The Journal of Neuroscience, Septiembre 3, 2008 28 (36) :9055-9065

9055

Comportamiento / Sistemas /
Cognitiva

Sexo-especficas de programacin de Offspring

Emotividad despus
El estrs a inicios del embarazo
Bridget R. Mueller y Tracy L. Bale
Departamento de Biologa Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Pennsylvania, Philadelphia,
Pennsylvania 19104

El estrs prenatal se asocia con una mayor vulnerabilidad a los trastornos del neurodesarrollo como el autismo y la esquizofrenia. A
determinar la ventana de tiempo crtico cuando antecedentes fetales pueden inducir una predisposicin a la enfermedad, se examinaron
las respuestas de comportamiento en
descendencia expuesta al estrs durante la primera, media y final de la gestacin. Se encontr que los hijos varones expuestos a estrs
temprano en la gestacin
mostrado desadaptativa responsividad conductual del estrs, anhedonia, y un aumento de la sensibilidad al inhibidor de la recaptacin
de serotonina
tratamiento. Alteraciones a largo plazo en el centro de factor de liberacin de corticotropina (CRF) y receptor de glucocorticoides (GR) de
expresin, as como
aumento hipotalmico-pituitario-adrenal (HPA) la capacidad de respuesta del eje, estuvieron presentes en estos ratones y
probablemente contribuy a una elevada
sensibilidad al estrs. Cambios en el CRF y GR metilacin de genes correlacionados con la expresin de genes alterados,
proporcionando evidencia importante de
programacin epigentica durante el estrs prenatal temprano. Adems, hemos encontrado el mecanismo bsico que subyace a la
vulnerabilidad masculina puede
involucrar a la capacidad de respuesta placenta sexo-especficas, donde el estrs temprano en el embarazo aumenta significativamente
la expresin de PPAR (peroxisome
receptor activado
por el proliferador),
IGFBP-1
(factor del
de ADN,
crecimiento
similar
a la insulina
protena
1 de unin), HIF3 (factor de 3aPalabras
clave: placenta;
neurodesarrollo;
metilacin
el estrs
prenatal,
depresin,
trastornos
inducible por hipoxia), y
afectivos
GLUT4 (transportador de glucosa 4) en placentas masculinos pero no las mujeres. El examen de maquinaria epigentica de la placenta
revel sexo basal
revelaron
una asociacin
entre la experiencia
de estrs
materno
durante
diferencias, proporcionando una prueba ms de que la programacin
especfica
del sexo comienza
muy temprano
en el
embarazo,
y el
Introduccin
pueden contribuir
a ladurante
sincronizacin
Experiencia
de estrs
la gestacin se asocia con un mayor el primer trimestre y un aumento del riesgo de la esquizofrenia en los
y la vulnerabilidad
del feto
en desarrollo
a las perturbaciones
maternas.
En conjunto, estos resultados indican que la experiencia de
incidencia
de numerosos
trastornos
neuropsiquitricos,
incluyendo
de-hombres
(Khashan et al., 2008). Por lo tanto, la hiptesis de que el temporal
estrs temprano
depresin,
la ansiedad,
en emla esquizofrenia, y el autismo (Koenig et al, 2002.;
especificidad puede contribuir al aumento de la incidencia de la
Nestler
et al, 2002;.
Gillotta ytrastornos
Standen, 2007;.
Walker et
al,
nancy puede
contribuir
del desarrollo
neurolgico
masculinos a travs de los efectos sobre la funcin de la placenta y el
2008).
El mecanismo
a travs del cual Antecedentes fetales contrib- enfermedad en
desarrollo
fetal.
Ute al desarrollo de la enfermedad no se conoce, pero probablementelos machos expuestos a estrs prenatal.
Aunque el mecanismo especfico por el cual el estrs materno
implica un
compleja interaccin entre el medio ambiente y la gentica. Porque contribuye al riesgo de la enfermedad sigue siendo poco clara, varios tecla
muchas de las enfermedades asociadas con el estrs prenatal (PS) contribudores han sugerido que implica cambios en la maternal horpresentan una
sesgo de sexo en la presentacin, la determinacin de cmo el sexo- milieu monal. Glucocorticoides elevados en el tero puede alterar la vida
temprana
especficas suscepti"Programacin" (Seckl, 2000; Meaney, 2004). Sin embargo, los pladad surge puede dar una idea mecanicista crtica, generando as
centa inactiva un porcentaje significativo de la mortalidad materna
la identificacin de nuevas dianas para el desarrollo teraputico.
Aunque el estrs prenatal ha sido ampliamente asociado con off- glucocorticoidescoids va 11 HSD2 (deshidrogenasa tipo 11-hidroxiesteroide 2),
enfermedad de resorte, el sistema nervioso en desarrollo es poco probable
proteger al feto a travs de las ltimas etapas del embarazo (Seckl
para mostrar
y Meaney, 2004). A pesar del papel fundamental de la placenta en reguvulnerabilidad uniforme a las perturbaciones en el transcurso de gestacin
cin del intercambio de hormonas, nutrientes y productos de desecho
cin. Hemos establecido recientemente que la influencia de la atencin
entre los sistemas circulatorios de la madre y del feto, muy poco es
prenatal
conocido con respecto ya sea los efectos del estrs materno o la influenel estrs en el aprendizaje dependiente del hipocampo y la memoria se
cia del sexo fetal en la funcin placentaria.
espeUn mecanismo potencial mediante el cual el estrs puede influir fetal
especfica a las fechas de la exposicin al estrs y el sexo de la
desarrollo y la programacin es a travs de la epigentica, incluyendo
Recibido 03 de abril 2008; Revisado el 30 de junio de 2008; aceptado el 23 de julio de 2008.
descendencia
Este trabajo fue apoyado por la Fundacin Universidad de Pennsylvania Investigacin y March
La metilacin del ADN (Seckl y Meaney, 2004;. Weaver et al, 2004b;
(Mueller
y Bale, 2006, 2007). Adems, un estudio reciente reof Dimes 5FY03-133.
Tsankova et al., 2007). Aunque se ha puesto nfasis reciente
B.R.M. fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Comportamiento / Cognitive
relativo a la participacin de la maquinaria epigentica en la programacin
Neuroscience Training subvencin T32
MH-017168. Damos las gracias a K. Carlin y C. Welle para el apoyo tcnico y D. Pankevichde
porlos
su acontecimientos de la vida temprana, la influencia de los
asistencia editorial.
antecedentes del feto en el EPIGLa correspondencia debe ser dirigida a la Dra. Tracy L. Bale, Escuela 201E de Medicina
enome sigue siendo desconocido (Meaney et al., 2007). Estrs central
Veterinaria, 3800 Spruce Street,
componentes, factor liberador de corticotropina (CRF) y la gluUniversidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104. E-mail: tbale@vet.upenn.edu.
DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1424-08.2008
receptor de cocorticoid (GR), han sido previamente demostrado ser
Copyright 2008 Sociedad para la Neurociencia 0270-6474/08/289055-11 $ 15.00 / 0

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Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino

Prenatal Temprana

regulado por metilacin y programado temprano en la vida (Weaver Tiempo de inmovilidad, que se define como la falta de todo movimiento con
excepcin de la barba
et al, 2004b;. McGill et al, 2006).. La serotonina (5-HT) neurotransmisin
misin y el desarrollo de enfermedades estn asociadas con el estrsel movimiento y la respiracin, se registr a lo largo de una sesin de prueba de 6
min
pathPrueba de natacin forzada. Los ratones se pusieron a prueba en una versin
manera la desregulacin (Valentino y Curtis, 1991;. Nestler et al,
modificada de la forzada
2002). Por lo tanto, la hiptesis de que mediada antecedant fetal
nadar prueba (FST) como se describe previamente (Lucki, 1997;. Cryan y col, 2005).
alteraciones en la programacin de estos circuitos pueden ser un
Todos los animales se colocaron en el cilindro para un preswim durante 5 min en el
da 1
subyacentey monitoreados luego durante una prueba de 5 min 24 h despus de la preswim
ing factor en los trastornos del neurodesarrollo.
(Cryan
y Lucki, 2000). El tiempo dedicado a la natacin, escalada, e inmvil era
determinado por un investigador ciego para el tratamiento y sexo. Inmovilidad
Animales
se defini como el tiempo pasado todava o slo el uso de enderezamiento a los
Los ratones utilizados en estos estudios estaban en una mixta C57BL / 6:129 fondo.
movimientos
Ratones hembras vrgenes (n 62) se aparearon en 6 - 8 semanas de edad.
permanecer a flote. Natacin se define como cualquier movimiento horizontal en
Presencia de
naturaleza que participan al menos dos miembros. Escalada se define como
un tapn de la cpula denota das de gestacin 1. La mujer embarazada fue cualquier
alojados individualmente, dado un nestlet de algodn, y asignado a un esfuerzomovimiento
de
vertical en la que la parte inferior de las patas delanteras toc el
tratamiento
lados del cilindro.
grupo de tratamiento (ver ms abajo).
Prueba de campo abierto. Los ratones fueron expuestos a la prueba de campo
Todos los animales fueron alojados en virtud de un 12 h luz / oscuridad ciclo (luces
abierto durante la oscuridad
a las 07:00
ciclo de 1 semana despus de la finalizacin de la FST para determinar el efecto de
AM) con temperatura ambiente de 22 C y una humedad relativa de 42%.
la PS en
Alimentos (Purina Rodent Chow; 28,1% de protenas, 59,8% de hidratos de carbono,
ansiedad-como el comportamiento y la actividad locomotora. El aparato de campo
12,1%
abierto
grasa) y el agua se proporcion durante todo el estudio ad libitum. Todos los consista en un plexigls blanco caja de 50 50 a 22 cm con 16 12 12 cm
estudios
cuadrados dibujados en el suelo. Las pruebas se realizaron con 120 lux en el
se hicieron segn los protocolos experimentales aprobados por la Unicentro del area, 2-4 horas despus de apagar las luces (9:00-23:00). Cada ratn
El estrs prenatal
sidad del Comit de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Pennsylvania.
se coloc en el centro de la caja para iniciar la prueba de 5 min. Los ratones fueron
Administracin de crnica, estrs variable se realiza como anteriormente
anot para los cruces
del total de
y centro de
cruza
un investigador
Determinacin
mecanicista
delneas
la influencia
la por
atencin
prenatal ciego
descrito (Mueller y Bale, 2006). En pocas palabras, las presas se asignaron al azar
al
grupo de tratamiento. Debido a que el tratamiento con frmacos ansiolticos
firmado a grupos de tratamiento para recibir el estrs durante una de las 3 semanas,
temprana
aumenta
o
presin
hijos varones
Debido asobre
que la los
descendencia
masculina destac temprano en la gestacin mostr
a un control (Ctrl) grupo no estresados. Ratones embarazadas asignadas a la cruza en cuadrados de centro, el rendimiento en la prueba de campo abierto es una
una
significativa
valigrupos de estrs experimentado un factor de estrs diferente en cada uno de los 7 d
aumento
de conductas
inadaptadas comportamiento
en el TST y FST,(Bale
examinamos
fechada medida
de ansiedad-como
et al., 2000).
durante la primera
sensibilidad anhednico en una prueba de preferencia sacarosa. Para evaluar la
(das 1-7), medio (das 8 -14) o tarda (das 15-21) de gestacin. Crnico
posible
estresores variables fueron las siguientes: 36 h de luz constante, 15 min
mecanismos que contribuyen a estos resultados a largo plazo propias de cada sexo,
(A partir de las 10:00) del zorro exposicin olor (1:5000 2,4,5-trimetillas comparaciones se hicieron mediante la placenta array PCR y anlisis
tiazol; Acros Organics) la exposicin, novela objeto (ocho canicas de similares
epigenticos.
Prueba de preferencia de
La exposicin forma y color) durante la noche, a 5 min de la moderacin de estrs
Suspensin de la cola y las pruebas de natacin forzada revelaron que el estrs
(empezando
sacarosa
temprano
a las 10:00 horas) en un tubo cnico de 50 ml, la novela de ruido (ruido blanco prenatal
/
(E-PS) produce un fenotipo depresivo-como en la descendencia masculina adulta. A
Naturaleza
confirmar estos resultados, E-PS varones adultos fueron examinados en una
Sonido-Sleep Machine; Brookstone) durante la noche, mltiples cambios de jaula
durante todo el ciclo de luz y ropa de cama saturado (700 ml, 23 C el agua) sacarosa prefprueba rencia, una medida de la anhedonia, un sntoma central de clnicas depredurante la noche. Estos estresores leves fueron seleccionados para ser
Sion (Moreau, 1997).
nonhabituating y
para no inducir dolor o influir directamente en la ingesta de alimentos o materna Ocho semanas de edad E-PS y el control de los hijos varones (n 16) se alojaron
en una sola jaula, recibieron comida estndar ad libitum, y fueron inicialmente
aumento de peso (Mueller
y Bale, 2006).
Establecimiento
de las relaciones
sexuales y la especificidad
entrenado para consumir agua en el paradigma de dos botellas de opcin durante 3
temporal de la atencin prenatal
da
tensin en el estrs conductual respuestas de afrontamiento
habituar a los ratones a la libre eleccin. Luego fue reemplazado Una botella de
Descendencia
Para examinar el sexo y la vulnerabilidad de tiempo de gestacin a la influenciaagua
de estrs prenatal, se compar la respuesta al estrs conductual del macho por una botella de solucin de sacarosa al 1% durante 1 semana y 2 de acceso
y la descendencia de mujeres adultas que fueron expuestos al estrs materno sacarosa.
Durante la semana 3, la concentracin de sacarosa se aument a 5%. Durante
durante el
principios, mediados y finales de la gestacin. Al nacer, las camadas fueron semana 4 y 5, la concentracin se increment a 10% (Weatherly y
Arthur, 2006). Las botellas se invierten dos veces por semana para controlar por lado
sacrificadas a ocho cras,
la preferencia. La ingesta de lquidos se midi diariamente y reemplazado
y camadas que contienen menos de seis cachorros fueron excluidos del anlisis.
Durante semanas despus del parto (4 das despus del parto 25-27) cras se semanalmente. La
resultados de consumo de sacarosa se expresaron como una relacin de preferencia
destetaron,
por
grupo alojado con los mismos compaeros de camada de sexo, y etiquetada-ear
sacarosa. Proporciones preferentes se calcularon como el porcentaje del volumen
para proporcionar una
mtodo de identificacin permanente. Desde 10 -16 semanas de edad, de uno de
a sacarosa consumida (por 24 h) dividido por el consumo total de lquidos (por
Prueba
esfuerzo
24 h). Lade
ingesta
de alimentos, ingesta de agua, y el peso corporal se controlaron
dos machos y de uno a dos hembras por camada fueron probados en la conducta
A
la largo
conclusin
de preferencia
sacarosa
(da 36), se elimin sacarosa
afue
lo
de la prueba
de preferencia
sacarosa.
Los ensayos de la emotividad. El rendimiento de los hermanos del mismo sexosacarosa
durante 24 horas en e-PS y el control de la descendencia. La ingesta de sacarosa
averms de 2 y 24 h fue
aos para evitar los efectos de camada (animales Control5 masculinos / femeninos
4
comparacin
entre los animales expuestos a un factor de estrs agudo olor de un
literas;
depredador
animales Control4 / 4 camadas; masculinas animales stress8 temprano / 6 literas;
(1:5000 2,4,5-trimethylthiazole; Thermo Fisher Scientific) y animales
estrs temprano hembra 7 animales / 6 litros, a mediados del estrs masculino que
6 se deja en paz (n 4). Un paradigma restriccin de estrs similares
animales / 4
se ha demostrado previamente para inducir el comportamiento de borrachera como
camadas; animales mediados de mujeres stress6 / 4 literas; varn tarde stress7en/ 4ratas (Hagan
camadas;
stress6 finales femeninas / 4 camadas). Estos descendientes
El
anlisisanimales
del
et al., 2003). Los animales recibieron comida estndar y agua ad libitum dureran
Ensayo
de suspensin de cola. Para examinar las conductas desadaptativas decin
los del perodo de restriccin de sacarosa. La comida y el agua se control la
comportamiento
probado
en
la
suspensin
de
la
cola,
de
natacin
forzada,
y
las
pruebas
de
campo
adultos fuera de la
ingesta
abierto,
como
de- fueron examinados mediante la prueba de suspensin de
primavera,
los se
ratones
cola la restriccin de sacarosa y las 24 h despus del regreso de sacarosa. Para
durante
se describe
continuacin, con un perodo de 10 d de recuperacin entre las controlar
(TST)
como aprepruebas. descrito (Steru et al., 1985). Los ratones se fijan a un suspendido
viamente
para la restriccin, se llev a cabo un segundo experimento comparando 2 y 24 h
varilla de vidrio con cinta adhesiva coloca 1 cm de la punta de la cola y son
la ingesta de sacarosa entre los animales expuestos a un estrs por inmovilizacin
suspendido 50 cm de la parte superior del banco dentro de un rea visualmente15 min y
aislado.
animales que quedaron inalteradas (n 4). Estos animales fueron sacrificados
despus de la finalizacin del estudio. No se salv de los tejidos.

Materiales y Mtodos

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-Actina. Este valor se define como la CT. Cambio cuantitativo relativa

se calcul utilizando la frmula 2 (control CT E-PS CT) (n 4 -5).
Para determinar si las conductas desadaptativas de estrs responden encontraron
en varones E-PS fueron en respuesta a una recaptacin de serotonina aguda
inhibidor (ISRS), el citalopram se inyect 30 minutos antes de la prueba en la cola
CRF y GR in situ hibridacin
prueba de suspensin (n 8), como se describi previamente (Crowley et al., 2005).
La expresin de genes importantes en neurocircuitos estrs se midi por
Todo
in situ hibridacin. E-PS y de control de los varones fueron asesinados 2 semanas
los ratones fueron conductualmente ingenua. El frmaco se disolvi en 0,9% dedespus de la
solucin salina y
ltima prueba de comportamiento. Los cerebros se cortaron en un criostato a 20 m
inyectada en dos dosis: 2,5 y 10 mg / kg en un volumen de 100 l. Vehculo
coronal secciones
inyeccin fue de 100 l de 0,9% de solucin salina. Estos animales fueron
y se montaron en portaobjetos (SuperFrost Plus; Thermo Fisher Scientific). Secsacrificados despus de comnes se fijaron posteriormente en paraformaldehdo al 4% y se procesaron como
pletion del estudio. No se salv de los tejidos.
anteRecogida de tejido cerebral de
ously descrito (Teegarden y Bale, 2007). Tejido avenido Atlas era
Para examinar los cambios bioqumicos y moleculares en el cerebro de un adulto
adultos
hibridada con GR antisentido 5S-UTP-etiquetados (generoso regalo del doctor
machos expuestos a estrs prenatal precoz, conducta ingenua e-PS y conAudrey Seasholtz, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI) o CRF
trol adultos descendientes varones murieron a los 4 meses de edad (n 4 -5). Sesos
sondas como se describi previamente (Bale et al., 2000). Los portaobjetos se
se han eliminado y dividida sagitalmente en dos hemisferios. Para todos nuestros
incubaron
la expresin gnica y anlisis autoradiographical, se obtuvo tejido
durante la noche a 55 C, se lav a 65 C, se deshidrataron en etanol, y se sec al
de o analizado en el mismo hemisferio a travs de todos los animales. Para Autoraaire.
cardiografa y in situ estudios de hibridacin, las mediciones para CRF y
Para los anlisis de granos de plata, portaobjetos se sumergieron en nucleares
GR eran de las secciones de tejidos cerebrales del hemisferio izquierdo. En seriolquidos NTB
estudios de PCR tiempo, micropunches se hicieron a partir de tejido de la derecha
emulsin (Eastman Kodak) durante 17 d (GR) y 21 d (CRF). Diapositivas fueron
hemisferio. Para los estudios de metilacin del ADN, micropunches bilaterales eran
desarrollado, counterstained con hematoxilina (Thermo Fisher Scientific),
obtenido para el aislamiento de ADN. Por Western blot adulto, cortical
y coverslipped. El nivel de expresin se cuantific mediante el anlisis
tejido se toma del hemisferio derecho. Todo el tejido cerebral se almacen a densidad ptica utilizando la versin 3.9 IPLab sistema de imgenes para Macintosh
80 C.
Computer (Scanalytics). Bajo iluminacin de campo brillante, adecuada
regiones de inters se extrajeron como se determina por referencia atlas (Paxinos
y Franklin, 2001). Las secciones del cerebro se corresponden anatmicamente antes
anlisis. Expresin GR dentro CA1, CA2, CA3 y giro dentado (DG)
se analizaron dentro de la misma seccin del cerebro en cuatro secciones
5-HT transportador autorradiografa
Evaluacin del transportador de serotonina (SERT) en E-PS y el control de los adyacentes y
promediado para cada animal antes del anlisis estadstico (n 4 -5). Central
hombres
ncleo de la amgdala (CEA) expresin de CRF se analiz en dos
se llev a cabo con los mtodos de autorradiografa 3H-citalopram. Freshadyacentes y en promedio para cada animal (n4 -5). Lo mismo
, secciones de cerebro de concordancia atlas congelados fueron seleccionadossecciones
de
herramienta regin de inters se utiliz para cada seccin. Antecedentes fue subcontrol y E-PS
ratones (n 4 -5). Las secciones del cerebro (20 m) se incubaron en tampn Tris,extrajo de cada medicin de la densidad mediante el uso de una regin a las afueras
cada seccin de tejido. Intensidad de luz microscpico se mantuvo constante en toda
pH 7,6, a 37 C durante 10 min. Las secciones fueron incubadas en tampn conconteniendo 3H-citalopram (1,4 nM; PerkinElmer) durante 1 h a 37 C y se lavanlisis. Las medidas se completan con un investigador ciego a
grupo de tratamiento (n 4 -5).
Hipotalmico-pituitario-adrenal
respuesta al estrs del eje
en fro (0 - 4 C) tampn de incubacin (210 min). Por ltimo, las diapositivas fueron
Para
se enjuagaron en agua destilada desionizada fra y se sec bajo una corriente de
frodeterminar si los machos E-PS mostraron hipotlamo-alterada
pituitario-adrenal (HPA) del eje de respuesta al estrs, los niveles de corticosterona
de aire. Las secciones del cerebro estaban adosados a Kodak Hyperfilm (Eastman
en
Kodak)
10 semanas de edad, los hijos varones adultos (n 6) despus de un sistema de
para el 21 d. Imgenes de pelculas que representan las secciones de tejido atlas
retencin de 15 minutos fueron
emparejados eran
en comparacin. Restriccin se llev a cabo en un tubo cnico de 50 ml. La sangre
seleccionado para el anlisis. Regin de los contornos de inters fueron diseados
de la cola
para stanse recogi inmediatamente antes del inicio del estrs (0 min), inmediatamente
anlisis estandarizado del hipocampo dorsal, septum lateral y hypothaldespus de
amus como se determina por referencia atlas (Paxinos y Franklin, 2001).
la exposicin al estrs (15 min), y 15 y 45 minutos despus de la final de la tensin
La densidad ptica se midi dentro de cada regin de inters y promedi
(30
despus de restar el fondo densidad de la pelcula. Las imgenes fueron capturadas
y 60 min, respectivamente). El procedimiento de extraccin de sangre dur 1 min.
usando una
Las muestras se centrifugaron y se almacenaron a 80 C inmediatamente hasta que
10 bit enfriado cmara digital QICam (QImaging). La densidad ptica meael
surements fueron hechas por IPlabs para el software de Macintosh (BD
Dorsal
del rafe
TPH2, SERT, y el anlisis de la expresin de 5Se anlisis
llev a cabo
el ensayo.
Losdel
niveles
corticosterona
determinaron por
El
de la
metilacin
ADNdede
la IRC, GRse
y BDNF
Biosciences
/ Scanalytics).
Secciones a travs del rafe dorsal 4,04-4,96 mm caudal a bregma
HT1A
radioimEl
estado de metilacin de los dinucletidos CpG especficas dentro del promotor
fueron cortadas a un espesor de 300 m (Paxinos y Franklin, 2001). La
ensayode
inmunolgico
(ICN Biomedicals).
N).Tipo
La intra-ensayo
de
regin
CRF ratn (McGill
et al., 2006),(6
GR
II (Weaver etcoeficiente
al.,
ubicacin de la regin de microperforada corresponde a las figuras 64 -72 de lala
fue2004b),
del 5%.y el factor neurotrfico derivado del cerebro (BDNF)
Sevariacin
analizaron
Paxinos y Franklin ratn atlas. El rea de la dorsal del rafe era
(McGill y col., 2006) (N 4 -5). El ADN genmico de la hipotlamo
se determina usando el hipocampo dorsal y acueducto cerebral como
y el ncleo central de la amgdala de E-PS y control de los varones eran
puntos de referencia. Se tomaron entonces Micropunches con un dimetro de 1extrada
mm
de los sedimentos celulares con el kit DNeasy Tissue (Qiagen), de acuerdousando una aguja hueca (Ted Pella). RNA fue aislado utilizando RNeasy (Qia- cin a las instrucciones del fabricante. Se realiz la pirosecuenciacin
gen) y se volvi a suspender en RNasa libre de agua y la concentracin me- por EpigenDx, como se describe previamente (Kim et al, 2007;.. Liu et al, 2007).
Sured en un espectrofotmetro (Eppendorf). ADNc se transcribi utilizando
Las muestras de ADN Universalmente metilado y unmethylated (Millipore Bioel Sistema de Sntesis superndice primer captulo en tiempo real (RT)-PCR Investigacin en Ciencias Reactivos) se utilizaron como controles en estos
con cebadores aleatorios (Invitrogen). Los cambios en el receptor de la serotonina
experimentos.
1A
(5Htr1a; NM_008308.4; Mm00434106_s1), triptfano hidroxilasa
Para determinar los perfiles de expresin de genes de la placenta despus del estrs
(Tph2; NM_173391.2; Mm00557717_m1), y transportador de serotonina
Recogida
prenatal, de tejido de la placenta
(SLC6A4; NM_010484.1; Mm00439391_m1) se midieron utilizando
presas expuestas a estrs durante los primeros 7 das de gestacin y las presas a la
cuantitativa en tiempo real PCR y TaqMan Gene Expresin Ensayo (APizquierda
-Actina (Actb; NM_007393.3; IMPLCITAS Biosystems).
imperturbable murieron 12 das despus de la presencia de tapn de la cpula. Esta
Adems,
vez
Mm00607939_s1) tambin se midi para cada muestra como un endgena
punto fue escogido porque en el da embrionario 12, la formacin de la placenta es
control, y el umbral de ciclo se ha deducido del umbral de destino
completo. Tejidos de embriones fue salvado para el aislamiento de ADN y placentas
valor. Todas las muestras y los controles se prepararon en pocillos duplicados de
fueron
una
se congelaron inmediatamente en nitrgeno lquido para el aislamiento de ARN.
Placa de 96 pocillos y se analizaron utilizando el Applied Biosystems 7500 Fast
Como anteriormente
Realdescrito, la RT-PCR usando cebadores especficos para Sry (5-GAGTACASystem Time PCR. Se utiliz el nmero de ciclo en el umbral (valor CT)
GGTGTGCAGCTCTA-3 y 5-CAGCCCTACAGCCACATGAT-3)
para los clculos de la cantidad relativa de las molculas de ARNm. El valor de CT
se han utilizado para identificar el sexo de los embriones individuales (Zwingman et
cada objetivo de genes se normaliz por la resta del valor de CT
al., 1993).
Ciclos trmicos condiciones fueron 98 C durante 30 s, 54 C durante 40 s, 72 C
durante 50 s
para 30 ciclos.

Serotonina tratamiento inhibidor de la recaptacin

9058 J. Neurosci. 3 de septiembre de 2008 28 (36)

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Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino

Prenatal Temprana

los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vas para el sexo de la progenie y
PS. Para
De cada camada, una placenta de un embrin masculino y una placenta
a partir de un embrin femenino se aadieron a reactivo TRIzol (Invitrogen) y selos estudios de preferencia y de corticosterona de sacarosa, se analizaron los datos
con da como un factor de medidas repetidas. Un ANOVA de dos vas para el PS y
sonicada brevemente antes de aislamiento total con cloroformo y la precipitacin
exposicin al estrs agudo determinado significado de los datos de prueba de
con isopropanol. ARN fue resuspendido en agua libre de ARNasa y consacarosa-estrs.
concentracin medida en un espectrofotmetro (Eppendorf).
El efecto de citalopram en el comportamiento de la descendencia en el ensayo de
suspensin de cola
PCR anlisis conjunto de los nutrientes de la placenta y el transporte se analiz mediante un ANOVA de dos vas para el PS y el tratamiento de drogas.
Bonferde oxgeno
Se utiliz la prueba-roni comparaciones mltiples post hoc para el control de la
ARN
(750 ng) fue
transcrito a cDNA utilizando la RT 2 primera cadena synla expresin
gnica
basura
kit tesis (C-03; SuperArray Bioscience) y se analizaron mediante el ratn
efectos. Para los estudios bioqumicos, moleculares, y de metilacin, un macho
va de sealizacin de la hipoxia array PCR (PAMM.032; SuperArray Bioy la hembra por camada fueron elegidos al azar para el anlisis, y Fisher
ciencia) y el SYBR verde Master Mix 2 RT PCR (SuperArray BioPLSD post hoc prueba determinada influencia de PS. Para la PCR de la matriz de
la ciencia). Cada serie consta de 84 genes que se sabe estn involucrados en el
respuesta hipxica, la diferenciacin celular, y el metabolismo, as como 12 SE-datos, genes
cuencias para el control de carga y calidad de cDNA [ADN plsmido pUC18 mostrando 2 veces cambios fueron analizados por un ANOVA de dos vas para el
sexo
como control negativo; actina, peptidilprolil isomerasa A, y
y PS para determinar los efectos principales. PLSD de Fisher post hoc prueba con
deshidrogenasa gliceraldehdo-3-fosfato para la carga]. El valor CT
una
se utiliz para el clculo de la cantidad relativa de las molculas de ARNm. El CT
reducido pse utiliz el valor de 0,01 para controlar para comparaciones mltiples.
valor de cada gen diana se normaliz por sustraccin del valor CT
Dobla los cambios se calculan con relacin a los controles no acentuadas para
Resultados
del promedio de los cinco genes de limpieza. Este valor se define como la
hombres ydel comportamiento
Anlisis
CT. Se calcul el cambio cuantitativo relativa utilizando la frmula
placentas
femenino.
Seposibles
llev a cabo
todosen
loselanlisis
utilizando
Para
determinar
los
efectos
tiempoestadsticos
y el sexo-especficas
de
2 (control CT E-PS CT) (n 4).
Statview
PS en
SE (Abacus Concepts).

Placenta aislamiento de ARN

hijos adultos depresin y comportamientos similares a la ansiedad,

hombres y
descendencia femenina destac durante principios, mediados, finales de la
Inflamacin de la placenta y la maquinaria epigentica
gestacin, o unanlisis de expresin
controles estresados se examinaron para las respuestas de estrs de
ARN (750 ng) fue transcrito a cDNA utilizando el superndice III Firstcomportamiento
Reactivo del Sistema de sntesis (Invitrogen). Los cambios en la necrosis del tumor
en la prueba de TST, FST, y campo abierto. Hubo un principal significativo
factor (TNF; NM_013693.2; Mm99999068_m1), interleucina-6 (IL-6;
efecto del PS (F (3,33) 3,9; p0,05) (fig. 1 Una) y una significativa
NM_031168.1; Mm01210733_m1), ADN metiltransferasa 1 (DNMT1;
la interaccin entre el sexo y PS tratamiento (F (3,33) 2,95; p
NM_0107883.3; Mm01151062_g1), Metil transferasa ADN 3a
0,05) (fig. 1 Una) el tiempo dedicado inmvil en el TST. Los varones ex(DNMT3a; NM_007872.4; Mm00432870_m1), y metil-CpG
La unin a protenas-2 (MeCP2; NM_010788.3; Mm00465017_m1) eran como-planteada a E-PS pasaron significativamente ms tiempo inmviles en
comparacin
evalu utilizando TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) (n
con machos de control ( p0,01) (fig. 1 A). Ningn efecto significativo de
4 -5). Adems,-actina (Actb; NM_007393.3; Mm00607939_s1) era
medido para cada muestra como control endgeno, y el ciclo
PS fue evidente en las mujeres (F (3,17) 0,8; p0,49).
umbral se resta del valor umbral objetivo. Todas las muestras y
En la FST, hubo un efecto principal significativo del PS a tiempo
los controles se prepararon en pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos ypasado
se
inmvil (F (3,26) 5,2; p0,05) y una significativa interanalizaron
accin entre PS y el sexo (F (3,26) 2,8; p0,05). E-PS masculina
utilizando el Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Los datos
descendencia pas mucho ms tiempo inmvil que el control
fueron
varones ( p0,01) (fig. 1 B). En esta prueba, el aumento del tiempo
normalizada a la actina y analizada por TC con base en veces de cambio clculo
dedicado
ciones toman de los datos del ciclo umbral primas, como se describi anteriormente.
inmvil el resultado de una disminucin significativa en el tiempo pasado
escalada (F (3,26) 4,25; p0,01) (fig. 1C) y una tendencia para
Anlisis de transferencia
tiempo dedicado natacin (F (3,26) 3,1 disminuido; p0,06) (fig.
1D),deindicando un efecto especfico del sexo de la primera PS en la
Western
Como evaluacin bruto de los posibles cambios especficos de sexo en el cerebro
desarrollo
catecolMent despus del estrs prenatal temprano en la gestacin, los niveles de
amina y los sistemas de neurotransmisores serotonina. No significativo
neurofilamentos-1
efecto del PS a tiempo inmvil pasado estuvo presente en las mujeres
(NF-1) se compararon entre E-PS y el control, las cras machos y hembras
fuera de la
en la maana (9:00-10 a.m.) del da postnatal 1 (el da en que
una camada estaba presente). Un macho y una cra hembra fueron asesinados,muelle
y el (F (3,13) 0,7; p0,51) (fig. 1 B).
Anlisis de los pasos centrales de la prueba de campo abierto no revel
todo el cerebro se retir y se congel rpidamente. En los hijos adultos (4
efecto del PS (F (3,31) 0,14; p0,92) o el sexo (F (1,31) 1,1; p
meses de edad), 500 mg de tejido que abarca la corteza prefrontal derecha
se escindi con la ayuda de la referencia atlas de cerebro de ratn (Paxinos y 0,31) (fig. 1 E). Para determinar si TST y FST resultados fueron
Franklin, 2001) (aproximadamente 4,20 bregma -3,20 mm) y congelado en
afectados por los cambios en la capacidad locomotora, lnea completa
mecanicista de la influencia de la atencin prenatal
nitrgeno lquido. Los anlisis bioqumicos se realizaron como se ha descrito Determinacin
cruza durante
temprana
previamente
Se midi la prueba de campo abierto. No hubo EF-significativa
viamente (Bale et al., 2003). Brevemente, el tejido se homogeneiz y protenaspresin sobre los hijos varones
defectos de PS tratamiento (F (3,31) 0,164; p0,03) (fig. 1 F) o el sexo
extrada. Todas las protenas se ha ejecutado a 30 g por carril. Los anticuerposPrueba de preferencia de sacarosa
(F (1,31) 1,3; p0,27) (fig. 1 F).
utilizados fueron
Para determinar si los comportamientos de mala adaptacin para afrontar
neurofilamentos-1 (150 kDa; 1:1000) (Millipore Bioscience Investigacin Re- el estrs disagentes) y el factor de crecimiento endotelial vascular (42 kDa; 1:1000) (Santa
interpretado por los hombres E-PS en el TST y FST reflejan un depresivoCruz Biotechnology). Todos los blots fueron despojados y volvieron a incubar con
como
-Actina (Sigma) para controlar los errores de transferencia o muestra de carga.
Los anlisis densitomtricos se realizaron utilizando IPLab (BD Biosciences / fenotipo, el estado hednico de estas cras se evalu en un
Scanalytics). Una regin de inters se ha elaborado en torno a una banda en latarea preferencia sacarosa. Machos E-PS mostraron una disminucin de la
pelcula,
ingesta
y una regin idntica se usa para medir densidades para cada postede 1% de sacarosa en comparacin con el control de la descendencia
banda frecuente en esa mancha. Comparaciones de datos crudos fueron slo dentro
masculina (F (1,179)
de
8,2; p0,05) (fig. 2 A). El aumento de la concentracin de sacarosa al 5 o
cada
mancha.
El anlisis
estadstico
10% mejor la preferencia disminuida de machos E-PS
Todos los estudios fueron realizados por un investigador ciego al sexo y PS trata(F (1179) 1,5; p0,85) (fig. 2 A).
Ment grupos. Para determinar el sexo y el peso especfico temporal del PS,
El peso corporal, la ingesta de alimentos y el consumo de agua se monmonitoriza semanalmente durante las pruebas de preferencia de sacarosa
(Tabla 1). Prenaestrs tal no afect significativamente el peso corporal (F (1168) 3,5;

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9059

Figura 1. Machos E-PS mostraron desadaptativa responsividad conductual del estrs

en la suspensin de la cola
y oblig a las pruebas de natacin. Las cras machos y hembras nacidos de madres
no acentuadas [de control (C)] o presas
expuesto a PS durante la primera (E), mid (M) o tarda (L) de gestacin fueron
comparados. A, B, Machos E-PS
pasaron significativamente ms tiempo inmvil en un ensayo de suspensin de cola
(A) y una prueba de natacin forzada (B)
Figura 2. Machos E-PS mostraron disminucin de la conducta hednica basal y el
en comparacin con los varones de control (* p 0,05). C, Machos E-PS pasaronaumento de la tensinsignificativamente menos tiempo subiendo
inducida por atracones sacarosa. La anhedonia de machos E-PS fue examinada en
en comparacin con los varones de control en la prueba de natacin forzada (*una
p prueba de preferencia sacarosa.
0,05). D, No hay diferencias significativas
Una, Machos E-PS muestran una disminucin significativa en la preferencia de
en el tiempo se detectaron natacin pasado entre el control y prenatalmente subray
sacarosa a una concentracin baja
hombre (Cuadro
o mujer 1, arriba), la comida (F (1168) 1,3; p0,05) (Tabla 1,
p0.05)
en comparacin con la tecla Ctrl (n 16) descendencia masculina (* p 0,05; n16). B, C,
descendencia.
E, F, No
encontraron
diferencias
en la1,
prueba
de campo abierto
medio), o de agua
(Fse
(1168)
1,2; p0.05)
(Cuadro
abajo)
Dosa horas (B) y
cruces
a
la
arena
central
ingesta. Durante el perodo de 5 semanas, el peso corporal en ambosveinticuatro horas (C) despus de un estrs agudo, los machos E-PS consumen
(E)
o el nmero total de lneas cruzadas (F). Los datos son la media SEM. n4 - significativamente
6 de.
ms del 10% sugrupos
Crose de control (* p 0,05) y sin molestias E-PS (#p0,05) de los hombres despus de
aumentado en comparacin con los pesos iniciales (F (5,168) 13.5; p0,05)
una noche
(Tabla 1, arriba), mientras que los alimentos (F (5,168) 18.5; p0,05) (Tabla
restriccin
sacarosa
(n 8).
D, E, Durante
el acceso
continuo
de sacarosa,
unala
Para el de
control
de los
efectos
del estrs
durante
la sacarosa
durante
1,
exposicin de estrs agudo hizo
noche
medio) y agua (F (5,168) 2,4; p0.05) (Cuadro 1, abajo)
no influir en 2 h (D) o 24 h (E) 10% de sacarosa para el control de admisin o
restriccin,
la ingesta
de 2 y 24 h despus de estrs agudo
ingesta disminuy.
machos E-PSse
(ncompar
4). Los datos
son
Prueba de esfuerzo sacarosa
la
exposicin
significa
SEM. en condiciones de acceso continuo. E-PS (F2 h (1,27)

Para evaluar el efecto de E-PS y el estrs agudo en la bsqueda de 1.2, p0,3; F24 h (1,27) 0,9, p0,5) y de estrs agudo (F2 h (1,27)
recompensa
1.8, p0,3; F24 h (1,27) 0,9, p0.5) no influy en 2 h
comportamiento, sacarosa se elimin durante 24 h. Los ratones fueron(Fig. 2 D) y 24 h ingesta de sacarosa (Fig. 2 E).
expuestos a un
estresor o deja en paz antes del regreso sacarosa aguda. La sacarosaTratamiento con ISRS
Debido a que los varones E-PS exhiben conductas similares a la depresin
la ingesta se midi durante 2 y 24 h. Hubo una significativa
el TST,
principal efecto de la exposicin al estrs agudo (F (1,27) 13,2; p0,05)en
(fig.
FST, y las pruebas de sacarosa, se compararon las respuestas de
2B) y una interaccin entre E-PS y la exposicin de estrs agudo
comportamiento a un
el 2 de ingesta h sacarosa (F (1,27) 5,3; p0,05) (fig. 2 B) y 24 h
aguda
admisin (F (1,27) 4,1; p0,05) (Fig. 2C) despus de la sacarosa durante
la ISRS. Un efecto principal de E-PS estuvo presente (F (1,29) 4,3; p
0,05), lo que indica que los machos E-PS tratados con vehculo pasaron
noche
restriccin. Durante la 2 h despus de estrs agudo, los machos E-PSsignificonSUMED significativamente ms sacarosa que los machos de control (cativamente ms tiempo inmvil que los controles tratados con vehculo ( p
0,01) (fig. 3A). Tambin hubo un efecto principal de citalopram tratamiento
p0,05)
(Fig. 2 B) y machos E-PS no perturbados ( p0,05) (fig. 2 B). Encima Ment en tiempo pasado inmvil (F (2,29) 3,9; p0,05) (fig. 3A).
La administracin aguda de 2,5 mg / kg de citalopram 30 min antes de la
24 h, el consumo de estrs expuestos machos E-PS sigue siendo
pruebasignificativamente
cin mejor la diferencia significativa en el tiempo pasado inmvil
elevada en comparacin con los controles ( p0,05) (fig. 2C).

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9060 J. Neurosci. 3 de septiembre de 2008 28 (36)

:9055-9065

Tabla 1. Pesos corporales medios y alimentos y la ingesta de agua diaria cada semana durante las pruebas
de preferencia de sacarosa
Comienzo
1
2
3
4
5
Peso corporal (g)
Ctrl
27.2 0.5
E-PS
25.9 0.5
La ingesta de alimentos
diaria (g)
Ctrl
E-PS
Ingesta de agua diaria (g)
Ctrl
E-PS

27.8
26.7

0.5
0.6

27.0 0.5
26.3 0.6

28.0 0.3
26.9 0.6

29.1 0.5
27.0 0.9

4.0
4.1

0.3
0.3

4.0
3.8

0.4
0.3

4.0
3.8

0.4
0.4

3.4
3.5

0.6
0.3

3.4
3.3

3.1
4.1

0.8
0.3

3.8
4.1

0.6
0.3

3.4
4.5

0.3
0.3

4.5
3.5

0.4
0.3

4.5
3.2

Tratamiento

29.1 0.51
27.5 0.9

Da

F(1168)

3.5

F(5168)

13.5 *

0.4
0.8

F(1168)

1.3

F(5168)

18.5 *

0.4
0.3

F(1168)

1.1

F(5168)

2.4 *

* P 0.05.

entre E-PS y de control tratado con vehculo machos ( p0,7) (fig.

Eje HPA subrayan respuesta
3A), mientras que la administracin de 10 mg / kg disminuy
Debido a una mayor sensibilidad al estrs es un componente bsico de
significativamente
afectotiempo dedicado inmvil durante ratones control y E-PS ( p0,05) (fig. trastornos TIVE, los niveles de corticosterona se compararon entre E-PS
3A). Un efecto principal de citalopram (F (2,29) 8,2; p0,05) (Fig. 3B) y control de los adultos descendencia masculina despus de una
y una interaccin significativa entre el citalopram y el E-PS (F (2,29) exposicin al estrs 15 min.
4,4; pNmero 0.05) (Fig. 3B) influenciado de la inmovilidad
Tratamiento de estrs prenatal temprano (F (1,18) 9,2; p0,05) y 15
combates. E-PS machos tratados con vehculo mostraron
exposicin al estrs min (F (3,20) 14,2; p0,05) significativamente alterada
significativamente ms
los niveles de corticosterona. E-PS no influy en la lnea de base
episodios de inmovilidad que los controles tratados con vehculo ( p0,01)
corticoste(Fig. 3B). La administracin aguda de SSRI a 2,5 mg / kg
niveles Rone. Machos E-PS han elevado significativamente corticosterona
significativamente
niveles despus de 15 minutos de la moderacin (tiempo de 15; p0,05), y
disminucin de episodios de inmovilidad mostradas por los machos E-PS
15 min
(
p
despus del fin de la tensin (tiempo de 30 min; p0,05) (fig. 5C). La
0,05) (Fig. 3B), pero no afect a los hombres de control ( p0,8) (fig. recuperacin de los
3B). La administracin de 10 mg / kg disminuy significativamente
Machos E-PS parecan ser retrasado, con los niveles de corticosterona 45
GR in situ hibridacin
episodios de
minutos despus de finalizar el estrs permaneciendo elevada ( p0,07) (fig.
E-PS disminuy significativamente la expresin de GR en el CA3 ( p
inmovilidad tanto para el control y los machos E-PS ( p0,05) (Fig. 3B).5C).
0,05) y DG regiones del hipocampo ( p0,05) (fig.
Tambin se midi la latencia a la primera pelea de la inmovilidad. Hubo
5D, E). Una reduccin no significativa tambin fue visto en CA1 despus
un efecto principal de E-PS (F (2,29) 15,5; p0,05) (fig. 3C) y un
estrs prenatal temprano ( p0,06) (fig. 5 D, E). No hay diferencias fueron
efecto principal significativo del tratamiento con citalopram (F (2,29) 4,4; p
detectado en la regin CA2 ( p0,4) (fig. 5 D, E).
0,05) (Fig. 3C) en la latencia de la primera pelea de la inmovilidad. Apoyar
nuestro
los resultados anteriores, los hombres E-PS tratados con vehculo
El anlisis de la metilacin del ADN de CRF, GR y BDNF genes
mostraron una menor
la latencia a la primera pelea de la inmovilidad ( p0,01) (Fig. 3C). ParaDado
E- que los estudios anteriores han demostrado que la experiencia de
vida temprana puede
PS
altera el epigenoma, investigamos si los cambios en metilvarones, tanto 2,5 mg / kg de citalopram ( p0,05) (Fig. 3C) y 10 mg / kg
acin conducan expresin alterada de CRF y GR (Weaver,
aument
significativamente
la
latencia
para
la
primera
pelea
de
la
La serotonina transportador autorradiografa
inmovilidad
( p0,05)
Para
examinar
los posibles efectos de la E-PS en los niveles de SERT2004a).
que En el hipotlamo, el anlisis de la metilacin de citosina-dentro de
(Fig. 3B).
Para los hombres de control, no hubo un efecto de 2,5 mg / el
kgpromotor CRF revel efectos principales de la posicin de base par (F
pueden
ser
citalocontribuyendo al aumento de la sensibilidad de ISRS en los hombres, (8,51)
44.25; p0,05) y la exposicin al estrs prenatal temprano (F (1,51) 4,35;
cochecito de nio ( p0,3) (Fig. 3C) o 10 mg / kg de citalopram ( p0,2) (fig.
SERT
p0,05)
con una reduccin de la metilacin en los hombres E-PS ( p0,05)
3C)
Se midieron los niveles de autorradiografa. Machos E-PS mostraron una
en la latencia
de la primera
de la
reduccin
significativa
en lospelea
niveles
deinmovilidad.
SERT en el CA1 (F (1,7) 25,6;(fig.
p
6A). No hay diferencias en la metilacin entre el estrs prenatal trata0,05) y CA2 (F (1,7) 7,6; p0,04) (fig. 4 A, B) regin de la
hipocampo en comparacin con los sujetos control. No hay diferenciastos fueron evidentes dentro de la regin analizada de la intrn CRF (F
(1,51)
fueron
1,35; p0,4) (figura 6B). Anlisis de los niveles de metilacin dentro de la
presentes en el hipotlamo (F (1,7) 0,8; p0,4), septum lateral
exn 17 regin del promotor GR revel efectos principales significativos
(F (1,7) 2,7; p0,16), o regiones CA3 del hipocampo (F (1,7)
de la posicin de base par (F (8,51) 10,5; p0,05) y E-PS (F (1,51)
2,0; p0,2).
Dorsal
del rafe TPH2, SERT, y el anlisis de la expresin de 5-HT1A
4,35; p0.05) con el aumento de la metilacin en los hombres E-PS ( p0,05)
Debido a que el rafe dorsal proporciona entrada serotoninrgico al hip(Fig. 6C). Sin efecto de E-PS fue evidente en la regin promotora del
hipocampo, los niveles de expresin de TPH2, receptor de serotonina 1A
BDNF (F (1,51) 0,75; p0,7) (Fig. 6D). De manera similar a los efectos de la
(5 hipoHT1A), y SERT se midieron en golpes del rafe dorsal por
tejido talmico, en el ADN aislado a partir del ncleo central de la
PCR cuantitativa en tiempo real. La expresin de genes mostr una
amgdala, el anlisis de la metilacin de citosina-dentro del promotor de
aparente aumento de TPH2 expresin (F (1,7) 5,7; p0,06)
CRF
(Fig. 4 B). No hay diferencias en SERT (F (1,7) 0,9; p0,4) (Fig. 4C)
revel efectos principales de la posicin de base par (F (8,50) 34,5; p0,05)
o 5-HT1A (F (1,7) 0,3; p0,7) (fig. 4 D) de expresin se
y la exposicin al estrs prenatal temprano (F (1,50) 3,65; p0.05) con
presente.
reducida metilacin en los hombres E-PS (336 pb: Ctrl 67,2 2,8,
E-PS 62,1 2,5; 232 pb: Ctrl 58.2 3.3, E-PS 62,9 4,8;
CRF in situ hibridacin
Debido a la capacidad de respuesta de estrs puede ser regulada por 226 pb: Ctrl 52.5 2.4, E-PS 52,4 3,8; 212 pb: Ctrl
73.6 3.1, E-PS 64,9 5,4; 147 pb: Ctrl 45.1 7.0, E-PS
CRF, que examen36,2 5,49; 101 pb: Ctrl 42.2 8.0, E-PS 37,8 4,98; 95
ined expresin CRF por in situ hibridacin. En el nu-centro
pb: Ctrl 35.8 9.6, E-PS 19,7 3,25; 79 pb: Ctrl 42.8
Cleus de la amgdala, los machos E-PS mostr una elevacin significativa
en la expresin en comparacin con los controles ( p0,01) (fig. 5 A, B).9.0, E-PS 37,5 5,3; 55 pb: Ctrl 28.8 3.6, E-PS 24.5
1,3; 36 pb: Ctrl 24.9 2.6, E-PS 18.8 2.6).

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9061

Figura 4. Machos E-PS mostraron niveles de transportador de serotonina alterados.

A, B, Machos E-PS mostraron
una reduccin significativa en los niveles de SERT en la regin CA1 del hipocampo
en comparacin con
machos de control (* p 0,05). C, PCR en tiempo real realizado en micropunches rafe
dorsal reveladas
ningn efecto significativo de E-PS en la expresin TPH2 ( p0,06). D, E, No se
Figura 3. Machos E-PS mostraron una mayor sensibilidad a tratamiento agudo detectaron
ISRS.
diferencias
A-C, En una cola
En
comparacin
con (E)
las expresin
placentasende
masculino
de control,
E-PSSEM.
en SERT
(D) o 5-HT1A
el sexo
rafe dorsal.
Los datos
son la media
prueba de suspensin, los machos E-PS pasaron ms tiempo inmvil (A), muestran
n4 -5. Hpc, masculinos
placentas
un mayor nmero de
Hippocampus;
Hypo, elregulacin
hipotlamo.de PPAR (4,7 veces; p0,01)
mostr significativa
episodios de inmovilidad (B), y mostr una latencia se redujo a la primera pelea de la
(Fig. 7A), IGFBP-1 (8,1 veces; p0,01) (fig. 7A), de GLUT4 (3,6inmovilidad (C) en comparacin
p0,01) (fig. 7), y HIF3A (2,9 veces; p0,01) (fig. 7A).
con machos de control (** p 0.01). Para los varones E-PS, una dosis subumbraldoblar;
de
Por el contrario, E-PS placentas de mujeres mostraron downregu
2,5 mg / kg de citalopram
significativa
redujo significativamente los episodios de inmovilidad (B) y la latencia a la primera
pelea de la inmovilidad (C #;p
lacin de PPAR (3,2 veces; p0,01), y una downregu-trending
0,05) en comparacin con el vehculo. El citalopram (10 mg / kg) redujo
lacin de IGFBP-1 (4,7 veces; p0,06) en comparacin con las mujeres
significativamente el tiempo pas inmvil
placentas de control. Para obtener una lista completa de los genes y
y episodios de inmovilidad para el control y los machos E-PS (#p0,05; # #p0,01)doblar
en
los cambios,
comparacin
PCR
anlisiscon
conjunto de la placenta de la expresin gnica
vanse
los cuadros complementarios 1 y 2 (disponible en
vehculo.
C, Citalopram
(10 mg / kg)subyacente
tambin aument
significativamente
la latencia
Para
determinar
el mecanismo
de conducir
el sexo-especfica
www.jneurosci.org
Placentario
TNF y anlisis de la expresin de IL-6
de
la
primera
pelea
de
la
inmovilidad
efectos del estrs prenatal temprana, control y E-PS da 12 placentas
comoexpresin
material suplementario).
para
los varones
E-PS (#p0,05).
Los datos
sonexaminadas
la media SEM.usando
n8.
TNF
no se alter por sexos de las cras ( p0.8) o
embriones
de hombres
y mujeres
fueron
una PCR

E-PS ( p0,13) (fig. 7B). IL-6 expresin no se alter por el sexo

enfocado
(p0.4) o E-PS ( p0,07) (Fig. 7C).
array. E-PS, sexos de las cras, y una interaccin entre la descendencia
el sexo y el E-PS influenciado significativamente la expresin placentaria
Placentario DNMT1, DNMT3a, y anlisis de la expresin de MeCP2
de perExpresin DNMT1 fue alterada por la descendencia de sexo (F (1,11) 5,4;
oxisome receptor activado por el proliferador (PPAR), similar a la insulina
p0,05)
factor de crecimiento de protena 1 (IGFBP-1), transportador de glucosa
4 y E-PS (F (1,11) 4,8; p0,05). Control masculino plade unin
(GLUT4), y el factor de 3a-inducible por hipoxia (HIF3A) (Tabla 2).

9062 J. Neurosci. 3 de septiembre de 2008 28 (36)

:9055-9065

Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino

Prenatal Temprana

Figura 5. Machos E-PS muestran estrs desregulacin va incluyendo el aumento de

Cea CRF,
disminucin del hipocampo GR, y un aumento de la respuesta de estrs del eje HPA.
A, B, E-PS significativamente
aumento de la expresin de CRF en el ncleo central de la amgdala en comparacin
con los controles (* p
0,05; n4). C, Los niveles de corticosterona despus de un estrs por inmovilizacin
15 min fueron significativamente mayores en
Machos E-PS comparados con los controles (* p 0,05; n6). D, E, De expresin de GR
fue significativamente
menor en los varones E-PS en comparacin con los controles en la CA3 y DG del
Figura 6. Las alteraciones en la metilacin del ADN de la IRC y GR en los hombres
hipocampo dorsal (p *
E-PS correlacionados con direccentas
menor expresin
que el (cional cambios en los patrones de expresin de genes. Una, El anlisis de metilacin
0,05). Latuvieron
aparentesignificativamente
disminucin en la expresin
de GR CA1de
no DNMT1
fue significativa
control
p0,07; n5). No
de los 10 dinucletidos CpG
efecto
de E-PS
se observ
en CA2.
Los7D).
datosAdems,
son la media
SEM.
Hpc,
dentro del promotor de CRF (336 a 36 pb) revel una disminucin significativa en la
placentas
femeninas
( p0,01)
(Fig.
E-PS
significatiHippocampus.
aumento tivamente expresin DNMT1 en placentas de mujeres ( p metilacin en
citosinas especficas en varones E-PS comparacin con los varones de control (* p
01) (fig. 7D), pero no las placentas masculinos ( p0,15) (Fig. 7D).
0,05). B, No hay cambios en
DNMT3a expresin no se alter por el sexo ( p0.1) o E-PS
metilacin fue evidente en la regin intrnica CRF (79 -248 kb). C, Una disminucin
(p0,1) (Fig. 7E). Expresin MeCP2 no fue alterada por el sexo
significativa en
(p0.9) o E-PS ( p0,2) (Fig. 7F).
metilacin
en citosinas
especficas en
varones
E-PSmostraron
en comparacin
con los sujetos
el desarrollo
de la vasculatura.
Machos
E-PS
una disminucin
control se detect en
significativa
Anlisis de transferencia Western
la regin del promotor GR (578-490 pb) (* p 0,05). D, No hay cambios en la
cerebro NF-1 ( p0,05) (fig. 8 A). No hay efecto de la primera
Como evaluacin bruto de posibles demoras propias de cada sexo enen
el todo elfueron
metilacin
estrs
prenatal
se observ
en (111
las mujeres
de BDNF.
NF-1 los
( p0,7)
(fig. 8
cerebro dedetectado
en la regin
promotora
a 24 pb) del
Losniveles
datos son
la media
SEM. n4.
desarrollo despus del estrs prenatal temprano en la gestacin, los B).

No se encontraron diferencias entre los grupos a los 4 meses de edad en

niveles de NF-1
NF-1 en la corteza prefrontal ( p0,8) (Fig. 8C). Prenatal temprano
se compararon en da postnatal 1 cerebros de E-PS masculino y femenino
el estrs no influy significativamente en el da postnatal 1 macho ( p
cachorros. Adems, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
0,7) (fig. 8 D) o mujer ( p0,9) (fig. 8 E) Niveles de VEGF.
se examin para determinar la influencia del estrs prenatal en la

Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino

Prenatal Temprana

J. Neurosci. 3 de septiembre de 2008 28 (36) :9055-9065

9063

Tabla 2. Efecto de la E-PS y la descendencia de sexo en la expresin de

genes en la placenta
da 12 de gestacin
Gene
E-PS
Sexo
Sexo E-PS
IGFBP-1
PPAR
GLUT4
HIF3

F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)

0.8
0.1
49.6 *
63.6 *

F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)

37.9 *
41,2 **
205.1 **
3.8

F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)
F(1,10)

7.0 *
5.6 *
51.2 *
5.7 *

* P 0,05; ** p 0.001.

respuestas
de supervivencia
de laen
descendencia
masculina
femenina
Figura
8. Disminuciones
significativas
el cerebro NF-1
los nivelesyen
los hombres
E-PS
soportan
retraso CNS deexpuesta
al estrs
desarrollo.
Como
marcador fueron
bruto deexaminados
desarrollo delinicialmente
cerebro, comparamos
NF-1 los si
a travs de
la gestacin
para determinar
niveles
de postnatal
especificidad
temporal puede ser la base de una vulnerabilidad del sexo
da
1 macho y la descendencia femenina. Una, Niveles de todo el cerebro de NF-1 se
dependiente
redujo significativamente en
al
estrsE-PS
prenatal.
Machos
compararon con los niveles masculinos de control en el da postnatal 1
cras
expuestos a E-PS exhibi desadaptativa compor(** Las
p 0.01).
B, machos
NF-1 los niveles
tamientos,
tanto enentre
la suspensin
de la cola
y las
pruebas
deNiveles
natacin
no
fueron diferentes
E-PS y Ctrl hembras
al da
postnatal
1. C,
corteza
forzada. Aunque
prefrontal
de
NF-1 node
fueron
diferentesen
entre
E-PS ymostraron
control de los
adultos
sexo masculino
controles
las mujeres
general,
una
mayordeinmovilidad
(16 semanas). D, E, No hubo
comefecto
significativo con
de E-PS
en VEGF en
varonesprenatal
(D) o mujer
el da
postnatal
1
en comparacin
los varones,
el estrs
no (E)
alter
an
ms los
cerebros. Los datos son
esfuerzos de policas
significa SEM. n3 - 4.
ing respuestas. Debido a las diferencias de sexo existentes en estos
pruebas, un efecto techo pudo haber impedido el estrs prenatal de
alterar an ms los resultados femeninos. Curiosamente, nuestros datos
corresfinales con los hallazgos clnicos recientes que muestran el estrs
temprano en
embarazo aument la presencia de la esquizofrenia en los hombres, supportar un riesgo especfico para el sexo temprano en el desarrollo
(Khashan et al.,
Figura 7. E-PS placentas masculinos mostraron cambios robustos en la expresin
de Aunque nuestros estudios anteriores han informado de efectos de
2008).
genes crticos para la
estrs durante los momentos de la gestacin adicionales sobre los
crecimiento y seales de desarrollo. Una, E-PS placentas masculinos mostraron
parmetros de
upregulation significativo de
aprendizaje
y la memoria y la regulacin del balance energtico (Mueller
PPAR, IGFBP-1, GLUT4, y HIF3 compar con las placentas de control masculinas
(*
y Bale, 2006, 2007), nuestros resultados actuales revelan una
p 0,01). En
vulnerabilidad de
Por el contrario, E-PS placentas de mujeres mostraron regulacin a la baja
significativa de PPAR (* p 0,01) y
va de la tensin de programacin especfica para el embarazo temprano.
una regulacin a la baja tendencia de IGFBP-1 ( p0,06) en comparacin con las Debido a que el macho E-PS aumenta la inmovilidad en la cola susplacentas de control de sexo femenino. B,
pruebas de pensiones y de natacin forzada era sugestivo de una
C, TNF (B) y la IL-6 (C) los niveles de expresin no se alter significativamente depresin
por
similar
sexo o E-PS (n 5).
fenotipo,
que
tambin examin la sensibilidad hednica en estos ratones
D, En nuestro anlisis de las diferencias de sexo en la maquinaria epigentica de la
usando una prueba de preferencia sacarosa (Moreau, 1997). E-PS
placenta, el control de placentas masculinos
varones exmostraron significativamente menor expresin de DNMT1 comparacin con
prohibida su preferencia disminuido por una solucin de sacarosa al 1%,
placentas
de mujeres de control
Discusin
(#p0,01). E-PS aumento de la expresin de DNMT1 en placentas de mujeres (*sugiriendo
p
La
mortalidad
y la morbilidad
resultante de neurodesarrollo
0,05).
No hay efecto
de
gesting una sensibilidad disminuida a la basal recompensas hednicos.
yE-PS
los se
trastornos
del
estado
de nimo
se ha mantenido
prcticamente
sin
detect en
niveles
DNMT1
masculinos.
E, F, DNMT3a
(E) y (F) MeCP2
Cmocambios
niveles
dedurante
expresinla ltima
Alguna vez, una exposicin de estrs agudo inducido machos E-PS para
no
alter
significativamente
por el sexo
E-PS
(n 4). Los
son la media
50 se
aos
(Insel
y Scolnick, 2006).
Dadao la
dificultad
dedatos
tratamiento
consumir
SEM.
cin de estas enfermedades, un enfoque interdisciplinario que identifica
100% ms de sacarosa en las 2 horas despus de una privacin sacarosa
el origen del desarrollo de las poblaciones de enfermedad y vulnerables es
comnecesario para crear nuevas estrategias de prevencin y tratamiento. La
en comparacin con los ratones de acceso continuo. La mayora de la
predisposicin a los trastornos sexuales sesgada, incluyendo esquizodiferencia
esquizofrenia, el autismo y los trastornos afectivos, se ha asociado con
entre el control y E-PS 24 h el consumo de sacarosa resultado
antecedentes fetales relacionadas con el estrs (Ward, 1991; Watson et al,
de este 2 h de admisin, indicativo de atracones inducida por el estrs re1999.;
respuestas (Lynch y Taylor, 2005; Avena et al, 2006.).
Pardo y Eberhart, 2007). Sin embargo, el mecanismo subyacente
Dado el fenotipo similar a la depresin de los varones e-PS, de
esta influencia de PS sigue siendo poco clara. En nuestros estudios, de
comportamiento
comportamiento
Se midieron las respuestas a un ISRS aguda, citalopram,. Machos E-PS
mostrado una mayor sensibilidad a una dosis subumbral de citalopram en

una prueba de suspensin de cola. Debido a que esta prueba mide

afrontamiento activo comporportamientos que son sensibles a los cambios agudos en los receptores 5HT, la
Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino
9064
J.sensibilidad
Neurosci. 3 dedetectada
septiembre en
de 2008
28 (36) E-PS puede indicar un
mayor
los hombres
Prenatal Temprana
:9055-9065
dysregulacin en las vas de 5-HT. Un examen ms detallado del sistema 5-HT en
Las alteraciones en el oxgeno y la disponibilidad de nutrientes han sido
estos ratones revel reduccin de los niveles del transportador de 5-HT en
tanel hipciados con la inflamacin (Altay et al., 2004), y porque rehipocampo y una tendencia de aumento de la triptfano hidroxilasa 2 exEstudios recientes han demostrado un vnculo importante entre la
depresin en el rafe dorsal. Por lo tanto, el potencial de aumento de la
inflamacin
produccin de 5-HT
eventos tory y el inicio de la depresin mayor (Dantzer et al.,
y la disminucin de la recaptacin puede ser la base del aumento de la
2008), las comparaciones adicionales de la placenta mark-inflamatoria
sensibilidad a
res se realizaron. Aunque no se de-sin diferencias significativas
tratamiento con ISRS aguda en estos ratones.
protegida para los niveles de TNF e IL-6 en este punto de tiempo, es entreLa desregulacin del sistema de la serotonina ha sido clsicamente
sante que placentas masculinos mostraron un cambio direccional
vinculada
sugerente
a la etiologa de los trastornos afectivos. CRF es un regulador conocido de
de una posible inflamacin despus de la E-PS que puede ser ms
Neurotransmisin 5-HT y un factor determinante de estrs responsivrobusta
dad (Valentino et al, 1991;. Bale y Vale, 2004;. Tan et al, 2004).
en diferentes puntos de tiempo embarazo.
Por lo tanto, la desregulacin de los componentes de la va de CRF y de
Para investigar ms a fondo los posibles mecanismos que subyacen a la
estrs
efecto especfico del sexo del E-PS en la expresin de genes de la
podra ser un colaborador aguas arriba a anormalidades en 5-HT transplacenta, se examisin y un fenotipo sensible al estrs. En las CEA, los machos E-PS
maquinaria INED metilacin del ADN en las placentas masculinos y
mostr un aumento significativo en la expresin de CRF. Como un
femeninos.
adicional
Curiosamente, la expresin de DNMT1, la enzima responsable de
indicacin de aumento de la capacidad de respuesta de estrs, los machos
mantenimiento metilacin, fue significativamente menor en el control
E-PS tambin exhibmasculino
tada niveles de corticosterona ms altos despus de un estrs agudo
placentas en comparacin con las placentas de control hembra,
moderacin, y
proporcionando
disminucin de los recursos genticos del hipocampo. Aunque estudios
apoyo a nuestra hiptesis de que puede comenzar la influencia del E-PS
previos han rea nivel de la placenta (Leonhardt et al., 1992). Adems,
cambios similares portados en los niveles de GR despus de estrs
aunque E-PS apareci para aumentar la expresin DNMT1 tanto
experimentado a finales de
sexos, este cambio slo fue significativa en las mujeres. Porque antegestacin, nuestros resultados indican una ventana de desarrollo anterior
OUS estudios han demostrado que el mantenimiento de la metilacin Patdurante
golondrinas de mar es fundamental en el desarrollo neurolgico y las
ING que las vas de estrs muestran una vulnerabilidad especfica del
perturbaciones en plasexo (Cratty
los patrones de metilacin del ADN Cental son fuertes predictores de fetal
et al, 1995;. Darnaudery y Maccari, 2008) '.
cambios, una elevacin inducida por el estrs de DNMT1 pueden indicar
El impacto a largo plazo del estrs prenatal sobre la regulacin de los
que
cenlas hembras son capaces de eludir los efectos del estrs por fortalecerla expresin de genes tral puede ocurrir a travs de efectos en el
ing el mantenimiento de la metilacin durante esta perturbacin
epigenoma. En
(Rivera et al, 2008;. Wang et al, 2008.).
nuestro examen de los patrones de metilacin del CRF, informamos
Estos cambios en la expresin gnica de la placenta relacionados con el
reduccin en la metilacin en citosinas especficos dentro de la identicrecimiento
cado CRF isla CpG promotor, tanto en el hipotlamo y
factores, el transporte de nutrientes, y la epigentica puede influir en el deCEA que puede contribuir al aumento de CRF detectado en estos
veloping SNC. Como marcador bruto de desarrollo del cerebro, que comratones. En nuestro examen del exn 17 regiones del GR procomparado NF-1 los niveles, desde el da postnatal 1 macho y hembra offpromotor, los machos E-PS mostraron un incremento de sitio especfico en
primavera. Machos E-PS, pero no las hembras mostraron una significativa
la metilacin
reduccin de la NF-1, el apoyo a un posible retraso en el desarrollo del
que se produjeron en la regin que contiene la secuencia consenso de
cerebroNGFI-A (factor de crecimiento nervioso inducible-A), donde la metilacin
Ment. Debido a las anomalas neuronales y retraso en el desarrollo
estado ha sido previamente vinculado a la experiencia de la vida temprana
se han asociado con el trastorno depresivo mayor y esquizoy deesquizofrenia, tales cambios en el centro de NF-1 pueden ser predictivos
expresin aumentado (Weaver et al., 2004a, b).
de futuro
Debido a que el cerebro fetal no est presente durante este perodo de
enfermedad (Reines et al, 2004;..-Miguel Hidalgo et al, 2005). No ef-'
estrs temprano, la hiptesis de que los cambios especficos del sexo fetal
se detectaron defectos de E-PS en la NF-1 los niveles en los hombres
en
adultos, indicando
el desarrollo y la sensibilidad a largo plazo pueden ocurrir a travs de accin que los hombres E-PS finalmente ponerse al da con los sujetos
ciones en la placenta, ya que se deriva de la blasto-desarrollo
control.
quiste y se somete a crtica del desarrollo durante este perodo de
En resumen, debido a que es poco probable que cualquier gen
E-PS (Hemberger, 2007). La placenta es el intermediario por
especfico
que el medio hormonal materna influye en el desarrollo
produce la diferencia en los comportamientos detectados entre el control y
embrin, y por lo tanto est a punto de ser influenciado por las
Machos E-PS, una serie de factores genticos, hormonales, y epigenticos
perturbaciones
fueron
examinados en estos estudios. Nuestros resultados apoyan la
Referencias
que ocurren temprano en el embarazo que pueden afectar el desarrollo
hiptesis
Altay
T, Gonzales ER, Parque TS, Gidday JM (2004) infla-Cerebrovascular
fetal
cin
de hipoxiaE-PS
breve de
episdica:
por neuronal
y endoque
ladespus
desregulacin
la IRCModulacin
y la programacin
va
de la tensin
durante todo el embarazo mediante la alteracin (1) de los nutrientes y el
endotelial
ntrico sintasa.
J Appl
96:1223-1230;
discusin
puede
ser de
unxido
elemento
clave para
elPhysiol
fenotipo
sensible al
estrs detectado
oxgeno trans1196.
en estos ratones macho, incluyendo el aumento de la inmovilidad en la
puerto, (2) las respuestas inflamatorias, y (3) epigentica programa- Avena NM, Rada P, Moise N, Hoebel BG (2006) alimentndose farsa sacarosa en un
cola
comunicados de horario de borrachera accumbens dopamina en varias ocasiones y
maquinaria ming. Para examinar esta hiptesis, examinamos efsuspensin y de natacin forzada pruebas, mayor capacidad de respuesta
elimina
defectos de E-PS sobre la expresin gentica de la placenta masculino la
y respuesta de saciedad acetilcolina. Neurociencia 139:813 - 820.
del eje
HPA,
femenino
Bale
TL, Valeque
WWinfluyen
(2004) y los
de5-HT.
CRF CRF:
papel
en la capacidad
de
y factores
en receptores
el sistema
Estos
estudios
proporcionan
respuesta de estrs
patrones de uso de una matriz de PCR especfico sobre los factores de
crtico
y otros comportamientos. Annu Rev Pharmacol Toxicol 44:525-557.
crecimiento y nutricin
visin mecanicista sobre la programacin subyacente de sexogenes de transporte ent. E-PS placentas machos exhiben significativaBale TL, Contarino A, Smith GW, Chan R, Gold LH, Sawchenko PE, Koob
GF, Vale WW,
Lee KF (2000)
Los ratones deficientes
trastornos
del desarrollo
neurolgico
sesgadas.para liberadora de corticotropina
aumentos en PPAR, IGFBP-1, GLUT4, y HIF3. Sorprendentemente,
receptores hormonales 2 display ansiedad-como comportamiento y son
E-PS placentas mujeres mostraron una reduccin de PPAR y
hipersensibilidadtiva al estrs. Nat. Genet 24:410 - 414.
La expresin de IGFBP-1. Debido a que los glucocorticoides aumentan la
expresin
de PPAR (Lemberger et al., 1994), y PPAR a su vez aumenta

Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrs Masculino

Prenatal Temprana

J. Neurosci. 3 de septiembre de 2008 28 (36) :9055-9065

9065

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