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potenciales
para la produccin de hidrolasas.
Becario
Rubn Montoya Lpez
Estudiante de Ingeniera Bioqumica de la Universidad
Autnoma de Aguascalientes, Mxico.
Orientador
Dr. Sindlia Freitas Azzoni / CTBE
Campinas, SP.
2012
AGRADECIMIENTOS
A Aline Tavares, por trabajar a la par conmigo en este proyecto, tambin a Aline Moreira
por todo su apoyo y asesora durante el trabajo en laboratorio y para Mateus Silva, de
quien agradezco de sus consejos.
A todo el personal del CTBE, a los investigadores por sus consejos y especialmente al
personal de apoyo a Vania y Rebeca cuya ayuda fue de gran importancia para el
desarrollo del proyecto.
A todos mis compaeros y grandes amigos becarios del programa por compartir grandes
momentos y experiencias juntos, por su compaa y apoyo durante esta gran vivencia.
A mis padres Rubn y Lourdes por todo lo que me han enseado, por estar conmigo
incondicionalmente siempre que los necesito, a ellos les debo lo que soy.
NDICE
ndice...........................................................................
ndice de Figuras......................................................................................
ndice de Tablas......................
1.0
2.0
Resumen..............
3.0
Objetivos...
3.1 Objetivo general............
3.2 Objetivos especficos.
4.0
Materiales y Mtodos....
4.1 Cepas de Bacillus sp. .....
4.2 Screening cualitativo de produccin de celulasas......
4.3 Fermentacin sumergida ....
4.3.1 Mantenimiento de las cepas de Bacillus sp. ...
4.3.2 Medios de cultivo ...
4.3.3 Preparacin de inculo..
4.3.4 Condiciones estndar de fermentacin...
4.3.5 Preparacin del extracto enzimtico....
4.4 Mtodos analticos....
4.4.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones
4.4.2 Actividad enzimtica sobre Papel filtro (FPasa).....
4.4.3 Actividad enzimtica sobre Carboximetilcelulosa (CMCasa) ......
4.4.4 Actividad enzimtica sobre Xilana (Xilanasa).....
4.4.5 Determinacin de azucares reductores por el mtodo de DNS...
4.4.6 Determinacin del contenido de protena por el mtodo de Bradford.
4.4.6 Actividad enzimtica proteoltica.......
4.5 Screening cuantitativo de produccin de celulasas.....
4.5.1 Seguimiento de la cintica de crecimiento durante las fermentaciones...
4.6 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y
hemicelulasas........
4.6.1 Efecto de la agitacin.....
4.6.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio....
4.6.3 Efecto de la fuente de carbono.
4.6.4 Efecto de la fuente de nitrgeno.....
4.7 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las
celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62..
6
7
7
7
8
9
10
10
12
14
14
14
15
15
15
16
16
16
17
17
17
17
17
18
19
19
19
20
20
21
21
Introduccin........
2.1 Definicin de las hidrolasas......
2.2 Hidrlisis de la celulosa........
2.3 Microorganismos potenciales para la produccin de celulasas.....
2.4 Ventajas de las celulasas bacterianas en comparacin a las de origen fngico........
2.5 Aplicaciones industriales de las celulasas..................................
2.6 Materiales lignocelulsicos como fuentes renovables de carbono....
2.7 Bioetanol de segunda generacin...
21
21
22
22
22
23
6.0
Resultados y Discusiones......
5.1 Screening cualitativo y cuantitativo de produccin de celulasas..
5.2 Variacin de las condiciones de fermentacin para la produccin de celulasas y
hemicelulasas.......
5.2.1 Efecto de la agitacin.....
5.2.2 Efecto de la presencia Cu+2 en el medio......
5.2.3 Efecto de la fuente de carbono.....
5.2.4 Efecto de la fuente de nitrgeno......
5.3 Optimizacin de las condiciones de reaccin para la medicin de actividad de las
celulasas y hemicelulasas de Bacillus sp. BH19 y BH62...
Conclusiones .....
7.0
Referencias Bibliogrficas... 38
5.0
24
24
27
27
29
30
31
33
37
NDICE DE FIGURAS.
Figura 2.2.1 Mecanismo de la hidrlisis de la celulosa
12
NDICE DE TABLAS.
12
1.0 RESUMEN.
Las celulasas y hemicelulasas son las enzimas hidrolticas responsables de la
degradacin de la lignocelulosa, la fuente de carbono renovable ms abundante en la
naturaleza. La aplicacin de este material para la produccin de combustibles lquidos
ha motivado intensos estudios en la bsqueda de nuevos microorganismos productores
de enzimas y el desarrollo de procesos de produccin basados en stos
microorganismos. El gnero Bacillus es reconocido industrialmente atractivo por sus
altas tasas de crecimiento, gran capacidad para la secrecin de enzimas extracelulares,
as como su desarrollo bajo condiciones ambientales extremas, anlisis del genoma de
sus especies han descrito su potencial para la produccin de las enzimas hidrolticas.
En este contexto fueron estudiadas cinco cepas de Bacillus sp. a partir de un una previa
seleccin de 25 cepas potenciales de un banco de 107 cepas aisladas de jugos despus
del proceso de pasteurizacin. En general las cinco cepas presentaron una baja
actividad, sin embargo Bacillus sp. BH19 y BH62 fueron seleccionadas con el mayor
potencial para la produccin de hidrolasas al desarrollarse adecuadamente en medio
mineral con carboximetilcelulosa como fuente nica de carbono tanto en placa con
medio slido y en fermentacin sumergida. Fueron investigados los efectos que tienen
algunos factores nutricionales y ambientales de los cuales se encontr que el salvado de
trigo y de soya como fuente de carbono inducen una mayor produccin de celulasas y
hemicelulasas,
as
mismo
las
fuentes
de
nitrgeno
orgnicas
junto
con
2.0 INTRODUCCIN
2.1 Definicin de las hidrolasas.
Las hidrolasas constituyen un grupo de enzimas cuya accin consiste transferir el
grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua. En este grupo se incluyen las
esterasas, tiolesterasas, fosfatasas, pirofosfatasas, peptidasas y las glicosidasas (Pea
A., 1988). Las glicosidasas catalizan la hidrlisis del enlace glucosdico de los
polisacridos liberando carbohidratos simples. Actualmente las glicosidasas de mayor
inters biotecnolgico son las
Gen
abfA
bglC
bglH
bglS
yhlE
yjeA
ynfF
Posicin en el
cromosoma.
2939
1940
4023
4011
1095
1281
1943
Enzima
-L-arabinofuranosidasa
endo-1,4--glucanasa
-glucosidasa
endo-1,3- y -1,4--glucanasa
Glucanasa
endo-1,4--xilanasa
endo-xilanasa
ligninasas
otras
enzimas
relacionadas
(Karmakar
M.,
2011).
de
carbono
mediante
una
produccin
sustentable
de
biomasa
11
Desechos lignocelulsicos
Desechos agrcolas
mundiales
Paja de maz
Paja de cebada
Paja de avena
Paja de arroz
Paja de trigo
Paja de sorgo
Bagazo
203.62
58.45
10.62
731.34
354.35
10.32
180.73
de biocombustibles de segunda
13
3.0 OBJETIVOS.
3.1 Objetivo general.
En este proyecto se pretende determinar y comparar el potencial celuloltico y
hemiceluloltico de seis cepas de Bacillus sp. previamente aisladas de jugos despus del
proceso de pasteurizacin, dichas cepas han sido preliminarmente identificadas como
posibles productoras de celulasas y hemicelulasas. Para este trabajo se pretende hacer
un anlisis ms detallado de este potencial mediante la medicin de actividad celuloltica
y hemiceluloltica de las cepas sometidas a diversas condiciones de cultivo (temperatura,
pH, aireacin, fuente de carbono, fuente de nitrgeno, presencia de iones, uso de otros
compuestos que pudieran aumentar la actividad) finalmente determinar cul o cules de
stas son las mejores y bajo qu condiciones para poder hacer un anlisis ms preciso y
detallado mediante cultivos en biorreactor.
14
Bagazo
explotado
Eucalipto
explotado
Bagazo
molido
Xilana
comercial
Avicel
Bagazo
(pulpa)
celulosa
Pectina
Actividad
(U/mL)
0.0980
0.4569
0.2128
0.4853
0.0533
0.0328
0.4428
0.2949
0.3861
0.0373
0.0177
0.3302
0.1554
0.7220
0.0772
1.2215
0.1496
0.7280
0.4253
0.9585
0.0189
0.2518
0.2316
0.4904
0.1929
0.4462
0.4247
0.3656
0.3965
0.2071
-0.0323
0.4440
0.2787
0.5441
0.1677
-0.2605
1.6897
0.3725
0.8528
0.1226
0.3427
0.0764
0.2603
0.1541
0.4162
Tabla 4.1.1. Cepas de Bacillus sp preseleccionadas. Cinco de las mejores veinticinco preseleccionadas
cepas de acuerdo a la mayor actividad registrada en los distintos tipos de sustrato. La tabla muestra la
absorbancia (540 nm) de los azucares reductores del medio (Anlisis por DNS).
15
con un pH ajustado a 7.0 con NaOH 1M. Las placas de CMC fueron incubadas a 37C
durante 5 das permitiendo la secrecin de celulasas. Una vez terminado ese tiempo las
placas fueron tratadas con 10 ml una solucin acuosa de Rojo Congo (0.5% p/v) durante
15 minutos. La solucin de tinte fue retirada de las placas y posteriormente fueron
cubiertas por 10ml de NaCl 1M durante 10 minutos para desteir la zona con actividad.
La formacin de una halo decolorado indica la degradacin de la celulosa (Teather R.
M., y Wood P. J., 1982). La cepa con mayor radio del halo fue considerada como la de
mayor actividad celuloltica.
Extracto de levadura 5,
16
aforando a 1000 mL con agua destilada con un pH ajustado a 7.0. Agar a una
concentracin de 1.5% fue utilizado en medio slido.
17
medio para las fermentaciones con medios translucidos (Medio mineral con CMC
nicamente). Para el caso de las fermentaciones con medio mineral y los distintos
bagazos la tcnica de O.D. no fue la adecuada por lo que se propuso la estandarizacin
de un mtodo ms rpido para la cuantificacin del crecimiento bacteriano presente en
el medio de cultivo basado en la cuantificacin de ADN genmico total de las diversas
muestras.
Para el ensayo se inocul la cepa BH19 en 30 mL de medio LB incubado a 37C
con agitacin orbital a 250 rpm durante 6 horas, cada hora se tom una muestra, se
determin su O. D. (600 nm) y posteriormente fue realizada la extraccin de ADN
genmico total mediante el mtodo de Hai-Rong Cheng & Ning Jiang (2006) en el cual 1
ml del cultivo fue centrifugado a 13, 000 rpm durante 5 minutos descartando el
sobrenadante y posteriormente lavando las clulas con 400 L de Buffer STE (NaCl
100 mM, Tris/HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH 8.0) dos veces, en seguida las clulas fueron
centrifugadas nuevamente y las bacterias fueron resuspendidas en 200 L de buffer TE
(Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). Luego se agregaron 100 L de Fenol saturado
con Tris (pH 8.0) seguido de 120 segundos de agitacin en vortex para producir la lisis
celular. Subsecuentemente las muestras fueron centrifugadas a 13, 000 rpm durante 5
minutos a 4C para separar la fase acuosa de la fase orgnica. 160 L del sobrenadante
fueron transferidos a nuevos microtubos. Posteriormente se realizaron varias
extracciones con cloroformo para purificar las muestras, luego se agreg 1 L de
ARNasa e incub a 37C por 20 minutos, finalmente se realiz otra purificacin con
cloroformo y la solucin de ADN fue utilizada directamente para su cuantificacin y
determinacin de pureza mediante NanoDrop 2000 de ThermoScientific. Fue realizada la
electroforesis en gel de agarosa 1% para observar la integridad de las muestras
18
19
20
21
22
23
A
5 mm
A
D
6 mm
A
B
15 mm
19 mm
A
E
12 mm
A
---A
Figura 5.1.1. Zona clara de colorante Rojo Congo en medio mineral con carboximetilcelulosa 1%. A
Bacillus sp. BH02, B Bacillus sp. BH05, C Bacillus sp. BH19, D Bacillus sp. BH51, E Bacillus sp. BH62
y F Control. En la parte inferior se indica la longitud en milmetros del halo producido por cada cepa.
24
CEPA
16 Horas
40 Horas
64 Horas
(h )
BH02
0.100
0.180
0.197
0.024
BH05
0.087
0.182
0.186
0.031
BH19
0.102
0.141
0.164
0.013
BH51
0.165
0.323
0.347
0.028
BH62
0.213
0.545
0.565
0.039
-1
25
dificultad que tienen las cepas de Bacillus sp. para desarrollarse en un medio que
contiene solo celulosa como fuente de carbono.
Figura 5.1.2. Cintica de crecimiento de las cepas de Bacillus sp. crecidas en medio mineral con
CMC 1% en funcin de la O. D. medida de las muestras tomadas en 16, 40 y 64 horas de
fermentacin.
26
de las muestras y la cantidad de ADN total, la Figura 5.1.3 muestra la integridad del ADN
extrado. De esta forma se determin que esta metodologa no es apropiada para el
seguimiento del crecimiento bacteriano en muestras de fermentaciones con bagazo.
Dada la dificultad que representa la medicin del crecimiento bacteriano no se determin
la cintica de crecimiento bacteriano para los siguientes experimentos, nicamente fue
determinada en aquellos casos en los que el medio es translucido.
Tiempo (h)
O. D. (600 nm)
ADN
(ng/mL)
0
1.2
2.1
3.2
4
0.200
0.752
1.730
2.470
2.630
2017.1
1883.5
1867.5
1831.8
1923.5
27
No Rotacin
0.030
0.008
0.041
50 RPM
0.036
0.020
0.036
100 RPM
0.017
0.000
0.028
150 RPM
0.013
0.028
0.039
-1
28
+2
29
Cepa Sust.
BH19 FS
BH19 FT
BH19 LQ
BH51 LQ
BH62 LQ
BH62 FS
12 Horas
CMCasa Xilanasa
(U/mL)
(U/mL)
0
0
0
0
0.223
0
0.177
0
0
0
0
0
Tiempo de Fermentacin
24 Horas
48 Horas
CMCasa Xilanasa
CMCasa
Xilanasa
(U/mL)
(U/mL)
(U/mL)
(U/mL)
0.178
0.171
0
0.166
0.170
0.150
0
0
0.247
0
0
0.151
0
0
0
0
0
0.168
0
0.174
0.240
0
0
0
Tabla 5.2.3.1. Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de celulasas y hemicelulasas. *En la tabla
solo fueron incluidos los tratamientos que mostraron actividad, en el resto de los tratamientos no se encontr
actividad.
30
CMC
BH19 0.197
BH51 0.323
BH62 0.000
LQ
0.000
0.000
0.000
31
Figura 5.2.4.1. Efecto de las fuentes de nitrgeno sobre el crecimiento de las cepas de Bacillus
sp. BH19 y BH62.
CEPA / Sustrato
BH19 CMC-Triptona
BH19 CMC-Yeast Ext.
BH19 CMC-NH4Cl
BH19 CMC-(NH4)2SO4
BH19 HT-Yeast Ext.
BH62 CMC-Triptona
BH62 CMC-Yeast Ext.
BH62 BEX-Yeast Ext.
Tiempo de Fermentacin
12 Horas
24 Horas
0.2989
0
0.1898
0.4793
0
0.5058
0.1564
0
0.1877
0
0.1975
0.5377
0.2011
0.4516
0.1728
0
Tabla 5.2.4.1. Efecto de la fuente de nitrgeno sobre la actividad Xilanasa (U/ml) registrada en
las cepas BH19 y BH62.* El resto de los tratamientos no fue puesto en la presente ya que no se
encontr actividad alguna.
32
33
Figura 5.3.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad de CMCasa de una muestra de Bacillus
sp. BH19 a pH ptimo pH 6.0.
34
.
Figura 5.3.4. Efecto de temperatura sobre la actividad de Xilanasa en Bacillus sp. BH19
a pH ptimo 6.0.
35
7.0 y una
En sntesis como lo muestra la Tabla 5.3.1, existe una gran diferencia entre las
actividades determinadas a condiciones de temperatura y pH optimas en comparacin
con las cuantificadas bajo condiciones estndar, siendo en la mayora de los casos
imposible registrar alguna actividad.
36
6.0 CONCLUSIONES.
37
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