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A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao.

Ela est fundamentada na


migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes
interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande
variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica
extremamente verstil e de grande aplicao. (DEGANI, A. L., 1998)
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao
atribuda a um botnico russo ao descrever suas experincias na separao dos
componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de ter de petrleo
(fase mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de clcio (fase
estacionria), qual se adicionou o extrato, levou separao dos componentes em
faixas coloridas. Este provavelmente o motivo pelo qual a tcnica conhecida como
cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar errnea idia de que
o processo seja dependente da cor. (COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, 1993)
Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser considerados
precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a
dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea
possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos,
levaram-na a um elevado grau de sofisticao, o qual resultou no seu grande potencial
de aplicao em muitas reas. (LOUGH, W.J. e WAINER, I.W., 1995)
A cromatografia envolve uma srie de processos de separao de misturas, acontece
pela passagem de uma mistura atravs de duas fases: uma estacionria (fixa) e uma
mvel. A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciada
por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e especficos
efeitos de afinidade e solubilidade. (CHAVES, M.H., 1997)
A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao
com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se
as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura.As
diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos
critrios: (ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM,
A.M.M. e BRANDO, A.M., 1995)
1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico
2. Classificao pela fase mvel empregada

3. Classificao pela fase estacionria utilizada 4. Classificao pelo modo de


separao
1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico
Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em:
cromatografia em coluna (cromatografia lquida, gasosa e supercrtica) e cromatografia
planar (Centrfuga, em papel e camada delgada).
A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido.
Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre duas fases
imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. Este mtodo muito til para a
separao de compostos polares, sendo largamente usado em bioqumica.
A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de adsoro lquido
slido. Nesse caso, a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes
de uma mistura pela fase estacionria.
A cromatografia lquida clssica muito utilizada para isolamento de produtos naturais
e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas
so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como
suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam
separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio.
A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) uma tcnica analtica usada para
separar e quantificar componentes numa mistura lquida. A utilizao de suportes com
partculas diminutas so os responsveis pela alta eficincia desse mtodo de
cromatografia. A fase mvel (lquida) movimenta-se continuamente atravs da coluna
contendo a FASE ESTACIONRIA (slido). O soluto interage com as fases
estacionria e mvel por adsoro, partio, excluso molecular, troca inica. As
separaes em CLAE podem se dar por adsoro (separao slido-lquido), partio
(separao lquido-lquido) ou ambos. O detector mais utilizado para separaes por
CLAE o detector de ultravioleta
(Absoro da luz na faixa UV visvel), sendo tambm empregados detectores de
fluorescncia, de ndice de refrao, e eletroqumicos, entre outros.

A Cromatografia gasosa uma tcnica de separao e anlise de misturas por


interao dos seus componentes entre uma fase estacionria e uma fase mvel.O
principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado na partio
dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria
lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por
adsoro, apresenta poucas aplicaes. A cromatografia gasosa uma das tcnicas
analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de resoluo, muito atrativa
devido possibilidade de deteco em escala de nano a picogramas. A diferena entre
CG e CGAR est na coluna (tubos longos de metais como ao ou cobre, vidro ou
teflon). Colunas de CGAR so maiores em comprimento, menores em dimetro,
possuem a fase lquida como um filme aplicado diretamente s paredes do tubo da
coluna e so mais eficientes.
2. Classificao pela fase mvel empregada
So de 3 tipos: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia
supercrtica (CSC). A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a
cromatografia lquida clssica (CLC) e a cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE). No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por
cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR).
3. Classificao pela fase estacionria utilizada
Quanto fase estacionria, distingue- se entre fases estacionrias slidas, lquidas e
quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido,
este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre
ele. Suportes modificados so considerados separadamente, como fases
quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus
mecanismos de separao.
4. Classificao pelo modo de separao
Separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou
misturas desses mecanismos.
OBJETIVO Executar a separao por cromatografia do carotenide e da clorofila em
camada delgada.

Bquer de 250 mL Slica G Funil para lquidos Erlenmeyer de 125 mL Coluna


cromatogrfica Suporte universal Gral e pistilo de porcelana Placas cromatogrficas de
slica G Tubo capilar
Agarradores de coluna ter de petrleo Diclorometano ter de petrleo Diclorometano
Provetas de 10 e 50 mL Algodo Areia lavada desidratada Frasco para anlise
cromatogrfica
A. Preparao da amostra
Preparou-se a amostra, colocando em um gral uma pequena poro do material
vegetal (folhas) com uma mistura de ter de petrleo e acetona (80:20), triturando para
obter uma soluo verde que foi colocada em um bquer.

Figura 1: soluo verde. Fonte: prpria.


B. Separao por cromatografia em coluna de pigmentos de um vegetal
Sujeitou-se a coluna de cromatografia, em posio vertical, a um suporte utilizando
dois agarradores: um perto da torneira e outra na parte superior e introduziu-se um
pequeno chumao de algodo em seu extremo inferior. Colocou-se um erlenmeyer
abaixo da coluna e um funil na parte superior (como mostrado na figura 2).

Figura 3: Mistura de carotenos (fase amarela) e mistura de clorofilas (fase verde).


Fonte: prpria.
Figura 2: Coluna cromatogrfica. Fonte: prpria.
Num bquer preparou-se uma suspenso com 5g de Slica G (adsorvente) e 50 mL de
ter de petrleo (eluente). Adicionou-se um pouco do eluente coluna e logo
transferimos a suspenso previamente preparada em seu interior. Abriu-se a torneira e
bateu-se suavemente nas paredes da coluna enquanto durou a sedimentao do
adsorvente. Deixou-se que o eluente descesse at uma altura sobre o adsorvente de
1-2 m. Fechou-se a torneira, o erlenmeyer foi retirado com o eluente e colocou-se
outro vazio.
Ento, adicionou-se cerca de da soluo verde que estava no bquer na coluna
cromatogrfica. Houve a formao de duas fases (como mostrado na figura 3).

Abriu-se a torneira at que toda a soluo de mistura de carotenos (banda amarela)


sasse e fechou-se a torneira. Retirou-se o erlenmeyer com a soluo de mistura de
carotenos e colocou-se outro erlenmeyer para coletar a soluo de mistura de
clorofilas (banda verde).
C. Anlise cromatogrfica em camada delgada de pigmentos de um vegetal Preparouse trs cmaras cromatogrficas com 5 mL dos solventes (fase mvel) em ensaio.
ter de petrleo para a soluo amarelada. ter de petrleo para a soluo
esverdeada.
Mistura de ter de petrleo/acetona na proporo 80:20 para o extrato vegetal.
Preparam-se trs lminas revestidas com slica-gel (fase estacionria). Em cada uma
das lminas foram aplicadas as trs solues com o auxlio de um capilar. Mergulhouse ligeiramente a lmina no eluente de modo que a zona onde se encontravam os trs
pontos no ficasse submersa.
Na cromatografia da soluo esverdeada houve separao do verde mais escuro do
mais claro. O verde mais escuro foi arrastado para cima medida que o eluente subia,
enquanto o verde mais claro permaneceu onde se tinha aplicado a soluo com o
auxlio de um capilar.
Na cromatografia da soluo amarelada no houve separao de tonalidades da cor
amarela, observou-se apenas um pequeno aumento da mancha amarela onde se tinha
aplicado a soluo com o auxlio de um capilar.
Na cromatografia da soluo extrato vegetal houve separao da cor verde da cor
amarela. A cor amarela foi arrastada para cima medida que o eluente subia,
enquanto a cor verde permaneceu onde se tinha aplicado a soluo com o auxlio de
um capilar (como observado na figura 4).
Figura 4: cromatografia em camada delgada da soluo verde (extrato vegetal). Fonte:
prpria.
Foi necessrio bater suavemente nas paredes da coluna enquanto durava a
sedimentao do adsorvente para que este se compactasse adequadamente
objetivando a no formao de borbulhas e evitando que a se secasse a slica G.

Assim foi evitado o aparecimento de rachaduras na coluna, o que prejudicaria a


separao cromatogrfica.
Na cromatografia da soluo esverdeada o verde mais escuro (clorofila ) se
concentrou na parte superior da placa devido sua menor polaridade, assim sendo
adsorvido menos fortemente, permanecendo menos tempo na fase estacionria.
Enquanto o verde mais claro (clorofila ) permaneceu onde tnhamos aplicado a
soluo com o auxlio de um capilar, devido sua maior polaridade, assim sendo
adsorvido mais fortemente, permanecendo mais tempo na fase estacionria.
Na cromatografia da soluo amarelada no houve separao de tonalidades da cor
amarela, devido apenas presena do -caroteno. Assim, no houve diferena
significativa de polaridade para a diferenciao de tonalidades da cor amarela na placa
de vidro com slica G.
Na cromatografia do extrato vegetal a cor amarela (caroteno) se concentrou na parte
superior da placa, devido sua menor polaridade, por ser adsorvido menos
fortemente, permaneceu menos tempo na fase estacionria. Enquanto a cor verde
(clorofila) permaneceu onde tnhamos aplicado a soluo com o auxlio de um capilar,
devido sua maior polaridade, assim, sendo adsorvida mais fortemente e
permanecendo mais tempo na fase estacionria.
O procedimento foi bem sucedido, pois foi possvel a observao do experimento em
suas diferentes etapas, possibilitando as anlises necessrias e aplanando os
conhecimentos a cerca das tcnicas e teorias utilizadas, assim, atingindo o objetivo da
aula prtica.
DEGANI, A. L. Um Breve Ensaio Sobre Cromatografia. SP, Qumica Nova na Escola,
numero 17. 1998.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos.
5 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.
LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Performance liquid chromatography: fundamental
principles and practice. Blackie Academic and Professional, 1995.
CHAVES, M.H.; Anlise de extratos de plantas por CCD: uma metodologia aplicada
disciplina Qumica Orgnica. Qumica Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, 1997.

ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. e
BRANDO, A.M. Determinao de cafena em bebidas atravs de cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE). Qumica Nova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.