UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

DISCIPLINA DE LABORATRIO BSICO II

RELATRIO DE AULA PRTICA

Cintica Enzimtica da Enzima Invertase

Acadmicos:

Alex Toshio Kassada

Guilherme Chaves Souto Branco
Letcia Maria Sgobi
Paulo Otvio Fioroto

Professora:

Lucinia Aparecida Cestaria Tonon

Maring, 12 de novembro de 2013

1. RESUMO

RA: 60772
RA: 60521
RA: 85462
RA: 60903

De acordo com a proposta inicial do experimento, que a determinao da inibio da

enzima invertase por efeito de concentrao de substrato, por efeito do sulfato de cobre e
frutose, o experimento foi realizado atravs do mtodo do DNS, com leitura da absorbncia a
600 nm no espectrofotmetro, para dez diferentes valores de concentrao de inibidor e
reagentes mantidos em temperatura ambiente, a fim de comparar os dez resultados obtidos para
cada inibio, e determinar qual a velocidade mxima de reao (Vmx) e a constante Michaelis
Menten (Km) durante a atividade dos inibidores. A partir do experimento realizado possvel
concluir que como o mesmo foi feito em uma temperatura diferente da considerada ideal para a
melhor atividade da enzima. A partir disto, pode-se afirmar que os perfis inibidores das
substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo necessria a repetio do experimento,
desta vez na temperatura favorvel, de 55C. Os erros podem ser resultado de manipulao
inadequada e de equipamentos descalibrados.

2. INTRODUO
A invertase uma enzima utilizada na hidrlise de sacarose e xarope de glicose e
frutose, o qual muito utilizado na indstria alimentcia. Por consumir menos energia
do que os mtodos tradicionais de hidrlise cida com cido sulfrico e gerar um
produto de melhor qualidade so considerados extremamente vantajoso.
Este relatrio tem como base o estudo da cintica enzimtica da enzima
invertase e os efeitos causados por inibidores sobre a reao da mesma.
3. FUNDAMENTAO TERICA
Cintica Enzimtica
Segundo Pinto (2009), cintica enzimtica o estudo das reaes qumicas que
so catalisadas por enzimas, e implica na determinao das velocidades de
transformao dos reagentes em produtos, assim como no entendimento da influncia
do meio reacional, envolvendo concentrao de reagentes e produtos, alm de fatores
termodinmicos como temperatura e presso sobre as velocidades dessas
transformaes. O conhecimento dessas propriedades de extrema importncia para a
compreenso das transformaes que ocorrem no interior das clulas que esto
envolvidas nos processos fermentativos e nos reatores enzimticos.
Influncia do Substrato
Um dos fatores que afetam a velocidade de uma reao catalisada por enzimas
a concentrao do substrato presente. A concentrao varia durante a ocorrncia da
reao, visto que ele convertido em produto durante o processo. Sendo assim, a
velocidade da reao varia em funo da quantidade de substrato ainda no convertido.
Quanto maior a quantidade de substrato, maior a velocidade da enzima e a velocidade
da reao atinge seu mximo quando a soluo est saturada de substrato (CSAR).

Equao de Michaelis-Menten
De acordo com Moyes e Schulte (2010), a relao entre a concentrao de
substrato e a velocidade foi descrita matematicamente pela primeira vez pelos
bioqumicos Leonar Michaelis e Maud Menten como uma hiprbole retangular, sendo
que ela leva em contra o valor da constante de Michaelis-Menten, chamada de Km, que
a concentrao necessria de substrato para que se obtenha uma velocidade inicial que
metade da velocidade mxima possvel. A constante Km indica a afinidade da enzima
por um substrato. Um Km baixo indica alta afinidade, e o contrrio tambm vlido.
A equao de Michaelis-Menten leva em conta, alm da constante Km, a
concentrao de substrato ([S]) e a velocidade mxima de reao (V max), sendo ela
descrita desta maneira:
Vo=

Vmax .[S ]
Km+[S ]
Inibio Enzimtica

Existem substncias que se associam a enzimas e alteram sua atividade

enzimtica de uma forma que influencia a ligao do substrato. Esse o caso dos
inibidores, que so substncias que reduzem a atividade de uma enzima. Segundo Voet
(2001), inibio pode ser de forma competitiva, na qual uma substncia compete com o
substrato pela ligao ao stio ativo da enzima, incompetitiva, na qual o inibidor liga-se
ao complexo enzima-substrato, mista, em que o inibidor se liga enzima e ao complexo
enzima-substrato, por produto, em que o produto que se acumula durante o curso da
reao compete com o substrato pela ligao ao stio-ativo, e por contato, em que a as
clulas encostam umas nas outras e impedem a proliferao.
4. MATERIAIS E MTODOS
Agitador Vortex;
Espectrofotmetro;
gua destilada;
Estante para tubo de ensaio;
Balo volumtrico; Pipeta;
Banho-maria;
Becker;
Cronmetro;

Dispensete;

Ponteiras;

Reatores batelada;
Rolhas;
Soluo de frutose [22mM];

Soluo de invertase [0,1 g/L];

Soluo de sacarose 5% p/v a pH
4,5;
Soluo DNS;
Sulfato de cobre [0,63mM];
Termmetro de mercrio;
Tubos de ensaio.

4.1. Metodologia da inibio enzimtica pelo efeito da concentrao de substrato

Primeiramente preparou-se vrias concentraes de sacarose de acordo com o
quadro 01.
Quadro 01. Reagentes e quantidades para o estudo do efeito da concentrao de substrato.

Tubos

10

Sacarose (0,5M) (mL) 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,3

1,5

1,7

gua destilada (mL)

8,8

8,6

8,4

8,2

7,7

7,5

7,3

Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida

foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL
colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e completou o volume com gua
destilada.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior
exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos
tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura
ambiente por dez minutos (anotando a temperatura).
Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por
10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a
evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de
dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos
de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas,
pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de
ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de
soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um
banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em
banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em
seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio,
agitando-os

rapidamente

em

agitador

Vortex,

com

posterior

leitura

no

espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o

branco.

4.2. Metodologia da inibio enzimtica pelo sulfato de cobre e frutose

Primeiramente numeraram-se os 10 tubos de ensaio para cada tipo de inibidor e
em seguida adicionou-se os reagentes segundo o quadro 02 e 03.
Quadro 02. Efeito da inibio por sulfato de cobre na atividade da enzima.

Tubos

10

Sacarose (0,5M) (mL) 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,3

1,5

1,7

Sulfato de cobre (0,63 2

Mm) (mL)

gua destilada (mL)

6,8

6,6

6,4

6,2

5,7

5,5

5,3

Quadro 03. Efeito da inibio da frutose na atividade da enzima.

Tubos

10

Sacarose (0,5M) (mL) 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,3

1,5

1,7

Frutose (22mM) (mL) 1

gua destilada (mL)

7,8

7,6

7,4

7,2

6,7

6,5

6,3

Aps a preparao dos tubos, estes foram agitados em um agitador. Em seguida

foi feito a diluio da enzima na proporo 1:10, em um balo volumtrico de 25 mL
colocou-se 2,5mL de enzima (concentrao de 0,1g/L), e complete com gua destilada.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com maior
exatido possvel, para isso, foi adicionado 1mL de enzima (0,01g/L) em cada um dos
tubos em intervalos de 30 segundos. Agitou-se e deixou-se reagir temperatura
ambiente por dez minutos (anotando a temperatura).
Os tubos foram levados a um banho contendo gua em ebulio e deixado por
10 minutos, a fim de inativar a enzima. Tamparam-se os tubos para minimizar a
evaporao. O teor de glicose e frutose, nas amostras, foi determinado pelo mtodo de
dosagem do DNS Berkeley-modificado: Aps todas as amostras de solues nos tubos
de ensaio terem passado pelo banho em gua fervente e sido devidamente resfriadas,
pipetou-se 0,5 mL da soluo de cada tubo de ensaio e transferiu-se para novos tubos de
ensaio previamente numerados. Com auxlio de um dispensete, adicionou-se 2,5 mL de
soluo de DNS em cada tubo, os quais foram tampados com rolhas e levados para um
banho em gua fervente por dez minutos. Aps o banho, os tubos foram colocados em
banho com gua a temperatura ambiente durante cinco minutos, adicionando em
seguida, com auxlio do dispensete, 3 mL de gua destilada em cada tubo de ensaio,
agitando-os

rapidamente

em

agitador

Vortex,

com

posterior

leitura

no

espectrofotmetro da absorbncia a 600 nm, sendo este zerado previamente com o

branco.

5. RESULTADOS
5.1. Efeito da Concentrao de Substrato
Os dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio de
acordo com a concentrao inicial de sacarose nos tubos esto dispostos na tabela 1.
Tabela 1 Leitura da absorbncia das amostras.

Tubo

Concentrao inicial de sacarose

Absorbncia

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

(mM)
0
11,11
22,22
33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

0
-0,012
0,007
0,008
0,009
0,026
0,027
0,037
0,072
0,081

Utilizando-se a curva padro da glicose + frutose, pelo mtodo do DNS, onde a

curva dada pela equao y = 0,5345x 0,0261, sendo do tipo y = a b.x. Ento, so
obtidos os valores do coeficiente linear da reta obtida (a) e coeficiente angular da reta
ajustada (b), que so, -0,0261 e 0,5345, respectivamente. A partir dos valores destes
coeficientes e das absorbncias contidas na tabela 1, podemos calcular a quantidade de
glicose + frutose presente (mg/mL), atravs da seguinte equao.
MG=x =

y a
b.d

Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)

d = diluio da amostra (1/6)
Para cada valor de absorbncia de cada amostra, ou seja, de y, obtm-se um
valor de MG, como pode ser visto na tabela 2.
A partir dos dados de quantidades em mg/mL de glicose + frutose, constantes na
tabela 2, calculou-se, atravs da equao abaixo, o nmero de moles de glicose + frutose
presentes na amostra.
moles de glicose+ frutose=

MG
x Vr
MM

Onde: MG = quantidade de glicose + frutose formada na reao (mg/mL)

MM = massa molar da glicose + frutose (0,360 mg/mol)
Vr = volume de reao (10 mL).
Os nmeros de moles de glicose + frutose calculados esto dispostos na tabela 2.
A partir do nmero de micromoles de glicose + frutose gerado durante 10
minutos de reao, calculou-se a velocidade da mesma, dividindo-se essa quantidade de
micromoles por 10, para se obter a velocidade em micromoles de glicose + frutose por
minuto. Os dados esto dispostos, tambm, na tabela 2.
Tabela 2 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.

Tubo

Concentrao inicial
de sacarose (mM)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0
11,11
22,22
33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

G+F
presente
(mg/mL)
0
0,158
0,372
0,383
0,394
0,585
0,596
0,708
0,072
0,081

micromole
s G+F
(moles)
0
4,397
10,321
10,633
10,945
16,246
16,558
19,676
30,589
33,396

Velocidade de
reao (moles/min)
0
0,440
1,032
1,063
1,094
1,625
1,656
1,968
3,059
3,340

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V)

da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos
esto dispostos na tabela 3.
Tabela 3 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.

Tubo

1/[S] (1/mM)

1/V (min/micromoles)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0,090
0,045
0,030
0,023
0,018
0,014
0,012
0,011
0,009

2,274
0,969
0,940
0,914
0,616
0,604
0,508
0,327
0,299

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de

reao, dispostos na tabela 2, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de Michaelis-

Menten), constante na figura 1. A partir dos dados constantes na tabela 3, elaborou-se o

grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 2.

Michaelis-Menten - [SUBSTRATO]
4.0
3.0

Velocidade (moles/min)

f(x) = 0.03x + 0.12

R = 0.91

2.0
1.0
0.0
0

20

40

60

80

100

120

[S] (mM)
Figura 1 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da
concentrao de substrato, obtidos neste experimento.

Lineweaver-Burk- [SUBSTRATO]
2.5
2

f(x) = 22.46x + 0.2

R = 0.95

1.5

1/V

1
0.5
0
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090 0.100

1/[S]
Figura 2 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da
concentrao de substrato, obtidos neste experimento.

A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 2, obtemos:

1
=0,2017
V mx

1
=0,00898
Km

A partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a

4,957 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis
Menten (Km) equivalente a 111,358.
5.2. Inibio da invertase por sulfato de cobre e frutose
5.2.1 Inibio da invertase por sulfato de cobre
Os dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio,
contendo soluo de sacarose e sulfato de cobre esto dispostos na tabela 4.
Tabela 4 Leitura da absorbncia das amostras.

Tubo

Concentrao inicial de sacarose

Absorbncia

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

(mM)
0
11,11
22,22
33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

0
-0,005
0,009
0
0,007
0,011
0,008
0,008
0,015
0,009

Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da

concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente
(mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao
(moles/min), esto dispostos na tabela 5.
Tabela 5 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.

Tubo

Concentrao inicial
de sacarose (mM)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0
11,11
22,22
33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

G+F
presente
(mg/mL)
0
0,237
0,394
0,293
0,372
0,416
0,383
0,383
0,461
0,394

micromole
s G+F
(moles)
0
6,579
10,945
8,138
10,321
11,568
10,633
10,633
12,816
10,945

Velocidade de
reao (moles/min)
0
0,658
1,094
0,814
1,032
1,157
1,063
1,063
1,282
1,094

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V)

da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos
esto dispostos na tabela 6.
Tabela 6 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.

Tubo

1/[S] (1/mM)

1/V (min/micromoles)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0,090
0,045
0,030
0,023
0,018
0,014
0,012
0,011
0,009

1,520
0,914
1,229
0,969
0,864
0,940
0,940
0,780
0,914

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de

reao, dispostos na tabela 5, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de MichaelisMenten), constante na figura 3. A partir dos dados constantes na tabela 6, elaborou-se o
grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 4.

Michaelis-Menten - SULFATO
1.4
1.2

f(x) = 0x + 0.81
R = 0.45

1.0
0.8

Velocidade (moles/min)

0.6
0.4
0.2
0.0
0

20

40

60

80

100

120

[S] (mM)
Figura 3 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio
por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.

Lineweaver-Burk - SULFATO
1.6
1.4
1.2

f(x) = 7.43x + 0.8

R = 0.72

1/V

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090 0.100

1/[S]
Figura 4 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio
por sulfato de cobre, obtidos neste experimento.

A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:

1
V mx

=0,8007

1
=0,10780
Km

A partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a

1,249 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis
Menten (Km) equivalente a 9,276.
5.2.2 Inibio da invertase por frutose
Os dados relativos leitura da absorbncia das solues nos tubos de ensaio,
contendo soluo de sacarose e frutose, esto dispostos na tabela 7.
Tabela 7 Leitura da absorbncia das amostras.

Tubo

Concentrao inicial de sacarose

Absorbncia

Branco
1
2

(mM)
0
11,11
22,22

0
0,025
0,041

3
4
5
6
7
8
9

33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

0,028
0,059
0,095
0,11
0,14
0,139
0,111

Seguindo a mesma metodologia de clculos utilizados no estudo do efeito da

concentrao de substrato, calcularam-se os valores de glicose + frutose presente
(mg/mL), micromoles de glicose + frutose presente (moles) e velocidade de reao
(moles/min), esto dispostos na tabela 8.
Tabela 8 Quantidades de glicose+frutose presentes nas solues e velocidade de reao.

Tubo

Concentrao inicial
de sacarose (mM)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0
11,11
22,22
33,33
44,44
55,55
72,22
83,33
94,44
111,11

G+F
presente
(mg/mL)
0
0,574
0,753
0,607
0,955
1,359
1,528
1,865
1,853
1,539

micromole
s G+F
(moles)
0
15,934
20,923
16,869
26,536
37,761
42,438
51,793
51,481
42,750

Velocidade de
reao (moles/min)
0
1,593
2,092
1,687
2,654
3,776
4,244
5,179
5,148
4,275

A partir dos valores de concentrao inicial [S] de sacarose e da velocidade (V)

da reao, foram calculados os valores inversos dessas variveis. Os dados inversos
esto dispostos na tabela 9.
Tabela 9 Valores invertidos de concentrao de sacarose e velocidade de reao.

Tubo

1/[S] (1/mM)

1/V (min/micromoles)

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0,090
0,045
0,030
0,023
0,018
0,014
0,012
0,011
0,009

0,628
0,478
0,593
0,377
0,265
0,236
0,193
0,194
0,234

A partir dos dados relativos concentrao inicial de sacarose e velocidade de

reao, dispostos na tabela 8, elaborou-se o grfico V x [S] (curva de MichaelisMenten), constante na figura 5. A partir dos dados constantes na tabela 9, elaborou-se o
grfico 1/V x 1/[S] (ajuste de Lineweaver-Burk), presente na figura 6.

Michaelis-Menten - FRUTOSE
6
5

f(x) = 0.04x + 1.19

R = 0.81

Velocidade (moles/min)

3
2
1
0
0

20

40

60

80

100

120

[S] (mM)
Figura 5 Curva de Michaelis-Menten obtida a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio
por frutose, obtidos neste experimento.

Lineweaver-Burk - FRUTOSE
0.7
0.6

f(x) = 5.5x + 0.2

R = 0.69

0.5
0.4

1/V

0.3
0.2
0.1
0
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090 0.100

1/[S]
Figura 6 Ajuste de Lineweaver-Burk obtido a partir dos dados, relativos ao efeito da inibio
por frutose, obtidos neste experimento.

A partir da curva do ajuste de Lineweaver-Burk, constante na figura 4, obtemos:

1
V mx

=0,2019

1
=0,03672
Km

A partir destes valores obtemos velocidade mxima de reao Vmx equivalente a

4,953 micromoles de produto gerado por minuto, com uma constante de Michaelis
Menten (Km) equivalente a 27,233.
6. DISCUSSO
Com base no prvio conhecimento de que um maior valor de Km indica uma menor
afinidade da enzima com o substrato, e quanto maior o valor de Vmx, mais rpido ocorrer a
reao desejada, tem-se a discusso dos resultados obtidos nas diferentes etapas do experimento
e metodologia utilizada a seguir.
A afirmao do perfil inibidor dos compostos utilizados no experimento (sulfato de
cobre e frutose) pode ser equivocada, pois o mesmo foi alvo de fontes de erro que interferiram
no resultado, principalmente nos dados de velocidade mxima de reao, pois como a mesma
foi realizada a temperatura ambiente (25C), tem-se que a velocidade foi diretamente

prejudicada, pois a temperatura tima para a enzima seria na faixa de 55C, como visto em
experimentos anteriores. Alm dos demais erros experimentais, como por exemplo, no momento
da pipetagem, erro na leitura de absorbncia, falta de preciso na cronometragem, entre outros.
Com isso, e com os resultados de Km e Vmx encontrados, tem-se que para este
experimento, nas condies descritas anteriormente, a concentrao de substrato provoca uma
menor afinidade entre enzima e substrato, pois obteve o maior valor da constante de Michaelis
Menten quando comparado aos demais.
De acordo com o estudo de Dias et al (2009), os valores para a enzima invertase de Km
e Vmx so respectivamente 16,5 mM e 1181 M/min. E a partir destes dados tem-se que o
sulfato de cobre se mostrou um inibidor incompetitivo, pois diminuiu o valor de Km e Vmx, o
que indica que ele se ligava somente quando se tinha a formao do complexo enzima-substrato,
impedindo a reao de catlise.
J no caso da frutose, a mesma demonstrou um perfil de inibidor competitivo, pois teve
um aumento no valor de Km (27,233 mM), o que significa dizer que a frutose ir competir com
as molculas do substrato.

7. CONCLUSES
A partir do experimento realizado possvel concluir que como o mesmo foi feito em
uma temperatura diferente da considerada ideal para a melhor atividade da enzima. Portanto,
concluses sobre o perfil inibidor das substncias utilizadas se tornam equivocadas, sendo
necessria a repetio do experimento, desta vez na temperatura favorvel, de 55C.

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Departamento de Engenharia Qumica. Engenharia de Alimentos. Maring Paran.
[2]. CSAR, Paulo. Introduo Cintica Qumica. In: Portal de Estudos em Qumica.
Disponvel em: <http://www.profpc.com.br/Cintica Qumica/Introduo.htm>. Acesso
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[3]. DIAS, A.; SANTOS, M.; BRANCO, M. Caracterizao cintica da enzima
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