PRIMERA PARTE (20 puntos)

Usted debe preparar 150 ml de un gel 1% m/v de agarosa, 0.5 g/ml de bromuro de
etidio y TAE 1X. Adems, necesita 350 ml de TAE 1X para utilizar como buffer de
corrida. En el laboratorio hay: TAE 50X, agarosa slida y bromuro de etidio 12.7
mM.
Dato: MrBrEt=394.3 g/mol
a) Calcule y explique cunta masa de agarosa necesita, cunto volumen de bromuro
de etidio debe agregar y cmo prepara todo el TAE 1X que necesita. 15 puntos
Agarosa
1 g.100 ml
1,5 g..150 ml
500 ml de TAE 1X
10 ml TAE50X + 490 ml H2O
BrEt
12,7 mM = 0,0127 M
0,0127 mol/L x 394,3 g = 5 g/L = 5 mg/ml = 5000 g/ml
5000 g/ml / 0,5 g/ml = 10.000
150 ml / 10.000 = 0,015 ml = 15 l
b) Explique cmo es posible visualizar cidos nucleicos utilizando bromuro de etidio.
5 puntos
El BrEt se intercala entre las bases del ADN y al ser expuesto a luz UV en un
transiluminador, fluoresce (unas 20 veces ms que cuando esta libre).
SEGUNDA PARTE (45 puntos)
Como parte de un nuevo proyecto de investigacin, un colaborador suyo en el
extranjero le enva unos pocos microlitros del plsmido p2011. Para corroborar que se
trata del plsmido correcto, lo somete a distintos tratamientos y realiza una corrida
electrofortica en un gel de agarosa 0,8%. Durante la preparacin de las muestras para
sembrar el gel, se mezclaron los tubos y desafortunadamente se borraron los rtulos.
Las muestras eran:
ABCDE-

Plsmido sin digerir y sin tratar con RNasa

Plsmido sin digerir y tratado con RNasa
Plsmido digerido con EcoRI y tratado con RNasa
Plsmido digerido con Hind III y tratado con RNasa
Plsmido cortado con EcoRI y Hind III y tratado con RNasa

Continuando con sus problemas, el gel corre ms tiempo del deseado pero sin
embargo es posible asignar las muestras A-E a las distintas calles.

a) Indique a qu muestra (A-E) corresponde cada calle y determine las distancias

relativas de los sitios de corte para las enzimas de restriccin utilizadas (mapa de
restriccin). Justifique brevemente. 20 puntos

B E A C D

Dato: Hind III posee un nico sitio de corte

Las calles A y B son las obvias, junto con D,
ya que Hind corta una sola vez (linealiza) y
se corresponde con la banda del medio
del plsmido sin cortar.
Sabiendo que el plsmido lineal tiene una
longitud de 8 kpb, se desprende que en la
tercer calle falta al menos una banda
dado que 3 + 4 = 7 8. Entonces hay una
banda de 1 kpb que se fue del gel.

Esto es coherente con que la anteltima calle corresponda al corte con Eco (2
sitios) y la tercera al corte con las dos (Eco + Hind).
Entonces, Hind corta 1 sola vez y Eco corta AL MENOS dos veces. Asi, un
posible mapa de restriccin seria:
EcoRI

1 kpb

EcoRI

3 kpb

HindIII

4 kpb

b) Cul es la longitud en pares de bases de cada una de las bandas de la calle

indicada con el asterisco (*)? 5 puntos
Las bandas corresponden a los topoisomeros del plsmido, por ende la longitud
de todas las bandas es la misma = 8 kpb
Usted necesita amplificar dicho plsmido, por lo que decide transformarlo utilizando
el mismo protocolo que aprendi en IBMyC. Sabiendo que el plsmido p2011 se
encuentra a una concentracin de 1 g/l, porta el gen de resistencia al antibitico
tetraciclina y que las bacterias competentes poseen una eficiencia de transformacin
(E.T.) de 1,5 x 106 UFC/g ADN.

c) Qu masa de p2011 debe utilizar si usted quiere obtener 150 UFC sembrando el
20% del producto de la transformacin? Teniendo en cuenta que no puede pipetear
volmenes inferiores a 1 l, qu dilucin de p2011 debe realizar? 12 puntos
Hay ms de una manera de responder esta pregunta, aqu una posible:
Masa necesaria: Si 150 UFC son el 20%, el 100% son 750 UFC. Reemplazando
en la formula la masa es 0,5ng. Dado que la concentracin del plsmido es 1g/l
la mnima dilucin que deben hacer para pipetear 1l es 1/2000.
Los controles que realiz en el experimento de transformacin fueron los siguientes:
i) Transformacin con la cantidad necesaria de un plsmido control (pRedscript)
para obtener, sembrando el 20% de la reaccin, 150 UFC (tubo 2).
ii) Transformacin con agua estril y plaqueo del producto de la transformacin
en placas LB con antibitico (tetraciclina, tubo 3) y LB sin tetraciclina
(tubo 4).
Los resultados que obtuvo fueron los siguientes:
Transformacin con:
1. p2011 (plaqueo en LB + Tetra)
2. pRedscript (plaqueo en LB + Tetra)
3. Agua (plaqueo en LB + Tetra)
4. Agua (plaqueo en LB)

UFC
23
157
2
Csped

d) Sabiendo que la eficiencia de transformacin fue calculada utilizando el plsmido

pRedscript (3 kpb), por qu cree que obtuvo menos UFC que las esperadas para el
p2011? 3 puntos
Dos opciones:
1. Porque se trata de plsmidos distintos que tienen una gran diferencia de
tamao (3 vs 8 kpb).
2. La preparacin del plsmido p2011 era ms sucia o de peor calidad.
e) De las cuatro condiciones mostradas en la tabla, cules son las relevantes para
analizar el efecto de la tetraciclina? Qu conclusiones obtiene? 5 puntos
Placas 3 vs 4 dado que son las nicas en las que la nica variable que se altera es
presencia de antibitico. Una conclusin es que las bacterias sin transformar
no son resistentes al antibitico.
TERCERA PARTE (25 puntos)
Al querer llevar a cabo una digestin de otro plsmido con la enzima de restriccin
BamHI, la cual posee un sitio nico de corte, usted se dio cuenta que no contaba con
el protocolo de digestin. Por ello decidi probar tres temperaturas distintas de
incubacin: 0C, 20C y 37C. En cada condicin de temperatura se tomaron alcuotas
a los 20, 40 y 60 minutos. Luego se corrieron los productos de digestin en un gel de
agarosa como se indica en la figura:

a) Identifique dnde ocurre la reaccin y dnde el revelado. 5 puntos

La reaccin ocurre en los tubos que contienen Enzima + DNA plasmdico,
mientras que el resultado se revela mediante la corrida electrofortica en el gel
de agarosa con bromuro de etidio (como explicaron antes).
b) A qu temperatura la enzima fue ms activa? Justifique graficando la
concentracin de producto en funcin del tiempo para las tres temperaturas ensayadas.
15 puntos
La enzima fue ms activa a 20 grados, ya que a los 40 minutos ha digerido a todo
el sustrato (en realidad, sustratos), evidenciado por la presencia de una nica
banda correspondiente al producto digerido.

A 0C no se mueve y a 20C llega al 100% antes que a 37C.

c) Cmo se modificaran los resultados del ensayo realizado a 37C si antes de la
incubacin con el ADN plasmdico se colocara la enzima durante 20 minutos a: i) 0C
y ii) 100 C? Se trata de pre-tratamientos o tratamientos? 5 puntos
Dado que dice ANTES de la incubacin, se trata de PRE-TRATAMIENTOS. Al
pre-incubar a 0C y luego llevar a cabo la reaccin a 37C, todo transcurrir
normalmente ya que la energa cintica era baja pero la enzima no sufre
cambios irreversibles. Al pre-incubar a 100C, la enzima se desnaturaliza
irreversiblemente, de modo que la volver a 37C, ya no ser activa.

CUARTA PARTE (10 puntos)

a) El fundamento de un protocolo alternativo para extraer plsmidos consiste en
incubar una suspensin de bacterias a 95C por unos segundos y colocarlas
inmediatamente en un bao de agua con hielo (0C). Qu estrategia comn comparte
este protocolo con el de lisis alcalina del TP N1? 5 puntos
La estrategia en comn es la de desnaturalizacin (tanto del cromosmico como
del plasmdico) seguida de renaturalizacin. As, el plasmdico (por ser ms chico
que el cromosmico) es capaz de aparearse correctamente mientras que el
cromosmico, debido a su gran tamao, es incapaz y precipita.
NO para paleontlogos
b) Con qu fin utilizamos la reaccin de Hill en el TP de Cloroplastos? Qu
hubiese pasado si en los experimentos realizados con los cloroplastos se hubiese
agregado un desacoplante del transporte de protones? 5 puntos
La reaccin de Hill se utiliza con el fin de analizar la capacidad fotosinttica de
los cloroplastos en general (y en particular del PSII).
Si se agregase un desacoplante del transporte de protones los resultados no
variaran dado que el transporte de electrones ocurre con o sin bombeo de
protones contra gradiente.