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GENERALIDADES
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando
como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que
funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes,
abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal
para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la
materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se
observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el nmero de
coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por
lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el
agua.
Cuando los productos alimenticios
han recibido un tratamiento trmico
(pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a
35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia
coli.
La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la
familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino
delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas
que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas
que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante
un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en
plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC),
E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente
difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las
cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.
Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea
del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de
infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los
nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina
termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a
la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular
(4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.
La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos
(lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva
puede ser ms baja.
Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la
mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en
ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa
generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica.
Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el
gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas
permiten su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis
infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples
serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin
del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente
relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy
Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
baja
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
O111 y otros
varios
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Varios
FUNDAMENTO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando
un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la
fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar
tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza
a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de
las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac
Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas
bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio pticod
Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclavea
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.
37C
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo
2 a 3 asadas/tubo
37C
44.5C
24 48 h
24 48 h
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva
INOCULO
(mL)
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
CONCENTRACIN
10 o ms
11 o ms
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
124.6
3.5 X
100
20
120
142.4
4X
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona,
incubarlo a 35C por 24 2 h.
Finalizada la incubacin , adicionar 0.6 mL de solucin KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2
mL de solucin alfa- naftol (VP2 )y agitar.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser,
se considera una prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologca de forma
recta. Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en
el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que
muestre formacin de gas y sembrar en un nmero igual de tubos con medio ECMUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Finalizado el periodo de incubacin, irradiar los tubos con una fuente de luz UV,
observar cuantos tubos presentan fluorescencia
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS
Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al
procedimiento sealado en la tabla 1, para estimar la poblacin de bacterias coliformes
totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua.
TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
BIBLIOGRAFA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos troceados y
curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones
sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la densidad microbiana por la
tcnica de nmero ms probable.
CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del
nmero ms probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia
coli por el nmero ms probable
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9 th
Arlington, VA: AOAC.
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Foods
(2005)