MICROSCOPIA ELECTRNICA

A diferena bsica entre as duas modalidades de microscopia,

consiste no facto de na primeira, a imagem ser produzida por fotes e
na segunda, por electres. Da decorrem necessariamente,
consequncias, quer a nvel de concepo fsica dos aparelhos, quer a
nvel da preparao do material, quer a nvel da natureza da imagem
e ou ainda da performance da tcnica.
Microscpio electrnico de transmisso
(Transmission electron microscope)
O microscpio eletrnico de transmisso habitualmente
designado abreviadamente pelas iniciais do seu nome em
ingls: TEM. Desenvolveu-se nos anos 30. Os primeiros cientistas a
utiliz-lo em Biologia, foram Albert Claude, Keith Porter e George
Palade, nos anos 40 e 50.
Tal como no microscpio fotnico, tambm no microscpio
eletrnico composto por uma fonte (de eletres), um
sistema ocular, um sistema objetiva e um sistema condensador. Estes
sistemas so constitudos por lentes (bobinas) eletromagnticas que
atuam sobre o feixe de eletres, reproduzindo a maior parte dos
sistemas ticos clssicos: lentes convergentes, lentes divergentes,
espelhos, prismas, etc.
A fonte consiste num filamento metlico tornado incandescente
pelo efeito de Joule. Este encontra-se inserido num campo eltrico em
que os eletres emitidos pelo filamento so atrados para um alvo. A
atraco gerada pela diferena de potencial (50 a 100 KV) criada
entre o prprio filamento, que neste contexto desempenha o papel de
ctodo, e o alvo (nodo). Tal facto tem como consequncia que os
eletres se deslocam a uma elevada velocidade. Nada porm
aconteceria se o alvo no fosse perfurado centralmente (cran
perfurado). Os eletres que passam atravs deste orifcio, constituem
um feixe apertado mas de tendncia divergente. Este feixe
condensado pela lente condensadora e incide sobre a preparao a
ser examinada (espcime).

Ao atravessar a preparao, os eletres so desviados uns mais

do que outros. O feixe de eletres com os desvios introduzidos pela
preparao, dispersado pela lente objetiva. Parte desse feixe , por
sua vez, dispersado por outro campo magntico que age como lente
de projeo.
No sendo a nossa viso sensvel aos eletres, a imagem
projetada sobre um ecr fosforescente de Sulfureto de Zinco. Neste,
os
pontos
onde
embate
um
electro,
emitem
fotes.
Consequentemente, podemos ver a imagem, indiretamente, atravs
da descodificao realizada pela matria fluorescente do cran. A
mesma imagem pode ser projectada sobre uma pelcula fotogrfica
ou ainda captada por um sistema de vdeo e posteriormente
digitalizada por um computador.
No objecto a observar, as zonas mais densas aos electres, que
induzem consequentemente maiores desvios ou mesmo absoro,
aparecero menos luminosas no cran. Pelo contrrio, as zonas
menos densas, daro origem a imagens mais brilhantes no cran;
portanto escuras no negativo e claras no positivo fotogrfico. Assim,
podemos dizer que a imagem que observamos a sombra electrnica
do objecto.
Contrariamente aos fotes, os electres no podem chocar com
quaisquer tomos ou molculas. Por esta razo, o interior do
microscpio electrnico encontra-se em vazio quase absoluto. Facto
que inviabiliza a observao de seres vivos.

Trajecto dos electres (em amarelo) no microscpio electrnico

de transmisso

Poder de resoluo
Tal como para o microscpio fotnico, tambm neste caso se
coloca a questo do poder de resoluo. Deve-se a Louis de Broglie a
descoberta de que aos electres, se encontra associada a propagao
de uma onda, cujo comprimento de onda dado pela frmula:
l = h / mv
em que h a constante de Plank (h = 6,62 x 10-27 no sistema de
unidades C.G.S), m a massa do electro e v, a sua velocidade. Por
exemplo, os electres acelerados por uma diferena de potencial de
75 KV, adquirem a velocidade de 145.000 Km/s e o seu comprimento
da onda associada l = 0,043 nm. Este valor 100.000 vezes inferior
ao comprimento de onda das radiaes azul-violeta, que
correspondem ao mximo de sensibilidade das emulses fotogrficas
(l= 4300 nm).
Este facto aponta para a possibilidade terica de se atingirem,
com os microscpios eletrnicos, resolues da ordem de 0,002 nm.
Todavia, como o poder de resoluo depende no s do comprimento
de onda mas tambm da abertura numrica, e esta ser limitada por
razes inerentes a natureza eletromagntica das lentes, atingem-se
limites de resoluo prximos de 0,1 nm. Todavia, na observao de
espcimes biolgicos, pela falta de contraste que os caracteriza,
raramente se consegue ultrapassar a resoluo de 1-2 nm.

Ampliao
O desenvolvimento do microscpio electrnico possibilita-nos
ampliaes de 100.000 x ou mesmo mais.
Preparao dos espcimes
Visto que o princpio deste microscpio a observao de
espcimes transparentes, estes devem apresentar-se extremamente
delgados. Para o efeito, o material biolgico sofre uma preparao
especfica que compreende as seguintes etapas: fixao, corte,
deposio em grelhas, contrastao.
Fixao
A fixao, como para a microscopia fotnica, um processo
atravs do qual se procura preservar as estruturas celulares. Neste
caso, porm, necessrio ter ainda em conta que as estruturas
celulares devero ser preparadas para resistirem com um mnimo de
distores, s condies de observao totalmente secas, como so

aquelas que vigoram no interior do microscpio. Empregam-se para

tal dois compostos: o glutaraldeido, que consolida as estruturas
proteicas, estabelecendo com elas ligaes covalentes; o tetrxido de
smio que estabiliza as bicamadas lipdicas e tambm as estruturas
proteicas.
Incluso e Corte
Porque os electres tm um poder de penetrao
extremamente fraco, os objectos devem ser cortados em fatias muito
finas, da ordem de 50 a 100 nm de espessura. Designam-se por
cortes ultra-finos. Para se conseguir obter cortes to delgados, os
tecidos so embebidos (incluso) em resinas que polimerizam sob a
forma de um bloco de plstico. Os cortes so depois efectuados com
recurso a facas de vidro ou de diamante.
O aparelho que se emprega para esta funo designa-se por
ultra-micrtomo. O seu funcionamento semelhante ao do micrtomo
rotativo descrito no captulo relativo microscopia fotnica, com a
diferena que o avano do brao porta objecto no resulta de um
processo mecnico, mas da dilatao de uma barra metlica.
Os cortes so depositados em grelhas de cobre de 3 mm de dimetro.

UUltramicrtomo e pormenor da operao de corte

Contrastao

Sabemos que o contraste obtido no microscpio electrnico

depende do nmero atmico dos tomos que compem o espcime:
quanto maior for o nmero atmico, maior ser a probabilidade de o
electro ser retido e, portanto, maior o contraste. As molculas
biolgicas so compostas por tomos com nmeros atmcos muito
baixos. Para aumentar o contraste, os cortes so submetidos a
olues de sais pesados, tais como o urnio ou o chumbo. Para este
fim, emprega-se correntemente o acetato de uranilo e o citrato de
chumbo.

Microscpio

electrnico de
varrimento
(Scanning electron microscope)

O microscpio electrnico de varrimento designa-se

habitualmente pela abreviatura do seu nome em ingls: SEM.
Emprega igualmente um feixe de electres, mas estes, em vez de
atravessarem o espcime, colidem com a superfcie deste,
previamnete metalizada, e libertam electres secundrios. a partir
destes electres, que se obtem uma imagem num monitor de vdeo.
O feixe de electes primrios mvel e varre a superfcie do
espcime. Da obter-se uma imagem completa da superfcie do
objecto a observar.
O Poder de resoluo dos SEM da ordem dos 10 nm, e a
ampliao atinge valores da ordem de 20.000x.

Trajecto dos electres no microscpio electrnico de

varrimento

A preparao do material para ser observado em SEM

compreende duas etapas principais: a deshidratao e a metalizao.
Esta ltima consiste na deposio de uma fina camada de um
metal, empregando-se geralmente o ouro. Para tal, o metal
aquecido sob vazio e, ao vaporizar-se, deposita-se sobre o espcime.