por ejemplo, cido clorhdrico-butanol). Esta reaccin
se utiliza para la determinacin de las molculas de proantocianidina. Si las subunidades constan slo de catequina y epicatequina, cianidina es el producto resultante
de la hidrlisis. Esos proantocianidinas son entonces llamados procianidinas
especficamente, sin embargo, esta diferenciacin no es seguida constantemente en la
literatura.Sustancias flobafeno-como tambin se forman cuando catequinas
condensados se calientan en soluciones de cido minerales de la polimerizacin
adicional de estos compuestos ( 10 , 15 , 61 , 68 , 73 y 75 ).
Proantocianidinas oligomricas son solubles en diferentes disolventes acuosos y
orgnicos, tales como acetona y metanol. Sin embargo, taninos condensados de alto
peso molecular son insolubles. Adems, cuando taninos forman complejos con
protenas o polisacridos de la pared celular, que permanecen insolubles. Esta
insolubilidad es responsable de errores significativos en la cuantificacin del contenido
de polifenoles de las plantas, porque por lo general polifenoles se analizaron en los
extractos, a menudo omitiendo la cuantificacin de taninos insolubles o no extrable
( Bravo, 1998 ).

3. Los polifenoles del cacao: alteraciones en la composicin y la

cantidad de grano de cacao al chocolate - estado del conocimiento
3.1. El grano de cacao
Los granos de cacao se obtienen de los rboles de cacao, que se encuentran en climas
clidos y hmedos en las zonas alrededor de 20 de latitud norte y al sur del
ecuador. En general, las semillas del Theobroma cacao (del orden Sterculiacae ) son
conocidos principalmente en dos variedades: Criollo y Forastero, con Forastero dividen
en varias subvariedades. Un tercer grupo se llama Trinitario, es esencialmente una
mezcla entre Criollo y Forastero y no se encuentra en la naturaleza. El grano de cacao
se compone de una porcin de punta interior cubierto por una capa exterior
( 43 y 55 ).
Los polifenoles en granos de cacao se almacenan en las clulas de pigmento de los
cotiledones.Dependiendo de la cantidad de antocianinas las clulas de pigmento,
tambin llamadas clulas polifenoles de almacenamiento, son de color blanco a purpur
profundo. Tres grupos de polifenoles se pueden distinguir: catequinas, o flavan-3-oles
(ca. 37%), antocianinas (aprox. 4%) y proantocianidinas (ca. 58%). La catequina
principal es (-)-epicatequina con un mximo de 35% de contenido de polifenoles. En un

estudio ( Kim y Keeney, 1984 ) los (-)-epicatequina contenido oscilaron desde 34,65
hasta 43,27 mg por g de muestra desengrasada en recin cosechado Catongo y granos
de cacao Forastero. En cantidades ms pequeas, (+)-catequina, as como trazas de
(+)-galocatequina y (-)-epigalocatequina se han encontrado. La fraccin de antocianina
se compone principalmente de cianidina-3-- L -arabinosid y cianidina-3-- D galactosid. Las procianidinas son en su mayora flavan-3 ,4-dioles, que son 4 8 o 4
6 unido a dmeros, trmeros condensados u oligmeros de epicatequina como la
extensin principal sub-unidad ( 6 y 75 ).
La cantidad total de polifenoles solubles en la masa seca libre de grasa de los granos
de cacao frescos es de 15 a 20% (equivale a aprox. 6% en los granos de cacao secados
al aire, que contiene 54% de grasa y 6% de agua), en los granos fermentados
aprox. 5% (10% y ms que se considera un signo de una mala fermentacin). Estos
valores son vlidos para los granos Forastero, criollo granos de cacao tienen aprox.2/3
de la cantidad de polifenoles, no se ha encontrado que las antocianinas ( Lange &
Fincke, 1970 ).
En resumen, los diferentes polifenoles que han sido identificados en los granos de
cacao
o
cacao-productos
se
enumeran
a
continuacin
( 32 , 38 , 39 , 60 , 67 , 73 , 75 y 80 ):

3.1.1. Las catequinas

(-)-Epicatequina

(+)-Catequina

(+)-Galocatequina

(-)-Epigalocatequina

3.1.2. Las procianidinas

procianidina B1 = epicatequina-(4 8)-catequina

procianidina B2 = epicatequina-(4 8)-epicatequina

procianidina B3 = catequina-(4 8)-catequina

procianidina B4 = catequina-(4 8)-epicatequina

B5 procianidina = epicatequina-(4 6)-epicatequina

procianidina C1 = epicatequina-(4 8)-epicatequina-(4 8)-epicatequina

procyanidin D = epicatequina-(4 8) - epicatequina-(4 8)-epicatequina-(4

8)-epicatequina

mayor oligo-y polmeros, en su mayora homlogos de epicatequina con 2 a 18

unidades monomricas

3.1.3. Las antocianinas

cianidina-3-- L -arabinosid

cianidina-3--

-galactosid

3.1.4. Glucsidos de flavonol

quercetina-3- O --

-arabinosid

quercetina-3- O --

-glucopuranosid

3.1.5. Otros

clovamide

dideoxyclovamide

3.2. Proceso de cacao en los pases de origen: el efecto de la fermentacin y el

secado sobre el contenido y la composicin de polifenoles
La correcta fermentacin y secado de los granos de cacao es esencial para el desarrollo
de sabores adecuados y / o precursores del sabor. Despus de que las vainas se cortan
de los rboles, los frijoles con la pulpa adherida se retiran y se transfirieron a
montones, cajas o cestas para la fermentacin tenga lugar. La fermentacin dura entre
5 y 6 das con granos Forastero teniendo lugar ms de Criollo. Durante el primer da de
la pulpa adherida convierte en lquido y se escurre, con el aumento de la temperatura
constante. Bajo condiciones anaerbicas, los microorganismos producen cido actico
y etanol. Estos procesos inhiben la germinacin de las semillas y contribuyen a los
cambios estructurales en los granos fermentados, tales como la eliminacin de la

compartimentacin de las enzimas y sustratos. Lquidos celulares se mueven por las

paredes celulares y se distribuyen por todo el cacao en grano. Esto ocurre
generalmente despus de 24-48 h de grano de fermentacin. Al tercer da de la masa
de granos se han calentado de manera bastante uniforme a 45 C y se mantendr
entre esta temperatura y 50 C hasta que la fermentacin se ha completado. Es
necesario mezclar los granos de vez en cuando para la aireacin y para asegurar que
los que estn siendo inicialmente en el exterior de la pila estn expuestos a la
temperatura en el interior ( 38 , 39 y 43 ).
Despus de la fermentacin, los granos se colocan en bandejas poco profundas que se
seque. En algunas zonas de cultivo, donde la cosecha principal coincide con la estacin
seca, secado al sol es la adecuada. En las zonas donde la lluvia y la humedad no
permiten el secado al sol, secado artificial sea necesario ( 39 y 55).
Despus de la fermentacin y el secado, los granos de cacao deben tener un contenido
de humedad de aprox. 5-7%. Esto es de gran importancia para un almacenamiento y
transporte como por encima de un contenido de humedad crtico de 8% correcta,
moldes son propensos a desarrollar ( 38 y 39 ).
Durante la fermentacin de los granos de cacao, los polifenoles se difunden con
lquidos celulares de sus celdas de almacenamiento y se someten a la oxidacin de
taninos condensados moleculares altos mayormente insolubles. Estas reacciones son
tanto no enzimtica y catalizada por la enzima polifenol oxidasa, a pesar de que esta
enzima est fuertemente inactiva durante los primeros das de fermentacin,
permaneciendo slo el 50 y el 6% de la actividad enzimtica despus de 1 y 2 das,
respectivamente (Hansen, del Olmo y Burri, 1998 ). La aparicin de reacciones de
condensacin se confirm por la fuerte disminucin del contenido de epicatequina
entre el segundo y tercer da de la fermentacin. Epicatequina y contenido de
polifenoles solubles, respectivamente, se reduce a aprox. 10 a 20% durante la
fermentacin.Esto no es slo debido al proceso de oxidacin, pero tambin causada por
la difusin de los polifenoles en exudaciones de fermentacin ( 8 , 9 , 27 , 32 y 39 ).
La polifenol oxidasa tambin es sensible al secado de manera que la actividad
enzimtica restante despus de la fermentacin y el secado de los granos es slo
alrededor de 2%. Se cree tambin que la oxidacin no enzimtica de los polifenoles
puede ser importante durante el proceso de secado ( Hansen et al., 1998 ).
Se ha demostrado que los 2 das de sol-secado de los granos de cacao frescos no
fermentados por s solos (sin fermentacin) provoca una disminucin del 50% en el
contenido de epicatequina (ca. 22 en lugar de aprox. 40 mg / g de muestra
desgrasada). Por lo tanto, para investigar el contenido de epicatequina de granos de
cacao frescos, stos tenan que ser liofilizado inmediatamente despus de la
eliminacin de las vainas. La mayora de los granos para la produccin de chocolate se
fermentan, sin embargo, est lejos de ser un proceso estandarizado en todo el mundo,
o incluso dentro de una misma regin. Esto se evidencia por una variacin de 6 veces
en la concentracin de epicatequina 10 muestras de granos de cacao fermentados de
diferentes regiones (vase la Tabla 3 ) ( Kim y Keeney, 1984 ).

Tabla 3. Concentracin de (-)-epicatequina en los granos de cacao fermentados de envos que

representan varios pases de produccin de

un

(mg / g) ( Kim y Keeney, 1984 )

Fuente de frijol

(-)-Epicatequina en la muestra desgrasada

Costa de Marfil

6.22

Maracaibo (Venezuela)

3.62

Samoa

10.64

Trinidad

4.68

Baha (Brasil)

8.23

Ghana

4.52

Lagos (Nigeria)

4.68

Costa Rica

16.52

Arriba (Ecuador)

8.08

Jamaica

2.66

un
Los resultados son valores medios de inyecciones duplicadas de un solo extracto.

Opciones de tabla

Durante el proceso de fermentacin, las antocianinas son hidrolizados a

antocianidinas. Los ltimos compuestos se polimerizan junto con catequinas simples
para formar taninos complejos. Las antocianinas suelen desaparecer rpidamente
durante el proceso de fermentacin (93% de prdida despus de 4 das).Por lo tanto, el
contenido de antocianina se ha considerado como un buen ndice para la
determinacin del grado de fermentacin de granos de cacao ( 43 , 64 y 85 ).
En una solicitud de patente reciente, se ha demostrado que los niveles de procianidinas
para disminuir 3 - a 5 veces durante la fermentacin (ver Tabla 4 )).. Hay una
correlacin negativa del contenido de procianidina con el grado de fermentacin y el
cambio de color de prpura a pizarroso ms de granos de caf ( Kealey et al., 1998 ).
Tabla 4. niveles Procianidina ppm (mg / g) en muestras de granos de cacao desgrasados ( T.
cacao , SIAL 659) con diversos grados de fermentacin ( Kealey et al., 1998 )
Las
horas de
fermenta
cin

Mon
mero

Di
mer

Tri
mer

Tetra
mer

Pent
mera

Hexa
mer

Hept
mero

Octa
mer

Nona
mer

Dec
mero

Undeca
mer

Tota
l

21929

100
72

101
96

7788

5311

3242

1311

626

422

146

Tr. un

607
53

24

21088

976
2

911
9

7064

4744

2906

1364

608

361

176

Tr.

572
52

48

20887

989
2

947
4

7337

4906

2929

1334

692

412

302

Tr.

581
65

96

9552

578
0

506
2

3360

2140

1160

464

254

138

Tr.

ND b

279
10

120

8581

466
5

407
0

2527

1628

888

326

166

123

Tr.

ND

229
74

un
Tr., Huellas.

b
ND, no detectado.

Opciones de tabla

3.3. Proceso de cacao para la fabricacin de chocolate en los pases usuarios:

Efecto del tostado, semilla-en grano, alcalinizantes y conchado
El primer proceso en los pases usuarios que deben preceder a la fabricacin de
chocolate o cacao es el de limpieza prima-frijol. El mecanismo consiste en una serie de
operaciones, que elimina de la fibra (a partir de los sacos de yute), agrupaciones de
frijol piedras y arena, de metal, y los inmaduros ( Minifie, 1989 ).
Tostado de todo el grano o semilla es un paso esencial en la fabricacin de licor de
chocolate o slidos de cacao desgrasada parcialmente. Los granos de cacao se tuestan
para desarrollar an ms el sabor del chocolate, ya que debe existir en la forma de
precursores derivados de la fermentacin correcta y el secado de los granos
originales. Todo el grano tostado tambin afloja la carcasa de modo que se puede
retirar fcilmente durante el proceso de eliminacin. El grado de tostacin de cacao es
una relacin dependiente del tiempo / temperatura, donde el tiempo puede variar de 5
a 120 minutos y la temperatura de grano entero tpicamente puede variar desde 120
hasta 150 C. Asados de menor temperatura son habituales para la leche-chocolate y
para algunos chocolates oscuros. En el pre-tostado de los granos enteros, un paso
inicial de calentamiento se puede realizar a justo por debajo de 100 C, seguido de
calcinacin de las puntas a temperaturas elevadas de hasta aproximadamente 130
C. Otras calor tratamientos previos para aflojar la cscara puede ser un choque trmico
de los granos dadas por aire caliente, vapor o calor infrarrojo ( 38 , 43 y 55 ).
El siguiente paso en el procesamiento de cacao convencional implica punta de
rectificado. Semilla de molienda se lleva a cabo tpicamente en dos etapas, una etapa
de trituracin inicial para convertir las puntas de slidos en una pasta fluida y una
etapa final de rectificado para lograr el tamao de partcula deseado.Durante la
molienda, la punta es de tierra, por ejemplo mediante molienda, en un fluido, de color
marrn oscuro "licor". La fluidez se debe a la ruptura de las paredes celulares y la
liberacin de la manteca de cacao durante el procesamiento ( 38 , 43 y 55 ).
Otros de tratamiento de cacao convencional incluye la separacin de la manteca de
cacao del licor por cualquiera de prensas hidrulicas o prensas de tornillo. Para la
fabricacin de chocolate esto tiene importancia para la manteca de cacao que se
aade al mezclar todos los ingredientes de chocolate y / o en el final del proceso de
conchado (descrito ms adelante) ( 38 , 43 y 55 ).
Otro paso puede implicar alcalinizante de los granos, licor, puntas, o polvo con
soluciones o suspensiones de lcali, principalmente para cambiar el color. La
alcalinizacin tambin afecta sabor, pero es dudoso si hay alguna mejora. Sin embargo,
no alcalinizante es un paso indispensable en la fabricacin de chocolate, pero ms
comn para otros productos de cacao tales como cacao en polvo, bebidas de cacao
oscuros o como un ingrediente en un revestimiento o una galleta ( 43 y 55 ).
Los ingredientes bsicos requeridos para la produccin de chocolate son semillas de
cacao, licor de cacao, azcar, otros edulcorantes, manteca de cacao, grasa de

mantequilla (aceite), leche en polvo, leche miga, y emulsionantes. Estos ingredientes

tienen que ser primero mezclado de forma continua o en las mezcladoras por lote. Esto
debera producir una pasta de chocolate de textura algo rugosa y consistencia plstica
(Minifie, 1989 ).
El refinado de pasta de chocolate como el prximo paso es una operacin importante y
produce la suave textura de deseable en chocolate pastelera moderna. Hoy en da, la
refinacin se lleva a cabo en los sistemas de refinado de varios pasos usando
refinadores rollo. En las refineras modernas, la presin entre los rodillos se controla y
cada rollo se enfra internamente de modo que la temperatura deseada se puede
lograr. Las temperaturas en los rollos por lo general varan de 25 a 50 C
( 38 , 43 y 55 ).
La pasta de chocolate refinado se almacena durante 24 horas a 45-50 C
("maduracin"), para conseguir una textura pastosa. Se puede usar como chocolate del
panadero, pero para conchado chocolate fino se requiere ( Minifie, 1989 ).
Conching puede ser considerado como el ltimo proceso en la fabricacin del chocolate
a granel, si el chocolate negro o con leche. Sin duda, es un proceso esencial para el
desarrollo de la textura final y el sabor.Por lo general es un proceso de dos pasos con la
primera para reducir la humedad, expulsar las sustancias voltiles, y distribuir la grasa
igualmente de manera que todas las partculas se dispersan en una fase grasa
continua. En el segundo paso, se aade manteca de cacao y, finalmente, la lecitina
para obtener una pasta homogeneizada lquido. Las condiciones de tiempo /
temperatura durante el conchado pueden variar en cierta medida para el tipo de
chocolate para ser procesado. Con miga de chocolate con leche 10 a 16 horas a 49-52
C con frecuencia se puede utilizar, 16-24 horas a 60 C es ms probable con
chocolates de leche en polvo y el chocolate oscuro es conched generalmente a
temperaturas ms altas, 70 C, a veces hasta 82 C ( 38 , 43 y 55 ).
Conchado condiciones pueden ser modificados (abreviado) mediante el tratamiento
previo del licor de chocolate, por ejemplo, tratamiento trmico (temperaturas por
encima de 100 C) como una pelcula delgada ( Minifie, 1989 ).
Antes del vertido en las formas, la pasta de chocolate tiene que ser enfriado a 10 C y
recalentados varias veces a 29-31 C para una buena cristalizacin ( 43 y 55 ).
La alteracin en el contenido y la composicin de compuestos polifenlicos en el
proceso de fabricacin de chocolate, preferibles durante la tostacin, molienda,
refinado, conchado y donde ms bien altas temperaturas se logran y el aire (oxgeno)
est presente debe ser anticipado debido a la alta actividad redox de polifenoles . Sin
embargo, el conocimiento de estos cambios es limitada.
Slo en una solicitud de patente ( Kealey et al., 1998 ) tiene tales cambios han
divulgado en relacin con los parmetros del proceso. Generalmente, las temperaturas
de tratamiento ms altas y / o ms largos tiempos de procesamiento reducen la
cantidad de polifenoles disponibles en los componentes de cacao. Si un paso
alcalinizante est presente en el proceso, esto tambin conduce a una disminucin
notable en el contenido de polifenol.

Para estudiar los cambios en la composicin y la cantidad de polifenoles, en virtud de

los granos de cacao fermentado-haban sido asados a tres temperaturas diferentes
para asar (127, 159, y 181 C) y posteriormente molida en dos pasos en licor de
chocolate. Los cambios que se encuentran en el contenido total de polifenoles y de un
pentmero de procianidina en relacin con las temperaturas de calcinacin o la
temperatura interna del grano (IBT), respectivamente, y la molienda se enumeran en la
Tabla 5 .
Tabla 5. Sub-fermentado resultados del proceso de frijol ( Kealey et al., 1998 )
Temperatura del
producto

Contenido pentmera de peso total

(g / g)

Procyanidin total de peso total (g

/ g)

127 C puntas
asadas

119 C, IBT un

1953

24618

Licor Finalizado

82-95 C

1943

23710

159 C puntas
asadas

142 C, IBT

810

21234

Licor Finalizado

59-92 C

727

16826

181 C puntas
asadas

162 C, IBT

425

12786

Licor Finalizado

59-83 C

408

11656

un
IBT, la temperatura interna del grano.

Opciones de tabla

A medida que la temperatura de calcinacin se aumenta desde 127 hasta 181 C, el

nivel de polifenoles totales disminuye desde 24.618 a 12.786 g / g, y la del pentmero
procianidina 1953 a 425 mg / g.Disminuciones similares en polifenoles y pentmero
contenido se logran mediante un aparato de calentamiento de infrarrojos con el fin de
calentar los granos enteros y aflojar la cscara de la semilla. En consecuencia, la
temperatura es un factor importante en la retencin de los polifenoles del cacao,
especialmente los oligmeros superiores ( Kealey et al. 1998 ).
Puesto que es un objetivo de la invencin es proporcionar mtodos de seleccin y / o el
procesamiento de los granos de cacao para la produccin de componentes de cacao o
chocolate, respectivamente, que tienen mayores niveles de polifenoles de cacao, existe
muy poca informacin sobre el contenido de polifenoles de fabricacin de chocolate
convencional. Una realizacin de la invencin se refiere a un "estndar de identidad"
chocolate negro que comprende al menos 3600 g (hasta ms de 8000 g) polifenoles de
cacao por gramo de chocolate. Otra realizacin se refiere a un "estndar de identidad"
chocolate con leche que comprende al menos 1000 g (hasta ms de 5000 g) por gramo
de chocolate con leche. Por lo tanto, se puede sugerir como se ha determinado
anteriormente que la "norma de identidad" convencional oscuro y chocolate con leche
tiene niveles por debajo de 3.600 y 1.000 mu g, respectivamente. Niveles similares de
chocolate negro han sido encontrados por Waterhouse, Sirley y Donovan (1996) ,
donde la cantidad de polifenoles totales, medidos por el mtodo Folin (descrito ms

adelante) da como equivalentes de cido glico (GAE), fue de 5 mg / g es igual a 205

mg polifenoles en una g (1,5 oz) trozo de chocolate 41. Estos valores ligeramente ms
altos podran ser debido a los diferentes mtodos utilizados para analizar el contenido
de polifenoles totales. En la solicitud de patente ( Kealey et al., 1998 ) slo monomrica
y oligomrica flavan-3-oles se describen, el resultado dado por peso, mientras que el
mtodo de Folin-mide todos los polifenoles dan como equivalentes de una curva patrn
obtenida con cido glico.
Principalmente el camino por el cual se conserva un alto contenido de polifenoles de
cacao en los componentes de cacao o chocolate es por la eleccin de los granos de
cacao ricos en polifenoles, el uso de menores de los granos fermentados, y reducir el
tiempo y / o la temperatura de tratamiento trmico, por ejemplo, en el tostado o el
calor tratamiento de licor de cacao. Sin embargo, el contenido de polifenoles ms alta
se asocia tpicamente con un amargo, sabor astringente. Varios mtodos se presentan
para reducir la, nota amargo y astringente, tales como aditivos de sabor, slidos de
leche en una cantidad mayor que 12% en peso de chocolates de leche, y diversas
variaciones en el procesamiento del chocolate. Por ejemplo, se han utilizado al menos
dos licores de chocolate con distintos niveles de polifenoles del cacao. Los que tienen
un contenido de polifenoles inferior se someten a una temperatura ms alta, mientras
que los que tienen un mayor contenido de polifenoles a una temperatura ms baja
para conservar el contenido de polifenoles elevada. Posteriormente los dos licores se
combinan para su transformacin en el producto de chocolate final ( Kealey et al.
1998 ).

4. Metodologa disponible para el anlisis, aislamiento, purificacin, e

identificacin
La metodologa aplicada para el estudio de los flavonoides depende en cierta medida
de la finalidad de la investigacin. Esto puede ser (1) para cribar una cierta grupo de
plantas para la presencia de flavonoides; (2) para aislar los flavonoides de una planta
que se sabe que contiene este tipo de sustancia; (3) para determinar la concentracin
de un determinado flavonoide en un en particular planta, o (4) para identificar un
flavonoide aislado y purificado ( Markham y Bloor, 1998 ).
Para la cuantificacin aproximada de polifenoles mtodos colorimtricos son
ampliamente utilizados principalmente debido a su simplicidad y alta
sensibilidad. Estos incluyen el mtodo de Folin-Ciocalteu y mtodos de Prusia-azules
para polifenoles totales, el ensayo de la vainillina-HCl de catequinas y el ensayo de
butanol-HCl para proantocianidinas ( 45 , 49 , 51 y 53 ).
Las capacidades de precipitacin de protena de taninos tienen relevancia para los
aspectos sensoriales, la fisiologa nutricional (por ejemplo, la biodisponibilidad de los
macronutrientes tales como protenas y polisacridos y micronutrientes tales como el
hierro y otros elementos traza), y procesamiento de alimentos.Por lo tanto, se han
desarrollado mtodos para determinar el porcentaje de taninos y no taninos,
respectivamente,
por
los
llamados
mtodos
de
precipitacin
de

protenas. Principalmente, se aadi albmina de suero bovino (BSA) o gelatina a un

extracto de polifenoles de crudo para producir una precipitacin taninoprotena. Entonces, o la protena restante en el supernatate o la protena de la
precipitacin despus de resolubilizacin se determina por el mtodo de la ninhidrina
( 50 y 49 ).
En ambos casos, se requiere un procedimiento de extraccin de polifenoles, y por lo
tanto, los resultados dependen mucho del disolvente de extraccin y
procedimiento. Por otra parte, una curva estndar con cido glico o catequina es
comn para los mtodos colorimtricos. Por lo tanto, los resultados slo se pueden dar
como equivalentes de las normas y los resultados son bastante inespecfica para los
tipos de flavonoides presentes ( Makkar, 1989 ).
Resultados ms especficos y hoy en da se utilizan ms comnmente son las tcnicas
cromatogrficas, como la cromatografa de capa fina (TLC) y la cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC), y ms recientemente la electroforesis capilar (CE). Estas
tcnicas se pueden aplicar para el anlisis cualitativo y cuantitativo, as como para los
procedimientos de aislamiento y purificacin.
La cromatografa en columna (CC) sobre Sephadex LH-20 se utiliza con frecuencia para
la purificacin final, ya que da soluciones libres de residuos para el anlisis estructural
por la degradacin o tcnicas instrumentales, tales como la espectrometra de masas
(MS) y resonancia magntica nuclear (RMN).
En general, los pasos que tienen que ser trabajado a travs se indican a continuacin
( Fig. 3. ) ( 22 , 45 , 49 ,51 y 53 ):

. Figura 3. Esquema del procedimiento general para ser trabajado a travs de anlisis,
cuantificacin, aislamiento y elucidacin estructural de los polifenoles en los alimentos.
Opciones Figura

4.1. Preparacin de la muestra

Dado que algunos flavonoides son inestables, como en el caso de polifenoles de cacao
antocianinas y procianidinas, se requiere un cuidado durante el almacenamiento y
preparacin de la muestra. Si cuantificacin es el objetivo del anlisis subsiguiente, la

congelacin, la congelacin a presin ms preferible en nitrgeno lquido es

aconsejable ( 22 y 51 ).
El primer paso en el anlisis es para aplastar, moler o molino de alimentos crudos (por
ejemplo, granos de cacao), o para mezclar u homogeneizar alimentos procesados (por
ejemplo, chocolate) con el fin de permitir un mejor contacto del disolvente de
extraccin con la muestra y para asegurar que el porcin extrada es representativa de
toda la muestra. Dado que muchos polifenoles se producen en forma ligada como
glicsidos o steres, la preparacin de la muestra puede incluir la hidrlisis alcalina o
cida de compuestos fenlicos enlazados libres antes o despus de la etapa de
extraccin con disolvente. Sin embargo, se omite la etapa de hidrlisis, si se desea la
medicin de compuestos fenlicos en las formas unidas. Por otra parte, las
procianidinas pueden someterse a hidrlisis parcial ( 22 , 45 , 51 y 53 ).

4.2. Procedimiento de extraccin

Para los polifenoles del cacao, metanol acuoso al 70-80% o acetona acuosa al 70% o
combinaciones de los mismos son los ms utilizados para la extraccin. El agua y el
etanol tambin se han utilizado, sin embargo, procianidinas oligomricas se extraen
slo parcialmente, polmeros de alto peso molecular no se extraen en absoluto
( 22 y 45 ).
Despus de una extraccin exhaustiva para un componente menor, los componentes
pueden estar presentes en un nivel muy diluida. La concentracin se realiza casi
siempre a bajas temperaturas (por debajo de 40 C) y bajo presin reducida para
reducir al mnimo la degradacin de los componentes. En esta etapa los analitos
arriesgan a ser oxidado ( Lee & Widmer, 1996 ).
Ejemplos de procedimientos de limpieza generalmente se utilizan a los extractos de
limpiar-up antes de continuar con el anlisis por HPLC (o CE). La etapa de limpieza es
una parte crtica de un mtodo, la eliminacin de componentes interferentes
potenciales (por ejemplo, teobromina y la cafena en el caso de cacao) y
necesariamente vara segn el tipo de matriz de los alimentos a analizar. Estos
incluyen particin lquido-lquido con un disolvente y cromatografa de columna no
miscible en Sephadex LH-20, poliamida, Amberlite XAD-2, HPLC preparativa, y
extraccin en fase slida (SPE), usando cartuchos desechables disponibles
comercialmente ( 22 y 51 ).
La eliminacin de la teobromina y la cafena por lo general puede ser llevada a cabo
por extraccin con cloroformo o diclorometano, ya que la mayora de los flavonoides
tienen una solubilidad muy limitada en estos disolventes. Los factores ms importantes
a considerar en la seleccin del adsorbente de limpieza son la eficiencia, la
recuperacin y la contaminacin ( Lee & Widmer, 1996 ).
Sephadex LH-20 se utiliz con xito para la purificacin adicional de los flavonoides y
de HPLC semi-preparativa en fase ligada C18 antes de la HPLC analtica se puede
aplicar tambin. Desde la introduccin de la extraccin desechable fase slida (SPE)
(cartuchos de pequeas columnas de cromatografa empaquetadas) con envases HPLC,

SPE se ha convertido en el mtodo preferido para la limpieza de los extractos crudos

antes del anlisis. Toda la gama de polares y no polares fases estacionarias a base de
slice en cartuchos pequeos est disponible comercialmente y SPE en fase ligada C18
se utiliza principalmente para el aislamiento de compuestos fenlicos, reemplazando el
uso de Sephadex para las etapas de purificacin. Por preacondicionamiento el cartucho
C18 secuencialmente con neutro o cido disolventes fraccionamiento de compuestos
fenlicos en cido y grupos neutros pueden ser alcanzados as como la separacin de
compuestos fenlicos por modificacin adicional por eluyendo secuencialmente usando
diferentes efluentes ( 22 , 45 y 51 ).

4.3. Los mtodos de anlisis

Aunque otros mtodos como mtodos colorimtricos (vase ms arriba), cromatografa
de papel (PC), la cromatografa en contracorriente (CCC) o la cromatografa de gases
(GC) se pueden utilizar principalmente el mtodo ms comn es el HPLC debido a su
alta resolucin, alta eficiencia, alta reproducibilidad, y el tiempo de anlisis
relativamente corto y sin derivatizacin y sin restricciones en la volatilidad de la
muestra. HPLC tambin se acopla fcilmente a una variedad de detectores ( 45 y 51 ).
Por lo tanto en los mtodos de HPLC se pondr el nfasis principal. Sin embargo, el TLC
como un mtodo de cribado y la electroforesis capilar se tomar una herramienta
prometedora en la consideracin tambin.

4.3.1. Cromatografa en capa fina (TLC)

TLC se utiliza principalmente como una tcnica analtica. Sus principales ventajas sobre
PC para este propsito son su velocidad y su versatilidad, resultante de la serie de
fases estacionarias disponibles. Estos incluyen almina, slice, celulosa, poliamida,
slice de fase inversa, etc Literalmente, hay una combinacin adsorbente y disolvente
para adaptarse a todos los tipos imaginables de flavonoide. TLC se utiliza
especialmente para la deteccin de los extractos que contienen flavonoides o
fracciones de otras separaciones cromatogrficas, por ejemplo, PC y CC, sino tambin
para el anlisis cualitativo. Tabla 6muestra un rango seleccionado de combinaciones de
disolvente-adsorbentes que se han utilizado para procianidinas y / o de antocianinas
cacao en grano u otros productos con una composicin de polifenoles similar
( 22 y 51 ).
Tabla 6. TLC combinaciones de polifenoles de cacao en grano y otras fuentes con una
composicin de polifenoles similares
Fuente

Fase
estacionaria

Opciones de disolvente a

Referencia

Granos de cacao

Slice /
celulosa

TLC sobre gel de slice usando: TAF (toluenoacetona-cido frmico 03:06:01); 2-D TLC en
celulosa: A: TBA ( t cido-agua-butanol-actico
03:01:01) y B: 6 cido actico%

Porter et al., 1991

Los granos de
cacao (cotiledones)

Celulosa

2-D TLC: A: 5% de cido actico; B: n cido-aguabutanol-actico 04:01:05

Jalal y Collin, 1977

Fuente

Fase
estacionaria

Opciones de disolvente a

Referencia

Las cerezas de caf

Slice

cido tolueno-acetona-frmico 06:06:01

Colmenarez et al., 1998

Corteza
deGuazuma
ulmifolia

Slice /
celulosa

1-D TLC sobre gel de slice: cido-agua-acetato de

etilo frmico 18:01:01, 2-D TLC de celulosa: A: 6%
de cido actico y B: cido agua 2-butanol-cido
actico 14:01:05

Hoer, Rimpler y Heinrich,

1995

Bebidas, semillas
de uva, almendras

Slice /
celulosa

El gel de slice: cido tolueno-acetona-actico

06:03:01; sobre la celulosa: cido frmico al 10%

Pascual-Teresa, Treutter,
Rivas-Gonzalo y SantosBuelga, 1998b

Uva y el vino

Slice

03:03:01 cido tolueno-acetona-actico

Sun, Leandro, Ricardo da

Silva y Spranger, 1998

Flavan-3-oles (en
general)

Celulosa

1-D TLC: 14:05:01 cido actico-iso-butanol-agua

o n -cido actico-butanol-agua 04:05:01; 2-D TLC:
A: 5% de cido actico; B: n -butanol -actico-agua
04:01:05 cido

Grayer, 1989

un
1-D TLC, la TLC unidimensional; 2-D TLC, la TLC de dos dimensiones.

Opciones de tabla

Al igual que con PC, manchas pueden ser visualizados utilizando una lmpara de
UV. Este es un mtodo muy sensible, especialmente cuando se utiliza slice
fluorescente UV. Uso de diversos reactivos de pulverizacin, tales como vainillina-HCl y
cloruro ferroso alcohlicas puede aumentar la sensibilidad de otros medios de
comunicacin ( 22 y 51 ).

4.3.2. Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)

HPLC se puede utilizar para la separacin, la determinacin cuantitativa, y la
identificacin de los flavonoides. En la mayora de los casos, los sistemas reportados
para la separacin de compuestos fenlicos y sus glucsidos presentes en los
alimentos se llevaron a cabo por fase inversa (RP) cromatografa en columnas de fase
C18-unidas a base de slice. El dimetro de partcula medio de HPLC envases es
tpicamente 3-10 micras. Columnas de tamao de partcula ms pequeo por lo
general proporcionan un mayor nmero de placas por unidad de tiempo que las
columnas ver con el tamao de partcula ms grande. Sin embargo, columnas 3-m son
algo ms difcil de trabajar y se tapan con ms facilidad ( 22 , 45 , 51 y 53 ).
La mayora de los sistemas de disolventes usados en HPLC analtica incluyen eluciones
binarios gradiente y, ocasionalmente, de elucin isocrtica. Gradiente o elucin
isocrtica utilizando disolventes de cidos actico, frmico acuoso, o fosfrico con
metanol (MeOH) o acetonitrilo (ACN) como modificador orgnico es comn. La gama de
fuerza de disolvente utilizado en eluciones gradiente y el tiempo requerido para la
separacin analtica depende del nmero y tipo de compuestos fenlicos en la
mezcla. A menudo las gradientes de varios pasos se emplean con mezclas

complejas. Isocrtica mtodos se pueden utilizar para los extractos o extractos crudos
que contengan slo unos pocos componentes de polaridad similar (parcialmente
purificada 22 , 45 y 51 ).
La naturaleza del disolvente, tales como la resistencia a disolvente y la viscosidad del
modificador orgnico tiene una influencia importante en la separacin cromtica. ACN
se ha encontrado para dar una mejor resolucin y dar picos mejores y ms cortante
que resulta en mayor nmero de placa que hicieron MeOH.Sin embargo, MeOH puede
ser preferible a ACN debido a su naturaleza menos txica. Adems, un mayor
porcentaje de disolvente orgnico se puede utilizar en la fase mvil para evitar el
deterioro de la columna de fase inversa. En algunos casos, la sustitucin de MeOH con
tetrahidrofurano (THF), que tiene incluso mayor valor de intensidad de disolvente de
elucin (fuerza elutropic) que tanto ACN y MeOH, resolucin mejorada (Lee & Widmer,
1996 ).
El pH y la fuerza inica de la fase mvil se sabe que influyen en la retencin de los
compuestos fenlicos en la columna en funcin de la aparicin de protonacin,
disociacin, o una disociacin parcial. Un cambio en el pH que aumenta la ionizacin de
una muestra podra reducir la retencin en una separacin en fase inversa.Por lo tanto,
pequeas cantidades de cido actico (2-5%), fosfrico o cido trifluoroactico (TFA)
(0,1%) se incluyen en el sistema de disolvente para suprimir la ionizacin de
compuestos fenlicos y grupos carboxlicos y por lo tanto mejorar la resolucin y la
reproducibilidad de carreras. La elucin de compuestos fenlicos de RP-HPLC es el fin
de la polaridad decreciente, por lo que los glucsidos son eluidos antes agliconas y
agliconas con grupos hidroxilo ms antes de los que tienen menos ( 45 y 51 ).
Postcolumna tcnicas de derivatizacin no se han utilizado mucho para la deteccin de
compuestos fenlicos, pero no es claramente un gran potencial en ella. Una aplicacin
fue la deteccin de catequinas y proantocianidinas oligomricas con 4dimetilaminocinamaldehido ( 53 , 62 y 89 ).
Rigaud et al. (1993) desarroll un mtodo HPLC usando una fase normal (NP) columna
de slice y un gradiente de metanol en diclorometano con constante de 4% de la
mezcla de cido frmico-agua (01:01) como eluyente para separar las procianidinas
sobre una base de masa molecular, sin derivacin. Se aplic varias veces para el
anlisis de extractos de procianidinas de cacao, as como para el semi-preparativa y
HPLC preparativa para el aislamiento, purificacin, y anlisis de la estructura posterior
( 25 , 38 y 75 ).
Fenoles absorben bien en la regin UV y el detector ms comnmente utilizado para la
HPLC UV es una longitud de onda variable o detector de UV-Vis. No hay una sola
longitud de onda es ideal para monitorear todas las clases de compuestos fenlicos ya
que presentan mximos de absorcin a diferentes longitudes de onda. Para obtener la
mxima sensibilidad, por lo general una longitud de onda cerca de la mxima se desea,
sin embargo, en la prctica, las longitudes de onda se establecen para la mejor
deteccin global de todos los componentes, que es en el caso de los flavonoides sobre
todo alrededor de 280 nm ( 45 y 53 ).

En los instrumentos modernos, multicanal, escaneo rpido, o detectores de matriz de

fotodiodos (PDA) se han convertido en la norma. PDA puede producir datos tanto en el
dominio del tiempo y espectrales. Se demostr la utilidad de la informacin cualitativa
de compuestos fenlicos analizados en base al espectro de absorcin. PDA tiene tres
ventajas principales para el anlisis de HPLC: deteccin de mltiples longitudes de
onda, la identificacin de picos y determinacin mxima pureza. Desde PDA puede
registrar la caracterstica espectros UV de los diferentes compuestos fenlicos, ya que
eluyen de la columna, la caracterizacin y la disponibilidad de la informacin sobre la
pureza de un pico se puede facilitar mediante la comparacin de los espectros en la
parte delantera, el pice, y la cola de cada pico. Por otra parte, el rpido clculo de la
relacin de absorbencia entre diferentes longitudes de onda es posible. Comnmente,
la identificacin de compuestos fenlicos en el anlisis por HPLC se llev a cabo a
menudo mediante la comparacin de los tiempos de retencin y las caractersticas
espectrales de los picos con los de los estndares. Muestras patrn de agliconas y
algunos de los glicsidos ms comunes estn disponibles comercialmente, sin
embargo, procianidinas especialmente oligmeros con tres o ms unidades
monomricas no lo son. El orden de elucin es en gran medida independiente de las
variaciones menores en el sistema de disolvente de una RP-HPLC, y por lo que tambin
es posible hacer identificaciones tentativas comparando los tiempos de retencin
relativos con las listas publicadas de estos datos ( 45 y 51 ).
Para la comprobacin de pureza del pico, los espectros de la pendiente ascendente,
cuesta abajo, y del mximo de pico se utiliza para comparar. Sin embargo, para los
ismeros, informacin espectral UV-Vis s sola no puede ser utilizado para la
identificacin positiva porque ismeros co-elucin pueden dar lugar a espectros que
representa una mezcla de ismeros. En este caso y para los compuestos, de los cuales
las normas no estn disponibles, medios adicionales de identificacin se deben utilizar
en la interpretacin de separacin por HPLC, tales como la espectrometra de masas
(MS), resonancia magntica nuclear (RMN), y la transformada de Fourier de infrarrojos
(FT-IR) (ver ms abajo) ( 22 , 45 y 51 ).
Detectores de fluorescencia tambin son utilizados para compuestos fenlicos, pero no
se han aplicado ampliamente para la deteccin de flavonoides. Deteccin de
fluorescencia puede ofrecer ventajas sobre deteccin UV en trminos de una mayor
selectividad y mayor sensibilidad. Por otra parte, junto con deteccin de fluorescencia
deteccin UV puede ser til en la identificacin de los picos y la determinacin pico
pureza ( Lee & Widmer, 1996 ).
Ms recientemente, el uso de la deteccin electroqumica (ED) ha recibido mucha
atencin. ED es muy sensible para compuestos que pueden ser oxidados o reducidos
en los potenciales de bajo voltaje, como los flavonoides. Se muestra una mayor
sensibilidad y selectividad sobre deteccin UV, y por lo tanto, es muy til en el anlisis
de muestras reales, ya que reduce los efectos de matriz y por lo tanto mejora la
cuantificacin e identificacin de los picos de analitos. Tiempo necesario para la
preparacin de la muestra, que adems son las posibles fuentes de error, se puede
reducir. Por otra parte, la disfuncin erctil es casi insensible a los cambios en

condiciones de fase mvil asociados con elucin en gradiente. Lneas de base

estacionario se puede lograr con ajustes de alta sensibilidad del detector. En un caso
(Madigan, McMurrough y Smyth, 1994) en lugar complejos gradientes de metanol y
cido fosfrico podran haber sido reemplazados por un cido actico (2,5 a 10%) en
gradiente lineal de agua consecucin de una lnea de base ms suave, obviamente
junto con una mayor resolucin de los flavanoles ( 29 , 30 , 45 , 46 , 48 y 53 ).
El uso de la doble-canal de deteccin electroqumica con HPLC para el anlisis de
compuestos fenlicos ha generado un inters particular. Esto es porque el uso de
electrodos de trabajo en serie o en paralelo a diferentes potenciales de funcionamiento
se puede utilizar para ofrecer una identificacin inequvoca de los componentes de la
muestra ( Madigan et al., 1994 ).
El acoplamiento de un mtodo de NP-HPLC modificado con el anlisis de
espectrometra de masas en lnea (MS) usando una cmara de ionizacin por
electropulverizacin presin atmosfrica ha demostrado ser una herramienta poderosa
para el anlisis cualitativo y la identificacin de las procianidinas de cacao y chocolate
componentes ( 25 y 75 ). La combinacin de los datos de tiempo de la masa y la
retencin es suficiente para pre-identificar o confirmar la identidad de las sustancias
sin aislamiento previo. La confirmacin de este mtodo como una herramienta fiable
para la determinacin cuantitativa de los niveles de procianidinas de cacao, chocolate,
y otros productos alimenticios est siendo investigado actualmente. Dado que este
mtodo no requiere el aislamiento de las sustancias con el fin de caracterizar su
tamao, es ms rpida y puede proporcionar adems una verificacin de la fiabilidad
de las tcnicas basadas en la hidrlisis para la estimacin del grado medio de
polimerizacin (DG) en proantocianidinas (que se describe ms adelante) ( 25 y 62 ).

4.3.3. La electroforesis capilar (CE)

CE es un refinamiento de la electroforesis tradicional en la que el poder de separacin
ha aumentado en un grado (hasta 120 000 platos tericos). Es capaz de superar HPLC
hasta en 65 veces. La sensibilidad tambin es 10-12 veces mayor que en la HPLC, para
la deteccin de la muestra, aunque tambin es comnmente por absorcin UV, el
tamao de la muestra inyectada es slo aprox. 1 ng. Por otra parte, tiempos de anlisis
son mucho ms cortos en CE que en HPLC. HPLC, sin embargo, a menudo sigue siendo
el mtodo de eleccin para el anlisis de flavonoides. Esto es debido al hecho de que
en el CE conseguidas espectros UV son a menudo ruidosa debido a la pequea
cantidad inyectada y los lmites de deteccin para los componentes en la muestra
original son ms altos. CE ofrece un mtodo para la separacin de los flavonoides que
utiliza bastante diferentes propiedades moleculares. Como tal CE a veces se producen
separaciones en HPLC no ( 45 y 51 ).
El principio de la CE se basa en un tubo capilar lleno de tampn de cuyos extremos se
encuentran en depsitos llenos de tampn que contienen electrodos. La muestra se
aplica por diversos medios a un extremo del tubo y una tensin de la tensin aplicada
entre los electrodos. Cualquiera de las especies cargadas positiva o negativamente

pueden
ser
seleccionados
mediante
el
cambio
de
la
polaridad
del
electrodo. Componentes Neutral viajan juntos a travs del capilar con el flujo electroosmtico de la memoria intermedia inducida por la diferencia de potencial entre los
electrodos. Molculas de la muestra cargados se separan a medida que migran a
travs del capilar (en contra del flujo) ( Lee & Widmer, 1996 ).
La movilidad de flavonoides en el CE se determina esencialmente por la relacin de
carga a masa de la molcula. Por lo tanto, los flavonoides no llevan una carga deben
estar ionizados por el uso de un tampn adecuado. Tampones de borato con un pH de
8-11 y una concentracin de 25-200 mM se utilizan comnmente, aunque tampones de
borato de sodio pueden formar complejos con orto grupos-dihidroxilados en el ncleo
flavonoide y con vecinales cis grupos-dihidroxilados en azcares ( 45 y 51 ).
Los flavonoides que no se ionizan fcilmente o son hidrofbicos pueden ser tratados
eficazmente mediante cromatografa capilar electrocintica micelar (MECC), en el que
un agente tensioactivo, a menudo dodecil-sulfato de sodio (SDS), se introduce para
producir micelas cargadas en la que el flavonoide neutro migra.Alternativamente, la
adicin a la memoria intermedia de alrededor de 20% de un disolvente orgnico tal
como metanol o acetonitrilo puede ser suficiente ( Markham y Bloor, 1998 ).
En la mayora de las separaciones, el flujo de endo-osmtica de agua hace que el
flavonoide para ser conducido hacia el ctodo, y el grado de este efecto se determina
por el tamao molecular. Esta es la gran influencia y fundamentales en la
movilidad. Sin embargo, los aniones de flavonoides, que son producidos por el pH
alcalino de la memoria intermedia, tambin son atrados hacia el nodo, con la fuerza
de esta atraccin est determinado por el grado de ionizacin. Por lo tanto, el equilibrio
de estos dos efectos determina la tasa neta a la que los flavonoides migran a lo largo
de la columna capilar para el ctodo.Mientras que el tamao molecular es
generalmente evidente por s mismo, es decir, desde el peso molecular, el grado de
ionizacin depende de la p K una del grupo (ms cido) hidroxilo ( 45 y 51 ).
MECC se ha utilizado como un mtodo rpido para separar oligmeros de procianidina
de cacao (Romanczyk et al., 1997 ). Se ha demostrado que este mtodo slo requiere
12 min para lograr la misma separacin que la obtenida por un min anlisis de HPLC de
fase normal 70. El tampn de MECC consisti en cido brico 200 mM, 50 mM de SDS e
hidrxido de sodio para ajustar el pH a 8,5. El capilar FUE UN 50 cm x 75 m
Identificacin sin recubrimiento de slice fundida y los analitos detectados por PDA.

4.4. Cuantificar flavonoides

Una cuantificacin crudo de componentes puros o mezclas individuales es posible
usando tcnicas colorimtricas (descrito anteriormente) y / o espectrofotometra UV /
visible. En los casos en que los componentes de una mezcla son de un tipo similar, por
ejemplo, todas las antocianinas o todos los flavanoles estos mtodos pueden dar
resultados razonables utilizando las curvas de calibracin con flavonoides disponibles
comercialmente. En el caso de componentes de cacao esto requiere, al menos, el
fraccionamiento de las antocianinas y flavonoles (vase ms arriba) o por

procedimientos de aislamiento an ms tediosas cuantificacin ms precisa utilizando

PC, CC, cromatografa de permeacin en gel (GPC), y HPLC o combinaciones de los
mismos tal como se describe ms adelante ( Markham y Bloor, 1998 ).
HPLC con un detector de UV / visible se puede utilizar como tal para la
cuantificacin. El chromatogramme muestra todos los componentes que se adsorben
en la longitud de onda de inters y el rea del pico de cada componente. El rea del
pico depende del coeficiente de absorcin de ese componente en esa longitud de
onda. Para la cuantificacin de estas reas de los picos se comparan luego con los de
compuestos estndar, que, o bien se incluyen en la muestra antes de la inyeccin
(patrn interno) o por separado cromatografi (patrn externo). Las funciones
principales de un patrn interno son en la determinacin de la fiabilidad de los
procedimientos de extraccin, preparacin de muestras, y cromatogrficos. Cuando se
conoce la clase de compuestos de cada compuesto de la mezcla bajo estudio (por
ejemplo, a partir de los espectros de absorcin), sus niveles pueden calcularse a partir
de su relatividad para el pico del patrn interno. Estos familiares, a una longitud de
onda especfica, se establecen por cromatografa separado del patrn interno con
representantes estndar adecuados de cada clase ( Markham y Bloor, 1998 ).
En el caso de los polifenoles de cacao, es bastante bien conocido que los flavonoides
son el grupo predominante sobre glucsidos y antocianinas (por ejemplo, flavonoles
(quercetina) 6 y 32 ). Sin embargo, tiene que ser establecido si oligmeros de
procianidina tienen respuestas similares de radiacin UV como sus unidades
monomricas epicatequina y catequina para los que estn disponibles los
estndares. Una opcin es la degradacin hidroltica de las procianidinas en la
presencia de floroglucinol o phenylmethanethiol para producir las catequinas
monomricas y por lo tanto el grado medio de polimerizacin (DG) (vase la
descripcin ms precisa a continuacin). Esto dara una cuantificacin de procianidinas
como un grupo como equivalentes de la norma monomrica. Si las fracciones de
procianidinas oligomricas se han aislado previamente, la cantidad de dmeros,
trmeros, tetrmeros, etc, podra lograrse (15 , 62 , 68 y 75 ).

4.5. Procedimientos de aislamiento de flavonoides

El aislamiento y purificacin de los flavonoides individuales se requiere a menudo
porque las estructuras son desconocidos o, como en el caso de las normas de
procianidinas de cacao no estn disponibles comercialmente. Material puro tambin
puede ser necesaria para mediciones de la actividad, por ejemplo, antioxidantes o
actividad anti-cancergena, o para estudios de biodisponibilidad en animales, seres
humanos o el uso de cultivos celulares (por ejemplo, la lnea celular de epitelio
intestinal humano Caco-2).
Un esquema generalizado para el aislamiento flavonoide que a menudo ha demostrado
ser til se presenta a continuacin ( Markham y Bloor, 1998 ):
1.
Inicial de limpieza del extracto

2.
Fraccionamiento en gran escala utilizando cromatografa en columna
3.
La purificacin final (por lo general de pequea escala)
La mayor parte del metanol acuoso o acetona peso del extracto es debido a los
hidratos de carbono. Una separacin crudo primaria de estos hidratos de carbono del
resto del extracto se puede lograr por CC utilizando materiales de relleno tales como
las resinas Amberlite XAD, gel de slice derivatizado (por ejemplo, RP-18) o de los
productos Diaion HP. Para este fin, el extracto se disolvi en agua (o el disolvente
orgnico se elimin por evaporacin rotativa) y se pas a travs de la columna. Los
azcares no se adsorben y se lavaron totalmente de la columna con agua adicional. Los
compuestos menos polares retenidas, incluyendo los flavonoides, se lavan a
continuacin de la columna con alcohol acuoso o puro. Si se desea, algo de separacin
se puede lograr en esta etapa por un aumento intensificado en el contenido de
metanol ( Markham y Bloor, 1998 ).
La separacin adicional de la fraccin flavonoide que contiene (s) puede ahora
proceder con otra forma de CC. Poliamida (por ejemplo, MN SC-6) y Sephadex LH-20
son tiles los medios de comunicacin de piel este propsito. El uso de agua cida,
metanol acuoso al 10-60%, y 60-100% de metanol en una columna de poliamida
previamente acidulada, antocianinas, glucsidos de flavonol y agliconas de flavanoles
(y proantocianidinas), respectivamente, puede ser fraccionada. Separacin por GPC
puede ser utilizado para ms fracciones de las separaciones de columnas ms
grandes. Sephadex LH-20 se emplea ms comnmente y produce separaciones
basadas no solamente en tamao molecular, sino tambin en la interaccin de enlace
de hidrgeno. La mayora de los flavonoides eventualmente se pueden aislar en forma
pura por GPC, aunque en algunos casos ser necesario repetir la cromatografa para
obtener fracciones de pureza suficiente para la purificacin final o determinacin de la
estructura. Estas columnas se suelen funcionar con un nico sistema de
disolvente. Para antocianinas, metanol-cido actico-agua (10:01:09) es til, mientras
que para otros flavonoides metanol-agua (o etanol) o alcohol solo resultado en buenas
separaciones. La acetona se puede aadir para ayudar a la elucin de algunos taninos
( Markham y Bloor, 1998 ).
Para separaciones ms difciles, o cuando slo se requiere una pequea cantidad de
compuesto puro, una forma preparativa de una de las tcnicas analticas se puede
utilizar. Se utiliza a menudo por HPLC semi-preparativa. Se requiere una columna ms
grande (10 mm de dimetro) y se utiliza una velocidad de flujo mayor que el utilizado
en el trabajo analtico. Dado que slo pequeas cantidades se pueden recoger de cada
ejecucin, los compuestos puros se acumulan a partir de varias inyecciones por la
recoleccin de los picos apropiados tal como se detecta por absorcin UV / visible o la
otra de deteccin. Para garantizar la reproducibilidad durante muchos carreras, se
prefiere un sistema de disolvente isocrtico y la temperatura de la columna debe ser
controlada con precisin a travs del uso de un calentador de la columna. GPC en

Sephadex LH-20 y ambos RP-HPLC semipreparativa y NP-HPLC se han usado para el

aislamiento y purificacin de los polifenoles de cacao ( Romanczyk et al.,
1997 ). Alternativamente, se puede utilizar PC unidimensional. Las cantidades de mg se
pueden obtener mediante la ejecucin de varias chromatogrammes de papel de una
sola dimensin. Las bandas apropiadas se extirparon, se eluyeron, y los eluatos
combinados. La contaminacin de material polisacrido puede ser retirado
posteriormente utilizando CC como se describe anteriormente ( 15 , 51 y 67 ).

4.6. Anlisis de la estructura por la degradacin

La tcnica ms importante para el anlisis de flavonoides por la degradacin es la de
hidrlisis. Para los componentes de cacao, la composicin de polifenoles es bastante
bien conocido y las normas para los monmeros que se producen estn disponibles
comercialmente. Dado que este no es el caso para las proantocianidinas oligomricas y
superior-polmero, la degradacin hidroltica puede proporcionar informacin til sobre
el tipo de proantocianidina presente en el extracto, en la estructura de
proantocianidina (de los componentes aislados y purificados), y en el grado medio de
polimerizacin (DG ).
Hidrlisis cida total en presencia de butanol-HCl se puede utilizar para establecer el
tipo de proantocianidina. En el caso de las proantocianidinas de cacao esto ha sido
demostrado para ser el tipo de procianidina, no galatadas y con epicatequina sobre
catequina siendo la unidad de extensin dominante ( 15 y 62 ).
Hidrlisis cida parcial se lleva a cabo para identificar los iniciacin (o terminal) subunidades "inferiores".Slo una parte de la unin entre flavan se rompe, liberando
subunidades inferiores libres, por lo que, por ejemplo, a partir de una procianidina el
trmero no hidrolizada trmero, se obtienen el dmero y monmero inferior (como puede
ser identificado por TLC y / o HPLC) ( 15 y 62 ).
La hidrlisis cida en presencia de floroglucinol y phenylmethanethiol, con
desulfuracin posterior de los tioteres (utilizando nquel Raney en metanol), se llevan
a cabo para la identificacin de las unidades de extensin "superiores". En esta
reaccin, los menores subunidades son liberados como catequinas libres, mientras que
el sub-unidades superior en forma de aductos floroglucinol o benzylthioethers,
respectivamente. La relacin entre las cantidades de productos de adicin o tioteres y
de catequinas libres liberados por lo tanto puede estar relacionado con el grado de
polimerizacin de los compuestos presentes en el extracto. El uso de
phenylmethanethiol es de desventaja debido a su olor fuerte y persistente y, por otra
parte, el anlisis cromatogrfico de los aductos de floroglucinol se han notificado a ser
ms fcil ( 15 , 62, 68 , 73 y 75 ).

4.7. Anlisis de la estructura usando tcnicas instrumentales

4.7.1. Espectroscopia de absorcin

Espectroscopia de absorcin se utiliza, en particular, para la cuantificacin de los

flavonoides y para los estudios preliminares de las estructuras de flavonoides aislados
por cromatografa o detectado por HPLC.Una ventaja principal de esta tcnica es que
requiere slo cantidades muy pequeas de flavonoides, por ejemplo, la cantidad
comnmente disponibles a partir de un punto PC de dos dimensiones es normalmente
suficiente.
Los espectros de absorcin de una amplia seleccin de flavonoides est ahora
disponible en la literatura, y estos espectros puede proporcionar un medio til para
determinar el tipo de flavonoide, el patrn de oxigenacin, e incluso en ocasiones el
patrn glycosalation. Sin embargo, los polifenoles del cacao son principalmente los
flavonoides (catequinas, procianidinas) y slo pequeas cantidades de glucsidos de
flavonoles y antocianidinas. As, la espectroscopia de absorcin slo pudo confirmar la
presencia de un flavanol, pero no pudo dar ms informacin para identificar si
epicatequina o catequina o un procianidina oligomrica. Para ello y de identificacin
positiva en general, las tcnicas tales como MS y RMN son indispensables ( 22 y 51 ).

4.7.2. La espectrometra de masas (MS)

Hasta la fecha, MS se utiliza principalmente en el anlisis de flavonoides para la
confirmacin de peso molecular ( Markham y Bloor, 1998 ). Por lo tanto, esta tcnica
podra proporcionar informacin muy til sobre el nmero de sub-unidades de
catequina en procianidinas de cacao.
Uso de impacto de electrones espectrometra de masas (EI-MS) en cantidades submiligramo, distintos de los pesos moleculares, las frmulas qumicas de los flavonoides
se puede determinar, y se obtiene informacin valiosa en cuanto a los patrones de
sustitucin de A-y B-anillos. Durante el procedimiento de impacto de electrones, los
flavonoides se escinden en un nmero de fragmentos de acuerdo con ciertas vas. Por
ejemplo, la fragmentacin de las flavanonas y dihidroflavonoles a menudo implica
procesos de retro-Diels-Alder. Durante la escisin, se forman muchos intacta
fragmentos A-y-B anillo, la combinacin de los cuales tiende a ser caracterstica de la
clase de los flavonoides a los que pertenece el compuesto en estudio. Con el fin de dar
un buen espectro de masas EI y el ion molecular, el compuesto en estudio debe ser
voltil a las temperaturas de la sonda utilizados en alto vaco en el espectrmetro de
masas (100-230 C).Agliconas flavonoides cumplen con este requisito, pero sus
glucsidos (y probablemente procianidinas oligomricas) no lo hacen. Sin embargo,
otras tcnicas espectrales de masas estn disponibles, por ejemplo, de iones negativos
de bombardeo de tomos rpidos MS (FAB-MS) y de desorcin de campo EM (FD-MS)
( 22 , 45 y 51 , pp 15, 30, 35).
Como se mencion anteriormente, el acoplamiento de la HPLC o CE con el anlisis de
espectrometra de masas en lnea (MS) puede ser una herramienta poderosa en el
anlisis cualitativo y la identificacin, as como la determinacin cuantitativa de
flavonoides, en particular, de procianidinas de cacao y componentes del chocolate, sin
aislamiento anterior ( 15 , 25 , 38 y 75 ).

4.7.3. Resonancia magntica nuclear (RMN)

Espectroscopa de RMN es una herramienta poderosa en la determinacin de la
estructura flavonoide.Adems de proporcionar informacin sobre el entorno qumico de
cada protn o ncleo de carbono en la molcula, la tcnica tambin se puede emplear
para determinar los vnculos entre ncleos cercanos, a menudo permitiendo una
estructura completa para ser ensamblado ( 22 , 45 y 51 ).
Protones bsica y 13 C espectros se obtienen normalmente en experimentos
separados. Debido a la relativamente baja abundancia natural de la 13 C istopo, 13 C
experimentos toman mucho ms tiempo para adquirir datos suficientes para producir
un espectro presentable (horas), mientras que los espectros de protones se puede
obtener en cuestin de minutos. Un espectro de protn descifrable se puede obtener
con tan poco como 0,3 mg de muestra, mientras que 13 C espectros generalmente
requieren muestras ms grandes, tpicamente ms de 1 mg ( Markham y Bloor, 1998 ),
un autor sugiere incluso ms de 15 mg (Grayer, 1989 ).
La mayora de los disolventes producen su propia / o protones y 13 seales C, y esto
puede influir en la eleccin del disolvente. Los disolventes tambin ejercen algn
efecto sobre los espectros. Por lo tanto, el mismo disolvente se debe utilizar cuando se
comparan datos. DMSO- d 6 (sulfxido de dimetilo) es el disolvente de eleccin para
muchos flavonoides, sin embargo, para flavanos y proantocianidinas, metanol- d4 ha
sido reportado para dar los mejores resultados ( Markham y Bloor, 1998 ).
En muchos casos de clases de compuestos bien estudiados como los flavonoides,
protn unidimensional bsica y 13 C espectros son todo lo que se requiere para
confirmar la sospecha de un tipo estructural.Interpretacin de los datos del espectro de
frecuencia se puede lograr a travs de la comparacin con los datos publicados para
los compuestos conocidos. Por lo tanto, la espectroscopia de RMN de protn se puede
utilizar: (1) para determinar el patrn de oxigenacin de la molcula; (2) para
determinar el nmero y la estructura de los grupos funcionales distintos de los
hidroxilos; (3) para establecer el nmero de azcares presentes en glucsidos; y (4)
para distinguir entre diferentes clases de flavonoides. 13 C espectroscopa de RMN
proporciona informacin valiosa sobre el esqueleto de carbono de un compuesto, por
ejemplo, el nmero de tomos de carbono y que de estos tomos de carbono se
oxigena. Tambin se puede utilizar para distinguir entre las diversas clases de
flavonoides. Sin embargo, la contribucin ms valiosa de esta tcnica ha sido que se ha
proporcionado un medio relativamente fciles de identificar el resto de azcar de
flavonoide C -glicsidos (y de O -glucsidos), de establecer la presencia y la identidad
de los grupos acilo, y de determinar las posiciones de los vnculos entre los diversos
restos ( 22 , 45 , 51 y 75 ).
Si un anlisis de compuestos conocidos no ofrece datos adecuados para la
determinacin de la estructura en comparacin, a continuacin, una serie de tcnicas
de RMN sofisticados estn disponibles para ayudar a determinar los vnculos dentro de
la molcula. En la mayora de estos experimentos el instrumento combina
automticamente los resultados de muchos experimentos y los datos se presentan

como un grfico de contorno de dos dimensiones ( 22 , 51 y 75 ). Sin embargo, est

ms all del alcance de esta descripcin general para discutir estas tcnicas en detalle.

4.7.4. Rayos infrarrojos de Fourier (FT-IR)

Espectroscopia de IR se ha usado con menos frecuencia para la identificacin de
sustancias fenlicas. Sin embargo, despus de GC o HPLC, la combinacin de las dos
tcnicas de deteccin de IR y MS pueden ser una herramienta poderosa para la
identificacin de compuestos fenlicos individuales, especialmente para los ismeros
de posicin. Para este tipo de compuestos, los espectros de masas son por lo general
prcticamente idntica pero espectros de IR puede ser muy diferente ( Lee & Widmer,
1996 ).

4.8. Visin de conjunto

Tabla 7 da una visin general de los procedimientos utilizados para el anlisis,
aislamiento, purificacin, identificacin y cuantificacin de los polifenoles en los
productos de cacao y en otras fuentes, con la composicin de polifenoles similares, es
decir, rica en procianidinas.
Tabla 7. Informacin general sobre los mtodos de anlisis, aislamiento, purificacin,
identificacin y cuantificacin de los polifenoles de granos de cacao y productos y fuentes de
polifenol con composicin similar (procianidinas)
Fuente

Extraccin
por
solventes

Los granos de
cacao o licor
de cacao

cido
acetonaagua-cido
actico
70:29.5:0.5

Los granos de
cacao
(cotiledones)

Cold
metanol
acuoso al
70%

Los granos de
cacao,
chocolate
negro

Acetona
acuosa al
70% de
metanol
acuoso al
70%
(judas);
cido
acetonaagua-

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

un

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

NP-HPLC;
gradiente de
diclorometano
-metanol con
const. 4% de
cido acticoagua (01:01)

DAD 280 nm;

fluorescencia
ex 276 nm,
em 316 nm

Kealey et
al., 1998

Acetato de
etilo
Acidificados
extracto
purificado de
varias carreras
de PC

2-D TLC en
celulosa: A:
5% de cido
actico;
B: ncidoagua-butanolactico
04:01:05

La luz
ultravioleta, la
vainillinaHCl, oxalato
de titanio

Jalal y
Collin, 1977

SPE sobre
C18; eluida
con agua para
eliminar los
azcares a
continuacin,
agua acetona,
cido actico
70:29.5:0.5
para

NP-HPLC;
gradiente de
diclorometano
-metanol con
const. 4% de
cido acticoagua (01:01)

DAD y MS
con cmara de
ionizacin
API-ES
utilizando
tanto el modo
de
exploracin y
control de
iones

Debido a la masa
molecular en
combinacin con
DAD espectros

Ref..

Hammerstone et al.,
1999

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

actico
70:29.5:0.5

procianidinas

Los granos de
cacao,
chocolate,
productos de
chocolate
primas

70% de
acetona
acuosa;
70% de
metanol
acuoso

Extracto de
acetato de etilo
en Sephadex
LH20 eluy
con gradiente
de paso
racional del
agua en
metanol

NP-HPLC:
gradiente
diclorometano
-metanol con
const. 4%
cido acticoagua (01:01);
RP-HPLC
gradientes de
agua-metanol
(Const 0,5%
de cido
actico);
MECC: 200
mM de cido
brico, 50
mM de SDS a
pH 8,5

Los granos de
cacao y las
semillas de
uva

70% de
metanol

Evaporada y se
volvi a
disolver en
60% de
acetona; salado
a cabo con
NaCl; se lav
con
cloroformo, se
extrajo con
acetato de
etilo;

Granos de
cacao

60% de
acetonaagua

Se extrajo con
acetato de
etilo; 1. fase
aqueousueous:
A: en
Sephadex LH20 (fraccin de
polmero) B:
en TSK-HW40 (F) se eluy
con metanol
(procianidinas
con el aumento
de M r -peso);
2. fase de
acetato de etilo
sobre
Sephadex LH20 se eluy
con agua en
gradiente
escalonado de
metanol

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

DAD 280 nm;

fluorescencia
ex 276 nm,
em 316 nm

FAB-MS usando
una tcnica de
espectrometra de
masas de iones
secundarios lquido
(LSIMS) en los
modos de iones o
MALDI-TOF/MS
positivos y
negativos; 13 C
RMN y 1 H RMN;
HOHAHA,
HMQC, COSY,
APT, espectros de
XHCORR; tiolisis
y desulfuracin

Romanczyk
et al., 1997

cido agua
NP-HPLC
diclorometano
-metanolfrmico con
relaciones A:
4:43:1:1 y B:
41:7:1:1

UV-VIS a 280
nm

Microthiolysis para
identificar
procianidinas

Rigaud et
al., 1993

TLC sobre gel

de slice
usando: TAF
(toluenoacetona-cido
frmico
03:06:01); 2D TLC en
celulosa: A:
TBA ( t cidoagua-butanolactico
03:01:01) y B:
6 cido
actico%; RPHPLC:
metanol-cido
actico (1%)
01:04
isocrtico

VainillinaHCl para
TLC; UV-Vis
a 280 nm para
HPLC

FAB-MS y 13 C
RMN, la
degradacin
tioltica

Porter y
Chan, 1991.

especficos
(SIM)

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

Los granos de
cacao
fermentado y
no fermentado
()

80% de
acetona
acuosa

RP-C18
cartucho SepPak eluy con
metanol
acuoso al 40%

RP-HPLC:
cido aguametanol-cido
actico
(87:8:5)
isocrtica

UV-VIS a 280
nm

El licor de
cacao

Hervir el
agua

Sephadex LH20 se eluy

con aguaacetona paso
gradiente de
sabia

RP-HPLC:
25% de
metanol que
contena cido
trifluoroactic
o 0,03%
(TFA)
isocrtico

UV-VIS a 280
nm

MS y 1 H y 13 C
RMN

Osakabe et
al., 1998

El licor de
cacao

Etanol
acuoso al
80%

Columna
Diaion
HP2MG eluy
con acetonaagua (que
contiene 0,05%
de TFA)
gradiente de
paso a paso

Preparacin
de RP-HPLC:
40% de
metanol que
contiene 0,1%
de TFA
isocrtica

UV-VIS a 280
nm

MS y 1 H y 13 C
RMN

Sanbongi y
col., 1998

Los granos de
cacao, cacao
en polvo bajo
en grasa no
alcalizado, y
cacao en polvo
instantnea

70% de
metanol
acuoso (de
polifenoles
totales y
taninos);
75% de
acetona
acuosa (por
HPLC)

La
precipitacin
de taninos en
el extracto de
metanol a pH 4
usando 1% de
NaCl en la
solucin de
gelatina al
10%, extracto
de acetona (por
HPLC):
filtracin y la
saturacin con
NaCl
(separacin en
dos fases), el
uso de la fase
de acetona, se
evapor a
sequedad;
disuelto de
nuevo en aguametanol

Total de
fenoles y
taninos con
reactivo de
FolinCiocalteu
(RFC), RPHPLC (slo
epicatequina):
agua a pH 2,6
gradientes
(cido
fosfrico)metanol

RFC:
absorbancia a
760 nm (en
equivalentes
de cido
glico);
HPLC: DAD
a 278-282 nm

Serra
Bonvehi y
Ventura
Coll, 1997

El licor de
cacao

Etanol
acuoso al
80%

RPcromatografa
sobre Diaion
HP-2MG eluy
con 20% de
etanol
(impurezas
tales como

Reactivo de
FolinCiocalteu

La
absorbancia a
760 nm

Sanbongi y
col., 1997

Kim y
Keeney,
1984

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

azcares y
protenas) y
80% de etanol
(polifenoles),
se sec al aire
y se disolvi
en DMSO
Chocolate y
cacao en polvo

95% de
metanol

Reactivo de
FolinCiocalteu

La
absorbancia a
760 nm

Waterhouse
et al., 1996

Manzana, uva
negra, frijoles
enlatados

Metanol
acuoso al
90%
(manzanas /
uvas), el
70% de
metanol
acuoso
(frijoles)

RP-HPLC: 5 a
25% de
acetonitrilo en
tampn de
fosfato (pH
2,4)

UV-Vis a 280
nm y la
fluorescencia
en serie

Artes y
Hollmann,
1998

RP-HPLC:
gradientes de
aguaacetonitrilo en
tampn de
fosfato de
amonio 0,05
M (pH 2,5)

De doble
electrodo LCECD

Lunte et al.,
1998

RP-HPLC:
2,5% cido
actico
gradientesacetonitrilo

UV-VIS a 280
nm

La degradacin
tioltica con
phenylmethanethio
l en cido
sulfuroso (+ RPHPLC);
desulfuracin con
nquel Raney (+
HPLC)

Rigaud et
al., 1991

TLC sobre
placas de
slice: cido
toluenoacetonaactico
03:03:01, RPHPLC: agua
10%
gradientes de
cido actico

VainillinaHCl para
TLC; UV-Vis
a 280 nm para
HPLC

La degradacin
tioltica con
tolueno--tiol (+
HPLC) para la
media de DP

Sun et al.,
1998

Vino y uva
semillas

C18 cartucho
Sep-Pak eluy
con agua
(cidos
orgnicos y
azcares),
solucin de
amonaco a pH
9,5 (cidos
fenlicos), y
metanol (para
los
flavonoides)

Soluciones
puras de
semillas de
uva
procianidinas
o aislados

Uva y el vino

Metanol (de
uva)

Cartuchos C18
Sep-Pak
eluidos con
agua (cidos
fenlicos),
acetato de etilo
(catequinas y
procianidinas
oligomricas),
metanol
(procianidinas
polimricas y

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

Extraccin
lquidolquido:
1. acetato de
etilo a pH 2,0;
2. fase de
acetato de etilo
se evapor y se
volvi a
disolver en
agua se extrajo
con acetato de
etilo a pH 7,0

RP-HPLC:
5% cido
actico
gradientesacetonitrilo

DAD a 535
330 310 280
nm

MS (PE-API/Sciex
interfaz de aerosol
de iones y un
triplequadrupole
MS Sciex Taga
6000E) con el
modo de iones
positivos de
antocianinas, modo
de iones negativos
de catequinas y
cidos fenlicos y
flavonoides

Ghiselli,
Nardini,
Baldi y
Scaccini,
1998

antocianinas);
fraccin de
acetato de etilo
de nuevo en
Sep-Pak,
eluyeron con
dietil-ter
(catequinas
monomricas)
y metanol
(procianidinas
oligomricas)
Vino tinto

Bebidas,
semillas de
uva, almendras

Metanol
(para las
semillas de
uva,
almendras)

Sephadex LH20

TLC sobre gel

de slice:
cido toluenoacetonaactico
06:03:01;
TLC de
celulosa:
cido frmico
al 10%; RPHPLC: aguametanol-4.5%
gradientes de
cido frmico

DAD
deteccin de
lnea doble: a
280 nm y
despus de
derivatizacin
con DMACA
a 640 nm

Semillas de
uva, piel de
manzana,
lentejas, carne
de almendras

Metanol
fro que
contiene
cido
ascrbico
0,05% (-20
C)

Extracto de
acetato de etilo
sobre
Sephadex LH
20 se eluy
con etanol al
96%

RP-HPLC:
gradiente de
2% de cido
acticometanol

UV-Vis a 280
nm; pureza de
los
compuestos
controladas
por HPLCDAD y LCMS

Semillas de
uva

Acetona
acuosa al
75%

Diaion HP-20
resina

Prep-RPHPLC: 15%
de metanol

Pascual
Teresa et al.,
1998b

LC-ESI-MS
(procianidinas
puros); hidrlisis
cida en presencia
de floroglucinol y
phenylmethanethio
l con la
subsiguiente
desulfuracin de
thiolethers; MS y
2-D RMN (para
catequinas
glicosiladas)

Plumb,
PascualTeresa,
SantosBuelga,
Cheynier y
Williamson,
1998

La hidrlisis con
tanasa
(procianidinas

Takahashi,
Kamiya y
Yakoo, 1998

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

galloylated);
degradacin
tioltica con
tolueno--tiol en
cido actico (+
HPLC)
Semillas de
uva

Metanol

Sephadex LH
20 se eluy
con etanol al
96%

RP-HPLC:
4,5% cido
frmico
gradiente de
acetonitrilo-

DAD a 280
nm

TLC en slice
(cido toluenoacetona-actico
3:7.5:1); hidrlisis
completa con
butanol-cido HCl;
hidrlisis parcial
con HCl 0,1 N (+
HPLC); tiolisis y
desulfuracin (+
HPLC); hidrlisis
enzimtica (slo
para galoilo
steres) (+ HPLC)

EscribanoBailon et al.,
1992

Las cerezas de
caf

70% de
acetona
acuosa

Extracto de
acetato de etilo
se lav con
diclorometano
(para eliminar
la cafena); en
una columna
Sephadex LH20 se eluy
con acetona
acuosa al 80%

TLC: cido
toluenoacetonafrmico
06:06:01; RPHPLC 0,5%
de cido
fosfrico
gradientesmetanol

DAD 280 nm

FT-IR usando
discos de KBr; 13 C
RMN; reaccin de
autooxidacin
con n-butanolHCl-Fe (III) para
evaluar la
homogeneidad de
las fracciones de
procianidina-ricos

Colmenarez
et al., 1997

T negro
descafeinado

Metanol
acuoso al
50%

Columna de
celulosa Solka
floc eluy con
metanol y
acetona; ms
fraccionamient
o en Sephadex
LH-20 se eluy
con 20, 40, y
80% de
acetona

Prep-RPHPLC:
acetonitriloagua-cido
actico10:0.5:89.5

DAD 280 nm

Negativo
electropulverizaci
n de ionesMS; 1 H, 13C RMN

Davis et al.,
1997

El t negro

Agua
caliente

La extraccin
de la cafena y
la clorofila con
cloroformo

RP-HPLC
0,5% de cido
actico
gradientesacetonitrilo

DAD dos
carreras entre
190 a 390 y
390 a 590 nm

Opie,
Robertson y
Clifford,
1990

El t negro

Agua

RP-HPLC:
acetonitrilocido o 1% de
cido actico
al 2% ctrico
(pH 2,8 con

DAD a 280,
380, 460 nm

Bailey,
Nursten y
McDowell,
1991

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

NaOH)acetonitrilo o
cido actico
al 2% en 2%
de EDTA sal
de sodioacetonitrilo
Cerveza y
cebada

Extrado
acetona
acuosa al
75%
(cebada)

Cerveza

RP-HPLC: 2,5
a 10% de
cido actico

Coulochem II
ECD
(electrodo
colorimtrico
en serie con el
electrodo
amperomtric
o

Madigan et
al., 1994

RP-HPLC:
3,5%
gradientes de
cido acticometanol

UV a 254 nm;
ECD;
voltametra
cclica

29 y 30

Frutas
almendras
inmaduros

Metanol
fro que
contiene
cido
ascrbico
0,05% (-20
C)

Sephadex LH20 se eluy

con 96% de
etanol y
acetona

RP-HPLC:
4,5% cido
frmico
gradientesacetonitrilo o
10 mM
NH 4OAc
0,1% de cido
frmico
gradientes
metanol

DAD a 280
nm, HPLCMS (ESI-MS)

Hojas de las
plantas
deAmeyena
scandens

Metanol
acuoso al
70%

Extracto de
acetato de
etilo; CC sobre
gel de slice

RP-HPLC en
acetonitriloagua (que
contiene cido
frmico al
0,03%)
gradiente

DAD a 280
nm, ESI-MS

Corteza
deGuazuma
ulmifolia

Fro 70% de
etanol
acuoso;
96% de
etanol y
70% de
etanol
(reflujo)

Se lav con
diclorometano;
extracto de
acetato de etilo
en una
columna
Sephadex LH20 se eluy
con A: 50% de
etanol y B:

1-D TLC en
gel de slice:
cido-aguaacetato de
etilo frmico
18:01:01, 2-D
TLC de
celulosa: A:
6% de cido
actico y B:

Vainillina
cido
sulfrico o
vainillinaetanol-aguaHCl
0.5:5:95:25)

Tiempos de
retencin de
HPLC-; de valores
de Rf de TLC 1-D
y 2-D TLC;
hidrlisis total
(butanol-HCl);
hidrlisis parcial
(HCl 1 N);
hidrlisis cida en
presencia de
floroglucinol y
phenylmethanethio
l con la
subsiguiente
desulfuracin; MS

Pascual
Teresa et al.,
1998a

Gariboldi,
Mascetti,
Galli,
Caballion y
Bosiso,
1998

n -butanol-HCl-Fe
(III) para evaluar la
homogeneidad de
las fracciones de
procianidina-ricos

Hoer et al.,
1995

Fuente

23 vehculos

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

etanol-aguaacetona
09:09:02

cido agua 2butanol-cido

actico
14:01:05

50% de
metanol
acuoso a 90
C
(compuesto
s fenlicos
no
conjugados)
; HCl 1,2 M
en 50% de
metanol a
90 C
(fenoles
totales)

Soluciones
estndar y
hojas de roble

Deteccin

Anlisis
colorimtrico
con el reactivo
de FolinCiocalteu
usando
catequina
como un
estndar

Precipitacin
de la protena
con BSA;
hidrlisis
alcalina de los
complejos de
tanino-BSA

Los
compuestos de
referencia
(disponibles
comercialment
e o aislado de
castao de
Indias)

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

Vinson,
Hao, Su y
Zubick,
1998

Mtodo de la
ninhidrina de
cidos BSAamino de
complejo
hidrolizado

Fotomtrica
(absorbancia a
570 nm)

Makkar et
al., 1987

RP-HPLC:
5% cido
frmico
gradientesmetanol

DAD a 280
nm ya 640 nm
despus de la
derivatizacin
con DMACA

Treutter et
al., 1994

Los taninos en
general

Agua o
metanol

Precipitacin
con BSA; lav
el sedimento y
se disolvi en
SDS (1%),
trietanolamina
(5%) en
solucin o slo
1% de SDS

Una: la
determinacin
de protenas
con
ninhidrina; B:
determinacin
de taninos con
0,01 M de
FeCl 3 en HCl
0,01 M

Fotomtrica
(a 570 nm
para la
determinacin
de protenas, a
510 nm de
taninos)

Makkar,
1989

Los
flavonoides en
general

Acetona
acuosa al
75%;
acuosa de
etanol o
metanol,
acetato de
etilo; C18SPE o
precipitaci
n con PVPP
(lquidos)

Aq extrae
acetona
saturada con
NaCl (dos
fases): la fase
acuosa
contiene
taninos; la fase
de acetona
(glucsidos de
flavonoles,
flavanoles ms

Citrato de
amonio frrico
en solucin
alcalina o de
FolinCiocalteu
reactivo
(fenoles
totales); HCl
vainillina
(flavan-3oles); RP-

UV-Vis a 280
nm (flavan-3oles) o 270280 y 475555 nm
(antocianinas)
o 350-365 nm
(glucsidos de
flavonoles) oa
640 nm
(despus de
derivacin de

McMurroug
h y Byrne,
1992

Fuente

Extraccin
por
solventes

La purificacin
y/o
fraccionamient
o

Mtodo de
anlisis

Deteccin

bajos
oligmeros) se
puede aplicar
en: C18-SPE,
cartuchos SepPak o
Sephadex LH20

HPLC: A:
gradiente
empinada de
metanol 0-95
o 0-50% en
cido actico
2,5%, B:
gradiente de
cido actico
al 0-10%

flavan-3-oles
con DMACA)
; DAD y ECD
(sola
explotacin o
doble
electrodos
detectores
amperic);
fluorescencia

Esclarecimiento
Estructura

Ref..

un
Abreviaturas utilizadas aqu que no se explican en el texto o son diferentes: la extraccin SPE en fase slida; DAD,
la deteccin por red de diodos, API-ES, electrospray ionizacin a presin atmosfrica, MALDI-TOF, matriz asistida
por lser de ionizacin disorption tiempo de vuelo; HOHAHA , homonuclear Hartmann-Hahn; HMQC, heteronuclear
mltiple coherencia cuntica;, espectroscopia de correlacin COSY homonuclear; APT, prueba de protones adjunta;
DMACA, p -dimetilaminocinamaldehido; ECD, la deteccin electroqumica; PVPP, polivinilpolipirrolidona.

Opciones de tabla

5. Conclusin
La importancia y la actualidad de los fitoqumicos en general y de los polifenoles, en
particular, tan prometedor quimio-preventores en la nutricin humana y la medicina
han sido tocados en la introduccin.Este ser manejado con ms detalle en otro
estudio de revisin.
Los polifenoles existen como un ingrediente intrnseca en el cacao, y por lo tanto, los
productos de cacao tales como el chocolate podran convertirse en un alimento
funcional para conferir efectos beneficiosos para la salud para el consumidor como se
sugiere para el vino tinto y el t verde o negro ( Zumbe, 1998 ). Sin embargo, durante
el procesamiento de los granos de cacao y de la fabricacin de chocolate an hay una
disminucin notable en el contenido de polifenoles. Tal disminucin se ha descrito
bastante bien para la fermentacin y el secado de los granos de cacao en los pases de
origen (por ejemplo, 8 , 9 , 38 , 39 y 43 ).Por otra parte, la elaboracin del cacao en
los pases usuarios y, en particular, la fabricacin de chocolate en relacin con los
cambios en la composicin y el contenido de polifenoles hasta ahora no ha sido mucho
objeto de investigacin con una excepcin de una solicitud de patente ( Kealey et al.,
1998 ). Por otra parte, incluso hay muy poco conocimiento sobre el contenido de
polifenoles en el chocolate, especialmente chocolate con leche, a pesar de estos
productos de cacao se consumen ampliamente en los pases occidentales. Las
variaciones en los parmetros del proceso (por ejemplo, la condicin de tiempo /
temperatura de calcinacin) pueden proporcionar productos de cacao con niveles
mejorados de polifenoles.
Sin embargo, para obtener una respuesta a la pregunta, si el chocolate podra
contribuir a la salud de las personas como un alimento funcional de acuerdo a su

contenido en polifenoles, uno tiene que obtener respuestas a preguntas ms concretas

tales como:

Qu polifenoles del cacao estn presentes y en qu cantidad se les puede

todava se encuentran en el chocolate, ya sea negro o con leche, y cules son
los factores clave del proceso responsable de su mantenimiento?

Esas polifenoles ya ejercen bioactividad en el tracto digestivo?

Son absorbidos en el intestino y en caso afirmativo en qu medida

(biodisponibilidad) y por cunto tiempo es lo que permanecen en el cuerpo
antes de su excrecin (biocintica)? Qu influencia sobre la biodisponibilidad
tiene el chocolate matriz alimentaria, por ejemplo, las protenas de la leche en
el chocolate con leche?

Qu sucede con los polifenoles no absorbidos en el colon expuestos a los

microorganismos?

Absorcin pre-supone son los polifenoles metabolizados, y si es as lo

bioactividad no ejercer esos metabolitos?

Qu interacciones con otros nutrientes o no nutrientes no existen?

Cules son las dianas moleculares de los polifenoles del cacao y sus
metabolitos?

Qu dosis se puede considerar como efectivo para cualquiera de los efectos a

corto plazo oa largo plazo?

El contenido fenlico y la capacidad antioxidante del

cacao en grano de variedades hbridas

WA Jonfia-Essien ,
G. West ,
PG Alderson ,
G. Tucker ,

Facultad de Biociencias de la Universidad de Nottingham, Sutton Bonington Campus,

Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, Reino Unido

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.12.001 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Abstracto
Cacao ( Theobroma cacao L.) es un importante econmicamente, cultivo importante,
internacional y se ha asociado con varios beneficios nutricionales que incluyen alta
capacidad antioxidante. Nuevos hbridos de cacao se han desarrollado en Ghana que
muestran resistencia a los daos de plagas durante el almacenamiento. El objetivo de
este trabajo fue evaluar el contenido fenlico y la capacidad antioxidante de estos
nuevos
hbridos
en
comparacin
con
las
variedades
de
cacao
ms
tradicionales. Compuestos fenlicos totales extrables fueron similares en todos los
cuatro hbridos ensayados que van desde 69,9 hasta 81,6 g FAE -1 . Estos niveles eran
muy similar a la que se extrae a partir de granos tradicionales (73,8 2,5 g FAE -1 ). El
"perfil fenlico" se determin por HPLC. Se observ un total de 25 picos pero slo haba
pequeas diferencias en este perfil entre los extractos de soja tradicionales e
hbridos. La capacidad antioxidante se determin utilizando el ensayo FRAP y se han
encontrado granos tradicionales de poseer 12,4 mmol TE g -1 . En comparacin con los
granos hbridos tuvieron capacidades antioxidantes que van desde 21,6 hasta 45,5
mmol TE g -1 , y stas fueron significativamente mayores que en los granos
tradicionales para tres de los cuatro hbridos. Dado que el fenlica y los niveles de
antioxidantes y en estas variedades hbridas eran ya sea similar a, o mayor que, la que
se obtiene a partir de granos tradicionales, la introduccin de estas nuevas variedades
sera poco probable que una incidencia perjudicial sobre estos componentes
nutricionales de los granos.

Palabras clave

Los granos de cacao ;

Las variedades hbridas ;
Los antioxidantes ;
Phenolics

1. Introduccin
Los polifenoles se han convertido en un foco intenso de inters de la investigacin
debido a sus efectos beneficiosos para la salud percibidos ( Wollgast y Anklam, 2000 ),
incluyendo anti-cancergena, anti-aterognico, anti-lcera, anti-trombticos, antiinflamatoria, modulacin inmune, anti -microbiana, efectos vasodilatadores y
analgsico.
Los estudios sugieren que las enfermedades cardiovasculares pueden prevenirse
mediante modificaciones del estilo de vida, como el ejercicio y la nutricin ( Hu y
Willett, 2002 , Stampfer et al., 2000 , Tanasescu et al., 2002 y Weisburger, 2000 ). Una

dieta que contenga las principales fuentes de antioxidantes y polifenoles se

recomienda para fines de prevencin.
Muchos estudios han considerado frutas, verduras y ts como una de las principales
fuentes de compuestos fenlicos antioxidantes dietticos, pero Lee, Kim, Lee, y Lee
(2003) demostraron la importancia de cacao. Vinos y bebidas, como el cacao, el vino
tinto, el t negro y el t verde se consume ampliamente y se sabe que son ricos en
fitoqumicos fenlicos. En particular, teaflavina, galato de epigalocatequina, el
resveratrol y procianidina en el t negro, el t verde, el vino tinto y el cacao,
respectivamente, han sido considerados como agentes quimio-preventivas principales,
principalmente debido a sus actividades antioxidantes fuertes ( Lee et al.,
2003 ). Cacao ( Theobroma cacao L.) es particularmente rico en polifenoles ( Wollgast y
Anklam, 2000 ). Tambin es una de las ms ricas fuentes naturales de
antioxidantes. En efecto los productos de cacao contienen una mayor capacidad
antioxidante y una mayor cantidad de flavonoides por la porcin que ya sea t o vino
tinto ( Lee et al., 2003 y Steinberg et al., 2003 ). Chocolate, un producto de cacao,
tambin puede ser una fuente importante de antioxidantes en la dieta, y estos pueden
tener efectos protectores contra la enfermedad cardiovascular ( Keen et al., 2005 , KrisEtherton y Keen, 2002 y Steinberg et al., 2003 ). El chocolate tambin se ha informado
de que una buena fuente de catequinas dietticos, slo superada por el t negro
( Artes, Hollman, y Kromhout, 1999 ).
La composicin polifenlica de cacao se ha caracterizado y cuantificado ( SnchezRabaneda et al., 2003 ,Wollgast y Anklam, 2000 y Zumbe, 1998 ). Los compuestos
identificados incluyen las catequinas: catequina - epicatequina, galocatequina y galato;
procianinas; antocianinas, y flavona y glucsidos de flavonoles tales como luteolina7- O -glucsido y quercetina-3- O -arabinsido.
Ghana es uno de los mayores productores de cacao de alta calidad. Sin embargo,
mientras que el consumo de cacao se ha incrementado en la ltima dcada, el
rendimiento de los cultivos en el pas ha estado en declive. Para mejorar el
rendimiento, los hbridos se han desarrollado a partir de cruces entre Amazon, Trinitario
y genotipos Amelonado para aumentar la II hbridos Series ( Adu-Ampomah y Sersah,
1987/1988 ) ya cultivadas por los agricultores ( Adu-Ampomah, 1996 ). Algunos de
estos hbridos han sido seleccionados sobre la base de sus rendimientos, que son
comparables a los materiales tradicionales de siembra de amelonado y genotipos
locales Trinitario de cacao, o en su resistencia a enfermedades y plagas. Si bien estos
no estn actualmente en uso comercial son probable que se introduzcan en el futuro
prximo. Sin embargo, muy poco se sabe sobre el nivel de nutrientes clave como
antioxidantes y compuestos fenlicos en estos hbridos. El objetivo de este estudio fue
determinar el contenido fenlico y la capacidad antioxidante de estos hbridos con el
fin de determinar cualquier impacto potencial sobre el contenido de estos importantes
nutrientes.

2. Materiales y mtodos

2.1. Materiales
Una serie de nuevas variedades hbridas de cacao ha sido desarrollado por el Instituto
de Investigacin del Cacao de Ghana. Cuatro de estos hbridos (HV1-HV4) ( Tabla 1 )
han sido seleccionados para el estudio adicional en base a sus altos rendimientos y se
cultivaron en condiciones tropicales en la finca experimental del Instituto de
Investigacin del Cacao de Ghana en Tafo, una ciudad en la regin oriental de
Ghana. Beans fueron cosechadas en noviembre de 2002. Granos tradicionales (TV) se
cultivaron en las mismas condiciones pero en diferentes granjas, y se cosecharon en
exactamente el mismo tiempo que los hbridos.Las vainas cosechadas se rompen para
extraer los granos, que despus se fermenta durante un perodo de seis das. Despus
de la fermentacin de los granos se secan al sol sobre esteras levantadas del
suelo.Habas planas o rotos se retiraron despus de secado y los granos fueron
embolsados en sacos de yute. Los granos fueron enviados al Departamento de
Investigaciones de la Divisin de Control de Calidad para el control de calidad,
embalaje y almacenamiento de trnsito de corta duracin antes de ser aire levantado
al Reino Unido en marzo de 2003 para iniciar el experimento.
Tabla 1. linaje gentico del cacao utilizado en este estudio
Tipo de Cacao

Variedad

Amazon / Trinitario hbridos

HV1

Inter hbridos Amazon (Amazon / Amazon)

HV2 y HV3

Amazon / Amelonado Hbridos

HV4

Tipo de cacao tradicional

TV
Opciones de tabla

Los granos de cacao secos se tamizaron para eliminar la suciedad. Frijoles se

combinaron juntos y se dividieron en cuatro partes iguales en diagonal. Una parte fue
seleccionado al azar para la primera muestra y un lote de 500 g pes. Los granos
restantes se combinaron juntos y se repiti el proceso dos veces ms para dar
muestras por triplicado de cada variedad. Cada muestra se almacena en un prototipo
sacos de yute.Sacos de yute se utilizan con el fin de ajustarse a la norma de los granos
de cacao almacenamiento aprobado. Los granos de cacao se almacenaron a
continuacin en un armario de ambiente controlado a 30 2 C y una humedad
relativa de 70 2%, sobre la base de las condiciones imperantes en los almacenes de
cacao en Ghana. Las muestras para el anlisis se tomaron en la tienda despus de 31
das.

2.2. Extraccin metanlica

Un g de muestra de cacao puntas de frijol 10 se moli con un caf licuadora y 2 g de
cacao en polvo resultante se homogeneiz en 50 ml de metanol al 80% durante 1 min
en un matraz de fondo plano usando un homogeneizador Polytron a 25.000 rpm. La
suspensin de cacao se someti a reflujo durante 30 min y despus se filtr.

Este extracto se utiliza para la determinacin tanto de la capacidad antioxidante y el

contenido de fenoles totales.

2.3. Ensayo antioxidante

La capacidad antioxidante se midi utilizando el potencial antioxidante de reduccin
frrico (FRAP) ensayo como se describe por Benzie y Strain (1996) , utilizando Trolox (020 nmol) como un estndar. Placas de micro-ensayo se prepararon poniendo 10 l de
etanol (en blanco), estndar de Trolox o solucin de la muestra en los pocillos de una
placa de microtitulacin seguido de la adicin de 100 l de reactivo de ensayo FRAP a
todos los pocillos. La absorbancia a 630 nm se registr usando un lector de placas (BioRad 550) y la capacidad antioxidante de la muestra se calcula como equivalentes de
Trolox.

2.4. Ensayo fenlica

Contenido fenlico total se midi usando el mtodo de Folin Ciocalteu y ensayo de
( Forrest y Bendall, 1969). Un ml de la muestra se someti a reflujo filtrada se diluy
con 49,0 ml de agua destilada. Reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu se diluy a 50%, a
continuacin se aadi 0,25 ml del reactivo de 50% a 0,25 ml de la muestra y se
incub en un bao de agua durante 3 min a 25 C. Esto fue seguido por la adicin de
0,5 ml de solucin acuosa saturada de Na 2 CO 3 y la solucin de incubacin adicional
en el bao de agua durante 60 min. A continuacin, se registr la absorbancia a 750
nm. Los resultados se expresan como equivalentes de cido ferlico (FAE) utilizando
una curva estndar de cido ferlico (0-20 g).

2.5. Perfil fenlico

Perfiles fenlicos se determinaron mediante cromatografa lquida de alto rendimiento
(Perkin-Elmer LC 200).La HPLC se equip con una columna Supelco C18
Descubrimiento, 4,6 mm x 15 cm, y un detector de matriz de diodos con absorbancia
ajustado a 280 nm.
Una muestra (5 g) de las puntas de granos de cacao molidas se coloc en un vaso de
precipitados de 200 ml y de 70% de metanol se aadi. Hesperitina (1 mg) se aadi
como un estndar interno para supervisar la recuperacin de compuestos fenlicos. La
mezcla se agit con un agitador magntico durante 2 h, despus se filtr bajo vaco a
travs de filtros Whatman GF / A de papel. El filtrado se transfiri cuantitativamente a
un matraz de fondo redondo y el metanol se evapor usando un evaporador rotatorio,
R-3000, a ~ 170 rpm y 30 C para dejar una solucin acuosa de aproximadamente 60
ml. El hidrxido de sodio se aadi y se dej hidrolizar durante la noche a temperatura
ambiente (50 ml x 2 N). A continuacin, la mezcla se transfiri cuantitativamente a 3
50 ml tubos de centrfuga, y se centrifug a 2000 g durante 15 min. El sobrenadante se
decant del sedimento y se filtr a travs de papel Whatman N 4 en un embudo de
separacin. Se aadieron 80 ml de ter, se agita y la solucin se dej a la particin. Se

mantuvo la fase acuosa. Este paso de particionado se repiti dos veces ms. Despus,
el extracto acuosa final se acidific a pH 1,5 con cido clorhdrico y se filtr a travs de
papel Whatman N 1 en un embudo de separacin. Se aadieron 80 ml de ter
dietlico, se agita y se deja particin. Se recogi la fase de ter. Esta particin se repiti
dos veces ms y los tres extractos de ter resultantes se agruparon. El extracto de ter
combinada se sec con MgSO 4(anhidro), se filtr a travs de papel Whatman N 1 en
un matraz de fondo redondo y se evapora de manera rotatoria hasta que slo unos
pocos ml de ter se mantuvo. Este se transfiri cuantitativamente a un pequeo tubo
de muestra y el ter se evapor a sequedad en una corriente de nitrgeno.
La muestra se recogi en 2 ml de una mezcla de metanol de grado HPLC (25%) y 0,02
M tampn fosfato pH 2,4 (75%), se filtr a travs de un filtro de jeringa de 0,2 micras y
10 mu l se inyecta en la HPLC. A continuacin, se eluy con un gradiente lineal de
metanol de grado HPLC y 0,02 M tampn fosfato pH 2,4 durante 25 min a partir de 20%
de metanol y tampn de 80% y terminando con 80% de metanol y 20% de tampn.

2.6. Estadstica
Todas las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados analizados por ANOVA
usando el programa estadstico Genstat 3.1.

3. Resultados y discusin
Granos de cacao tradicionales e hbridos fueron muestreados y compuestos fenlicos
extrados en 70% de metanol. Los compuestos fenlicos extrados totales se
cuantificaron entonces ( . Fig. 1 ). Todas las variedades de frijol analizados contenan
relativamente alto - alrededor de 70 a 80 mg g -1 - niveles de compuestos fenlicos. El
contenido fenlico total de los granos de cacao se ha informado que oscilar entre 67 y
149 y 101 a 144 mg g -1 de cacao en grano recin cosechadas y 2 das fermentado,
respectivamente (Niemenak, Rohsius, Elwers, Ndoumoua, y Lieberei, 2006 ) . Los
valores ligeramente ms bajos en este caso podran atribuirse o bien al hecho de que
los granos se haban almacenado antes del anlisis o las diferencias de
variedades. Haba, sin embargo, no hay diferencias significativas observadas entre los
niveles en las cuatro nuevas variedades hbridas y la de la mezcla tradicional. Por lo
tanto es probable que sea el caso de que estos cuatro hbridos no son diferentes a los
granos tradicionales en trminos de fenoles totales.

. Figura 1. Total de compuestos fenlicos extrables a partir de granos de cacao tradicionales o

hbrido. Puntas de fresado de cualquiera de los granos de cacao tradicionales (TV) o hbridos
(HV1-HV4) se extrajeron en 70% de metanol y fenoles totales medidos con el ensayo de FolinCiocalteu. Los resultados se expresan como equivalentes de cido ferlico y presentan como
la media y SE ( n = 3). No hubo diferencias estadsticamente significativas entre ninguno de
los granos analizados.
Opciones Figura

Mientras fenoles totales pueden ser un indicador til de potencial beneficio nutricional,
el perfil real de compuestos fenlicos dentro del frijol es probable que sea ms
importante. As, el perfil de los compuestos fenlicos extrables, despus de la hidrlisis
alcalina, de cualquiera de los granos de hbridos o tradicional se determin por
HPLC. Un perfil tpico de HPLC se muestra en la figura. 2 A. Se observ un total de 25
picos dentro de las variedades probadas. No fue posible asignar identidades de estos
picos. Un procedimiento de extraccin similar, pero sin la hidrlisis alcalina ( Niemenak
et al., 2006 ), logr resolver los 8 picos, tres de los cuales fueron identificados como
theobromide, epicatequina y la cafena. Un anlisis comparativo se llev a cabo
mediante la comparacin de las reas de los picos relativos entre los cinco tipos
diferentes de frijoles. Por lo tanto cada una de las 25 reas de los picos, despus de la
correccin para el patrn interno, se expres como un porcentaje de la totalidad. Slo
hubo pequeas diferencias evidentes entre el tipo tradicional y las variedades hbridas
( Fig. 2 B). Los valores para los picos 1 y 3 fueron ms altos en todas las variedades
hbridas que en el tipo tradicional. Pico 11 estaba ausente en los granos de las
variedades hbridas, pero tambin fue muy baja en el tipo tradicional. Los picos 17, 18,
19 y 20, mientras que bajo en todas las variedades hbridas, fueron indetectables en el
tipo tradicional. No se observaron cambios consistentes en los hbridos en comparacin
con los granos de tipo tradicional y, como tal, es poco probable que los niveles de
cualquiera de los compuestos fenlicos individuales se alteran significativamente entre
los granos de hbridos y tradicionales.

. Figura 2. perfil fenlico de extractos metanlicos de cacao en grano seco. Milled puntas de
granos de cacao se extrajeron en 70% de metanol y el agente de extraccin resultante se
secaron y se sometieron a hidrlisis alcalina antes de la separacin por HPLC y deteccin a
280 nm. (A) traza tpica de HPLC para una variedad hbrida que muestra la numeracin de los
picos principales observados. IC = Control Interno (hesperitina). (B) la contribucin relativa de
cada pico de contenido total de compuestos fenlicos. Los valores se presentan como% del
total del rea integrada de los picos de correlacin despus de para el control interno.
Opciones Figura

La capacidad antioxidante de los granos, se determin utilizando el ensayo FRAP ( . Fig.

3 ). Este se encontr que era 12,4 7,3 mmol TE g -1 para la variedad tradicional,

mientras que los valores para los hbridos vari de 21,6 + 2,7 a 45,5 + 2,86 mol TE g 1
. Los valores para HV1 ( p = 0,001), HV2 ( p = 0,004) y HV3 ( p = 0,002) fueron
significativamente ms alto que el de los granos tradicionales. El valor para HV4,
mientras numricamente mayor que para los granos tradicionales, no fue
estadsticamente significativa ( p = 0,055). Es difcil comparar estos valores de
capacidad antioxidante con los citados por los trabajadores anteriores, debido a las
diferencias en ambas metodologas de ensayo y extraccin. Sin embargo, Gu, Casa,
Wu, Ou y Prior (2006) utilizando una extraccin etanlica y un ensayo ORAC reportaron
valores de 826 + 103 mmol TE g -1 para el polvo de cacao natural. Estos valores son
notablemente superiores a los encontrados en este estudio. Desde fenlicos
representan un componente importante de los granos de cacao se postula que
representan la principal fuente de la capacidad antioxidante en granos de cacao y sus
productos. AsOthman Ismail, Ghani y Adenan (2007) monitoreados fenlicos y
capacidad antioxidante en los granos de una variedad de orgenes geogrficos, entre
ellos Ghana, y han demostrado que hubo un efecto significativo de la "zona de
produccin" en ambos parmetros y que hubo una buena correlacin entre fenoles
totales y capacidad antioxidante. Del mismo modo, Gu et al. (2006) han demostrado
una buena correlacin entre los fenoles totales y capacidad antioxidante en los granos
de cacao y sus productos. Es interesante observar que en este estudio, mientras que el
contenido fenlico total no se vio afectada en los hbridos, la capacidad antioxidante
aparentemente ha aumentado. Esto podra sugerir la presencia de otros antioxidantes
importante en el grano de cacao.

. Figura 3. Capacidad total antioxidante extrable de granos de cacao tradicionales o

hbridas. Puntas de fresado de cualquiera de los granos de cacao tradicionales (TV) o hbrido
(HV1-HV4) se extrajeron en 70% de metanol y la capacidad antioxidante total medido
utilizando el ensayo FRAP. Los resultados se expresan como equivalentes de Trolox y presentan
como la media y SE ( n = 3). Los valores marcados con (*) representan muestras cuya
capacidad antioxidante es significativamente ( p <0,005) diferente a la TV.
Opciones Figura

En conclusin, parece que hay poca o ninguna diferencia entre las variedades hbridas
y los granos de cacao de tipo tradicional en trminos de cualquiera de sus contenidos o
composicin fenlica. La capacidad antioxidante de los hbridos es equivalente a, o

incluso puede ser mayor que, los granos tradicionales. Sobre la base de este estudio,
por lo tanto, es poco probable que la introduccin de estas variedades hbridas en el
comercio tendra un impacto en la prestacin de estos nutrientes esenciales para el
consumidor.

Diario de Composicin y Anlisis de Alimentos

Volume 19, Issues 6-7 , septiembre-noviembre de 2006, Pages 612-619
La biodiversidad y la nutricin: un camino comn
La biodiversidad y la nutricin: un camino comn

Artculo Original

Estudio comparativo de diferentes cacao ( Theobroma

cacao L.) clones en trminos de sus compuestos
fenlicos y antocianinas contenidos

Nicolas Niemenak una , ,

Christina Rohsius b ,
Silke Elwers b ,
Denis Omokolo Ndoumou
Reinhard Lieberei b

un

una

Laboratorio de Fisiologa Vegetal, Departamento de Ciencias Biolgicas, Escuela de

Formacin Normal Superior de la Universidad de Yaund I PO Box 47 Yaounde, Camern

Instituto de Botnica Aplicada de la Universidad de Hamburgo, Ohnhorststrasse 18, 22609

Hamburgo, Alemania

http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2005.02.006 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Abstracto

Los polifenoles se analizaron a 280 nm por el dispositivo de HPLC utilizando un detector

de matriz de fotodiodos (PDA). Las antocianinas se separaron con la columna de la SEPPAK Vac 6 cc 1000 mg (Waters) y se midi a 520 nm con un PDA. Diecinueve clones de
cacao de Camern banco de genes fueron analizados. Se utilizaron semillas frescas y
fermentados-como. Dos polifenoles principales estaban presentes en las muestras:
catequina y epicatequina. Epicatequina representa el 2-4% de MS de polvo de semillas
de cacao desgrasado. Sustancias no definidas llamados A, B y C tambin se encuentran
en las semillas de cacao. La sustancia A se discute como un derivado de cido cafeico y
un
compuesto
ster
enlazado. Sustancias
B
y
C
son
oligmeros
de
proantocianidinas. No se detectaron cido Protocatechiuc y quercetina. Dos
antocianinas se encuentran en las semillas del cacao: cianidina-3-galactosidasa y
cianidina-3-arabinsido. Representan 0,02 a 0,4% de MS de polvo de semillas de cacao
desgrasado.Fenoles totales, catequina, epicatequina y antocianina en granos frescos y
fermentados-como eran genotipo-dependiente. Los polifenoles de las semillas de dos
vainas diferentes de un mismo clon mostr una diferencia cuantitativa importante. Test
de correlacin de Spearman mostr que no existe una correlacin entre el nmero de
semillas por vaina, peso de la vaina y el contenido de compuestos polifenlicos. Sin
embargo, se encontr una correlacin negativa entre el nmero de semillas por vaina y
el contenido de catequinas ( r =
- 0 , 4 6 3 , P < 0 , 0 1 ). No se observaron
agrupaciones de muestras utilizando PCA y anlisis de agrupamiento jerrquico. La
separacin entre los grupos est relacionada con su contenido de polifenoles y
antocianinas.

Palabras clave

Las antocianinas ;
HPLC ;
Anlisis de componentes principales ;
Los compuestos polifenlicos ;
Semillas;
Theobroma cacao

1. Introduccin
En las plantas superiores, muchos fenmenos y funciones son atribuibles a los
metabolitos secundarios. La naturaleza de los compuestos de polifenol en las plantas
es complejo. Los fenoles se han asociado con procesos de la planta y el tejido de
maduracin, mecanismos de defensa ( Kubo y Matsumoto, 1984 ), y la caracterizacin
sensorial de los productos alimenticios derivados de las plantas ( Cimato et al., 1990 ).
Los granos de cacao son ricos en polifenoles, contribuyendo algunos 12-18% del peso
en seco de todo el grano ( Bravo, 1998 ). Polifenoles de cacao de frijol se han asociado
con el sabor y color del chocolate. En la fermentacin aerbica, pigmentos marrones se

forman a partir de polifenoles ( Forsyth, 1952 ). La epicatequina y catequina polifenoles

son oxidados a quinonas, y la condensacin de las protenas y polifenoles resultados en
una reduccin de la astringencia y sabor amargo. Las quinonas pueden tambin
complejo con aminocidos, pptidos y protenas y polimerizar con otros
flavonoides. Taninos de alto peso molecular complejos con protenas a travs de
enlaces de hidrgeno, y el resultado de estas reacciones es un agua, pigmento
insoluble marrn. Granos de cacao frescos contienen pigmentos antocianidina prpura,
3 - -Galactosil-y 3 - - L -arabinosil-cyanidins. Durante la fermentacin, estos
pigmentos se hidrolizan por glicosidasas, lo que resulta en un blanqueo de los
cotiledones ( Forsyth y Quesnel, 1957 ).
Flavonoides de cacao se ha informado que tienen una amplia gama de propiedades
biolgicas, incluyendo la sntesis de eicosanoides de modulacin, el aumento de la
sntesis de xido ntrico, la reduccin de la tasa de lipoprotenas de baja densidad
(LDL), la oxidacin, la inhibicin de la activacin de plaquetas, estimulacin de la
produccin de citocinas antiinflamatorias, y la inhibicin de la produccin de ciertas
citoquinas proinflamatorias ( Waterhouse et al, 1996. ; Kondo et al, 1996. ; Mao et al,
1999. ; Karim et al, 2000. ; Mao et al, 2000. ; . Rein et al, 2000 ; Schramm et al,
2001. ; Wan et al, 2001. ). Estas actividades biolgicas diversas se cree que son
atribuibles a un grupo de compuestos polifenlicos presentes en el cacao, incluyendo
los monmeros flavan-3-ol (-)-epicatequina y (+)-catequina y varios oligmeros de
procianidina construidas sobre estas unidades monomricas.
Recientemente, Lee et al. (2003) mostraron que el cacao tiene ms sustancias
fitoqumicas fenlica y una mayor capacidad antioxidante que el t y el vino
tinto. En T. cacao L., estudios de compuestos fenlicos se han centrado en los granos
de asar y licor de cacao debido a su importancia en la industria del chocolate.Poca
atencin se ha prestado a cacao crudo y muy rara vez el espectro de polifenoles en
granos frescos se ha investigado al mismo tiempo como la base de fitoqumicos
fenlicos presentes en el chocolate. Los granos de cacao se utilizan en la industria de
confitera provenir de una amplia gama de reas geogrficas, y pueden tener
diferentes propiedades qumicas y organolpticas. Por consiguiente, el productor de
chocolate debe seleccionar y combinar estos granos en diversas proporciones con el fin
de cumplir con ciertas normas de calidad y especificacin econmica. Los fabricantes
tienen que producir chocolates de sabor constante utilizando materia prima que es
variable. Por esta razn, es importante para ellos tener criterios analticos para la
rpida estimacin de la calidad de la materia prima.
Los polifenoles se analizaron en planta, planta de semillero y el tejido culturas maduras
de cacao ( Jalal y Collin, 1977 ). Leucocianidina se fraccion en las semillas de cacao
por Quesnel (1968) . La medida en que el genotipo, la procedencia geogrfica y el
mtodo de fermentacin y el tamao de las vainas de cacao afecta polifenoles no se ha
demostrado de manera inequvoca y estudios que abordan estas cuestiones son ms
bien escasos.
El objetivo de este estudio fue utilizar HPLC para determinar el contenido de polifenoles
en los granos de cacao crudos y fermentados-como las semillas de Camern y luego de

evaluar las posibles relaciones entre compuestos fenlicos y su origen geogrfico. La

correlacin entre el tamao de la vaina, se analizan el nmero de granos por vaina y el
contenido polifenlico.

2. Materiales y mtodos
2.1. Muestras
Las semillas de cacao eran de las vainas maduras, genticamente indefinidos
cosechados en el "Institut de Recherche pour le Dveloppement Agricole (IRAD)"
Nkoemvone, Ebolowa (Camern). Las semillas fueron analizadas en el Instituto de
Botnica Aplicada de la Universidad de Hamburgo, Alemania. A su llegada, se midieron
los parmetros morfolgicos (peso de la vaina, el nmero y peso de las semillas por
vaina) para cada clon. Semillas no fermentadas se tomaron de las vainas (7 das
despus de la cosecha), choque-congelaron en nitrgeno lquido despus de la
eliminacin de testas y se liofiliza. Para los estudios de fermentacin-como, semillas
con testa se colocaron en placas de Petri ( 10 semillas / placa) y se incubaron a 25 C
durante 1 y 2 das antes de la elaboracin.

2.2. Reactivos y normas

La epicatequina y quercetina se obtuvieron de Sigma. cido Protocatechiuc y catequina
eran de Aldrich y Fluka, respectivamente. 3 - - L -arabinosil cyanidinin y 3 - - D galactosil cianidina fueron adquiridos de polifenoles. Todos los disolventes utilizados
eran de grado analtico comprado a Merck (Darmstadt, Alemania). El agua se purific
en un sistema de purificacin de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.).

2.3. La extraccin de polifenoles

Antes de la extraccin, los ensayos preliminares ( Waterman y Mole, 1994 ) mostraron
que las 60:40 de acetona / agua disolvente (v / v) y los diferentes procedimientos
descritos en este documento para el fraccionamiento de los diferentes grupos fenol
maximizadas el porcentaje de recuperacin.
Dos gramos de cotiledn liofilizado se molieron hasta un polvo fino en un Kroll Retsch o
Resch MM 200 (Alemania) molino de laboratorio con 10 ml de n -hexano para la
eliminacin de grasa. La mayor parte de la grasa de semilla residual se extrajo lavando
el polvo con 25 ml de n -hexano en un embudo Buchner.
Los compuestos fenlicos se extrajeron mediante agitacin de 0,5 g de la muestra libre
de grasa en el hielo tres veces con 50 ml de acetona acuosa al 60% con agitacin
constante. Despus de la centrifugacin a temperatura ambiente a 5000 rpm durante
15 min, los tres sobrenadantes se combinaron en un matraz que contena 2 ml de cido
actico glacial. La acetona se elimin mediante evaporacin rotatoria bajo vaco parcial
a 40 C. La fase acuosa obtenida se ajust a 100 ml con agua Milli-Q Plus en un matraz

aforado.Total de contenidos de compuestos polifenlicos se analizaron a partir de esta

fase acuosa.
Para limpiar la muestra, 30 ml de la fase acuosa anterior se mezclaron cinco veces con
30 ml de acetato de etilo. Despus de 1 min agitando, las fases acuosas se desecharon
y las fases orgnicas se combinaron, se secaron mediante la adicin de 20 g de anhidro
Na 2 SO 4 y se filtraron despus de 5 minutos en la oscuridad con papel Whatman. El
residuo de sal se desech y la fase orgnica clara se sec a 40 C bajo vaco. El
extracto seco de compuestos polifenlicos se disolvi en 5 ml de metanol puro
(LiChrosolv, Merck) y se filtr con papel de Millipore (0,45 micras). Los extractos de
polifenoles puros fueron almacenadas a -20 C hasta que la HPLC analiz.

2.4. La purificacin de antocianinas

La purificacin de antocianinas se llev a cabo a partir de la fase acuosa de 100 ml
usando un Sep-Pak Vac columna de 6 cc C18 (Waters). La columna se eluy primero
con una mezcla de metanol puro (10 ml): cido actico al 2% (10 ml). Un ml de alcuota
de la muestra de la fase acuosa 20 se carg en la columna y se lav con 2 x 5 ml de
cido actico al 2%. Las antocianinas se eluyen a continuacin dos veces de la
columna con 5 puro metanol de grado analtico ml (LiChrosolv, Merck). Las fracciones
que eluyen se combinaron y se secaron por evaporacin rotatoria. Los residuos se
volvieron a suspender en 2 ml de una mezcla de metanol puro y cido actico al 2%.

2.5. Anlisis de compuestos polifenlicos por HPLC de fase inversa

Total de contenidos de compuestos polifenlicos en los extractos de granos de cacao se
determinaron de acuerdo con el procedimiento de Folin-Ciocalteu ( Singleton y Rossi,
1965 ).
Los anlisis cromatogrficos se llevaron a cabo en el sistema de HPLC de Waters
equipado con un 200-A2 inyector automtico, bomba de HPLC Knauer 64, Knauer HPLCprograma 50 controlador de disolvente, Waters 996 detector de matriz de fotodiodos
(PDA) y se analizaron con el software de MilleniumTM 3,2 (Millipore Corporation, Milford
, MA, EE.UU.). Separacin de los polifenoles se realiz en un LicroCart 250-4
octadecilsililo (SAO) C18, 5 micras de partculas [RP-18 (5 micras)] columna (Merck) a
26 C. La columna de proteccin consisti en una LicroCart 4-4 Lichrospher 100 RP-18
(5 micras) (Merck). La fase mvil binaria ( Tabla 1 ) consista en cido actico al 2% en
agua (A) y mezcla de cido actico concentrado-acetonitrilo-agua (04:09:01 v / v / v)
(B). Veinte microlitros de muestra se inyect en la columna. La separacin de los
polifenoles se control usando un detector PDA a 280 nm y antocianinas fueron
registrados a 520 nm. La identificacin de cada pico se confirm por comparacin del
tiempo de retencin y la coelucin con patrones autnticos de cido protocatechiuc,
catechinhydrate, epicatequina, quercetina, cianidina-3-galactsido y cyanindin-3arabinsido.

Tabla 1. gradiente binario utilizado para la separacin de compuestos de polifenol y

antocianinas presentes en los granos de cacao
Tiempo (min)

El flujo de combustible (ml min -1 )

Disolvente A (%)

Disolvente B (%)

1.2

90

10

1.2

90

10

38

1.1

77

23

50

1.0

60

40

70

1.0

10

90

73

1.0

10

90

78

1.2

90

10

93

1.2

90

10
Opciones de tabla

2.6. El anlisis estadstico

Los datos se sometieron a anlisis de varianza y las correlaciones entre el tamao de la
fruta, nmero de semillas por vaina y el contenido de compuestos polifenlicos
utilizando el software SPSS 10.0 para Windows. Los valores medios se compararon
mediante la diferencia menos significativa (DMS) de prueba.Anlisis de componentes
principales (PCA) se realiz para describir la variabilidad de los datos qumicos.Este
anlisis se realiz con el SPAD 4.01 (Systme d'porttil analizar des donnes) software.

3. Resultados y discusin
Los contenidos totales de compuestos polifenlicos de cacao en grano se determinaron
y se expresaron como equivalentes de epicatequina. El contenido total promedio vari
desde 67 hasta 149,2 mg g -1 MS en grano recin cosechado, 102,3-139,6 mg g -1 MS en
1 da de edad fermentados-como frijol y 101,3-143,6 mg g -1 MS en 2 - frijoles das de
edad fermentadas ( Tabla 2 ). Diferentes tendencias y la gama de concentraciones se
encontraron en estudios que informaron los niveles de polifenoles en los granos de
cacao de una poblacin autofecundada y heterocigotos ecuatoriana del clon EET 95
( Luna et al., 2002 ).
Tabla 2. polifenoles totales, catequina, epicatequina y antocianos contenidos en las semillas
recin cosechadas de diferentes vainas de cacao de diferentes clones
Clones

Peso de
las
vainas
(g)

Nmero
de
semillas /
vaina

Polifenoles
totales (mg g1
)l

Catequina
(mg kg -1)

Epicatequina
(mg kg -1 )

Cianidina-3galactosidasa
(mg kg -1 )

Cianidina-3arabinsido
(mg kg -1 )

SNK10
(A)

304.97

32

119,7

836

28 186

853

978

SNK10
(B)

271.73

42

122,9

725

29 028

820

880

SNK413

376.03

31

103,5

1036

29 839

1031

1453

SNK64
(A)

412.00

52

96.8

895

29 046

650

2375

SNK64
(B)

299.79

30

105,7

1389

27 787

1483

2485

SNK60

389.20

26

114,6

890

30 924

997

1692

Clones

Peso de
las
vainas
(g)

Nmero
de
semillas /
vaina

Polifenoles
totales (mg g1
)l

Catequina
(mg kg -1)

Epicatequina
(mg kg -1 )

Cianidina-3galactosidasa
(mg kg -1 )

Cianidina-3arabinsido
(mg kg -1 )

SNK478

362.06

45

122.2

497

34 750

601

1040

SNK480
(A)

324.14

46

86.6

694

24 499

494

821

SNK480
(B)

354.52

46

117,6

899

33 230

1833

2186

SNK476

352.52

25

149,2

863

41 519

1544

2732

SNK16

322.47

35

134,4

1234

43 903

396

941

SNK505
(A)

357.86

30

136,2

833

42 926

308

2273

SNK505
(B)

277.89

37

109,6

328

31 697

nd

673

SNK417
(A)

326.68

44

67.0

125

14 435

94

404

SNK417
(B)

226.37

43

75.8

179

16 989

79

502

ICS84
(A)

405.06

44

129,0

503

36 282

1486

3212

ICS84
(B)

566.15

40

147,8

672

39 098

1288

1693

ICS84
(C)

517.26

40

121,4

968

32 618

1099

1114

ICS84
(D)

464.08

22

94.1

609

29 452

438

659

ICS1 (A)

321.16

34

126,6

332

35 623

455

1508

ICS1 (B)

324.61

46

134,6

525

38 692

321

894

ICS95
(A)

337.70

34

100.7

1192

30 894

294

466

ICS95
(B)

640.52

38

139.4

867

43 154

1781

4552

ICS95
(C)

351.24

40

122,7

545

37 319

561

1581

ICS95
(D)

359.93

39

147,9

431

34 606

1006

1388

UPA134
(A)

148.80

29

118,5

737

29 788

1807

2452

UPA134
(B)

283.64

34

104,0

781

20 833

590

639

UPA143
(A)

417.21

28

88.9

555

18 639

369

491

UPA143
(B)

352.59

36

118,2

974

33 225

699

1327

UPA143
(C)

277.33

28

116,9

1295

29 910

1402

1776

UPA143
(D)

375.73

22

114,4

1059

35 545

792

1096

UPA143
(E)

896.08

44

103,5

782

35 639

379

940

IMC60
(A)

571.04

35

131,2

1239

27 196

1829

2027

IMC60
(B)

383.00

26

139.4

1442

34 363

2817

4443

T79/467

695,5

57

84.4

170

16 880

448

1661

Clones

Peso de
las
vainas
(g)

Nmero
de
semillas /
vaina

Polifenoles
totales (mg g1
)l

Catequina
(mg kg -1)

Epicatequina
(mg kg -1 )

Cianidina-3galactosidasa
(mg kg -1 )

Cianidina-3arabinsido
(mg kg -1 )

T79/467
(B)

548.05

34

94.1

688

20 193

1313

2389

T79/501
(A)

368.90

45

101,0

nd

26 852

477

1012

T79/501
(B)

380.64

31

112,9

507

28 563

1362

1795

(A)

Dependiendo de la disponibilidad de material vegetal, cuatro y cincuenta y nueve vainas se

analizaron por clon. Los resultados se expresaron como unidad / g o kg de polvo de grano de
cacao seco desgrasado. Los resultados son la media de anlisis duplicados.
Opciones de tabla

El contenido total de compuestos polifenlicos en granos recin cosechadas en

comparacin con granos fermentados-como ( Tabla 3 ) mostr que a partir de la misma
vaina no hay evolucin regular de este determinante durante la fermentacin-como
proceso. En algunos clones, compuestos fenlicos totales aumentaron un 25% despus
de 2 das (SNK10, T79/467, UPA143), disminuy en otros, entre un 14% and25% (ICS84,
ICS1), mientras que se mantiene constante en los clones SNK413, IMC60, ICS95 y
UPA134 . De acuerdo con Forsyth (1952) , las prdidas de fenol total son debido a la
difusin de los cotiledones y se pueden calcular como 24% despus de 60 h de
fermentacin, llegando a 58% despus de 8 das. Los compuestos fenlicos tambin
complejos con las protenas de cacao y polisacridos ( Forsyth et al, 1958. ; Zak y
Keeney, 1976 ). Por otra parte, aumentar de los polifenoles durante el proceso de
fermentacin-como puede reflejar una formacin de proantocianinas polimricos.
Tabla 3. Cambios en polifenoles totales, catequina, epicatequina y el contenido de antocianina
durante la incubacin de fermentacin similar a 25 C de los diferentes granos de cacao de
diferentes clones (de lo contrario, como en la Tabla 2)
Clones

SNK413

SNK480

T79/467

Polifenoles
totales (mg g 1
)

Catequina
(mg kg -1 )

Epicatequina
(mg kg -1 )

Cianidina-3galactosidasa (mg
kg -1 )

Cianidina-3arabinsido (mg
kg-1 )

Sin fermentar

103,5

1036

29 839

1031

1453

Fermentadoscomo (d 1 )

112,8

1121

30 723

1080

1481

Fermentadoscomo (d 2 )

105,3

917

28 037

1036

1563

Sin fermentar

86.6

694

24 499

494

821

Fermentadoscomo (d 1 )

119,8

1298

33 098

2127

4552

Fermentadoscomo (d 2 )

116,2

1319

32 980

1024

3821

Sin fermentar

94.1

688

20 193

1313

2389

Fermentadoscomo (d 1 )

112,1

950

26 632

1925

3507

Fermentadoscomo (d 2 )

126,6

1278

31 358

2554

5031

Clones

IMC60

ICS95

UPA134

ICS1

ICS84

UPA143

Polifenoles
totales (mg g 1
)

Catequina
(mg kg -1 )

Epicatequina
(mg kg -1 )

Cianidina-3galactosidasa (mg
kg -1 )

Cianidina-3arabinsido (mg
kg-1 )

Sin fermentar

139.4

1442

34 363

2817

4443

Fermentadoscomo (d 1 )

139,6

1618

34 936

2590

3915

Fermentadoscomo (d 2 )

141,6

1735

37 652

2359

3473

Sin fermentar

139.4

867

43 154

1781

4552

Fermentadoscomo (d 1 )

135,7

742

42 419

1497

3543

Fermentadoscomo (d 2 )

143,6

739

44 644

1045

3198

Sin fermentar

118,5

737

29 788

1807

2452

Fermentadoscomo (d 1 )

113,2

735

28 626

1596

2120

Fermentadoscomo (d 2 )

107,9

814

26 761

1228

2184

Sin fermentar

126,6

332

35 623

455

1508

Fermentadoscomo (d 1 )

116,0

370

30 584

354

2455

Fermentadoscomo (d 2 )

103,0

272

2401

149

1639

Sin fermentar

129

503

36285

1486

3212

Fermentadoscomo (d 1 )

1023

337

27691

1220

2752

Fermentadoscomo (d 2 )

1143

330

32795

1172

2617

Sin fermentar

118,2

974

33225

699

1327

Fermentadoscomo (d 1 )

138,6

1274

40089

1283

2422

Fermentadoscomo (d 2 )

130,2

1085

35884

1008

1672
Opciones de tabla

Los compuestos polifenlicos se identificaron por su comportamiento cromatogrfico y

espectros UV (280 nm), HPLC y comparaciones cromatogrficas con patrones
autnticos. El patrn cromatograma ( . Fig. 1a ) que se encuentra en granos de cacao
fue similar a la descrita por Elwers (2002) a partir de cacao de otros pases. Los
polifenoles predominantes identificados en liofilizado de cacao desgrasada frijol fueron
catequina y epicatequina. No se detectaron cido Protocatechiuc y quercetina. La
epicatequina representado 2-4% ( Tabla 2 ) de la masa seca del polvo desgrasada,
mientras que la catequina era aproximadamente 0,05-0,1% de frijol desgrasada.

. Figura 1. cromatogramas de HPLC de (a) polifenoles y (b) las antocianinas en las semillas de
cacao. Condiciones cromatogrficas se describen en el texto. Identificacin de los picos: 1sustancia A, 2-Catechinhydrate, 3-sustancia B, 4-epicatequina, 5-Sustancia C, 1'-cianidina-3galactsido (tiempo de retencin, 19,123 min), 2'-cianidina-3-arabinsido (tiempo de
retencin, 24,463 min). Los otros picos en (a) son aquellos de los alcaloides de purina y sus
derivados. As picos a 4,5 y 11,5 min son teobromina y cafena, respectivamente.
Opciones Figura

Est bien establecido que la (-)-epicatequina es el polifenol principal que se encuentra

en los granos de cacao ( Kim y Keeny, 1984 ; Nelson y Sharpless, 2003 ; Zhu et al,
2003. ). cido Protocatechiuc se discute que se sintetizan en los granos de cacao
despus de la infeccin, por lo que pod involucrados en mecanismos de defensa
patgenos vis--vis y parsitos. Tres compuestos no identificados fueron revelados con
tiempo de retencin a 6,9 min (sustancia A); 12,6 min (sustancia B) y 20,4 min
(sustancia C). La sustancia A, debido a los resultados de PDA es un derivado de cido
cafeico y un compuesto ster enlazado. La sustancia B y C son oligmeros de
proantocianidinas. Porter et al. (1991)establecieron la presencia de oligmeros de
procianidina a travs heptamers en el cacao utilizando la columna y cromatografa en
capa fina y bombardeo de tomos rpidos espectrometra de masa negativa.Evidencia

de oligmeros de procianidinas de cacao a travs octamers fue reportado

por Clapperton et al.(1992) que utiliza una combinacin de cromatografa en columna,
HPLC de fase inversa, y espectrometra de masas de iones secundarios lquida
positiva. Procianidinas monomricos y oligomricos presentes en el cacao y el
chocolate se separaron e identificaron por Hammerstone et al. (1999) utilizando un
mtodo de cromatografa lquida de alta en fase normal modificado junto con el anlisis
de espectrometra de masas en lnea usando una cmara de ionizacin por
electrospray y la presin atmosfrica.
Durante la fermentacin similar a la incubacin, cambio en compuestos de polifenol
dependa de los clones y los metabolitos analizados ( Tabla 3 ). La fermentacin de los
granos de cacao es crtico para el desarrollo de los precursores de sabor a
chocolate. Las interacciones complejas entre los polifenoles para formar taninos de alto
peso molecular y su asociacin con las protenas juegan un papel importante en la
calidad general de los granos de cacao fermentados para la produccin de chocolate
( Forsyth, 1952 ).
. Figura 1b muestra un cromatograma tpico del extracto de antocianina. Los
principales compuestos de antocianina en grano recin cosechado incluyen cianidina-3arabinsido que van desde 466 hasta 4552 mg kg -1 de los granos secos y desgrasada,
y cyanindin-3-galactsido que van desde 294 hasta 2817 mg kg -1 (Tabla 2 ). Contenido
del cyanindin-3-arabinsido en todos los clones fueron consistentemente ms altas en
granos no fermentados y fermentados-como en comparacin con cianidina-3galactosidasa. Durante la fermentacin similar a la incubacin, la variacin en
antocianina era clon y de la vaina dependiente ( Tabla 3). El valor medio de
antocianinas totales en recin cosechadas, fermentados-como (d1) y fermentadoscomo (d2) de frijoles de nueve genotipos de cacao fue de 6587.5, 8239 y 6720 por mg
kg -1 MS, respectivamente.
Test de correlacin de Spearman mostr que no existe una correlacin entre el nmero
de semillas por vaina, peso de la vaina y el contenido de compuestos polifenlicos. La
ausencia de correlacin significativa entre el contenido de polifenoles y los parmetros
morfolgicos puede derivar de diferencias evolutivas de acuerdo con factor ambiental
que los vnculos de genes. Sin embargo, se encontr una correlacin negativa entre el
nmero de semillas por vaina y el contenido de catequinas ( r =
- 0 , 4 6 3 , P < 0 , 0 1 ). Existe una correlacin significativa positiva alta ( r =
0 , 8 4 2 , P < 0 , 0 1 ) Se encontr entre el contenido total de compuestos polifenlicos
y la acumulacin epicatequina en los granos de cacao. De la misma manera el
contenido total de compuestos polifenlicos y cyanindin-3-galactsido mostr una
correlacin positiva con un coeficiente de r = 0 , 8 4 2 a P < 0 . 0 1 .
Un PCA se llev a cabo en los datos de todos los clones estudiados. Los tres primeros
componentes principales representan el 93,76% de la variabilidad total, los fenoles
totales, catequina, epicatequina y el contenido de antocianina son las caractersticas
dominantes en el primer componente principal (58,60% de la variabilidad total) y el
contenido epicatequina la caracterstica con mayor peso en el segundo componente
principal (21,60% de la variabilidad total). Contenido en catequinas mostr el mayor

peso en el tercer componente principal (14,06% de la variabilidad total). Fig. 2 muestra

una representacin clsica de las puntuaciones de PC1 y PC2 (79,70% de la varianza
total). Haba del clon IMC60 B contiene una gran cantidad de catequina, cianidina-3galactsido y cianidina-3-arabinsido, y esta es la razn PC1 separa claramente de las
otras muestras. Examen de un grfico de las puntuaciones de dos dimensiones en el
espacio definido por la PC1 y PC2 muestra que la distribucin de las muestras sigue un
patrn. La separacin entre los grupos se relaciona con el contenido de polifenoles de
los granos. Esto se aclar mediante la prueba de LSD. No se encontraron medios
Promedio de compuestos polifenlicos dentro del grupo a ser estadsticamente
diferentes ( P < 0 , 0 5 ). El primer grupo comprende 8 clones de cacao contiene altas
cantidades de fenoles totales, catequina, epicatequina y antocianina (dominando
caractersticas en el primer componente principal). El segundo grupo (6 clones)
contiene cantidades promedio de fenoles totales y la epicatequina en comparacin con
el total de las cantidades medias. El tercer grupo (12 clones) contiene cantidades
promedio de catequina y cianidina-3-galactsido en comparacin con el total de
cantidades medias. Grupo 4 (clones SNK417A y B, T79/467A) difiere de los otros por su
bajo contenido en todos los compuestos analizados. El anlisis de agrupamiento
tambin clasifica las muestras en cuatro grupos de acuerdo con la distancia de 0,5
(dendrogam no se muestra).
. Figura 2. Cargando parcela de los dos primeros componentes principales de polifenoles
totales, epicatequina, catequina, cianidina-3-arabinsido y cianidina-3-galactsido de cacao de
diferentes genotipos.
Opciones Figura

Hay varios factores internos y externos que afectan a la calidad y / o cantidad de

compuestos polifenlicos en las plantas. Estos incluyen la diversidad gentica (varietal
y regional), as como muchas variables ambientales, por ejemplo, las condiciones de
cultivo, tales como la intensidad de la luz, la humedad, la temperatura, el uso de
fertilizantes, heridas, infecciones u otros factores de estrs ( Macheix et al,
1990. ;Chalker -Scott, 1999 ; Cabrita et al, 2000. ; Vallejo et al, 2003. ; Stintzing y
Carle, 2004 ). La calidad de los compuestos polifenlicos presentes en el cacao crudo
de Camern est de acuerdo con los de Ghana y Malasia, a pesar de sus diferencias
genticas ( Elwers, 2002 ). Las diferencias cuantitativas registrados dentro de los
clones se podran explicar, al menos en parte, por la interaccin de varios genticos,
fisiolgicos, agronmicos (es decir, la posicin de las vainas en el rbol), y los factores
ambientales (microclima) la modificacin de la concentracin final en cada vaina. Por
ejemplo, se ha demostrado que muchos factores ambientales controlan la acumulacin
de antocianinas en las plantas ( Roubelakis-Angelakis y Kliewer, 1986 ). Adems de la
luz y la temperatura ( Kliewer, 1977 , Cobbina y Miller, 1987 ;Wang y Zheng, 2001 ), la
disponibilidad de nutrientes para las plantas tambin tiene una gran influencia en la
acumulacin de polifenoles ( Francis y Atwood, 1961 ; Doak y Miller, 1968 ; Piccaglia et
al., 2002 ).

4. Conclusin
Nuestros resultados sugieren que no hubo diferencia cualitativa en polifenoles en los
granos de cacao, a pesar de su origen gentico y el proceso de fermentacin
similar. Como dominar los componentes fenlicos epicatequina, catequina, cianidina-3galactosidasa y cianidina-3-arabinsido as como tres sustancias indefinidas A, B, C se
encontraron. Diferencia cuantitativa encontrado podra atribuirse a las condiciones de
cultivo (microclima, la posicin de los frutos en el rbol). Se encontraron correlaciones
negativas entre el nmero de semillas por vaina y contenido en catequinas. Anlisis de
agrupamiento jerrquico PCA y clasifica la muestra en funcin de su contenido de
polifenoles y antocianinas.

Agradecimientos
El estudio fue apoyado financieramente por el Deutscher Akademischer
Austauschdienst (DAAD) a travs de subvencin a Niemenak Nicolas (Grant N 413;
A/02/04357). Los autores expresan agradecimiento al Sr. Thomas Tumforde y el Sr.
Detlef Boehm por su ayuda en los experimentos

Diario de Composicin y Anlisis de Alimentos

Volume 23, Issue 8 , diciembre de 2010, Pages 790-793

Artculo Original

Deteccin fluorescente de (-)-epicatequina en

micromuestras de semillas de cacao y productos de
cacao: Comparacin con el mtodo de Folin-Ciocalteu

Israel Ramrez Snchez- un , b ,

Lisandro Maya una ,
Guillermo Ceballos un , b ,
Francisco Villarreal una , ,

el

Departamento de Medicina de la Universidad de California, San Diego, San Diego, CA,

Estados Unidos

Seccion de Posgrado, Escuela Superior de Medicina del Instituto Politcnico Nacional, Ciudad

de Mxico, Mxico

http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2010.03.014 , Cmo citar o enlazar Usando DOI

Permisos y reimpresiones

Abstracto
Los compuestos polifenlicos de la familia de flavonoides estn muy presentes en las
semillas de cacao y sus productos de cacao. Los resultados de los estudios que utilizan
los productos de cacao indican efectos beneficiosos de los flavonoides en los puntos
finales cardiovasculares. La evidencia indica que el (-)-epicatequina es el principal
flavanol del cacao asociado con efectos cardiovasculares, por lo que la cuantificacin
precisa de su contenido en las semillas de cacao o productos de cacao es
importante. Los mtodos comunes para la cuantificacin del contenido fenlico en los
productos de cacao se basan en la reaccin de fenoles con reactivos colorimtricos
tales como el mtodo de Folin-Ciocalteu (FC). En este estudio, se compar el mtodo
de FC de determinaciones fenlicos con 2 normas diferentes (cido glico y (-)epicatequina) para la construccin de curvas de calibracin. Se comparan estos
resultados con los obtenidos a partir de un mtodo fluoromtrico sencilla (ex 280 /
Em 320 nm) se utiliza para determinar catequina / (-)-epicatequina contenido en las
muestras de las semillas de cacao y productos de cacao. Los valores obtenidos a partir
del mtodo de determinacin de polifenoles FC producen una sobreestimacin del
contenido de fenoles (flavonoides), cuando se utiliza cido glico como estndar. Por
otra parte, la epicatequina es un estndar ms fiable debido a su abundancia en las
semillas de cacao y productos de cacao. El uso de espectros fluoromtrica produce un
medio sencillo y altamente cuantitativo para una cuantificacin ms precisa y rpida
de cacao catequinas. Valores fluoromtricos son esencialmente de acuerdo con lo
reportado el uso de mtodos ms complicados. En conclusin, el uso de espectros de
emisin de fluorescencia es un medio rpido, prctico y adecuado a la cuantificacin
de catequinas en las semillas de cacao y productos de cacao.

Palabras clave

Semilla de cacao ;
Productos de cacao ;
Theobroma cacao ;
Fenoles ;
Rapid mtodo de anlisis ;
Folin-Ciocalteu ;
Fluorescencia ;
Los flavonoides ;
Los flavanoles ;

(-)-Epicatequina ;
Catequina ;
Anlisis de productos alimenticios ;
Composicin de los alimentos

1. Introduccin
Los compuestos polifenlicos de la familia de los flavonoides estn presentes
abundantemente en los productos naturales ( Natsume et al., 2000 ). Las plantas
tales Theobroma cacao producir una diversidad de compuestos fenlicos en donde los
flavonoides, taninos y antocianinas son los principales fenoles presentes ( Sanbongi y
col., 1998 y Toms-Barbern et al., 2007 ). Semillas de cacao contienen, en peso, muy
grandes cantidades de flavonoides (en particular, la flavanoles catequina y (-)epicatequina) (Cienfuegos-Jovellanos et al, 2009. ). Catequina y (-)-epicatequina estn
presentes en el cacao en una proporcin de 40/60. Estudios de productos de cacao
indican efectos beneficiosos de (-)-epicatequina sobre los parmetros cardiovasculares,
tales como la presin arterial (hipertensin) ( Corti et al, 2009. ). Los flavonoides
tambin ejercen otros efectos beneficiosos relacionados con la salud. Estos
compuestos actan como informes, eliminadores de radicales libres y los inhibidores de
la biosntesis de eicosainoid; en sistemas modelo, sino que tambin reducen la
oxidacin de lipoprotenas de baja densidad, evitar la agregacin de plaquetas y
protegen el corazn de la lesin por isquemia-reperfusin ( Ainsworth y Gillespie,
2007 , Xu et al. de 2007 y Yamazaki et al., 2008 ). El contenido de flavonoles de los
productos de cacao vara con el origen de las semillas de cacao y su procesamiento
posterior. Los trabajadores en este campo necesitan un mtodo rpido y fiable de
cuantificar y comparar el contenido de catequina de diversas muestras de modo que
los datos de concentracin-dependencia precisos pueden ser obtenidos.
El mtodo ms comn para la cuantificacin del contenido de compuestos fenlicos en
los productos de la planta se basa en la reaccin de fenoles con un reactivo
colorimtrico tales como azul de Prusia ( budinos et al., 1980 ) o de Folin-Ciocalteu (FC)
( Ainsworth y Gillespie, 2007 ) . Este mtodo se basa en la reaccin de fosfomolibdato y
fosfotungstato con compuestos fenlicos y polifenlicos ( Ainsworth y Gillespie,
2007 y Cicco et al., 2009 ). Una limitacin importante del mtodo FC es su falta de
especificidad, ya que otros productos de oxidacin pueden interferir con las
mediciones, provocando de este modo overestimatation del verdadero contenido de
polifenoles ( Ainsworth y Gillespie, 2007 ). Aunque este mtodo colorimtrico,
produciendo un contenido de polifenoles "aparente", no es muy fiable, que se utiliza de
forma rutinaria en diversos laboratorios para las determinaciones de fenlicos. En una
comparacin de los diferentes productos de cacao, puede ser til para que nos
hagamos una idea aproximada de (-)-epicatequina nivel (EPI) y catequina (CAT), ya que
sus monmeros y polmeros son abundantes en las muestras de cacao. Por el contrario,
un mtodo fluoromtrico simple y rpida facilita la cuantificacin del contenido de PAI /

CAT de cacao en los productos que contienen y en muestras biolgicas tales como
sangre humana.
En un esfuerzo por mejorar la cuantificacin de la (s) contenido en catequinas sin el
uso de metodologas complejas tales HPLC y espectrofotometra de masas, se midi el
contenido de polifenoles presentes en las semillas de cacao y productos de cacao con
el mtodo FC utilizando cido glico o PAI como estndares y compar la los valores
obtenidos con los derivados de los espectros de fluorescencia de catequinas (ex 280 /
Em 320 nm) ( Cho et al., 1989 ).

2. Materiales y mtodos
2.1. Desengrasante de muestras
Las muestras utilizadas en este estudio se indican en la Tabla 1 . Para la prdida de
grasa 1 g de muestra se aadi a 3,5 ml de hexano, se agit vorticialmente, se
centrifug (1.350 g durante 15 min) y se desech el sobrenadante. El sedimento
resultante se re-extrajo 2 veces ms por el mismo procedimiento y el hexano final en
grnulos se evapor a sequedad bajo una corriente de N 2 . Para el ensayo, las
muestras se reconstituyeron en agua.
Tabla 1. Listado de productos de cacao usados en el estudio.
Muestra original (1 g)

Desgrasada de peso seco de la muestra (g), media DE

Semillas de cacao crudo pulverizado

0,51 0,07

Polvo de cacao natural

0,82 0,06

Oscuro 85%

0,56 0,05

Oscuro 72%

0,59 0,06

Oscuro 70%

0,56 0,07

De Hershey 60%

0,63 0,09

Oscuro 60%

0,56 0,07

Leche 40%

0,51 0,08
Opciones de tabla

2.2. Extraccin de polifenoles de las semillas de cacao y productos de cacao

Cincuenta miligramos de la muestra desgrasada se aadi a 0,5 ml de disolvente de
extraccin (acetona: agua: cido actico, 70:29.5:0.5) y agitaron con vrtex hasta que
la muestra se distribuy homogneamente. A continuacin, la muestra se incub (37
C, 30 min) con agitacin continua. Las muestras se centrifugaron (3.600 g , 15
min). La extraccin se repiti una vez ms y todos los sobrenadantes de mezclado. Los
disolventes se evaporaron hasta que el volumen fue de ~ 50 l. El extracto obtenido se
utiliz para medir el contenido total de polifenoles siguiendo el mtodo de SingletonRossi modificado FC o el enfoque fluoromtrico ( Roura et al., 2006 ).

2.3. Ensayo de Folin-Ciocalteu

Los ensayos se realizaron usando el reactivo FC de Sigma-Aldrich, tampn de

carbonato de sodio y cido glico, PAI o CAT como estndares. Se disolvieron en agua
destilada Normas H 2 O a temperatura ambiente y el color desarrollado evaluado a 765
nm. El ensayo se realiz en un volumen final total de 1.000 l. Se aadieron muestras o
estndares acuosas (100 l) a tubos de ensayo que contienen 700 l de agua destilada y
50 l de reactivo de FC. Las mezclas se agitaron y se dejaron equilibrar (20 C, 10 min)
despus de lo cual, el color se estabiliz mediante la adicin de carbonato de sodio
(150 l de una solucin 0,7 mM) y, a continuacin, la mezcla se agit en vrtex y se
incub a 40 C durante 20 min. Los tubos se enfriaron rpidamente en hielo y 200 l de
cada muestra se colocaron en una microplaca de 96 pocillos. El color desarrollado se
ley a 765 nm utilizando un lector de microplacas (uQuant, Biotek, Instruments
Inc.). Todas las muestras se analizaron al menos por triplicado y el contenido fenlico
se expresaron como mu M (media SD).

2.4. Ensayo de fluorescencia

Aqu, 1 l de espacios en blanco, los estndares o muestras desgrasadas se diluy a 600
l con agua destilada y la fluorescencia evaluado a Ex 280 / Em 320 nm usando un
espectrofluormetro (Perkin-Elmer LS55). Las muestras se analizaron al menos por
triplicado.

2.5. El anlisis estadstico

Todas las curvas estndar se analizaron mediante una regresin lineal de los datos de
clculo del coeficiente de correlacin ( r ) en un nivel de confianza del 95%. La
significacin estadstica = P 0.05.

3. Resultados
3.1. Curvas estndar FC
El cido glico, el EPI y el estndar CAT curvas obtenidas utilizando la metodologa FC
fue lineal en el rango de 10 a 140 M de la polifenol ( . Fig. 1 ). La curva estndar de
cido glico tiene relativamente poca pendiente, la pendiente usando EPI era ms
favorable para un ensayo sensible. No hubo diferencias entre EPI y curvas CAT (datos
no presentados), por lo que hacemos ms referencia nicamente a las curvas de
calibracin del PAI. Las pendientes de las dos curvas en la figura. 1 son
estadsticamente diferentes ( P <0,001) y, confirmando datos de la literatura, por lo
tanto, el contenido de compuestos fenlicos en las muestras de cacao puede ser mal
interpretado cuando se utiliza cido glico como el estndar en el ensayo de
FC. Bsicamente, el uso de galato como un estndar en la evaluacin de PAI y CAT dar
lugar a una sobreestimacin del contenido de PAI / CAT por la relacin de las
pendientes, o en aproximadamente un 57% (diferencia entre pistas). Las

concentraciones inferiores a 20 mM con galato como un estndar y 10 mM con EPI de

serie dio lugar a las medidas indetectables ( . Fig. 2 insert B).

. Figura 1. Comparacin de cido glico y las curvas de calibracin con el mtodo del PAI
FC. Las curvas de calibracin de concentracin-DO utilizando cido glico (pendiente = 7,753
10

-3

,r

= 0,99754) (crculos negros) o (-)-epicatequina (pendiente = 1,2226 10

-2

,r

0,99717) ( n = 3 ) (crculos blancos). Las pendientes son estadsticamente diferentes

( p <0,001).
Opciones Figura

. Figura 2. (A) Representante espectros de fluorescencia (ex

280

/ Em

320

nm) de concentraciones

crecientes de (-)-epicatequina. (B) la curva de concentracin-DO de (-)-epicatequina ( n = 3)

(pendiente = 19,5249, r

= 0,999). No se detectaron-epicatequina (grfico inserto) medidos

con el mtodo de FC - Las bajas concentraciones de ().

Opciones Figura

3.2. Las curvas de calibracin de fluorescencia

El espectro de emisin de fluorescencia de EPI (Ex 280 / Em 320 nm) se muestra en la
figura. 2 A. La intensidad de emisin aumenta como una funcin lineal de la
concentracin, con una sensibilidad de ~ 0,5 mM ( . Fig. 2 B). Dada la falta de
diferencia entre EPI vs laderas CAT, slo hacemos referencia adicional a las curvas del
PAI.

3.3. Fenoles totales de mtodo FC utilizando cido glico o (-)-epicatequina

curvas estndar
La comparacin de los valores se presenta en la figura. 3 . Como se demostr
anteriormente ( . Fig. 1 ), el uso del ensayo de FC con galato como un estndar da
consistentemente valores ms altos para todas las muestras, falsamente elevadas. El
contenido de polifenoles totales medidos por FC con cido glico como estndar fue de
151 m para la muestra con 85% de contenido de cacao. Leche y 40% tenan el menor
contenido de polifenoles (46 M). Polvo de cacao natural tiene 194 m. La semilla de
cacao seco sin tratar tuvo la concentracin ms alta (206 m). Cuando se utiliza PAI
para generar una curva estndar de las densidades pticas grabadas resultaron en ~
36% de disminucin en la concentracin de polifenol vs estndar de cido glico. Con
este enfoque, se encontr que la muestra de chocolate con un 85% de contenido de
cacao tena 97 mM de polifenoles, Milk-40% = 30 m, cacao natural = 124 micras y
semillas de cacao = 132 m.

. Figura 3. comparacin relativa de la concentracin de flavonoides en las muestras

analizadas. Metodologa FC utilizando cido glico como (barras negras) estndar, la
metodologa FC utilizando (-)-epicatequina como estndar (barras grises) y, de fluorescencia
(Ex

280

/ Em

320

nm) metodologa (barras punteadas).

Opciones Figura

3.4. FC vs mtodo de fluorescencia

Utilizando el mtodo fluoromtrico, semillas de cacao y polvo de cacao natural fueron
los productos con mayor contenido (47 y 44 m, respectivamente). En promedio ( Tabla
2 ), el contenido relativo de PAI / CAT-detectado por fluorescencia fue de
aproximadamente 35% de polifenoles totales FC detecta utilizando PAI como el
estndar. figura. 3 informes el valor promedio de 3 extracciones de polifenoles y el
contraste del cido glico FC, FC EPI y mtodos fluoromtricos. Como se puede
observar, la relacin entre los valores obtenidos a partir de polifenoles totales FC vs
catequinas fluorescencia detectados se mantiene en ninguna de las muestras
ensayadas, independientemente de la curva estndar que se utiliza. Estos resultados
sugieren que el mtodo fluoromtrico es una tcnica fiable y simple para detectar PAI y
CAT en las muestras.
Tabla 2. Comparacin de la concentracin de polifenoles de Folin-Ciocalteu (cido glico o
normas epicatequina) y metodologas de fluorescencia en muestras de cacao.
Muestra

GA std curva
FC mM
(media DE)

EPI std curva

FC mM
(media DE)

EPI vs . GA FC std
curvas de
deteccin%

EPI std curva de

fluorescencia Ex 280 /
Em 320 nm SD

Fluorometric
vs .FC EPI% de
deteccin

Semillas de
cacao
pulverizado

206 8

132 5

64.2

47 3

35.5

Polvo de cacao
natural

194 6,5

124 3,5

64

44 2,5

35.5

Oscuro 85%

151 6,5

97 3,7

64.2

33.5 3

34.6

Oscuro 72%

109 5,5

70 3

64.5

26,5 2,5

36

Oscuro 70%

108 5,5

70 3,5

65

21,5 2,5

31

De Hershey
60%

111 5

71 3

64

25 2

35

Oscuro 60%

78 5

50 3,7

64.5

17.2 2

34

Leche 40%

46 5,5

30 3,5

65

11,8 1,5

39

GA = cido glico, EPI = epicatequina.

Opciones de tabla

4. Discusin
Los resultados del estudio indican lo siguiente que, primero, catequina espectros de
fluorescencia puede utilizarse de manera fiable para obtener mediciones precisas de
contenido de flavonoles de cacao. Esta metodologa es precisa y rpida y no utiliza
reactivos o incubaciones especiales, por lo que es adecuado para mejorar las
mediciones en los productos de cacao. En segundo lugar, nuestros resultados tambin

sugieren que otros flavonoides presentes en el cacao (por ejemplo, quercetina)

tambin pueden ser cuantificados adecuadamente mediante sus espectros de emisin
de fluorescencia especfica.
HPLC y mtodos de espectrofotometra de masas son el estndar de oro para el anlisis
cuantitativo de los flavonoides en las muestras. Estos mtodos requieren
instrumentacin
compleja
no
est
fcilmente
disponible
en
muchos
laboratorios. Adems, se basan en el uso disolventes no respetuosas del medio
ambiente. Por estas razones, las metodologas colorimtricas ms tradicionales pueden
ser preferidos. El ensayo colorimtrico FC es una tcnica til para determinar fenoles
totales. Sin embargo, en una comparacin de los diferentes productos de cacao, puede
ser til para que nos hagamos una idea aproximada de (-) Nivel -EPI/CAT, ya que sus
monmeros y polmeros son abundantes en las muestras de cacao. Por lo general, el
contenido de polifenoles en muestras de plantas se calcula a partir de cido glico
como un estndar, expresada como equivalente de cido glico. Sin embargo, si el
objetivo principal es estimar la concentracin de catequinas, cido glico no es el
estndar ideal, ya que tiene una estructura monofenlicos y catequinas tener ms de 2
grupos fenlicos. Con este tema en mente, hemos implementado una curva estndar
alternativo usando EPI y se compararon los resultados observados con los obtenidos
utilizando cido glico. Los resultados demuestran que el cido glico y PAI FC FC
estndar curvas pendientes son estadsticamente diferentes. Utilizando los resultados
de cido glico en un 36% ~ sobreestimacin de contenido en polifenoles (flavonoides)
en las muestras analizadas.
El mtodo de FC tambin no es especfico; sustancias tales como azcares, aminas
aromticas, dixido de azufre, cido ascrbico, y cidos orgnicos y bases (incluyendo
algunos tampones comnmente utilizados como Tris) pueden reaccionar con el reactivo
de FC ( Roura et al, 2006. ) . La presencia de estas sustancias puede por lo tanto
contribuir tambin a la sobreestimacin del contenido de flavonoides. En un intento de
desarrollar un enfoque rpido, econmico y simplificado para cuantificar las catequinas
del cacao, hemos implementado un mtodo fluoromtrico. Para ello, nos aprovechamos
de las propiedades fluorescentes de EPI / CAT. El ensayo resultante es un orden de
magnitud ms sensible que el ensayo de absorbancia basada. Los datos del ensayo de
fluorescencia tambin concuerdan bien con la determinacin hecha por tcnicas
avanzadas.
La cantidad de catequinas determinadas por fluorescencia, ~ 35% por peso de la
muestra, est de acuerdo con el contenido report el uso de la espectrometra de
masas (~ 40%) en muestras similares ( Joseph, 2008). El 5% de diferencia puede estar
relacionada con la presencia de procianidinas (polmeros de 4, 6, 8 PAI / CAT), ya que la
cuantificacin de fluorescencia de estos productos no es bastante lineal y, de hecho, su
presencia parece interferir con (es decir, disminucin) de fluorescencia emisin
( Joseph, 2008 y Toms-Barbern et al., 2007 ). Tambin es posible que la
contaminacin de las muestras con protenas, que tambin emiten a Ex 280 /
Em 320 espectros, puede explicar la discrepancia. Sin embargo, esto no es probable que

el caso ya que la fluorescencia en cualquier muestra dada es ~ 35% de los valores de

FC, incluyendo la muestra con un alto contenido de la leche (que tiene casena).

5. Conclusin
Dada la gran cantidad de catequinas del cacao y la relacin entre fenoles totales y
catequinas, podemos concluir que el mtodo de FC para la medicin del contenido de
flavonoides en las muestras de cacao se puede implementar mediante el uso de EPI
como un estndar, ya que permite una mejor aproximacin cuantitativa. El uso de
espectros de emisin de fluorescencia es un mtodo rpido, prctico y altamente
cuantitativa para medir EPI / CAT de cacao y cacao muestras.

Agradecimientos
Los autores agradecen el inters estimulante y atinados comentarios del Prof. L.
Laurence Brunton, Departamento de Farmacologa de la Facultad de Medicina de
UCSD. Este trabajo fue apoyado por un NIH HL-43617 y EN-004 277 a F. Villarreal. Israel
Ramrez Snchez por el CONACYT beca postdoctoral de Mxico y G. Ceballos por un
profesor visitante de becas CONACYT de Mxico.