Guia de Practicas de Bioquimica II Ingenieria Biotecnologica

PRACTICA N 1
GLICOLISIS
RELACIN DE EXPERIMENTOS
1.- Gliclisis anaerbica en un preparado de msculo esqueltico de conejo
GLUCOSA
a) Determinacin de glucosa basal y despus de Fosforilasa

1 hora
Glucgeno
ATP
Fructosa
HEXOQUINASA
Glucosa
1P
b)
Determinacin
de
cido
lctico
basal
de 1 hora.
Galactosa
ADP y despus
Manosa
Fosfofructomutasa
Glucosa 6 P
INTRODUCCIN
Fosforilacin
La gliclisis es unaFOSFOGLUCO
va metablica que consiste en una secuencia de reacciones
ISOMERASA
citoplasmticas a travs de las cuales 1 mol de glucosa se convierte en 2 moles de piruvato

Fructosa
6P
con la concomitante produccin de ATP
y la reduccin
del NAD+ a NADH + H+ si es que
ocurre en presencia de oxgeno.

En condiciones de
anaerobiosis, es decir en ausencia de
ATP
FOSFOFRUCTO
QUINASA
oxgeno, stos 2 moles de piruvato
se reducen a 2 ADP
moles de Lactato a expensas del NADH
+ H+. En presencia de oxgeno los tejidos pueden posteriormente oxidar el piruvato
Fructosa 1, 6 Bis P
totalmente hasta CO2 y H2O a nivel mitocondrial.
ALDOLASA
La gliclisis es una va que ocurre en todas las clulas del organismo, con la finalidad
de hacer posible que la glucosa TRIOSA
pueda FOSFATO
degradarse, proporcionando la energa qumica
ISOMERASA
Gliceraldehido 3-fosfato
Dihidroxiacetona fosfato
necesaria para la actividad celular en forma de compuestos fosfricos ricos en(2)
energa
(ATP). As, por molcula de glucosa que se convierte en 2 de cido Pi
lctico, se produce
+
una sntesis neta de 2 molculas de ATP, de tal modo
el proceso global que ocurre en
NADque
(2)
GLICERALDEHIDO
3P
las clulas, podra resumirse como:
NADH2
Ac. LACTICO
Glucosa + 2ADP + 2Pi
DESHIDROGENASA
2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O

Acido 1,3 difosfoglicrico (2)
NAD
Tanto las reacciones as como las enzimas que catalizan las diversas etapas de la
NADH2
gliclisis se encuentran en el citoplasma, no obstanteADP

existe una estrecha
asociacin con las
FOSFOGLICERO
(2)
Ac. Piruvico
mitocondrias
en donde se lleva a cabo la descarboxilacin
oxidativaKINASA
del Piruvato, las
ATP
reacciones del ciclo de Krebs y la fosforilacin oxidativa.
Acido 3-fosfoglicrico
(2
ATP
PIRUVATO
En la presente prctica se evaluar a la gliclisis a travs del consumo de glucosa
y la
)
KINASA
FOSFOGLICERO
produccin de cidoADP
lctico en un sistema de ensayo que contiene
homogenizado de
MUTASA
msculo esqueltico mantenido en condiciones de anaerobiosis a 37 C durante una hora.

Ac. Fosfoenol piruvico
(2)
ENOLASA
H2O
1
FIGURA N 1 .- Va Glicoltica
(2)
EXPERIMENTO 1
2
Gliclisis anaerbica en un sistema preparado con msculo esqueltico de cobayo

Objetivos
1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxgeno se transforma en cido lctico,
utilizando como fuente enzimtica un homogeneizado de msculo de cobayo o en
caso contrario de rata.
2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso
3. Comprobar la produccin de cido lctico en condiciones de anaerobiosis
Procedimiento:
a) Degradacin de la glucosa:
1. En un Erlenmeyer de 125 ml. limpio y seco, medir 10 ml de una solucin de
glucosa al 1%, disuelta en una solucin Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo
Nicotinamida 0.03 M, NAD+ 0.2 % y ATP 0.2 %.
2. Incubar la solucin en bao mara a 37 C por 10 minutos.
3. Agregar al Erlenmeyer 50 ml de homogenizado de msculo al 10 % (P/V),
8,1016,18,20,22preparado previamente en solucin Krebs Ringer Fosfato.
4. Mezclar y rpidamente tomar un volumen de aproximadamente 20 ml en una
probeta y colocarlo inmediatamente en hielo. Esta muestra constituye la muestra
basal a tiempo cero.
5. Despus de haber extrado la muestra basal, aadir al Erlenmeyer con la muestra
sobrante, un volumen adecuado de parafina lquida, para crear las condiciones
de anaerobiosis. Proseguir entonces con la incubacin a 37 C durante 60
minutos. Esta ser la muestra incubada en donde se habr de producir la
gliclisis.
6. Realizar las determinaciones de glucosa y cido lctico, tanto en la muestra
basal a tiempo cero, as como en la muestra incubada por 60 minutos a 37C,
siguiendo la metodologa para cada una de ellas.
b) Determinacin de glucosa. ( Mtodo de Nelson-Somogy ).
La de terminacin de glucosa por este mtodo, recomienda que la muestra a
analizar est libre de protenas, ya que de no ser as, stas podran reaccionar con el
reactivo de cobre utilizado dando interferencia en la coloracin obtenida.
Desprotenizacin:
3
a) Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4 ml de agua destilada y agregar

2 ml. de muestra respectiva.
b) Agregar 2 ml. de ZnSO4 al 5 %, agitar y dejar en reposo por 5 minutos.
c) Aadir 2 ml. de Ba(OH)2 0.3 N. Agitar y dejar en reposo por 5 minutos.
d) Transcurrido el tiempo, proceder a centrifugar o filtrar dichas muestras. El
filtrado libre de protenas deber ser incoloro y transparente. La determinacin de
glucosa se har en este filtrado.
Procedimiento para cuantificar glucosa:
1. Preparar 4 tubos de Folin, de acuerdo a la siguiente tabla:
REACTIVOS
1 ml
---
---
--
Filtrado muestra incubada
---
1 ml
---
---
Solucin Estandar (**)
---
---
1 ml
---
Agua destilada
---
---
---
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Filtrado de la muestra basal
Reactivo Cprico-alcalino
(**) Solucin estndar de glucosa conteniendo 50 ug/ml. La absorbancia leda del

sistema estndar fue de 0.154 D.O. ( 67 UK).
2. Colocar los tubos en bao mara hirviente por 15 minutos.
3. Enfriar los tubos en agua corriente.
4. Aadir a cada tubo, 1 ml del reactivo arsenomolibdato, disolviendo con suave
agitacin el Cu2O producido.
5. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. Dejar en reposo 5 minutos.
6. Leer en el fotocolormetro con filtro verde y anotar.
7. Hacer los clculos respectivos y expresar la concentracin de glucosa en mg %.
c)
Determinacin de Acido Lctico (Mtodo Volumtrico).

El cido lctico se determinar por titulacin con una solucin de KOH 0.02 N,
utilizando al rojo de fenol como indicador.
Procedimiento:
4
1. En cada uno de dos beakers medir aproximadamente 15 ml de las muestras basal e

incubada respectivamente y hacerlas hervir por 2 minutos teniendo cuidado de que
no se proyecten
2. Enfriar y filtrar a travs de una gasa y luego a travs de papel filtro.
3. Proceder a la titulacin de 3 ml de cada muestra con KOH 0.02 N, agregando 1
gota del indicador rojo de fenol, hasta obtener un color naranja-rosa.
4. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad del cido lctico.
Resultados
Anote sus resultados en la siguiente tabla :
MUESTRA BASAL
MUESTRA INCUBADA
Glucosa en mg %
Acido lctico en mEq/L
En el siguiente espacio discuta los resultados obtenidos
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
__________________________________________________________
INTERROGANTES
1. Defina a la gliclisis anaerbica y gliclisis aerbica
2. En que clulas o tejidos, la glucosa es degradada anaerbicamente, y en cuales

aerbicamente
3. Escriba las reacciones de la gliclisis que requieren de ATP y las que producen ATP
a)
5
b)
c)
d)
4. Cul es la produccin neta de ATP en la oxidacin anaerbica de un mol de glucosa.
Haga los clculos respectivos.
5. Como se define la fosforilacin a nivel de sustrato. Qu enzimas de la gliclisis

catalizan estas reacciones?
6. Cul es la produccin neta de ATP por la oxidacin aerbica de 1 mol de glucosa hasta
CO2 y H2O. Describa de manera general las etapas en donde se forma ATP.
7. Cul es la importancia de la gliclisis para los eritrocitos y las neuronas
8. Mediante un esquema demuestre la funcin del NAD + en la gliclisis. Por qu no

aparecen NADH y NAD+ en la reaccin neta?
9. A qu se llama enlaces fosfricos ricos en energa. Qu intermediarios de la gliclisis

lo presentan?
10. Escriba las reacciones irreversibles de la gliclisis, indicando las enzimas que las
catalizan
11. Cmo se regula la gliclisis?
12. A partir del G de la gliclisis y del nmero neto de ATPs producidos, calcule la
eficiencia en porcentaje del proceso.
13. Qu inhibidores de la gliclisis conoce Ud.? Indique el lugar y el mecanismo de accin

de estas sustancias.
14. Si se aadiese CN y/o dicumarol en el experimento de la presente prctica, se afectara

la sntesis de ATP de la gliclisis?
PRACTICA N 2
CICLO DE KREBS
RELACION DE EXPERIMENTOS
1.- Determinacin del consumo de oxgeno (Manometra)
2.- Determinacin del consumo de piruvato (Colorimetra)
INTRODUCCION
Cuando la glucosa se degrada por la va glicoltica se obtiene como producto final
piruvato o lactato. En condiciones aerbicas, la etapa siguiente en la degradacin de la
glucosa, es la descarboxilacin oxidativa del piruvato a nivel mitocondrial, para formar
acetil CoA, el cual puede oxidarse hasta CO2 y H2O en una va metablica llamada ciclo de
Krebs, ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo del cido ctrico el cual funciona en
estrecha relacin con la cadena respiratoria mitocondrial. Es necesario remarcar que el
acetil CoA no slo proviene del metabolismo de los carbohidratos, sino que tambin se
forma durante la beta oxidacin de los cidos grasos o en la oxidacin de algunos
aminocidos.
El ciclo de Krebs se realiza en las mitocondrias y est ntimamente ligado a la cadena
respiratoria; este hecho tiene importancia metablica por que los hidrgenos provenientes
de las oxidaciones producidas en el ciclo de Krebs, son captados por los transportadores de
la cadena respiratoria para llevarlos hasta el oxgeno molecular que se reduce y forma
agua. Como consecuencia se produce 2 3 molculas de ATP por cada proceso oxidativo.
Durante el ciclo de Krebs ocurre esencialmente lo siguiente: Un compuesto de 4 tomos
de carbono (oxalacetato), se condensa con el acetato (acetil CoA) para dar lugar a un cido
tricarboxlico de 6 tomos de carbono (citrato). Un ismero de ste el isocitrato es
descarboxilado y oxidado para dar un cetocido de 5 carbonos (alfa ceto glutarato), l cual
a su vez es descarboxilado oxidativamente para formar un cido dicarboxlico de 4
carbonos (succinato). A partir del succinato se regenera oxalacetato a travs de reacciones
en las que ocurren dos oxidaciones.
En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente de enzimas, y se
demostrar el requerimiento de varios cofactores para un buen funcionamiento
AMINOACIDOS
GLUCOSA
ACIDO PIRUVICO
HSCoA
NAD+
CO2
NADH2
Complejo de la Piruvato
Deshidrogenasa
CIDOS
GRASOS
Acetil - SCoA
HSCoA
Citrato Sinteasa
Acido. Oxalactico
H2O
NADH2
NAD
Acido. Ctrico
Aconitasa
Deshidrogenasa
Mlica
Acido Isoctrico
Acido Mlico
Fumarasa
Isocitrato
Deshidrogenasa
H2O
CO2
Acido Fumrico
FADH2
H2O
ADP + Pi
ATP
Succinato
Deshidrogenasa
Acido Succnico
GTP
GDP + Pi
NADH2
Acido - cetoglutarato
HSCoA
CO2
FAD
NAD+
Succinil - SCoA
NAD+
Complejo
- ceto Glutarato
Deshidrogenasa
NADH2
Succinil CoA
Sinteasa
HSCoA
ATP
NAD
FMN
ATP
Coenzima Q
Cit. b
ATP
Cit. c1
Cit. c
H2O
2H+
FIGURA N 2.- Ciclo de Krebs

10
Cit.(a + a3)
1/2
O2-
del ciclo. Como en este proceso de oxidacin de Piruvato, el oxgeno es reducido hasta
agua, el ciclo de Krebs ser estudiado:
1. Midiendo el consumo de oxgeno mediante el empleo de un mtodo manomtrico.
2. Midiendo los micromoles de Piruvato consumidos, mediante un mtodo colorimtrico
Experimento 1
Determinacin del consumo de oxgeno.
La integracin del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial va a originar que
el oxgeno sea reducido y convertido en agua, producindose un consumo neto de este gas,
consumo que puede ser medido mediante el uso del respirmetro de Warburg.
Fundamento del respirmetro de Warburg.
El frasco de Warburg que contiene el sustrato, cofactores y el homogenizado de hgado,
en cuyo medio se quiere medir el consumo de oxgeno, es colocado en bao de agua a
temperatura constante. Estando cerrado el frasco y en comunicacin con el manmetro, el
consumo de oxgeno determinar una disminucin de la presin del sistema, lo cual se
evidencia por un desnivel del lquido manomtrico presentes en las columnas. ( el
funcionamiento del respirmetro de Warburg as como los clculos respectivos ya fueron
indicados en la practica de Fotosntesis: Bioqumica I ) .
Manmetro
Warburg
Compartimiento
principal
Frasco
Warburg
Bao mara
Warburg
Nave
central
Frasco Warburg
Reservorio de lquido
manomtrico
Figura N 10.1.- Respirmetro de Warburg
Procedimiento.
11
Brazo
lateral
Se preparan 6 frascos de Warburg; en la copa central de cada uno de ellos medir 0.4 ml de
KOH al 20 % y colocar un fragmento de papel filtro plegado en acorden. Luego en el
compartimiento principal de cada frasco medir los siguientes reactivos:
ATP 0.01 M
MgSO4 0.02 M
NAD
Sustrato *
Buffer fosfato 0.1 M pH 7.3
H2O
Fluoroacetato
Homogenizado de hgado **
0.4 ml
0.3 ml
0.1 ml
---0.5 ml
0.7 ml
---2.0 ml
0.4 ml
0.3 ml
0.1 ml
0.6 ml
0.5 ml
0.1 ml
---2.0 ml
---0.3 ml
0.1 ml
0.6 ml
0.5 ml
0.5 ml
---2.0 ml
0.4 ml
---0.1 ml
0.6 ml
0.5 ml
0.4 ml
---2.0 ml
0.4 ml
0.3 ml
---0.6 ml
0.5 ml
0.2 ml
---2.0 ml
0.4 ml
0.3 ml
----0.6 ml
0.5 ml
---0.1 ml
2.0 ml
* El sustrato contiene 5 volmenes de piruvato de sodio 0.1M y un volumen de fumarato de sodio 0.01M.
** El homogenizado de hgado se obtuvo al homogenizar en frio durante 2 minutos, hgado de rata en ayunas
con 9 volmenes de sacarosa 0.25 M de buffer tris 0.02 M pH 7.4.
Preparar adems un frasco termobarmetro( TB) que debe contener 4 ml de agua

destilada para corregir o compensar los cambios de presin y temperatura durante el
experimento.
Equilibrar los sistemas por 10 minutos sin cerrar la llave de los manmetros,
permitiendo el libre intercambio gaseoso con el medio ambiente. Cerrar luego la llave de
los manmetros y la llave lateral de los frascos de Warburg y hacer la lectura cada 15
minutos.
Expresin de resultados
-
Confeccionar una Tabla o Cuadro y anotar las lecturas obtenidas cada 15 minutos para
cada sistema.
Convertir las lecturas obtenidas en l de oxgeno consumido en una hora para cada uno
de los sistemas.
Interpretar los resultados para cada sistema.
Sistema 1: _____________________________________________________________
________________________________________________________________
Sistema 2: ________________________________________________________
12
CUADRO DE RESULTADOS:
( Completar el siguiente cuadro, realizando los

clculos respectivos ).
Tiemp
TB
1
KO2=0.96
2
KO2=1.03
3
KO2=0.94
4
KO2=1.00
5
KO2=0.89
6
KO2=0.88
183
295
297
289
278
274
275
10
184
234
205
250
230
220
250
20
186
211
120
220
185
170
229
30
185
182
40
299
190
135
130
200
40
188
136
206
173
100
100
185
50
188
113
135
155
65
292
80
165
60
186
92
48
50
275
65
145
Consumo de
oxgeno
en l / 60
Consumo de
Piruvato
en Moles
Sistema 3: ___________________________________________________________
___________________________________________________________________
Sistema 4: _____________________________________________________________
___________________________________________________________________
Sistema 5: ___________________________________________________________
____________________________________________________________________
13
Sistema 6: ___________________________________________________________
___________________________________________________________________
2.- Determinacin de los micromoles de piruvato consumidos.
Fundamento.
El piruvato reacciona con la 2,4-dinitrofenil hidrazina, dando lugar a la formacin de
una hidrazona que en medio alcalino toma una coloracin pardo oscura, cuya absorbancia
se mide en el fotocolormetro.
Procedimiento.
Al finalizar el experimento de la medicin del consumo de oxgeno se abren todas las
llaves de los manmetros y frascos Warburg. Luego se trasvasa el contenido del
compartimento principal de cada frasco a tubos de prueba numerados del 1al 6.
A parte preparar en tubos de prueba los sistemas 1, 2 y 6 (que estn marcados con )
donde el tubo 1 sirve de blanco; los tubos 2 y 6 sirven de estndares.
Luego con los 8 tubos ( 1 6 despus de haber medido el consumo de oxgeno; y los
sistemas basales 1, 2 y 6 ) se procede de la siguiente manera:
-
Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo
Aadir 18 ml de ATCA al 5 % . Mezclar. Dejar en reposo por 5 minutos y filtrar.

En otros tubos medir respectivamente:
0.4 ml de cada filtrado
0.6 ml de agua destilada
1.0 ml de 2,4-dinitro fenil hidrazina, dejar 20 minutos en reposo.
Aadir 10 ml de NaOH al 10 %. Dejar en reposo por 5 minutos
Leer con filtro verde

Tubo 1 : 0.038
Tubo 2 : 0.612
Tubo 6 :
0.605
Absorbancia de los tubos del 1 al 6 :

1: 0.038
2: 0.088
3: 0.471
4: 0.467
Calcular el Factor de calibracin:

14
5: 0.458
6: 0.589
Factor de calibracin: .......................

Calcular los micromoles de piruvato consumidos en cada sistema:
1: ............
2: .............
3: ..............
4: ..............
5: ..............
6: ...............
INTERROGANTES:
1.- Qu es el ciclo de Krebs, qu importancia tiene y en qu lugar de la clula ocurre?
2.- Haga el balance energtico del Ciclo de Krebs asociado a la cadena respiratoria
mitocondrial para un mol de acetil CoA.
3.- Qu finalidad tiene la preparacin del sistema termobarmetro?
3.- Qu finalidad tiene en la presente prctica, el empleo de KOH en el compartimiento

central de cada frasco Warburg ?
4.- Qu es el KO2
5.- Explicar la relacin que existe entre el consumo de oxgeno y el funcionamiento del
ciclo de Krebs.
6.- Cul es la razn de que el sustrato contenga fumarato?
7.- Qu inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud.? . Dnde actan?
15
8.-Indique qu vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan para la descarboxilacin

oxidativa del alfa ceto glutarato. Qu otro cido relacionado con el metabolismo de la
glucosa sufre igual transformacin.
9.- Cmo se regula el flujo metablico del ciclo de Krebs. Qu enzimas regulatorias
intervienen en este proceso y como son reguladas?
10.- Cul es el rendimiento neto de ATPs, cuando 1 mol de Piruvato es oxidado hasta CO 2
y H2O ?. Cul sera el cambio de energa libre ( G ) total?
16
PRACTICA N 3
FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA
1. Formacin de Acetaldehido y Etanol a partir de glucosa en presencia de
Saccharomyces cerevisiae.
a) Identificacin de acetaldehido
b) Cuantificacin de etanol
2. Cuantificacin del contenido alcohlico en diversas bebidas
INTRODUCCION.
Las fermentaciones son procesos anaerbicos que liberan energa para la formacin de
ATP en un proceso conocido como fosforilacin a nivel de sustrato. La energa
producida en los procesos de fermentacin y que las clulas aprovechan para las reacciones
endergnicas, se acumula en forma de ATP; parte de la cual se emplea en la fosforilacin
de las hexosas.
La fermentacin alcohlica es un proceso bioqumico que por accin de las levaduras, 1
mol glucosa es convertida anaerbicamente en 2 moles de etanol. Las clulas de levadura
son esenciales para producir las enzimas necesarias que participar en el proceso
fermentativo, pero una vez que stas estn presentes ya no sern tan indispensables para
que la fermentacin se produzca en forma normal.
En levaduras, la glucosa anaerbicamente es convertida en etanol y dixido de
carbono, y las etapas enzimticas son idnticas a las de la fermentacin lctica o gliclisis,
a excepcin de la etapa terminal catalizada por la Deshidrogenasa lctica, la cual es
reemplazada por dos etapas enzimticas adicionales, donde intervienen la Piruvato
Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa.
La reaccin de descarboxilacin del Piruvato, en acetaldehido y dioxido de carbono, es
catalizada por la Piruvato Descarboxilasa, enzima que requiere de Pirofosfato de Tiamina
(PPT) como coenzima, adems de iones Mg2+. Como producto intermediario se forma
cido pirvico activo que por liberacin del CO 2 se convierte en acetaldehido activo
(PPTAcetaldehido), intermediario que luego se descompone en PPT acetaldehido, ste
17
ltimo se reducir a etanol en la reaccin siguiente ; no obstante, una parte del acetaldehido
activo se condensa a acetaldehido libre para formar acetil-metil-carbinol. (Acetona).
GLUCOSA
ATP
ADP
HEXOQUINASA
Glucosa 6 P
FOSFOGLUCO
ISOMERASA
Fructosa 6 P
ATP
FOSFOFRUCTO
QUINASA
ADP
Fructosa 1, 6 Bis P
ALDOLASA
TRIOSA FOSFATO
ISOMERASA
Dihidroxiacetona fosfato
Gliceraldehido 3-fosfato
Pi
GLICERALDEHIDO 3 P
DESHIDROGENASA
NAD+
NADH2
Acido 1,3 difosfoglicrico

(2)
ETANOL
ALCOHOL
DESHIDROGENASA
FOSFOGLICERO
KINASA
(2)
(2)
ADP
ATP
NAD
NADH2
(2)
FOSFOGLICERO
MUTASA
(2)
Acetaldehido
PIRUVATO
DESCARBOXILASA
PPT
ATP
ADP
Ac. Pirvico
(2)
(2)
CO2
ENOLASA
H2O
Ac. Fosfoenol pirvico

PIRUVATO
KINASA
FIGURA N 3 .- Fermentacin alcohlica de la glucosa

18
(2)
La conversin de acetaldehido en etanol es llevada a cabo por la alcohol

deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH + H + y que cataliza la
reaccin de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en un medio ligeramente cido
( pH de 5 a 6 ), por el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se realiza de
derecha a izquierda.
Como inductores de la fermentacin alcohlica, no slo actan las levaduras de
Saccharomyces cerevisiae, sino tambin las bacterias: pseudomonas, xantomonas y
aeromonas.
En la fermentacin alcohlica, adems del etanol y dioxido de carbono se originan
productos secundarios como glicerina, cido actico y cido succnico.
EXPERIMENTO 1.
FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA
ACETALDEHIDO Y ETANOL
En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml., agregar lo siguiente:
M-1
M2
1.- Levadura de panificacin fresca
1.0 g
1.0 g
2.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 5.5
10.0 ml
------
3.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 8.0
------
10.0 ml
4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio
------
500 mg
5.- Mezclar y agregar rpidamente parafina lquida hasta que

5.0 ml
cubra la superficie.
Incubar en bao de agua a 37 C durante 60 minutos
5.0 ml
6.- Centrifugar a 3,000 rpm.
10 min.
10 min.
Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones del acetaldehido y
etanol
Identificacin del acetaldehido.
Fundamento:
En el sobrenadante de la muestra de incubacin el sulfito de calcio atrapa al
acetaldehido, el cual puede observarse por el color azul que se produce al reaccionar con el
nitroprusiato de sodio y la piperidina.
19
Procedimiento.
En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados, agregar lo siguiente:
T-1
T 2
T3
1. Sobrenadante de M 1
1.0 ml
----2. Sobrenadante de M 2
--1.0 ml
--3. Agua destilada
----1.0 ml
4. Solucin de Nitroprusiato de Sodio
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Mezclar y colocar los tubos en bao de agua hirviente por 5 minutos.
5.Observar. Anotar el color y olor caracterstico
del acetaldehido
CUANTIFICACION DEL ETANOL (Mtodo de Shefftel modificado).

Fundamento.
La mezcla oxidante Dicromato-cido sulfrico acta sobre el alcohol etlico
transformndolo en cido actico, a la vez que se forma sulfato cromoso con una
coloracin que vara del amarillo al verde, en forma proporcional a la concentracin de
etanol existente en la muestra, susceptible a ser medido por fotocolorimetra.
Reactivos:
a) Dicromato de potasio.
Agua destilada
b) Acido sulfrico Q.P.
8.524 g.
1000 ml.
1000 ml
c) Mezcla sulfocrmica: Verter lentamente el cido sulfrico a la solucin de

bicromato (Reaccin exotrmica).
Procedimiento:
1. Colocar 0.5 ml de la mezcla sulfocrmica en un frasco de 30 ml.
aproximadamente.
2. Colocar exactamente 0.2 ml. de la muestra a analizar en una tira doblada de
papel filtro adherida a un tapn de jebe con un alfiler.
3. Finalmente colocar hermticamente en el frasco que contiene la solucin
sulfocrmica, cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del frasco
ni el reactivo.
20
4. Colocar las tapas rosca y llevarlos a Bao Mara hirviente o a estufa a 100 C por
10 minutos.
5. Retirar el tapn con la tira de papel que contiene a la muestra. Enfriar y agregar
12.5 ml de agua destilada.
6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm.
7. Preparar sistemas estndar del mismo modo que para las muestras problema,
slo que en su lugar medir 0.2 ml del estndar respectivo ( 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml
y 2 mg/ml ) en la tira de papel filtro.
8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de la misma
manera que para la muestra problema, slo que en lugar de esta ltima medir 0.2
ml de agua destilada en la tira de papel filtro.
RESULTADOS.
Calcular los Factores de calibracin respectivos en base a los datos indicados:
Absorbancia
Blanco
Estandar 1 ( 0.5 mg/ml )
Estndar 2 ( 1.0 mg/ml )
Estndar 3 ( 2.0 mg/ml )
Factor de
Absorbancia
( D.O )
0.001
0.005
0.009
0.018
Fc
Promedio
Calibracin.
neta
------
------
-----
Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentacin alcohlica de la

glucosa ), en el siguiente Cuadro:
T1
T2
T3
Identificacin de acetaldehido
Coloracin obtenida
Cantidad de etanol (mg % )
Anotar los resultados obtenidos en el experimento 2.
Bebida alcohlica
Blanco
Anizado
Cerveza
Chicha
Absorbancia
Concentracin en la
Concentracin en
cantidad de muestra
mg %
0.001
21
Pisco
INTERROGANTES Y COMENTARIOS.
1.- Comente o explique los resultados obtenidos en la identificacin del acetaldehido.
2.- Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificacin de etanol del

experimento 1.
3.- Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentacin alcohlica de la fructosa
4.- Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato descarboxilasa y la
alcohol deshidrogenasa.
5.- Indique para qu se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la presente

prctica:
Sulfito de calcio:
Solucin sulfocrmica diluida:
6.- Mencione las diferencias entre la fermentacin lctica y fermentacin alcohlica.
7.- De qu otras maneras se puede estudiar la fermentacin alcohlica?

22
8.- Qu otros compuestos se pueden formar durante la fermentacin alcohlica?
23
PRACTICA N 4
OXIDACION DE ACIDOS GRASOS Y FORMACION DE CUERPOS CETONICOS
INTRODUCCION:
Como se sabe, la oxidacin de los cidos grasos comprende una serie de reacciones
enzimticas que al final conducen a la formacin de Acetil CoA y un acil CoA de 2 tomos
24
de carbono menos; este ltimo compuesto reingresa al ciclo, de tal manera que el cido
graso queda convertido finalmente en varios Acetil CoA dependiendo del nmero de
carbonos del cido graso. As por ejemplo, para el caso del cido palmtico, oxidacin dar
lugar a 8 Acetil CoA y tratndose del cido butrico originar 2 Acetil CoA. Las molculas
Acido Graso den tomos de carbono
de Acetil CoA sern ampliamente utilizadas por el organismo y as de primera importancia
C (CH
) COOH y seguir las reacciones
es el empleo en la produccin de energa, al Hunirse
al oxalacetato
3
2 n
ATP
HSCoA
ACTIVACION
DE en
interviene
tambin
la sntesis de cidos grasos, sntesis de
del ciclo de Krebs;
AMP + PPi
ACIDOS GRASOS
colesterol, en procesos de acetilacin. Aqu estudiaremos tambin de forma particular el rol

C (CH2)nlo CO
CoA especialmente en el
CoA Hcetnicos,
del acetil CoA en la formacinAcil
de cuerpos
que ocurre
3
FAD
hgado. Se conocen bajo la nominacin

de cuerpos cetnicos a los cidos:
FADH2 Aceto actico,
OXIDACION
DE CIDOS GRASOS
beta hidroxibutrico y a la acetona.
Trans Enoil CoA
En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente de enzimas para

Acil CoA
- OH Acil
la oxidacin del butirato y la formacin de cuerpos cetnicos. SeLemplear
paraCoA
este efecto,
Acetil CoA
NAD
el aparato manomtrico de Warburg para medir el consumo de oxgeno.
NADH2
Ceto Acil CoA
HSCoA
OBJETIVOS:
HSCoA
etc.
1. Estudiar la oxidacin
del
cido
butrico
a
travs
del
consumo
de oxgeno utilizando un
Citrato Sinteasa
homogenizado de hgado como fuente enzimtica.
Acido. Oxalactico
Acido. Ctrico
2. Demostrar la necesidad del NAD, iones magnesio y ATPH en
O la oxidacin de los cidos
NADH2
Aconitasa
Deshidrogenasa
Mlica
grasos.
NAD+
H2O
Acido Isoctrico
3. Determinar cualitativamente la formacin de cuerpos
cetnicos en los diferentes
Acido Mlico
Isocitrato
CICLO
NAD+
sistemas de estudio.
Deshidrogenasa
DE
Fumarasa
NADH2 de cuerpos
KREBS
4. Interpretar losH2Oresultados sobre
el consumo de CO
oxgeno
2
y formacin
Acido Fumrico
cetnicos.
FADH2
Procedimiento:
ADP + Pi
ATP
Succinato
Deshidrogenasa
Acido - cetoglutarato
HSCoA
CO
NAD+
Complejo
- ceto Glutarato
Deshidrogenasa
Preparar
4 frascos de Warburg en la siguiente forma: 2
FAD
NADH2
Acido Succnico GTP GDP + Pi Succinil - SCoA
Succinil CoA
Sinteasa
HSCoA
ATP
NAD
FMN
ATP
Coenzima Q
2H+
Cit. b
ATP
Cit. c1
Cit. c
Cit.(a + a3)
1/2
H2O
25
TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA CADENA
RESPIRATORIA MITOCONDRIAL
FIGURA N 4 .- Oxidacin Completa de un cido graso
O2--
1. Colocar 0.4 ml de KOH 20% en la copa central de cada frasco y un pedazo apropiado
de papel filtro plegado en acordeon, y luego en el compartimiento principal de cada
frasco medir lo siguiente:
ATP 0.01M
Mg SO4 0.02 M
NAD
Sustrato
Buffer Fosfato 0.1 M; pH 7.4
1
0.4 ml.
0.3 ml.
0.1 ml.
------0.5 ml.
26
2
0.4 ml.
0.3 ml.
0.1 ml.
0.6 ml.
0.5 ml
3
------0.3 ml.
0.1 ml.
0.6 ml.
0.5 ml.
4
0.4 ml.
0.3 ml.
------0.6 ml.
0.5 ml.
Agua destilada
Enzimas
0.7 ml.
2.0 ml.
0.1 ml.
2.0 ml.
0.5 ml.
2.0 ml.
0.2 ml.
2.0 ml.
NAD 3.0 mg y 43 mg de nicotinamida.

.. Sustrato ( 5 volmenes de butirato de sodio 0.1 M y 1 volumen de Fumarato de sodio 0.01 M.
... Enzimas : Homogenizado de hgado de rata en ayunas con 9 volmenes de sacarosa 0.25 M en buffer
Tris 0.02 M ( pH 7.4 ).
2. Preparar adems, un frasco termobarmetro conteniendo 4 ml. de agua destilada para

compensar los cambios de presin y temperatura durante el experimento.
3. Colocar cada frasco en su correspondiente manmetro; sin cerrar la llave de los
manmetros, equilibrar durante 10 minutos a 37 C en el aparato de Warburg con
agitacin constante. Despus de esta fase inicial, cerrar la llave de los manmetros y
proceder a la lectura basal. (Cuadro de Resultados )
4. Continuar las lecturas cada 10 minutos, haciendo las correcciones necesarias de
acuerdo a los cambios observados en el termobarmetro. (Cuadro de Resultados )
5. Al final del experimento, calcular el consumo de oxgeno total de cada frasco y
trasvasar el contenido de cada compartimiento principal de los frascos a tubos de
ensayo enumerados en forma similar.
Identificacin de cuerpos cetnicos:
6. Saturar el contenido de cada frasco con sulfato de amonio slido y dejar en reposo
durante 5 minutos. Filtrar despus de decantar los cristales de la sal.
7. A un volumen igual de cada filtrado ( por ejemplo 1.0 ml. ), agregar 3 gotas de
NH4OH concentrado y 2 gotas de nitroprusiato de sodio al 5 %. Agitar lateralmente y
dejar ambos tubos en reposo durante 5 minutos. La concentracin relativa de cuerpos
cetnicos (aceto acetato) en cada tubo ser apreciada por la presencia de un color
violeta, cuya intensidad de color ser considerada de 0 a ++++.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1.- Interprete y comente los resultados obtenidos en :
Sistema N 1 :
27
Sistema N 2 :
Sistema N 3 :
Sistema N 4 :
INTERROGANTES:
1.- A travs de un diagrama describa la beta oxidacin del cido butrico
2.- Cul es la razn de que se use fumarato junto al sustrato butirato?
3.- De qu otros modos se podra evaluar la oxidacin de los cidos grasos?
4.- Calcule cuantos ATPs netos se obtienen cuando el butirato se degrada completamente
hasta CO2 y H2O y calcule su eficiencia energtica (%).
5.- Donde ocurrir la activacin de este cido graso? , por que?
6.- Hay necesidad de carnitina para la oxidacin de butirato? . por qu?
28
7.- Explicar la relacin existente entre consumo de oxgeno y oxidacin de cidos grasos.
8.- Un desacoplador de la fosforilacin oxidativa tendra algn efecto sobre la oxidacin de

los cidos grasos en la presente prctica?
9.- Cul es el fundamento de la determinacin cualitativa de los cuerpos cetnicos?
10.- Qu finalidad tiene en la presente prctica el empleo de KOH en el compartimiento

central del frasco Warburg?
11.- Escriba la reaccin de sntesis de cada uno de los cuerpos cetnicos
12.- Como los cuerpos cetnicos pueden cumplir un rol energtico?
13.- Qu entiende por cetosis. Cules son los llamados cuerpos cetnicos. En qu
condiciones se acumulan en el organismo
14.- Qu hormonas estimulan la capacidad de transformar la glucosa en cidos grasos?
15.- Qu hormonas intervienen en la movilizacin de cidos grasos desde los depsitos?

29
16.- Cual es la principal razn de utilizar acido butrico y no otro acido graso en la
presente practica?
Cuadro de Resultados. Complete los datos del siguiente cuadro
TIEMPO
( Minutos)
0
10
KO2 = 0.98
KO2 = 1.12
KO2 = 0.95
KO2 = 0.94
298
300
295
280
TB
180
182
260
231
30
270
258
20
181
30
179
40
181
50
180
60
180
229
175
250
230
220
114
233
221
197
42
215
208
168
298
----214
198
191
149
140
162
153
Consumo de
Oxgeno
en l.
Cuerpos Cetnicos
+++
31
++++
PRACTICA No 5
DEGRADACIN DE AMINOCIDOS: TRANSAMINACIN
1. Transaminacin utilizando un extracto enzimtico de hgado de paloma
INTRODUCCION
La transaminacin es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo
amino desde un aminocido hasta un cetocido , dando como resultado conversin del
primero en un cetocido y el segundo en un nuevo aminocido Esta reaccin es de gran
32
importancia en el metabolismo de los aminocidos y es catalizada por enzimas llamadas

TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayora de tejidos animales. El
cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfacetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formndose por tanto cido glutmico.
NH3
R-CH-COO-
H
C=O
OOC-CH2-CH2-C-COO
- ceto Glutarato
Enzima
O
R-C-COO-
NH3
H - C -NH2
OOC-CH2-CH2-CH-COO-
Enzima
L-aminocido + alfa-cetoglutarato
Glutamato
alfa-cetocido + L-glutmico
El inters clnico est centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfacetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa glutmico Pirvica o TGP) y L-aspartato:
alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutmico Oxalactica o TGO). Estas
enzima tienen una accin eminentemente intracelular, por lo que la actividad srica en
condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad ser evidencia de un
deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente
importantes corazn e hgado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado
aumento de la actividad de TGO, debido a la liberacin al torrente sanguneo de esta
enzima tan abundante en el miocardio. En este caso no existir aumento e la actividad
srica de TGP o ser mnimo.
En hepatitis vrales u otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis de
tejido, habr tambin un incremento considerable de la actividad srica de transaminasas,
incluso antes de la aparicin de sntomas clnicos como la ictericia. En este caso TGP ser
la enzima predominante debido a su gran concentracin en el tejido heptico. Una elevada
actividad de transaminasas puede detectarse tambin en otras condiciones como : traumas
accidentales o quirrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.
TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE
PALOMA
33
Objetivo:
Aplicacin de la tcnica de cromatografa en capa fina para estudiar la transaminacin
en presencia de un preparado de hgado de paloma como fuente enzimtica, utilizando
alanina y aspartato como substratos.
Procedimientos:
Preparacin de la fuente enzimtica (Polvos acetnicos):
Los hgados recientemente extrados de 4 pichones son homogeneizados en 10
volmenes de acetona fra durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el
residuo obtenido es secado a temperatura ambiente obtenindose as polvos secos, fciles
de conservar.
El da de la prctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetnicos con 7 ml de
agua destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta
el sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.
La acetona por su accin deshidratante facilita la extraccin de enzimas de los tejidos.
En
esta forma la acetona reduce la desnaturalizacin de las (enzimas) protenas y
concomitantemente produce la desintegracin de las estructuras celulares y la disrupcin

de los enlaces lipoproteicos.
Preparacin del experimento de la transaminacin.
En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO 3 concentrado,
medir lo siguiente :
REACTIVOS
Alanina 0.05 M
Glutamato 0.05 M
Aspartato 0.05 M
alfa-cetoglutarato 0.1 M
Piruvato 0.1 M
Extracto enzimtico
Extracto enzimtico hervido
SISTEMAS
II
III
I
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
-
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
-
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
-
IV
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en bao mara a 37 oC durante una
hora
34
Identificacin de los productos de la reaccin por cromatografa en capa fina :

Cada grupo dispondr de una placa de vidrio con Silica Gel, de 200 x 200 mm, en la
que se han marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia
entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de
experimento y tres para los tres estndares de : Alanina, Glutamato y Aspartato. Estos
sistemas estndares debern ser preparados de la siguiente manera:
Medir 0.2 ml del Aminocido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se
encuentra a concentracin 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua.
Muesta o
Sistema No
Rf x 100
PUNTOS DE ORIGEN
Estandar Estandar Estndar
Alanina
Glutmic. Asprtico
3
4
Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde,
10 ul de cada sistema incubado y 2 ul de las soluciones estndar de aminocidos en
alcuotas de no ms de 1 ul cada vez, dejando secar cada rea despus de cada aplicacin.
Al final, colocar la placa en la cmara cromatogrfica conteniendo como solvente 75
volmenes de fenol y 25 de agua.
La cromatografa termina cuando el solvente alcanza la lnea marcada a 10 cm de los
puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 C por 3 minutos, y
revelar el cromatograma rociando una solucin de ninhidrina al 0.1% en n-butanol
saturado con agua y luego dejarla secar. La representacin esquemtica de los resultados
obtenidos luego de revelar el cromatograma se muestra en la pgina siguiente.
Expresin de Resultados:
Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completar la tabla anterior e interpretar el
cromatograma con los resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los
sistemas preparados:
Rf
Rf
Mancha N 1
................
Mancha N 5
................
Mancha N 2
................
Mancha N 6
................
Mancha N 3
................
Mancha N 7
................
Mancha N 4
................
35
Haga la identificacin de cada una de las manchas sealando a qu aminocido

corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los
aminocidos: Alanina, ac. glutmico y ac. Asprtico son de 58, 26 y 11.2 respectivamente,
para el solvente usado en la presente cromatografa.
Aminocido
Aminocido
Mancha N 1
................
Mancha N 5
................
Mancha N 2
................
Mancha N 6
................
Mancha N 3
................
Mancha N 7
................
Mancha N 4
................
INTERROGANTES BIOQUIMICAS
1. Que es Rf
Frente del solvente

Interpretacin de los resultados
Obtenidos.
Sistema1
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
Sistema 2
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
II
Sistema 3
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
III
IV
36
Sistema 4
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
Figura N 6.1.- Cromatograma de la transaminacin

2. Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP
3. Que papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminacin ?. Cul es
el grupo funcional del cofactor ?. Explique su mecanismo
4. Cul es el objeto del sistema 2
5. Explique el mecanismo que permite la separacin de sustancias por cromatografa en
capa fina
6. Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reaccin de transaminacin ?.
Fundamente su respuesta
7. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradacin de los
aminocidos. La degradacin de los 20 aminocidos sera afectada ?.
8. Cul ser la distribucin celular de la TGO y TGP ?

37
9. Si en el experimento de transaminacin que Ud. realiza colocar cido pirvico
uniformemente marcado con C14, Qu aminocidos espera encontrar marcados

preferentemente ?. Fundamente.
10.
Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se
incorporaran en una protena. Seale algunas secuencias de reacciones que permitan

explicar este fenmeno.
11.
Participan las reacciones de transaminacin en la biosntesis de aminocidos ?
12.
Que pensara de un ensayo en el cual una muestra biolgica como el suero se
mezclara con aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de malato

deshidrogenasa ?. Que ideara para determinar la actividad de TGP por un mtodo
similar ?.
13.
Si se utilizara leucina y -ceto glutarato para estudiar la transaminacin; qu
productos se podra identificar?. Qu nombre propondra para la enzima involucrada?
14.
Es factible la identificacin de cetocidos mediante cromatografa?. De qu
manera?
38
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA
(TGP) EN SUERO SANGUINEO
Objetivos
Estudio de la transaminacin en sueros normales y patolgicos
Aplicacin del mtodo colorimtrico de Reitman y Frankel para la determinacin

de la actividad de la TGP srica.
Mtodos.
Determinar la cantidad de piruvato formado luego de reaccionar Alanina y - ceto
Glutarato en presencia de la TGP del suero utilizando la reaccin con la 2,4 dinitro
fenilhidrazina en medio alcalino.
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo rotulados como B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:
REACTIVOS
Sustrato TGP (Alanina y ceto glutarato en Tampon Fosfato pH 7.4)
0.25 ml 0.25 ml
Colocar en Bao mara a 37 C por 2 minutos y aluego agregar:
Suero sanguineo
-----50 l
Agua destilada
-----50 l
Mezclar por agitacin suave. Incubar exactamente por 30 minutos y luego agregar:
Reactivo 2.4 DNFH ( 2,4 Dinito fenilhidrazina)
0.25 ml 0.25 ml
Mezclar. Dejar durante 10 minutos a 37 C. Luego agregar:
NaOH 0.4 M
2.5 ml
2.5 ml
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 minutos leer en el fotocolormetro
con filtro verde (500-550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua
destilada.
Construccin de la curva de calibracin.
Para poder convertir la absorbancia de la muestra en unidades de actividad enzimtica es
necesario construir la curva de calibracin respectiva.
39
As, usando los datos de la siguiente Tabla, haga en papel milimetrado la curva
correspondiente y pguela en el espacio sealado. Coloque en el eje vertical (Y) las
absorbancias netas y en el eje horizontal (X) las actividades en unidades/litro de suero.
Actividad
TGP en U/L
Absorbancia
(DO)
13
28
46
66
90
0.165
0.240
0.300
0.360
0.410
0.455
Valores Normales.
Actividad TGP srica : 6 30 U/L
Actividad TGO srica : 8 40 U/L
1.- Complete la siguiente Tabla:
SISTEMAS
Absorbancia bruta
Absorbancia neta
Actividad de TGP (U/L)
2.- Haga un breve comentario del experimento realizado y del valor de actividad
transaminsica obtenida.
Interrogantes Bioqumicas.
1.- Escriba las reacciones catalizadas por la TGP y TGO.
2.- Qu papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminacin.

Explique su mecanismo de accin.
3.- Se desprende amoniaco libre en el medio durante las reacciones de transaminacin?

Fundamente su respuesta.
40
4.- De qu manera es de utilidad la determinacin de la actividad TGP en el diagnstico de

la deficiencia de piridoxina? Si en un paciente se encuentra disminuida la actividad TGP
del suero, es suficiente este dato para diagnosticarlo como deficiente en piridoxina?.
Por qu?
5.- Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente

citoslica. Est Ud. de acuerdo con esta afirmacin? Cul sera la distribucin
intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta.
6.- Si en el experimento de transaminacin que Ud. ha realizado, colocara cido pirvico

uniformemente marcado con C-14. Qu aminocidos esperara encontrar marcados
preferentemente? Fundamente su respuesta.
7.- Si se administra glucosa C-14 a un animal de laboratorio, los carbonos marcados se

incorporarn en una protena? Seale la secuencia de reacciones que permita explicar
este proceso.
8.- Participan las reacciones transaminacin en la biosntesis de aminocidos? Cite algunos

ejemplos.
9.- Qu otro mtodo, adems del que se us en esta prctica, podra emplear para detectar
los productos de la reaccin de transaminacin.
41
10.- Qu pensara de un ensayo en el cual una muestra de suero es mezclada con aspartato,
alfa ceto glutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa? Cul sera su
fundamento? La actividad de qu enzima se estara midiendo?
PRACTICA N 6
GLUCOGENO HEPATICO
1. Determinacin de glucgeno heptico en animal alimentado
2. Determinacin de glucgeno heptico en animal en ayunas
3. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con adrenalina
4. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con aloxano
INTRODUCCION
El glucgeno es una forma de almacenamiento de glucosa fcilmente movilizable. Al
igual que la amilopectina del almidn, es un polisacrido ramificado, constituido por
unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por
enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones estn separadas unas de otras por lo menos cuatro
residuos en las porciones ms centrales de la molcula hacindola ms compacta.
El glucgeno, polisacrido de reserva, se encuentra en los tejidos animales, pero
abunda especialmente en el hgado y en el msculo. Aparece en las clulas como partculas
discretas, las cuales evidentemente son agregados de molculas con un peso molecular que
varia alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucgeno varia ampliamente, no solamente
42
entre diferentes tejidos, sino tambin dentro de un mismo tejido, dependiendo del
suministro de glucosa y de la demanda metablica de energa. El hgado y el msculo
contienen los ms grandes depsitos de glucgeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de
su metabolismo en estos rganos.
En general la dieta afectar ms el contenido de glucgeno del hgado que el del
msculo, mientras que el ejercicio fsico afectar ms el contenido de glucgeno muscular
que el del hgado. Adems los depsitos de glucgeno heptico y muscular tendrn
diferentes roles. El glucgeno muscular esta presente para servir como una reserva de
combustible para la sntesis de ATP dentro del msculo, mientras que el glucgeno
heptico funcionar como una reserva de glucosa para el mantenimiento de la
concentracin de glucosa en sangre (glicemia).
Un valor tpico para el contenido de glucgeno heptico en una persona bien alimentada
es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos despus del ayuno y mucho ms
despus de una dieta rica en carbohidratos. El msculo esqueltico tpicamente tiene
1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho despus del ayuno nocturno o con una dieta
rica en carbohidratos.
El glucgeno heptico puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacridos
(glucognesis), como tambin de residuos provenientes del metabolismo intermediario de
los hidratos de carbono, protenas y lpidos (gluconeognesis). Las vas de sntesis de
glucgeno (glucognesis) y de degradacin hasta glucosa (glucogenolisis), son
independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del
glucgeno acten independientemente.
La glucgeno sinteasa y la glucgeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de
sntesis y degradacin de glucgeno respectivamente. Ellas son reguladas recprocamente;
cuando una es estimulada, la otra es inhibida, nunca estn completamente activas
simultneamente.
GLUCOGENO SINTEASA A ACTIVA
OH
Sntesis de glucgeno favorecida

GLUCOGENO FOSFORILASA B INACTIVA
OH
Pi
H2O
ATP
ADP
GLUCOGENO FOSFORILASA A ACTIVA
O-P
43
GLUCOGENO SINTEASA B INACTIVA
O-P
Degradacin de glucgeno favorecida

Regulacin recproca de la glucgeno sinteasa y la glucgeno fosforilasa por fosforilacin
y defosforilacin. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P
OBJETIVOS:
1. Realizar la determinacin de glucgeno heptico
2. Cuantificar los niveles de glucgeno heptico en diferentes estados nutricionales y
hormonales:
-
Animal alimentado normalmente (ad libitum)
Animal en ayunas
Animal tratado con adrenalina
Animal Diabtico (tratado con aloxano)
PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES
a) Rata A: Que recibir su alimentacin habitual sin restriccin alguna.
b) Rata B: Que permanecer en ayunas por lo menos 24 horas antes del
experimento.
c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025
mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipacin a la
prctica. Utilizar una solucin de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectar por va subcutnea una
solucin de aloxano ( 50 mg / ml ) a razn de 200 mg / Kg de peso.
2. EXTRACCIN DEL GLUCGENO
Mtodo: Mtodo de krisman
Fundamento:
44
Se trata un trozo de tejido heptico con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo
degradadas las protenas y otros constituyentes; quedando preservado el glucgeno, el cual
es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinacin
colorimtrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reaccin con la presencia del cloruro de
calcio.
Reactivos:
1. Solucin iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio.
Disolver en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de
calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solucin de cloruro de calcio con 0,5 ml
de la solucin iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 C, durante siete das
mximo.
Procedimiento:
1. En un tubo de centrfuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un bao
mara hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitacin y tan rpido como sea posible extraer el
hgado y pesar 100 mg de l. Colocar inmediatamente el trozo de hgado en la
solucin de KOH que se encuentra en el bao hirviente y dejarlo all por 20
minutos, agitando de vez en cuando para permitir la disgregacin del tejido.
3. Retirar el tubo del bao y enfriar. Aadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y
calentar la solucin hasta la ebullicin teniendo cuidado que no se proyecte.
Enfriar inmediatamente en bao de hielo por 5 minutos, para permitir la
precipitacin del glucgeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el
tubo boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de lcali aadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y
mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solucin
aadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo
45
6. Preparar un blanco para lo cual se mide 0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del
reactivo de yodo; proceder enseguida igual que las muestras problema.
7. Colocar el tubo en bao mara hirviente durante 15 minutos y enfriar. Aadir 0,2
ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo. Si la cantidad de glucgeno
precipitado es grande, hacer en esta etapa una dilucin apropiada.
8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde
9. Para preparar las soluciones estndar se pueden medir 0,4 ml de soluciones que
contengan 0,06 mg, 0,18 mg 0,24 mg de glucgeno. A cada una de estas tres
soluciones estndar, aadir 2,6 ml del reactivo de iodo , mezclar y proceder de la
misma forma que la sealada para la muestra de hgado.
Resultados.
1. Anotar el aspecto y tamao del hgado de los animales de experimentacin
Rata A: ...........................................
Rata C: ................................................
Rata B: ............................................
Rata D: ................................................
2. Observar la cantidad de precipitado despus de centrifugar.

Absorbancia
bruta
BLANCO
ESTANDAR 1
ESTANDAR 2
Absorbancia Concentracin
neta
de Glucgeno
(mg)
0.118
0.192
0.338
46
Factor de
calibracin
ESTANDAR 3
0.416
3. Calcular el factor de calibracin: ..........................

4. Graficar la curva de calibracin con los datos anteriores. Utilizando papel
milimetrado
5. Calcular la concentracin de glucgeno en cada una de las muestras Expresar los

resultados en mg de glucgeno por 100 mg, 200 mg y en el peso total del tejido
heptico
Peso del
hgado
(mg)
Ab
Ab
Bruta Neta
CONCENTRACION en mg
/ 200 mg / 100 mg / Hgado
Hgado
Hgado
Total
Rata A
5.35
1.20
(Alimentado )
Rata B
4.50
0.50
(ayunas)
Rata C
4.32
0.44
(trat. con adrenalina)
Rata D
3.98
0.38
(trat. con aloxano)
6. Calcular el porcentaje de disminucin del glucgeno en 100 mg de hgado con
relacin al animal alimentado
mg de glucgeno/
100 mg de hgado
RATA A
RATA B
RATA C
47
Porcentaje de disminucin en
relacin al animal alimentado
RATA D
7. Haga la interpretacin de los resultados para cada rata:
Rata A:
Rata B:
Rata C:
Rata D
INTEROGANTES
1. Qu ventaja tiene la fosforlisis del glucgeno en comparacin con la hidrlisis.
2. Qu diferencia hay entre la accin glucogenollitica de la adrenalina y glucagon en el

hgado y en el msculo.
3. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la adrenalina sobre la

regulacin en el metabolismo del glucgeno.
3. Si se administra leucina marcada con C-14 ser factible ala identificacin posterior de
glucgeno marcado con C-14.
4. Cmo se explica que el animal diabtico tenga menores niveles de glucgeno heptico
que su contraparte normal.
48
5. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la insulina sobre el

metabolismo del glucgeno.
49
PRACTICA No 7
METABOLISMO DE LIPIDOS: HIGADO GRASO EXPERIMENTAL
1. Produccin de un hgado graso en rata
2. Determinacin de cidos grasos en el hgado de una:
-
Rata control
Rata a la cual se ha administrado Etionina
Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina
INTRODUCCION
El rol que cumple el hgado en el metabolismo lipdico es sumamente importante. En
este sentido podemos decir que los siguientes procesos se realizan en la:
-
Oxidacin de los cidos grasos
Sntesis de cidos grasos y colesterol
50
Sntesis de lipoproteinas plasmticas :Lipoproteinas de muy baja densidad

(VLDL); lipoproteinas de alta densidad (HDL)
Sntesis de cidos biliares
Se encarga casi exclusivamente de la sntesis de cuerpos cetnicos
PPi de estos procesos en el hgado, lo que

En ocasiones puede ocurrir ATP
alteraciones
determina un anormal aumento en su contenido graso, esta situacin se denomina hgado
METIONINA
METIONIL - AMP
graso o esteatosis heptica. Esta
entidad merece
una especial atencin del mdico ya que
Metionil-tRNA
Sinteasa
tRNA
resulta
ser con frecuencia el antesala de la cirrosis heptica.
ATP
ATP Metionina Adenosil
Transferasa
AMP
PPi +Desde
Pi un punto de
vista general podemos considerar hasta cuatro situaciones
Estrgeno
Met-tRNA
importantes
que pueden ocasionar hgado graso.
S-Adenosilmetionina
Fosfatidil
Aumento en laetanolamina
cantidad de cidos grasos que llegan al hgado; sea procedentes
de la alimentacin o de otros tejidos
Fosfatidil
Sntesis Proteica
Menor oxidacin colina
de los cidos grasos en el hgado
Mayor sntesis de cidos grasos en el hgado
- Disminucin en la salida lipdica del hgado generalmente debido a un defecto

S-adenosilhomocisteina
LIPOPROTEINAS
en la sntesis de lipoproteinas plasmticas.
ATP
ETIONINA
ATP
PPi + Pi
PPi
Metionil-tRNA Sinteasa
ETIONIL - AMP
tRNA
ATP Metionina Adenosil

Transferasa
Estrgeno
S-Adenosiletionina
Fosfatidil
etanolamina
Fosfatidil
etilcolina
S-adenosilhomocisteina
Sntesis Proteica
LIPOPROTEINAS
FIGURA N 7.. Rol de la Metionina y efecto de Etionina sobre el metabolismo

lipdico
51
Arriba: Mecanismo por el cual la metionina
participa en la sntesis de lipoproteinas.
Abajo: Como la etionina afecta la sntesis de lipoproteinas.
Nota: Las lneas discontinuas indican que el evento no se est realizando.
Experimentalmente se puede inducir el hgado graso mediante la administracin de

diversos agentes, como el tetracloruro de carbono, puromicina, cido ortico, etionina, etc.
En esta prctica estudiaremos el hgado graso inducido por la etionina, tomando como
parmetro el contenido de cidos grasos del hgado, ya que a pesar que el hgado graso
puede ser inducid de diversas formas, es comn denominador el aumento de triglicridos
Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al aminocido esencial
metionina y por lo tanto tiene un comportamiento de antagonista competitivo, en la sntesis
de protenas y de fosfatidil colina, de esta manera bloquea la sntesis de lipoproteinas y
finalmente la salida de lpidos del hgado.
COOH
COOH
CH CH2 CH2 S CH3

NH2
CH CH2 CH2 S CH2 CH3

NH2
Metionina
Etionina
Objetivos:
1.- Conocer el mecanismo bioqumico por el cual etionina induce esteatosis heptica
52
2.- Conocer el fundamento de la determinacin de los cidos grasos en el hgado

3.- Estudiar el efecto de la metionina sobre el hgado graso producido por metionina
4.- Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que sufren esteatosis
heptica
Metodologa.
El da anterior a la prctica se inyecta va intraperitoneal a un lote de tres ratas
hembras, las siguientes soluciones:
1.- Rata control: Solucin salina isotnica 3 ml. Inyectar la misma cantidad a las 2:30, 5
horas y 7 horas despus de la primera inyeccin.
2.- Rata tratada con Etionina: Se inyectar intraperitonealmente 3 ml de una solucin
de DL-Etionina (16,7 mg/ml). Inyectar la misma cantidad alas 2,5 horas; 5 horas y 7
horas despus de la primera inyeccin.
3.- Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo tratamiento que la rata
con etionina, pero adems se le inyecta 3 ml de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora
antes de la primera inyeccin de etionina y una hora despus de cada inyeccin de
etionina.
En este experimento se usarn ratas hembras, debido a que el incremento de grasa
heptica es mucho ms pronunciada en hembras que en machos.
DETERMINACION DE LOS ACIDOS GRASOS
- Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los animales se les sacrifica y se
les retira rpidamente del hgado un trozo de 2,5 g, el que se fragmenta con la ayuda
de tijeras y se deposita en un Erlenmeyer de 250 ml.
- Se le aade luego 10 ml de hidrxido de potasio al 33% y 40 ml de etanol al 96% con
alcohol isoamlico al 0,4%.
- Se calienta la preparacin en bao mara hirviente durante 20 minutos, teniendo
cuidado que no se proyecte el contenido.
- Aadir 17 ml de HCl al 25%, mezclar y dejar en reposo algunos minutos
- Aadir luego con pipeta volumtrica 25 ml de ter de petrleo.
- Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente durante un minuto. Dejar en
reposo por 10 minutos para conseguir una adecuada separacin de las fases ter de
petrleo y etanol-cido. Para esta ltima etapa se puede utilizar una probeta en lugar
del Erlenmeyer, con la ventaja de mirar mejor la separacin de las dos fases.
53
- Retirar 5 ml de la capa etrea (superior), y colocarlos en un Erlenmeyer y aadir 1 ml

de solucin de etanol-alcohol isoamlico y dos gotas de azul de timol.
- Finalmente titular con NaOH 0.1 N hasta obtener un color azul verdoso que debe
permanecer estable por lo menos 3 minutos.
Para efecto de los clculos asuma que el PM promedio de los cidos grasos que se estn
titulando es de 284.
Complete la siguiente tabla:
Rata control
Rata con etionina
Rata con Etionina + Metionina
Caractersticas del hgado

Peso total
Color
Consistencia
6.8 gr
7.3 gr
7.2 gr
Anote el contenido de cidos grasos en miliequivalentes en el volumen de titulacin y en

miligramos por gramo de tejido heptico hmedo.
NaOH 0,1 N
ml gastados
Rata Control
1.3
Rata con
etionina (E)
Rata con E +
Metionina
3.6
Contenido de cidos grasos

mEq / 5 ml mEq / 25 ml
mg de A.G.
por gramo
de hgado
2.0
INTERROGANTES
1.- Haga una interpretacin adecuada de los esquemas mostrados
2.- Porque la administracin de adenina revierte en cierta forma los efectos de la etionina
3.- Cite por lo menos cinco alteraciones bioqumicas que se producen en los animales
tratados con etionina
54
4.- Porqu la deficiencia de cido pantotnico puede determinar hgado graso
5.- Qu conocimientos tiene, en relacin al hgado graso inducido por etanol
55
PRACTICA N 8
HIPERBILIRRUBINEMIAS
1.- Determinacin de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguneo
2.- Identificacin de pigmentos biliares en la orina (Reaccin de Gmelin)
INTRODUCCION
Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan con aumento en la
concentracin de bilirrubina en el suero sanguneo. Este aumento puede ser a predominio
de la bilirrubina directa (conjugada); en cuyo caso se hablara de hiperbilirrubinemias a
predominio indirecto o a predominio directo. Sin embargo resulta ms apropiado agrupar
las hiperbilirrubinemias en atencin al mecanismo de su produccin y desde este punto de
vista, se describen cuatro categoras:
I.- Hiperbilirrubinemias por sobreproduccin de bilirrubina
II.- Hiperbilirrubinemias por menor captacin heptica de bilirrubina
III.- Hiperbilirrubinemias por alteracin en la conjugacin heptica de la bilirrubina
IV.- Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excrecin de bilirrubina
56
Para la tipificacin de las hiperbilirrubinemias se han descrito diversos anlisis de

laboratorio. Entre estos podemos destacar :
a) Determinacin de bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguneo
b) Identificacin de pigmentos biliares (bilirrubina) en la orina
c) Excrecin urinaria de urobilingeno
d) Medida de la actividad transaminsica (TGP y TGO) en suero
e) Medida de la actividad glucoronil transfersica del hgado
f) Medida de la actividad fosfatsica alcalina del suero
g) Prueba de la bromosulfotaleina
De todas estas determinaciones slo se practicarn las dos primeras en la presente
prctica y se usarn como muestra el suero sanguneo y la orina de un paciente ictrico y
de una persona aparentemente normal.
EXPERIMENTO 1
DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL
SUERO (Mtodo: Malloy Evelyn.)
Fundamento del mtodo.
M
HO
C
H
Acido Sulfanlico
Diazotizado
HSO3
HO
CH2
H
H
B I L I R R U B I N A
OH
C
H
N = NCl
C
H
CH2Cl
HSO3
N=N
C
H
COMPLEJO DE COLOR ROJO
Figura N 8.- Diazo reaccin de Ehrlich

57
OH
Objetivos:
1.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia.
2.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal
3.- Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones
Procedimiento
1.- En 4 tubos de prueba rotularlos como I, II, III y IV, medir lo siguiente:
I
II
Suero diluido (1/10)
2,0
2,0
Agua destilada
2,5
2,5
Metanol
----Reactivo de Erhlich
0,5
--Reactivo blanco
--0,5
2.- Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos
III
2,0
--2,5
0,5
---
IV
2,0
--2,5
--0,5
3.- Leer en el fotocolormetro utilizando filtro verde

4.- Con anterioridad a la practica se prepar un sistema estndar, midiendo 2,5 ml de
una solucin de bilirrubina (0.004 mg/ml), se aadi luego 2.5 ml de metanol y
0.5 ml del reactivo de Erhlich. Se midi la absorbancia en las condiciones
sealadas para el suero (2 y 3) y se obtuvo una lectura de 0.224.
5.- Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del paciente ictrico y el
suero normal
Expresin de los resultados
1.- Estimar el factor de calibracin porcentual
Absorbancia del Estndar
: .................
Concentracin del Estndar
: .................
Factor de calibracin
: .................
Factor de calibracin porcentual
: ................
2.- Completar la siguiente tabla:

ABSORBANCIAS
I
II
III
CONC. BILIRRUBINAS
IV
Suero Normal
Suero A
Suero B
0.052 0.034 0.430 0.046

58
BT
BD
BI
Suero C
0.194 0.058 0.292 0.052
3.- Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la concentracin de

bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina indirecta (BI), estn aumentados (A),
normales (N) o disminuidos (D).
Bilirrubina directa
Bilirrubina indirecta
(BD)
(BI)
MUESTRA A
MUESTRA B
MUESTRA C
EXPERIMENTO 2
IDENTIFICACIN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA
Objetivos
1.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina colrica
2.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina normal y comparar el resultado
obtenido con el correspondiente a la orina colrica
Mtodo
Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la accin oxidante del
cido conteniendo trazas de cido nitroso (reaccin de Gmelin).
Procedimiento
1.- En un tubo de prueba medir 2 ml de orina
2.- Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, 2 ml de cido ntrico-nitroso,
tratando que se formen dos capas
3.- Observar los cambios de coloracin que ocurren entre ambas capas
4.- Hacer la reaccin utilizando la orina patolgica y una orina normal
Expresin de los resultados
Anote sus resultados en el espacio en blanco
1.- Orina normal
2.- Orina patolgica
INTERROGANTES
59
1.- Qu Contiene el reactivo de Erhlich
2.- Porqu no se prepara un tubo blanco para la determinacin de bilirrubinas por el

mtodo de Malloy Evelyn. Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no corresponden a
los blancos que Ud. esta acostumbrado a preparar.
3.- Qu bilirrubina es la que se determina en el tubo N 3 y por qu?

4.- Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reaccin de Gmelin. Fundamente su
respuesta.
5.- El urobilingeno da positiva la reaccin de Gmelin?
6.- Qu tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en cantidades trazas en una

persona normal?
7.- A qu se llama ictericia?
8.- Cumplen rol fisiolgico los pigmentos biliares?
9.- Seale las causas ms comunes de un aumento de bilirrubina tipo directa.
60
61
PRACTICA-TALLER N 9
ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS NUCLEOTIDOS
Caso Clnico 1
N.S.T.es un empleado de 47 aos de edad que asisti al servicio de emergencia de un
hospital, quejndose de un dolor muy intenso en el primer dedo del pi derecho y que
haba comenzado 6 horas antes de la consulta.
No haba sufrido ningn trauma en ese dedo, pero al examen clnico apareca rojo e
hinchado. Estaba con mayor temperatura y extremadamente doloroso a cualquier presin.
El Paciente no poda flexionar ni extender las articulaciones de dicho dedo y el
movimiento pasivo de las mismas le causaba un intenso dolor. El resto del examen clnico
fue completamente normal.
Los exmenes de laboratorio resultaron normales, con excepcin de una excrecin
urinaria de cido rico de 1.21 g / 24 hrs (V.N. 0.3 a 0.6 g / 24 hrs.) y una concentracin de
cido rico en el suero de 0.64 mmoles / L. Se obtuvo mediante aspiracin con una aguja,
una muestra de lquido de la articulacin comprometida y la observacin bajo microscopa
de luz polarizada revel la presencia de cristales semejantes a agujas y que se encontraban
tambin fagocitados por leucocitos. Este material fue informado como cristales de urato de
sodio.
En Vista de lo anterior, nuestro paciente fue diagnosticado como gotoso y una vez
mejorado el cuadro agudo, se le indic para su tratamiento Alopurinol por va oral a la
dosis de 150 mg dos veces al da. A los pocos das de iniciado el tratamiento el cido rico
62
srico comenz a bajar y luego de varias semanas dichos valores ya estaban muy cerca de
lo normal.
El Paciente fue controlado durante los meses siguientes, no volviendo a presentar un
episodio similar de artritis gotosa e igualmente no se constat manifestaciones sugerentes
de la presencia de clculos renales de cido rico.
Caso Clnico 2
Nuestro paciente es ahora una nia de 22 meses de edad, nica hija de un matrimonio
entre primos hermanos. Desde su nacimiento present una severa deficiencia de linfocitos
T, que se manifest por infecciones respiratorias
frecuentes, candidiasis y marcada
linfopenia, menos de 500 linfocitos por microlitro de sangre. Se considera linfopenia en

nios cuando el nmero de linfocitos es menor a 3000 por microlitro de sangre;
normalmente los linfocitos T son cerca del 50 % del nmero total de linfocitos.
La administracin de vacuna contra la difteria, tos convulsiva y ttano produjo una
mnima respuesta en la nia.
Se practic la determinacin de la actividad de las isoenzimas de Adenosina
Desaminasa (ADA) en un lisado de hemates de la paciente, hacindose el mismo estudio
en ambos padres y en dos controles normales. Los resultados se muestran en la figura
adjunta y corresponden a la separacin electrofortica de las dos isoenzimas ms
importante de la ADA y su tincin para determinar su actividad. La determinacin
espectrofotomtrica de la actividad total de la ADA demostr ausencia de actividad en los
hemate de la nia ; en tanto que el padre y la madre tenan actividades de ADA que
correspondan al 50 % y 60 % de lo normal respectivamente..
Canaletas:
1
1.- Control normal (a)

2.- Nia afectada
3.- Madre
4.- Padre
5.- Control norma (b)l
Figura.- Representacin esquemtica del aspecto del
electroforetograma de las isoenzimas de ADA, luego
de su tincin para medir su actividad
63
En la nia deficiente de ADA, se detrminaron los niveles de desoxinucletidos de

adenina en los eritrocitos, obtenindose los resultados que se muestran en la tabla
siguiente.
TABLA 1.- Niveles de desoxinucletidos de Adenina en los eritrocitos de la nia
afectada (nmoles/ml de paquete de hematies
PACIENTE
NORMAL
NSD: No se detecto
dATP ( nmoles/ml)
904
NSD
dADP (nmoles/ml)
98
NSD
dAMP (nmoles/ml)
5
NSD
Bases Moleculares y Correlato Clnico-Bioqumico.

Si bien se ha descrito varias enfermedades asociadas a alteraciones en el metabolismo
de los nucletidos pricos y pirimidnicos, las alteraciones que predominan en humanos
son aquellas que resultan de un alterado catabolismo de los nucletidos pricos.
La Tabla 2. Muestra las diferentes enfermedades asociadas a alteraciones en el
metabolismo de nucletidos pricos y pirimidnicos
TABLA N 2 .- ENFERMEDADES ASOCIADAS A ALTERACIONES EN EL METABOLISMO
DE LOS NUCLEOTIDOS PURICOS Y PIRIMIDINICOS.
1.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PURINAS

Enfermedad
Enzima afectada
Gota
PRPP Sinteasa, PRPP Amidotransferasa
HGPRT (parcialmente)
Sndrome de Lesch-Nyhan
HGPRT (completamente)
Inmunodeficiencia Severa Combinada Adenosina Desaminasa ADA
(SCID)
Xantinuria
Xantino Oxidada
Inmunodeficiencia
Purinonuclesido Fosforilasa (PNP)
Enfermedad de Von Gierke
Glucosa 6 Fosfatasa
2.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PIRIMIDINAS
Aciduria Ortica Tipo I
Orotatofosforribosiltransferasa y OMP
Descarboxilasa
Aciduria Ortica Tipo II
OMP Descarboxilasa
Aciduria Ortica Moderada sin el Ornitina carbamil transferasa (enzima del
componente hematolgico
Ciclo de la rea).
GOTA.
Es el transtorno ms frecuente del metabolismo de los nucletidos y se caracteriza por
una excesiva produccin de cido rico, que a causa de su escasa solubilidad en el agua
tiende a precipitar como cristales de urato de sodio, de manera especial en el lquido
sinovial de las articulaciones. Las clulas fagocticas intentan digerir este material, pero su
64
tamao y la indigestibilidad de los cristales causa ms bien la destruccin de estas clulas

y la liberacin de sus enzimas lisosomales al espacio articular. Estas enzimas a su vez
determina una reaccin inflamatoria aguda de la capsula articular (sinovitis) determinando
las tpicas manifestaciones de la artritis gotosa.
La manifestacin bioqumica caracterstica de la gota es el aumento de cido rico en
sangre (hiperuricemia) y casi siempre esta acompaada con aumento en su excrecin
urinaria (uricosuria). Los valores normales para el cido rico en sangre son de 3.5 a 7.0
mg % en varones y de 2.6 a 6.0 mg % en mujeres y debe tenerse en cuenta que estos
valores aumentan con la altitud. La excrecin urinaria vara normalmente entre 0.3 a 0.6
g/da.
Se acostumbra clasificar a la gota en primaria y secundaria. La primera corresponde al
transtorno producido por alteracin gentica, la secundaria es consecuencia de otras
alteraciones, como la leucemia, la policitemia, el uso de antimetabolitos para disminuir la
sntesis de cidos nucleicos, etc.
La frecuencia con la que se presenta al gota es relativamente alta, cerca del 3% en los
EEUU y en otros pases parece ser muy similar. La incidencia familiar es del 70 al 80% y
es mucho ms frecuente en varones que en mujeres (proporcin 3 a 1).
Se han descrito diversas situaciones que pueden explicar la mayor produccin de cido
rico en un paciente gotoso. Destaquemos las siguientes:
Aumento en la actividad de la fosforribosil Pirofosfato Sinteasa (PRPP sinteasa).
Resistencia de la PRPP sinteasa a su inhibicin por retoalimentacin. Sera el caso

en que sus metabolitos reguladores, como el GMP. AMP e IMP que normalmente
se unen a la enzima y la inactivan, por algn cambio en la estructura de la misma,
no se pueden unir y por lo tanto sigue aumentando la sntesis de nucletidos
pricos.
Aumento en la afinidad de la enzima por la Ribosa 5P. Al cambiar la estructura de

la enzima su afinidad por el sustrato aumenta (menor KM) y por lo tanto aumenta la
sntesis de PRPP.
Aumento en la afinidad de la PRPP amidotransferasa por el PRPP motivado por

una alteracin en la estructura de la enzima.
65
Perdida de la inhibicin por retroalimentacin de la PRPP amidotransferasa. Los

nucletidos que normalmente la inhiben (AMP, ADP, ATP, GMP, GDP y GTP) no
pueden hacerlo.
Deficiencia pacial en la actividad de la enzima Hipoxantina-guanina fosforribosil

transferasa ( HGPRT) que impide la reutilizacin de hipoxantina
y guanina
determinando su destino hacia la mayor formacin de cido rico.

En el tratamiento de la gota se usa un anlogo de hipoxantina que es el Alopurinol.
Recordemos que la Xantino Oxidasa cataliza la conversin de hipoxantina en xantina y
posteriormente de la xantina en cido rico (ver figura). Estando en el medio el alopurinol,
la xantino oxidasa lo hidroxila y lo convierte en aloxantina (oxipurinol). Este compuesto
permanece unido al complejo Mo-S de la enzima y lo inhibe, no permitiendo la formacin
de ms cido rico.
O
O
HN
N
N
X.O
HN
N
N
H
Alopurinol
Aloxantina
O
N
HN
N
H
N
H
O
N
HN
X.O
N
N
H
N
H
Xantina
Hipoxantina
Figura N
X.O
O
N
H
HN
H
N
O
O
N
H
N
H
Acido Urico
Efecto inhibitorio del Alopurinol sobre la Xantino Oxidasa
Tambin se ha descrito que el alopurinol puede reaccionar con el PRPP formando el

nucletido correspondiente y utilizando PRPP y determinando que bajen sus niveles y
disminuya la sntesis de purinas.
Sindrome de Lesch-Nyhan.
El sndrome de Lesch-Nyhan resulta de una alteracin a nivel del gen que codifica para
la enzimahipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, que est localizado a nivel del
cromosoma X (Xq26-q27.2) determinando una enfermedad que se transmite bajo la
66
modalidad ligada al sexo. Los pacientes tiene severas manifestaciones de gota, ya que hay
un gran aumento en la formacin de cido rico y adems desarrollan conductas
sumamente agresivas que los lleva a su propia automutilacin, frecuentemente se muerden
las extremidades distales de los dedos y los labios. Junto a lo anterior, los pacientes
muestran movimientos involuntarios y retardo mental. El pronstico es malo y
generalmente estos pacientes mueren antes de alcanzar los 20 aos de edad.
La severidad de esta alteracin hace ver la importancia de la va de sntesis de
nucletidos pricos por la va de recuperacin y parece ser que sta sntesis a nivel
extraheptico es sumamente importante y se vera completamente afectada en estos
pacientes, contribuyendo a explicar la severidad de su cuadro.
Deficiencia de Adenosina Desaminasa.
En esta enfermedad tambin denominada Inmunodeficiencia Severa
Combinada8SCID), hay una marcada deficiencia de la enzima Adenosina Desaminasa que
normalmente cataliza la remocin del grupo amino de la desoxiadenosina y de la
adenosina, durante el catabolismo de las purinas. Las clulas que ms sufren la deficiencia
de esta enzima son los linfocitos T y tambin los linfocitos B. Estas clulas acumulan
grandes cantidades de desoxiadenosina que al ser fosforilada rinde grandes cantidades ( 50
veces ms de lo normal) de dATP. La alta concentracin de ste nucletido inhibe a la
Ribonucletidoreductasa evitando la formacin de otros dNTP y por lo tanto inhibiendo la
sntesis de ADN. Como los linfocitos tienen que proliferar en respuesta a los invasores que
llegan al organismo, la respuesta inmune fracasa y los nios portadores de esta enfermedad
no pueden superar el menor proceso infeccioso y frecuentemente mueren antes de los 2
aos de edad.
BIBLIOGRAFIA.
MONTGOMERY R., COWAY T., SPECTOR A. and CHAPELL D. (1996) Biochemistry.
A case-oriented approach. VI Ed. Mosby. St Louis. USA.
CHAMPE P. and HARVER R. (1996). Biochemistry. II ed. Lippincott-Raven. Philadelhia.
USA.
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adenosine deaminase for lymphocyte function- BBRC 272:311-315.
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Rheumatology 16: 282-286
67
ROTT K. and AGUDELO C. (2003). Gout. JAMA 289: 2857-2860

CUESTIONARIO
1.- Expresar la concentracin del cido rico del paciente del caso clnico 1, en mg% (PM
del cido: 168).
2.- La concentracin intracelular del PRPP es normalmente es de 10 -5 a 10-6 mol/L. La

determinacin de la KM de la fosforribosil pirofosfato amidotransferasa para PRPP en un
paciente gotoso dio un valor de 2 x 10-5 M, en comparacin con un control normal cuyo
valor result 3 x 10-4 M. Utilizando estos datos proponga el mecanismo que explicara la
hiperuricemia del paciente.
3.- Para determinar si una persona con gota ha desarrollado su enfermedad por una
sobreproduccin de cido rico o a causa de una disminucin en su capacidad de
excretarlo, se hace con frecuencia la prueba de la administracin oral de un aminocido
radioactivo. Qu aminocido sera el ms apropiado y como se procesara dicha prueba?
4.- Qu alimentos por su alto contenido en purinas deben ser excluidos de la dieta del
paciente gotoso? Es suficiente este tipo de tratamiento para normalizar los valores sricos
de cido rico en los pacientes gotosos?
5.- Explicar la hiperuricemia de los pacientes con el sndrome de Lesch-Nyhan. Proponga

alguna explicacin sobre la causa de las alteraciones neurolgicas que estos pacientes
presentan.
68
6.- Explicar la hiperuricemia que se encuentra frecuentemente asociada: a) A la deficiencia

de glucosa 6 fosfatasa (Enfermedad de Von Gierke) y b) A la hiperactividad de la glutatin
reductasa.
7.- Como acta el alopurinol en el tratamiento de la gota? Por qu se seala que el

alopurinol es un inhibidor suicida?
8.- Cul es el mecanismo de accin de la colchicina en el tratamiento de la gota? En que

momento se le usa?
9.- Cmo se explica que los cristales de cido rico en el lquido articular de los gotosos
corresponda a urato monosdico, en cambio en la orina de los mismos pacientes los
cristales sean frecuentemente de cido rico solamente. Podra encontrarse en estos
pacientes, cristales de urato disdico en algn lugar del organismo?
10,. Por qu mecanismo (s) el alcoholismo puede determinar hiperuricemia?
11.- Que explicacin puede dar a los resultados mostrados en el electroforetograma de las
isoenzimas de ADA en el caso clnico 2?. Teniendo en cuente que en los hemates hay una
gran cantidad de protenas, cmo se puede mediante la tcnica utilizada,detectar solamente
las dos isoenzimas ms importantes de la Adenosina Desaminasa?
69
12.- Como se explica la linfopenia del paciente del caso clnico 2 y los continuos cuadros
de infeccin respiratoria que present?
13.- Que evidencia (s) existe (n) que los altos niveles de dATP en los pacientes con
deficiencia de ADA sean los que inhiban a la Ribonucletidoreductasa y determinen menor
sntesis de ADN y con ello el dao a los linfocitos?
15.- De qu manera se ven afectadas las reacciones de metilacin en que interviene SAdenosil Metionina (SAM), en los pacientes con deficiencia de ADA. Utilice en su
explicacin el siguiente esquema.
METIONINA
S- ADENOSILMETIONINA
(SAM)
Metil
Transferasa
X
X CH3
S-ADENOSILHOMOCISTEINA
(SAH)
Hidrolasa
HOMOCISTEINA
70
ADENOSINA
71
PRACTICA N 10
INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO
1. Produccin de Diabetes Experimental
2. Determinacin de glucosa en sangre
3. Determinacin de glucosa en orina
4. Determinacin de cuerpos cetnicos en orina
INTRODUCCION.
El metabolismo intermediario de cada clase de sustrato por lo general es considerado
por separado; sin embargo, estos procesos ocurren en nuestro organismo en forma
concertada, donde las diferentes vas metablicas se hallan enlazadas, formando una
verdadera red metablica controlada rigurosamente por diferentes mecanismos
regulatorios.
Esta integracin exquisitamente regulado, es la que permite a cada clula llevar a cabo
sus funciones bioqumicas y sin duda, de esta intima y armoniosa organizacin depender
la funcin integrada de todas las clulas que conforman un organismo, caso contrario
sobrevendr una enfermedad.
Un aspecto muy interesante en la regulacin del metabolismo celular corresponde a la
participacin de las hormonas que son sintetizadas en tejidos especficos (Glndulas)
secretadas a al sangre y luego transportadas hasta alcanzar sus clulas blanco, donde
previa interaccin con sus receptores ejercern sus efectos regulatorios fundamentalmente
a travs de :
-
Activacin o desactivacin de enzimas ya existentes en las clulas blanco, a

travs de segundos mensajeros
72
Induccin de la sntesis de enzimas o alguna otra protena.
En esta prctica centraremos nuestra atencin en algunas acciones metablicas de la

insulina usando como modelo experimental el estado diabtico.
La diabetes Mellitus es una enfermedad producida por la carencia absoluta o relativa de
insulina en el organismo, se conoce dos tipos de esta enfermedad: La diabetes tipo I o
insulino dependiente y la diabetes tipo II o insulino no dependiente. Hay varias
PROTEINAS
GLUCOSA
Glucosa 6 P
NADPH2
Aminocidos
Ribosa 5
P
TRIGLICERIDOS
Glucgeno Glicerol
Ac. Grasos
GA 3 P
Di OH A P
Albmina
NH4
Serina
VLDL
Ac. 3 PG
Glicina
Ceto cidos
Alanina
A. Grasos
Piruvato
Colesterol
Acetil CoA
Albmina
Ac. Grasos
Acetil CoA
Acetil CoA
Oxalacetato
Aspartato
TG
Ac. Grasos
Albmina
Cuerpos
Cetnicos
CK
Acetil CoA
Acetil CoA
Asparragina
CADENA RESPIRATORIA
Figura N 9..- Integracin de las vas metablicas de carbohidratos, lpidos y

protenas
diferencias en cuanto a la etiologa y alteraciones metablicas entre los dos tipos

mencionados; pero lo que caracteriza a cada uno de ellas y les da el nombre es el hecho de
que en la diabetes tipo I, la causa primaria es un defecto o destruccin de las clulas beta
del pncreas, productores de insulina, y el paciente solo se alivia con la administracin de
insulina. En tanto que en la diabetes tipo II la causa primaria es un defecto en la respuesta a
la insulina, aqu el paciente alivia sus sntomas por administracin de antidiabticos que
73
estimulan la secrecin de insulina por las clulas beta del pncreas y raramente hacen
cetosis.
Adems la diabetes tipo II aparece en pocas tardas de la vida (Despus de lo cuarenta
aos ) y la herencia juega un rol importante. En cambio en la Diabetes tipo I La cetosis es
comn y aparece en etapas tempranas de la vida niez o juventud. La tabla I resume las
caractersticas ms importantes de ambos tipos de diabetes.
TABLA I. Caractersticas distintivas entre la diabetes mellitus insulino dependiente (Tipo
I) y la diabetes mellitus no dependiente de insulina (Tipo II).
CARACTERSTICAS
TIPO I
TIPO II
Edad de inicio
Menos de 30 aos
Mas de 40 aos
Cetosis
Comn
Raro
Peso corporal
No obeso
Obeso (80%)
Prevalencia
0,2- 0,3%
2-4%
Presencia de anticuerpos contra SI
NO
islotes
Complicaciones
Frecuentes
Frecuentes
Secrecin de insulina
Casi nula o nula
Normal o casi normal
Tratamiento con insulina
Siempre necesaria
No es necesario
Resistencia a la insulina
Ocasional
Usual
Hay muchas sustancias que pueden producir los sntomas diabticos cuando son
administrados al organismo debido a que pueden producir un deterioro o destruccin de las
clulas beta del pncreas, con la consiguiente ausencia parcial o total de insulina.
Una de las sustancias que produce diabetes es el aloxano (2,4,5,6 tetraoxipirimidina o
pirimina tetrona). Causa un dao permanente de las clulas beta de los islotes de
Langerhans, producindose un cuadro de diabetes mellitus humana. Esta sustancia tambin
es txica y hepatotxica
pero a dosis mayores.
O
La estreptozotocina es otra sustancia que causa diabetes,
O
HN
es un antibitico de amplio espectro obtenido de

Streptomyces achromogenes produce necrosis de las
clulas beta y su accin es ms selectiva sobre dichas
NH
74
Aloxano
clulas que el aloxano razn por la cual ahora se el usa

mas en diabetes experimental.
Otras sustancias con capacidad de producir diabetes por afectar a las clulas beta de los
islotes de Langerhans son el cido dehidroascrbico, la 8-hidroxiquimolina, la ditizona y
otras quimolinas; pero su accin diabetognica es menos pronunciada y menos especfica
que el aloxano y estreptozotocina.
EXPERIEMNTO 1
DETERMINACIN DE LA GLICEMIA
Objetivo :
Determinar la concentracin de glucosa en sangre de un paciente , utilizando el mtodo
colorimtrico ( Nelson y Somogy).
NOTA: EL uso de este mtodo requiere la desproteinizacin de la muestra sangunea a fin
de evitar interferencia en las reacciones que deben depender nicamente de la glucosa)
Fundamento:
El filtrado libre de protenas se calienta en presencia de una solucin cprico-alcalino
(Cu++) obtenindose la reduccin del cobre a CuO, el cual acta luego sobre el arsenomolibdato producindose un complejo de molibdeno reducido de color azul, cuya
intensidad se mide en el fotocolormetro
Procedimiento:
-
Desproteinizado: En un tubo de ensayo medir :

3,0 ml de NaCl 0,9 %
0,2 ml de sangre
0,4 ml de Sulfato de Zinc al 5%
0,4 ml de hidrxido de Bario al 0,3%
Mezclar bien y dejar en reposo por 5 minutos, luego filtrar o centrifugar para recuperar el
filtrado libre de protenas
-
Determinacin de glucosa : En tubo de Folin Wo medir lo siguiente :

1 ml de filtrado libre de protenas
1 ml de reactivo cprico alcalino
mezclar y calentar en bao mara hirviente por 15 minutos
Enfriar en agua corriente y luego aadir:
1 ml de reactivo arseno-molibdato
75
Mezclar suavemente; aadir agua destilada hasta la marca de 25 ml, mezclar por
inversin, dejar en reposo por 5 minutos y leer en el fotocolormetro con filtro verde.
Preparar un blanco usando 1 ml de agua destilada en lugar del filtrado.
Preparar un estndar de glucosa que contenga 50 g/ml. Medir 1 ml de sta solucin y
colocarla en un tubo de Folin Wo y proceder como para el caso de la muestra. La lectura en
el fotocolormetro fue de 67 UK (D. O : 0,134).
Resultados
1. Estimar el Factor de calibracin porcentual
Absorbancia blanco
__________________
Absorbancia bruta del estndar __________________

Absorbancia neta del estndar
__________________
Concentracin del estndar
__________________
Factor de calibracin
__________________
Factor de calibracin %
__________________
2. Completar los espacios en blanco

Lectura Bruta
Lectura Neta
Tubo blanco
____________
____________
Tubo Muestra (N)
____________
____________
Tubo Muestra (P)
____________
____________
Concentracin de Glucosa en la muestra (N) es de ___________mg/100 ml

Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal, Alto o Bajo _________
Concentracin de Glucosa en la muestra (P) es de ___________mg/100 ml
Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal, Alto o Bajo _________
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE GLUCOSA EN ORINA
Objetivo :
Determinar la concentracin de glucosa en orina utilizando la prueba de Benedict
Fundamento :
Esta reaccin redox ocurre ms rpidamente en medio alcalino; as cuando se calienta
una suspensin de hidrxido cprico en medio alcalino y en presencia de una sustancia
76
reductora, como algunos carbohidratos (glucosa) , el hidrxido cprico se reduce a oxido

cuproso (precipitado de color rojo ladrillo)
Procedimiento :
-
Colocar 5 ml de l reactivo de Benedict en un tubo de ensayo
Aadir 8 gotas de muestra de orina. Mezclar bien
Hervir durante 3 minutos
Anotar el resultado explicando lo observado
Resultados :
Llene el espacio en blanco escribiendo (+) cuando hay precipitado o coloracin rojo
ladrillo y (-) cuando no lo hay.
ORINA N
_______________
DIAGNOSTICO: ___________________
ORINA P
_______________
DIAGNOSTICO: ___________________
EXPERIMENTO 3
DETERMINACIN CUALITATIVA DE CUERPOS CETNICOS EN ORINA
Objetivo:
Identificar la presencia de cuerpos cetnicos en orina utilizando la reaccin del
nitroprusiato en medio alcalino
Fundamento:
El mtodo se basa en que al acetona y el acetoacetato al reaccionar con el nitroprusiato
de sodio en medio alcalino forman un complejo de color violeta indicando la positividad de
dicha reaccin.
Procedimiento:
-
Colocar unas gotas de orina sobre el reactivo nitroprusiato de sodio en medio

alcalino
Mezclar bien y esperar unos minutos para observar la aparicin de color
Resultados:
Anotar el resultado, explicando lo observado
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_____________________________________________________________
77
INTERROGANTES
1.- Por qu razn se produce cetonuria en el estado diabtico
2.- Qu tipo de dieta le dara Ud. a un diabtico insulino no dependiente?
3.- Mediante un esquema seale las principales rutas de sealizacin para el mecanismo
de accin de la insulina.
4.- Cmo se explica la hiperglicemia y glucosuria que presentan los diabticos de tipo II
5.- Cmo se encontraran los ciclos alanina glucosa y Cori en un diabtico no tratado
6.- En qu casos se indica la prueba de tolerancia a la glucosa?
7.- Cul es la razn de emplear fluor en la mezcla anticoagulante para la sangre cuando
se va a determinar glucosa en la muestra
78
8.- Considerando los tipos de diabetes i y II, la diabetes causado por aloxano, a cul de
ellos se asemeja. Por qu?
9.- Qu es la hemoglobina glicasada, y que importancia tiene en el estudio de la diabetes
10.- Cmo se encontrar la gluconeognesis en una persona con Diabetes tipo I no

tratada? Por qu?
11.- Por que en un paciente diabtico insulino dependiente, uno de los problemas que se
le presenta es la hipoglicemia?
79
PRACTICA N 11
PEROXIDACION LIPIDICA
1.- Induccin y evaluacin de la peroxidacin lipdica
INTRODUCCION.
Los radicales libres son definidos como molculas o sustancias altamente reactivas, que
presentan un electrn desapareado en su orbital externa, lo cual puede iniciar una cadena
de reacciones al remover un electrn de otra molcula para completar la suya. La
transferencia de electrones haca el oxgeno resulta en la formacin de los siguientes
intermediarios como son el anin superxido (O 2-), el perxido de hidrgeno (H2O2) y el
radical hidroxilo libre (OH). De estos intermediarios en la reduccin del oxgeno hacia
agua, el radical hidroxilo es indudablemente el radical libre de oxgeno ms daino, pues
est involucrado en reacciones tales como la peroxidacin lipdica y generacin de otros
radicales txicos. El perxido de hidrgeno, por si slo no es un radical libre, pero ste es
convertido en radical hidroxilo a travs de las reacciones de Fenton o Harver-Weiss en
presencia de Fe2+ o Cu+, prevalentes en las clulas.
Los radicales libres de oxgeno (o Especies Reactivas de Oxgeno), causan dao a la
mayora de macromolculas de las clulas (protenas, cidos nuclicos, lpidos). As, el
radical hidroxilo se ha descrito que extrae tomos de hidrgeno de los lpidos
(fosfolpidos) de membranas (cidos grasos poliinsaturados) e inician las llamadas
reacciones de peroxidacin lipdica; los perxidos lipdicos as formados, se descomponen
a especies carbonilo reactivas, tales como el malondialdehido y el hidroxinonenal, los
cuales a su vez reaccionan con protenas, daando la integridad de la membrana celular y
la integridad de protenas transportadoras, colapsando las gradientes de iones, y
80
conduciendo as hacia la muerte celular. Estos procesos fueron muy bien documentados
por estudios en hemates; sin embargo, hoy se sabe que similares procesos tambin ocurre
en clulas nucleadas, lo que explica el peligro que entraa la sobreproduccin de estos
radicales.
Como se puede entender, la generacin de radicales libres es un hecho natural que
ocurre normalmente en las clulas, sin embargo, igualmente existen mecanismos de
defensa, conocidos como antioxidantes (superxido dismutasa, glutation peroxidasa,
glutation reductasa, etc.), que permiten contrarrestar la presencia de estos agentes dainos.
Sin embargo, bajo ciertas condiciones tales como radiaciones, ingesta de drogas,
infecciones, injurias, etc., un organismo puede responder con una sobreproduccin de estos
radicales, por lo que se hace imprescindible potenciar las defensas antioxidantes ya sea
endgenas o a travs de la dieta con la ingesta de alimentos con alto potencial antioxidante
( vitamina C, vitamina E, carotenos, flavonoides, etc.).
No obstante, estas especies
reactivas de oxgeno inclusive, cumplen un rol importante en las clulas fagocticas para
hacer frente a infecciones bacterianas.
La evaluacin de la peroxidacin lipdica a travs de la determinacin de
Malondialdehido, se constituye en una prueba muy til no slo para conocer la presencia
de radicales libres, generados por algn agente causal, sino tambin para poder evaluar las
bondades antioxidantes de muchos productos naturales.
EXPERIMENTO N 1
Determinacin de Malondialdehido como medida de peroxidacin lipdica.
Objetivos:
1. Preparar los sistemas biolgicos de estudio, a partir de hgado de rata para la induccin
de peroxidacin lipdica.
2. Determinar la concentracin de malondialdehido en los sistemas de estudio.
3. Interpretar los resultados y discutir los alcances del uso de esta tcnica en trabajos de
investigacin.
Fundamento:
El Malondialdehido (MDA) forma un aducto 1:2 con el cido tiobarbitrico
produciendo el siguiente compuesto (complejo Acido TiobarbitricoMalondialdehido):
N
Figura N 10 .- Complejo
Acido TiobarbituricoMalondialdehido
OH
HO
81
CH CH = CH
OH
SH
OH
de color rojo-naranja, el cual puede ser medido por fluorometra o espectrofotometra;

aunque esta reaccin tiene mucha ms alta sensibilidad cuando se mide por fluorometra,
sin embargo, pueden emplearse cualquiera de los dos. En la presente prctica, por razones
tcnicas se la har por espectrofotometra (colorimetra).
Muchas muestras biolgicas, contienen una mixtura de Sustancias Reactivas al Acido
Tiobarbitrico (TBARS), incluyendo aldehdos e hidroperxidos lipdicos, los cuales se
incrementan como resultado del stress oxidativo. Estas sustancias retornan a sus niveles
normales con el tiempo, dependiendo de la presencia de antioxidantes. En la prctica, las
TBARS son expresados en trminos de malondialdehido (MDA) equivalentes. En el
presente ensayo, se usa un estndar de malondialdehido para construir la curva estndar
respectiva.
Preparacin de la Curva de Calibracin:
Rotular 9 tubos de ensayo y proceder a medir en cada uno de ellos, lo que se indica el
siguiente cuadro:
N de
Concentracin de
Volumen de MDA
Volumen del
Estndar
MDA (nmol/ml)
Estndar (l)
diluyente (l)
1
2
3
4
Blanco
12.5
25
50
100
0
125
250
500
1000
0
875
750
500
0
1000
Absorbancia
(DO)
Con los datos obtenidos, construya la curva de calibracin para el malondialdehido.

(Absorbancia (DO) vs Concentracin de Malondialdehido (nmoles/ml).
82
Reactivos:
KCl 0.15 M
FeSO4 15 mM
Acido Tiobarbitrico ( C4H4N2O2S ) 0.67 % en cido actico al 50 %.
Acido tricloroactico ( Cl3CCOOH ) 5 %.
Procedimiento:
a) Preparacin del homogenizado de hgado de rata al 10%.
1. Pesar 2.5 gramos de hgado y mantenerlo siempre sobre hielo.
2. Tamizar el tejido utilizando una malla metlica, presionando el tejido contra la
malla y agregando KCl 0.15 M fro, para lavar la sangre.
3. Recuperar las membranas (tejido parenquimal) que queda sobre la malla
4. Colocar las membranas en un mortero fro (sobre hielo) y triturar con 25 ml de KCl
0.15 M fro, hasta obtener un homogenizado homogneo. El proceso de triturado no
debe demorar ms de 10 minutos.
5. Filtrar el homogenizado con la ayuda de una gaza.
6. Separar y guardar el filtrado a 0 C, para hacer los ensayos de peroxidacin lipdica. Se
recomienda utilizar el filtrado fresco para cada ensayo.
b) Induccin y determinacin de la peroxidacin lipdica.
1. Medir 3.0 ml. de homogenizado de hgado al 10 %e iniciar la peroxidacin lipdica
aadiendo 100 l de sulfato ferroso (FeSO4) 15 mM. Preparar un sistema sin FeSO 4,
que servir como control.
2. Incubar los sistemas por 1 hora a temperatura ambiente..
3. Transcurrido el tiempo de incubacin, tomar 200 l de cada sistema y mezclar por
agitacin con 200 l de cido tricloroactico al 5 %.
4. Centrifugar a 15,000 rpm durante 5 minutos.
83
5. Tomar 100 l de sobrenadante y mezclar con 1.0 ml de Acido tiobarbitrico 0.67 % en

cido actico 50%.
6. Incubar las muestras en bao de agua hirviente, durante 1 hora..
7. Transcurrido este tiempo, retirar los sistemas del bao hirviente y enfriar en hielo por
15 minutos.
8. Realizar las lecturas en un espectrofotmetro a 535 nm.
9. Determinar la cantidad de Malondialdehido (MDA) formado, a partir de la curva de
calibracin.
Concentracin
Absorbancia
Absorban-
Factor de
Factor
de MDA (M)
(DO)
cia neta
Calibracin
Promedio
Estand. 1
10
0.036
Estand. 2
20
0.061
Estand. 3
30
0.094
Estand. 4
40
0.101
Estand. 5
50
0.153
Estand. 6
100
0.250
Estand. 7
150
0.354
Estand. 8
200
0.429
Blanco
0.003
Sistemas de
estudio
Muestra 1
Muestra 2
Concentracin de
MDA (Moles / L)
- Haga Ud. una interpretacin e los resultados:
INTERROGANTES BIOQUIMICAS:
1. Qu otros daos provocan los radicales libres? Descrbalos.
84
2. Describa el proceso de peroxidacin lipdica.
3. Qu otros mtodos conoce Ud. para evaluar la produccin de radicales libres de

Oxgeno?
4. Escriba la reaccin del Malondialdehido con el cido Tiobarbitrico.
5. Cules son los sistemas antioxidantes con que cuenta nuestro organismo? y como
funcionan?
6. Cmo se generan las especies reactivas de oxgeno (ROS) en nuestro organismo?
7. A qu se denomina antioxidante, y de que maneras podran actuar?
85
PRACTICA-TALLER N 12
METABOLISMO DE XENOBIOTICOS
Objetivos:
1. Hacer un repaso de algunas vas importantes en el metabolismo de los Xenobiticos.
2. A propsito de algunas interacciones medicamentosas, sealar el probable mecanismo,
teniendo en cuenta el metabolismo de un xenobitico.
3. A propsito de un caso de intoxicacin alcohlica aguda, hacer un repaso del
metabolismo del etanol en el organismo humano y discutir algunos de los efectos del
etanol.
CASO 1.
Una seora de 28 aos de edad, estaba consumiendo anticonceptivos orales con el
objeto de evitar el embarazo. Despus de un tiempo a su esposo se le diagnostic un
cuadro de tuberculosis pulmonar, el cual fue tratado adecuadamente en forma ambulatoria.
El mdico le recet a la seora, rifampicina por precaucin, ya que ella estaba en estrecho
contacto con su esposo. A los pocos meses, la seora result embarazada, a pesar de haber
seguido con el uso de los anticonceptivos orales, sin descuidarse.
CASO 2.
Un paciente de 45 aos de edad, haca algunos aos que se le haba diagnosticado que
padeca de gota, pero en el momento actual estaba en fase de remisin, siendo tratado
nicamente con una dieta adecuada y fenilbutazona ( una droga antiinflamatoria y que
secundariamente es uricosrica). De improviso se le declar un cuadro de tromboflebitis, el
cual exigi tratamiento con warfarina ( un anticoagulante ). El control de la dosificacin
de la warfarina se hizo en forma rigurosa, con el uso del tiempo de protrombina. Se not
que la dosis de warfarina requerida para el paciente fue de tres veces mayor que lo
habitual. Luego de la mejora del paciente, el mdico tratante, le dio de alta, habindole
retirado la fenilbutazona e indicado que siga con el tratamiento de warfarina por diez das,
86
con el encargo de volver para su control. Luego de transcurrido dicho tiempo. Sin
embargo, el paciente retorn a los siete das en estado de shock y con hemorragia
gastrointestinal masiva, la cual no pudo ser controlada, falleciendo el paciente dos das
despus.
CASO 3.
Un japons de 26 aos de edad, fue invitado a una recepcin en donde, como es
habitual, comenz a comer y beber en abundante cantidad.
Anteriormente el haba
ingerido alcohol muy pocas veces y en pequeas cantidades, por que al beber un poco de
cualquier bebida alcohlica, notaba un cierto disconfort, pero en esta oportunidad tena
motivos especiales para estar alegre y beber, por lo que decidi comer bastante y beber
simultneamente. Las bebidas que ingiri fueron a base de vodka con cocacola y haba
comido bastantes bocaditos endulzados. Efectivamente, al inicio no sinti el malestar que
antes haba tenido al ingerir bebidas alcohlicas, pero despus de dos o tres horas, y
habiendo bebido
y comido bastante, empez a sentir quemazn y picor en la cara,
enrojecimiento de los ojos, palpitaciones, aumento del pulso, dolor de cabeza, todos los
signos y sntomas compatibles con el fenmeno de flushing (rubor o bochorno). Empez
a sentir somnolencia, quedndose luego dormido. A la maana siguiente se levant ya sin
los sntomas anteriores, pero empez a tener aquellos sntomas y signos de la llamada
resaca (hangover), sintindose mucho mejor despus de habrsele puesto por va
endovenosa glucosa al 10 %.
BASES MOLECULARES.
La induccin del sistema Citocromo P450, puede producir una alterada eficacia
teraputica de frmacos, ya que, la no acelerada tasa de hidroxilacin, puede incrementar la
inactivacin o acrecentar la tasa de excrecin de los frmacos. En otros casos, la induccin
del sistema de Citocromo P450 puede producir efectos colaterales inesperados e
indeseables de agentes teraputicos, debido a una incrementada formacin de metabolitos
que pueden acusar injuria celular, si son producidos en concentraciones suficientes.
Una de las caractersticas de los sistemas de Citocromo P450, es que un xenobitico
puede inducir la actividad del Citocromo P450 particular que lo metaboliza. Prcticamente
cada especie de Citocromo P450 puede ser inducido por uno o un grupo de compuestos en
particular. Si un compuesto induce un determinado Citocromo P450, inmediatamente dicho
compuesto se metabolizar ms rpido, pero tambin otros compuestos que son
87
metabolizados por dicho Citocromo P450, tambin se metabolizar ms rpido. Esto es, la
induccin de un citocromo P450 por una droga puede estimular por si mismo el
metabolismo de ella o de otras drogas que son sustratos del Citocromo P450 inducido. La
consecuencia de ese metabolismo acelerado, es en general, una eliminacin acelerada de
una droga en el organismo. Esto explica varias de las interacciones medicamentosas o de
otro tipo que se conocen.
Aunque el etanol puede producir varios efectos sobre otros xenobiticos, un efecto bien
estudiado ahora, es que induce un Citocromo P450 particular; el P450 2EL Este citocromo
tiene las siguientes caractersticas en cuanto a inductores, supresores y sustratos, segn el
siguiente esquema:
Supresores:
Dietticos
Fonetil
Isotiocianato
P450
2EL
Inductores:
Uso crnico de
Etanol
Ayuno
Sustrtos:
Alcoholes
AcetonaAnilina
Piridina
Benzeno
Fenol
Tetracloruro de carbono
Dihaloetanos
Tricloroetileno
N-Nitrosodietilamina
Eteres
Acetominofen
Halotano
etc, etc.
La Administracin crnica de etanol incrementa la tasa de eliminacin de varios

frmacos, tales como meprovamato, pentobarbital, aminopirina, tolbutamida, propanolol,
rifampicina y testosterona.
La administracin crnica de etanol a ratas causa una proliferacin del retculo
endoplasmtico del intestino delgado superior y del hgado.
Es bastante conocido que el metabolismo del etanol en el organismo humano, puede
seguir diversas vas, siendo las ms importantes las siguientes:
1. Va de la actividad de las enzimas alcohol deshidrogenasa y la acetaldehido
deshidrogenasa, mejor llamada aldehdo deshidrogenasa.
88
2.
Por el sistema llamado MEOS, sistema microsomal oxidante del etanol, el cual es
dependiente del citocromo P450 2MI y que produce acetaldehido, cuyas caractersticas
ya se han descrito.
3. Por la catalaza, que en ciertas circunstancias puede comportarse como una peroxidasa y
produce tambin acetaldehdo.
La ms importante es la primera, pero la segunda tambin interviene y cobra
importancia, cuando se consume grandes cantidades de etanol.
En las razas orientales se ha descrito que tienen una frecuencia elevada de mutacin de
una isoenzima de la aldehdo deshidrogenasa, la ALDH2, que la hace inactiva, lo cual
explica una elevacin del acetaldehdo, responsable del fenmeno de flushing. El 50 %
de orientales carecen de actividades de la ALDH 2 en el hgado. En razas blancas esto es
raro. En algunas razas indgenas de Chile y Ecuador la carencia es del 40 % de la
poblacin. Esto no se ha investigado en nuestro pas, por lo que no tenemos datos. Parece
que el aumento del acetaldehdo produce un aumento en la liberacin de las catecolaminas
adrenalina y noradrenalina de la mdula suprarrenal y terminaciones nerviosas simpticas.
El disulfiram y la cianamida son inhibidores de la aldehdo deshidrogenasa.
Despus del consumo de etanol puede producirse una hipoglicemia, la cual en parte se
explica por disminucin de la gluconeognesis, pero tambin por una mayor sensibilidad a
la insulina. Cuando se consume alcohol y no se come mucho, la hipoglicemia es mayor,
pero tambin , si se ingiere muchos dulces o comidas endulzadas con mucho azcar, se
acenta el efecto hipoglicmico, por que los azcares estimulan la produccin de insulina y
la presencia de etanol potencia los efectos de la insulina.
INTERROGANTES:
1. Explique en qu consiste la Fase I del metabolismo de los xenobiticos.
2. Explique en que consiste la Fase II del metabolismo de los xenobiticos.
3. Qu es el itocromo P450?
89
4. Qu significan que los citocromos P450 sean autoinducibles?
5. Intente dar una explicacin, de por que en el caso 1, la seora result embarazada, aun
habiendo estado consumiendo anticonceptivos orales.
6. En el caso 2 , cul sera la explicacin de que el paciente requiere de tres veces mayor
dosis de warfarina para que ejerza un buen efecto anticoagulante?
7. En el caso 2, al retirar la fenilbutazona el efecto de la warfarina se hace ms manifiesto,

por qu?
8. Por qu el etanol es considerado como un xenobitico?
9. Haga un esquema de la va de metabolizacin del etanol, por la accin combinada de

las enzimas: Deshidrogenasa alcohlica y aldehido deshidrogenasa.
10. Que es el sistema MEOS de metabolizacin del etanol?
11. Qu fase de matabolizacin del etanol es el sistema MEOS? . Por qu?
90
12. Tiene importancia el dato, de que la persona que estaba ingiriendo alcohol, sea
Japons? Por qu?
13. A qu se debe el fenmeno de flushing en personas que ingieren bebidas alcohlicas?
14. En personas diabticas, que ingieren antidiabticos orales del tipo de la clorpropamida,
al ingerir alcohol, se desencadena un fenmeno de flushing. Intente dar una
explicacin.
15. En la intoxicacin alcohlica aguda, parte de la hipoglicemia que se presenta puede ser
debida a una disminucin de la gluconeognesis. De una explicacin bioqumica para
esto.
16. En la intoxicacin alcohlica aguda puede presentarse acidosis lctica. De una

explicacin bioqumica para esto.
17. Hay un dicho popular que dice borracho que come miel pobre de l. Cul es la
explicacin bioqumica para esto?
18. Si Ud. alguna vez ha ingerido bebidas alcohlicas en exceso ( que esperamos no lo
haga siempre) y a la maana siguiente ha tenido el fenmeno de la resaca; describa lo
que sinti. Si nunca ha experimentado este fenmeno ( lo cual es plausible que as sea,
por lo que lo felicitamos), averigue en otra persona en que consisten los sntomas de la
resaca.
91
19. Explique los sntomas de la resaca.
92
PRACTICA N 13
93
NUTRICION
OBJETIVOS
1) Aprender a hacer clculos de los requerimientos diarios energticos de una
persona.
2) Distribuir los requerimientos energticas en cantidades de hidratos de
carbono, lpidos y protenas que debe ingerir una persona en su dieta diaria,
para satisfacer dichos requerimientos
3) Manejar tablas de composicin de alimentos.
INTRODUCCION:
Como ya se ha visto en la parte terica existen 2 mtodos para calcular los requerimientos
energticos diarios de una persona. En la presente prctica se emplearn los dos mtodos
para dicho clculo y luego, empleando las tablas de composicin de alimentos, proponer
una dieta que satisfaga los requerimientos calculados. Para esto se debe proceder de la
siguiente manera:
PRIMER METODO:
1. Calcular las necesidades energticas para satisfacer los requerimientos para el
metabolismo basal. Para esto cada persona debe saber su peso y talla. Luego calcular
su superficie corporal en metros cuadrados empleando la frmula correspondiente,
Usando la tabla que se adjunta calcular las kilocaloras necesarias para satisfacer su
metabolismo basal, segn su superficie corporal.
2. Calcular las Kilocaloras necesarias para satisfacer los requerimientos correspondientes
a la actividad fsica que se desarrolla, de acuerdo con lo siguiente:
Actividad ligera: 30 % del metabolismo basal
Actividad moderada: 40 % del metabolismo basal
Actividad pesada : 50 % del metabolismo basal
3. Calcular las necesidades para la Accin Dinmica Especfica de los alimentos
(ADEA).
Por este mtodo, sus necesidades energticas diarias para Ud., fueron: _____________
SEGUNDO METODO:
1. Usando la tabla correspondiente para gasto segn actividades, calcular las Kcal. que se
requieren diariamente; para esto hay que hacer un cmputo de que actividades se
realizan en un da y segn la tabla calcular las Kcal que se necesitan por da. Adems,
94
hay que tener en cuenta que los datos de dicha tabla ya involucran en cada actividad
las caloras correspondientes al metabolismo basal.
2. Como la tabla da lo que requiere una persona de 65 Kg hay que hacer una correccin
para el peso de cada persona en particular.
Por este mtodo sus necesidades energticas fueron: _______________
Clculo de la dieta diaria que habr de consumir una persona para satisfacer sus
necesidades energticas.
Para esto se puede usar cualquiera de los dos datos que se calcularon en el acpite
anterior; sin embargo, se recomienda usar el obtenido en el segundo mtodo.
Las necesidades energticas diarias habr que repartirlas en cantidades de hidratos de
carbono, lpidos y protenas, que se deben consumir diariamente. Se recomienda usar los
siguientes datos:
Hidratos de carbono:
60 % de las necesidades energticas diarias
Lpidos:
Protenas:
Con los equivalentes calricos correspondientes convertir las Kcal en gramos de

carbohidratos, lpidos y protenas que se deben consumir diariamente; por lo tanto, Ud.,
deber de consumir:
Hidratos de carbono:
---------------------g
Lipidos:
---------------------g
Protenas:
---------------------g
Luego con las tablas de composicin de alimentos, hacer una dieta que satisfaga los
requerimientos calculados. Distribuir las necesidades alimenticias en el desayuno,
almuerzo y comida ( cena ).
Desayuno:_____________________________________________________________
______________________________________________________________________
Almuerzo: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________
Comida: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________
Nota: Puede Ud. usar hojas adicionales si desea.
FORMULA PARA CALCULAR LA SUPERFICIE CORPORAL
95
S = P 0.425 x H 0.725 x 0.007184

En donde:
S: Superficie corporal en metros cuadrados

P: Peso corporal en Kg.
H: Talla en centmetros
Nota: Con esta frmula se puede calcular la superficie corporal con un error no mayor del 5 %.
CUADRO 1.- Valores normales del metabolismo basal, en Kcal / m3 / h, referidos a la

edad del ltimo cumpleaos.
Aos
Hombre
Mujer
Aos
Hombre
Mujer
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
53.05
52.4
51.5
49.9
48.0
47.2
46.8
46.5
46.4
46.1
45.5
44.4
42.9
42.2
41.6
50.5
48.05
46.7
46.1
45.7
45.1
43.9
42.5
41.1
39.7
36.6
37.6
37.0
36.6
36.3
21
22
23
24
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
41.2
40.9
40.7
40.5
40.3
39.6
38.9
38.3
37.6
37.0
36.3
35,7
35.1
34.5
33.4
36.2
36.1
36.1
36.0
36.0
35.8
35.7
35.5
35.3
34.4
33.4
32.8
32.4
32.2
32.0
CUADRO N 2 .- Consumo de energa total en kilocaloras por da de personas

que efectan diversos trabajos, durante ocho horas.
Oficio
Sastre
Encuadernador
Zapatero
Obrero metalrgico
Pintor
Carpintero
Albail
Aserrador de madera
Costurera de mano
Costurera de mquna
Encuadernadora
Servicio domstico
Lavandera
Metabolismo basal nedio (24 horas)
SEGUNDO METODO:
96
Hombre
Mujer
2600 2800
3000
3100
3400 3500
3500 3600
3500 3600
4700 5200
5500 - 6000
-------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------2000
2100 2300
2100 2300
2500 3200
2900 3700
1700
1350
TABLA 1.- VALORES DE GASTO DE ENERGIA SEGN ACTIVIDADES (Kcal / minuto )
Dormir
0.9
Gimnasia deportiva
7.0
Vestirse
1.9
Trabajo intelectual (no modifica)
Lavarse
2.0
Cargador de frutas, verduras 10
Baarse
2.5
Picapedrero
12
Tomar alimentos
1.8
Albail comn
4.0 a 8.0
Caminar despacio
3.3
Barrer
4.0
Caminar rpido
4.9
Jugar futbol
10
Correr
8.8
Trapear
6.8
Viajar en mnibus sentado
1.4
Estar de pi descansando
1.7
Viajar en mnibus de pi
2.0
Aspirar el piso
3.0
Viajar en colectivo sentado 1.2
Nadar
9.8
Manejar automvil
2.1
Montar bicicleta rpido
7.8
Atender una clase
1.2
Bailar suave
4.4
Afeitarse
2.0
Bailar rpido
6.0 a 9.0
Pintar una pared
2.3
Lavar platos
2.2
Pintar un techo
4.5
Lavar ropa a mano
4.2
Pintar un mueble
3.0
Manejar auto en carretera
2.1
Leer en voz alta sentado
1.5
Manejar auto en ciudad
3.0 a 4.0
Leer en voz alta parado
1.9
Planchar ropa
2.2
Escribir a mquina rpido
2.2
Montar a caballo
5.8
Estar echado sin dormir
1.0
Tocar piano
2.6
Echado viendo TV o leer
1.2
Jugar ping pomg o paleta
5.9
Lavarse los dientes
1.9
Coser a mano
1.5
Tender la cama
3.0
Confeccionar ropa
2.1
Bajar escaleras
2.5
Coser a mquina de pedal
3.5
Subir escaleras
4.0
Coser a mquina elctrica
1.5
Recoger y guardar las cosas 1.8
Sentado, quieto mirando TV 1.4
Gimnasia rtmica
Escribir a mano, sentado
3.0
1.8
NOTA.
Esta tabla ya incluye el gasto de metabolismo basal y la accin dinmica especfica de los
alimentos. Corresponde a una persona de 65 Kg de peso, por lo que habr que hacer la
correccin para el peso de cada persona ( regla de tres ).
97
TABLA N 2 .- RECOMENDACIONES DIETETICAS PARA INGESTION DE

ENERGIA.
Edad y
Peso
Talla
Necesidades energticas
Sexo
Infantes
0.0 0.5
0.5 1.0
Nios
13
46
7 10
Varones
11 14
15 18
19 22
23 50
51 75
76 o ms
Mujeres
11 14
15 18
19 22
23 50
51 75
76 o ms
Embarazo
Lactancia
Kcal en 24 hrs.
6
9
60
71
Kg x 115
Kg x 105
13
20
20
90
112
132
1300
1700
2400
45
66
70
70
70
70
157
176
177
178
178
178
2700
2800
2900
2700
2400
2050
46
55
55
55
55
55
157
163
163
163
163
163
2200
2100
2100
2000
1800
1600
ms 300
ms 500
COMPOSICION DE ALIMENTOS COMUNMENTE USADOS EN AMERICA LATINA
* ( por 100 g de porcin comestible )
ALIMENTO
Agua
g
87.4
75.3
Leche fresca de vaca

1
Huevos de gallina
2
Carnes
Atn enlatado
3
52.6
Camarones
4
78.8
Carne cerdo
5
62.3
Carne de res
6
75.2
Carne pollo o gallina
7
62.1
Chorizos
8
56.1
Corazn de cerdo
9
76.4
Lengua de res
10 69.1
Panza de res
11 81.1
Pescado fresco de agua dulce 12 75.7
( Por 100 g. de porcin comestible )
Caloras
61
148
Protenas
g
3.5
11.3
Grasa
g
3.0
9.8
Total
g
5.5
9.8
Fibra
g
0,0
0.0
288
86
270
113
246
278
115
191
90
99
24.2
17.3
13.1
21.4
18.1
15.8
14.7
16.0
14.0
19.6
20.5
0.2
23.7
2.4
18.7
22.8
4.2
13.2
2.7
1.7
--2.5
(0.0)
(0.0)
(0.0)
1.1
3.7
0.9
1.4
(0.0)
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.1
0.0
0.0
0.3
0.0
98
CARBOHIDRATOS
ALIMENTO
Agua
g
76.7
80.1
75.3
77.8
Pescado fresco de agua salada 13

Pulmn de res
14
Rin de res
15
Sesos de res
16
Vegetales verdes y amarillos
Acelga
17 90.8
Aj
18 88.8
Berro
19 92.2
Espinaca
20 89.8
Hojas de nabo
21
9.8
Hojas de rbano
22
85.6
Hojas de remolacha
23
86.4
Lechuga escarola
24
93.1
Tallos de cebolla
25
92.2
Verdolaga
26
91.2
Zanahoria
27
89.1
Otros vegetales
Apio
28
93.6
Berenjena
29
94.5
Cebolla ( cabeza )
30
88.1
Coliflor
31
89.4
Esprragos
32
92.7
Nabo
33
92.5
Palta
34
77.0
Pepino
35
95.4
Rbano
36
93.2
Remolacha
37
87.8
Repollo
38
91.4
Repollo chino
39
95.6
Tomate
40
93.8
Frutas
Albaricoque fresco
41
84.2
Pltano
42
72.2
Cidra
43
88.7
Ciruela
44
87.0
Coco tierno
45
81.4
Durazno blanco
46
85.3
Melocotn
47
85.9
Fresa
48
90.0
Granadilla
49
76.3
Guanbana
50
83.1
Guayaba
51
80.8
Lima dulce
52
89.9
Lima limn
53
91.0
Mamey
54
86.8
Mandarina
55
87.8
Mango
56
83.5
( Por 100 g. de porcin comestible )
Caloras
100
90
124
134
Protenas
g
20.8
16.9
16.8
10.4
Grasa
g
1.2
2.0
5.0
9.6
Total
g
(0.0)
(0.0)
1.8
0.8
27
38
32
30
31
52
45
20
26
286
41
1.6
1.9
2.8
2.8
2.4
2.8
3.2
1.7
1.8
2.0
8.8
0.4
0.6
0.4
0.7
0.4
0.5
0.4
0.2
0.6
0.4
0.4
5.6
8.0
3.3
4.9
6.2
9.9
8.1
4.1
4.7
5.0
8.9
1.0
2.2
1.1
0.7
0.8
1.3
3.8
0.0
1.1
0.9
0.8
19
17
45
33
22
27
154
115
23
44
28
14
21
0.8
0.6
1.4
2.8
2.0
0.8
1.7
0.7
0.9
1.7
1.7
0.8
0.8
0.2
0.1
0.2
0.4
0.2
0.2
15.8
0.1
0.1
0.1
0.2
0.4
0.3
4.2
4.0
9.7
6.5
4.4
5.7
4.4
3.4
5.0
9.5
6.1
2.5
4.6
0.6
0.7
0.8
1.0
1.2
0.8
1.8
0.4
0.7
1.0
1.0
0.5
0.6
57
97
40
47
122
52
49
36
94
60
69
30
32
47
43
59
0.8
1.2
0.6
0.6
1.9
0.8
0.9
0.8
2.4
1.0
0.9
0.7
0.4
0.6
0.7
0.5
0.6
0.1
0.1
0.2
11.9
0.2
0.1
0.3
2.8
0.4
0.4
0.6
1.4
0.2
0.2
0.2
13.8
25.5
10.2
11.9
4.8
13.3
12.5
8.5
17.3
14.9
17.3
8.4
7.0
12.1
10.9
15.4
1.1
0.7
1.4
0.4
0.7
0.9
0.8
1.3
4.2
1.1
5,3
1.0
0.3
1.0
0.4
0.8
99
CARBOHIDRATOS
Fibra
g
0.0
0.0
0.0
0.0
ALIMENTO
Manzana
57
Meln
58
Naranja
59
Papaya
60
Pepino
61
Pera
62
Pia
63
Sanda
64
Toronja
65
Leguminosas
Arvejas
66
Frijoles
67
Garbanzo
68
Habas
69
Lentejas
70
Man
71
Cereales y derivados
Arroz
72
Avena
73
Cebada
74
Galletas de soda
75
Galletas dulces
76
Harina de trigo enriquecida 77
Macarrones
78
Maz
79
Pan de rodaja
80
Pan dulce
81
Pan francs
82
Pan integral
83
Tallarines
84
Pastel simple
85
Races, tubrculos y pltano.
Arracacha blanca
86
Camote o batata
87
Papas
88
Pltano
89
Yuca
90
* De ICNND
INCAP
58
25
42
32
32
56
52
22
38
Protenas
g
0.3
0.5
0.8
0.5
0.4
0.3
0.4
0.5
0.6
Grasa
g
0.3
0.1
0.2
0.1
1.0
0.2
0.2
0.1
0.2
Total
g
15.2
6.2
10.5
8.3
6.3
14.8
13.7
5.3
9.6
12.0
12.0
11.9
12.6
12.6
6.9
343
337
364
339
340
543
22.5
22.0
18.0
24.0
23.7
25.5
2.0
1.6
6.2
2.2
1.3
44.0
61.0
60.8
61.1
58.2
60.7
21.3
4.7
4.8
3.4
5.9
3.2
4.3
12.0
10.0
10.5
5.3
10.1
12.0
8.6
10.6
23.6
10.3
26.7
29.5
9.6
26.8
364
370
348
435
406
364
377
361
311
438
298
286
381
327
7.2
11.6
9.7
9.6
3.9
10.5
12.8
9.4
12.6
6.2
10.3
9.1
12.6
6.4
0.6
3.1
1.9
13.2
9.7
1.0
1.4
4.3
1.1
17.2
1.2
1.5
3.4
8.2
79.7
73.8
75.4
69.7
74.9
76.1
76.5
74.4
60.8
65.2
50.7
57.5
73.2
57.0
0.6
3.5
6.5
0.5
0.2
0.3
0.4
1.8
0.8
0.6
0.2
1.0
0.4
0.1
73.4
68.9
77.9
65.6
60.6
102
116
79
122
148
0.8
1.3
2.8
1.0
0.8
0.2
0.3
0.2
0.3
0.3
24.4
28.6
18.2
32.3
37.4
1.0
0.9
0.6
0.5
1.0
Agua
g
84.0
92.8
87.7
90.7
92.0
84.4
85,4
93.6
89.2
Caloras
100
CARBOHIDRATOS
Fibra
g
0.7
0.5
0.4
0.6
0.4
1.9
0.4
0.2
0.2
BIBLIOGRAFIA
1. Bernab, J. C., Pacheco, J. y Arenas, C. 2006. Manual de prcticas de Biologa
Molecular. II Edicin. Universidad Catlica de Santa Mara. Arequipa-Per.
2. Campbell M.K. Bioqumica 3 Ed. Universitaria Sao Paulo-Brasil 2001
3. Champe P.C. Harvey R.A. Biochemistry. Lippiincott-Raven. 3 Ed. 2004
4. Devlin T. Biochemiostry: With clinical correlation. John Wiley .& sons. 5 Ed. 2002.
5. Fitzpatrick D. Biochemistry. Lab Manual. Universidad de Manitota. 1991
6. Guia de Prcticas de Bioqumica. Universidad Nacional de Trujillo. 1965
7. Gutierrez Correa, J. Gua de Practicas de Bioqumica UNSA. 1969
8. Nelson D y Cox M. Principles in Biochemistry of Lehninger. IV Ed. Amazon 2004
9. Noriega P., Paz., Bernal O., Zegarra F., Muriel O. y Paz I. Practicas del Curso de
Bioqumica Mdica I. UCSM, 2005
10.Paz B., Zegarra F., Jurez R., Crdenas L. y Paz I. Gua de Prcticas para
Agronoma UNSA. 2000.
11.Paz. B, Noriega P., Bernal O., Zegarra F., Muriel O. Practicas del Curso de Bioqumica
Mdica II. UCSM, 2005
12. Prcticas de Laboratorio. Curso de Bioqumica. Universidad de Chile. 1976.
13. Stryer L., Berg J.M. y Tymoczko J.L. Bioquimica. Editorial Revert. S.A BarcelonaEspaa. 2008.
101
PRESENTACION
Ponemos a disposicin de nuestros alumnos de Ingeniera Biotecnolgica de la
Universidad Catlica de Santa Mara, esta Gua de Prcticas de BIOQUIMICA II, que
consideramos ser de ayuda para apoyar el proceso enseanza aprendizaje de nuestro
curso de bioqumica y que aprovecha la experiencia acumulada por un grupo de Profesores
de Bioqumica que venimos enseando el Curso terico y a la vez realizamos las prcticas
respectivas durante muchos aos.
Conscientes del creditaje y naturaleza del Curso de Bioqumica en las diferentes carreras,
hemos tenido que seleccionar un grupo de prcticas en razn a que corresponden en
algunos casos; a captulos de mayor relevancia y en otros casos, a que por su propia
naturaleza deben ser incluidos para alumnos de Biotecnologa.
Igualmente se podr observar, que en algunos experimentos, se proporcionan directamente
los resultados, esto en razn a las limitaciones de ciertos reactivos y equipo; sin embargo,
en muchos casos la idea es que es mucho ms importante que el alumno comente sus
resultados y sobre todo haga la interpretacin correcta y adecuada de los mismos.
Todas las prcticas incluyen un cuestionario, donde se pregunta al alumno sobre aspectos
que trata el tema , donde el alumno puede aplicar o aportar otros datos a fin de deducir
explicaciones y resolver las interrogantes planteadas.
Tambin hemos tratado que el alumno anote sus resultados, interpretaciones y respuestas
en la misma Gua de Prcticas para que no tenga que perder tiempo copiando en un
cuaderno aparte el protocolo de la misma.
No dudamos que esta Gua de Prcticas tenga muchos aspectos que puedan ser mejorados
en las prximas ediciones, de all que los autores seremos muy receptivos a las sugerencias
de los usuarios a quienes desde ya les estaremos muy agradecidos.
Los Autores
102
NOMBRE DEL CURSO: ___________________________________

GRUPO N
____________________________________________
APELLIDOS:
____________________________________________
NOMBRES:
____________________________________________
DIA/HORA:
_____________________________________________
LABORATORIO: __________________________________________
NOMBRE DEL PROFESOR: ________________________________
103
COOCH2
COO
CH2
(2)
CH2
CH2
ALA - Sintasa
COSCoA
SUCCINIL SCoA
(2)
AMINO
CETO ADIPICO
CH COO NH3+
ALA - Sintasa
GLICINA
(2)
5 ANINO
LEVULINATO
CH2
(ALA)
(2)
CO
CH2
CO
CH2
NH3+
NH3+
6H
M
PROTOPORFIRINOGENO III
CO2
PROTOPORFIRINA III
Protoporfirigeno
Oxidasa
M
V
M
V
Fe N
COOCOO - CH2
CH2
CH2
Ferroquelatasa
HEMO Sintasa
M
V
CH COONH3+
HSCoA
M
P
Fe2+
CO
GRUPO
HEMO
H2O
OH
O2
Coproporfirinogenasa
2 H2O
ALA Deshidrasa
Porfobilingeno Sintasa
M
COOPORFOBILINOGENO
COO - CH2
CH2
CH2
C
+
CH2
H3N+
A
3 NH4+
Hidroximetilbilano Sintasa
CH
NH
H3N
A
C
P
C
CH
CH2
NH
A
C
P
C
A
C
P
C
A
C
Uroporfiringeno III
Cosintasa
P
C
CH C
CH
C
CH
C
CH2 NH CH2 NH
CH2 NH
US
P
A
UROPORFIRINOGENO I
UC
A
P
COPROPORFIRINOGENO III
4 CO2
FREDY ZEGARRA A.
A
CESAR CACERES Z.
A
JULITZA PAREDES F.
P
A
Arequipa
Per
104 UROPORFIRINOGENO III
2014
105
INDICE
Pag
PRACTICA N 1 : Gliclisis :....................................................................................... 1
PRACTICA N 2 : Ciclo de Krebs : ............................................................................. 9
PRACTICA N 3 : Fermentacin alcohlica : ............................................................. 17
PRACTICA N 4 : Oxidacin de cidos grasos : ......................................................... 25
PRACTICA N 5 : Degradacin de aminocidos : Transaminacin : .......................... 33
PRACTICA N 6 : Glucgeno heptico : ..................................................................... 43
PRACTICA N 7 : Metabolismo de lpidos: Hgado graso experimental: ................... 51
PRACTICA N 8 : Pigmentos biliares: Hiperbilirrubinemias: ..................................... 57
PRACTICA-TALLER N 9: Metabolismo de nucletidos: ........................................ 63
PRACTICA N 10 : Integracin y regulacin del metabolismo : .................................. 73
PRACTICA N 11: Peroxidacin lipdica:........................... 81
PRACTICA-TALLER N 12: Metabolismo de xenobiticos ............................................87
PRACTICA N 13: Nutricin.......................................:............................................. 91
BIBLIOGRAFIA: ......................... 102
106

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PRACTICA N 1

a) Determinacin de glucosa basal y despus de Fosforilasa

citoplasmticas a travs de las cuales 1 mol de glucosa se convierte en 2 moles de piruvato

ocurre en presencia de oxgeno.

Glucosa + 2ADP + 2Pi

2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O

gliclisis se encuentran en el citoplasma, no obstanteADP

msculo esqueltico mantenido en condiciones de anaerobiosis a 37 C durante una hora.

Gliclisis anaerbica en un sistema preparado con msculo esqueltico de cobayo

a) Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4 ml de agua destilada y agregar

Filtrado muestra incubada

Solucin Estandar (**)

Filtrado de la muestra basal

(**) Solucin estndar de glucosa conteniendo 50 ug/ml. La absorbancia leda del

Determinacin de Acido Lctico (Mtodo Volumtrico).

1. En cada uno de dos beakers medir aproximadamente 15 ml de las muestras basal e

2. En que clulas o tejidos, la glucosa es degradada anaerbicamente, y en cuales

5. Como se define la fosforilacin a nivel de sustrato. Qu enzimas de la gliclisis

7. Cul es la importancia de la gliclisis para los eritrocitos y las neuronas

8. Mediante un esquema demuestre la funcin del NAD + en la gliclisis. Por qu no

9. A qu se llama enlaces fosfricos ricos en energa. Qu intermediarios de la gliclisis

11. Cmo se regula la gliclisis?

13. Qu inhibidores de la gliclisis conoce Ud.? Indique el lugar y el mecanismo de accin

14. Si se aadiese CN y/o dicumarol en el experimento de la presente prctica, se afectara

FIGURA N 2.- Ciclo de Krebs

Preparar adems un frasco termobarmetro( TB) que debe contener 4 ml de agua

Interpretar los resultados para cada sistema.

( Completar el siguiente cuadro, realizando los

Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo

Aadir 18 ml de ATCA al 5 % . Mezclar. Dejar en reposo por 5 minutos y filtrar.

0.4 ml de cada filtrado

0.6 ml de agua destilada

1.0 ml de 2,4-dinitro fenil hidrazina, dejar 20 minutos en reposo.

Aadir 10 ml de NaOH al 10 %. Dejar en reposo por 5 minutos

Leer con filtro verde

Absorbancia de los tubos del 1 al 6 :

Calcular el Factor de calibracin:

Factor de calibracin: .......................

3.- Qu finalidad tiene la preparacin del sistema termobarmetro?

3.- Qu finalidad tiene en la presente prctica, el empleo de KOH en el compartimiento

6.- Cul es la razn de que el sustrato contenga fumarato?

7.- Qu inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud.? . Dnde actan?

8.-Indique qu vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan para la descarboxilacin

Acido 1,3 difosfoglicrico

Ac. Fosfoenol pirvico

FIGURA N 3 .- Fermentacin alcohlica de la glucosa

La conversin de acetaldehido en etanol es llevada a cabo por la alcohol

1.- Levadura de panificacin fresca

2.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 5.5

3.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 8.0

4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio

5.- Mezclar y agregar rpidamente parafina lquida hasta que

6.- Centrifugar a 3,000 rpm.

CUANTIFICACION DEL ETANOL (Mtodo de Shefftel modificado).

c) Mezcla sulfocrmica: Verter lentamente el cido sulfrico a la solucin de

Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentacin alcohlica de la

2.- Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificacin de etanol del

3.- Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentacin alcohlica de la fructosa

5.- Indique para qu se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la presente

7.- De qu otras maneras se puede estudiar la fermentacin alcohlica?

8.- Qu otros compuestos se pueden formar durante la fermentacin alcohlica?

del ciclo de Krebs;

colesterol, en procesos de acetilacin. Aqu estudiaremos tambin de forma particular el rol

hgado. Se conocen bajo la nominacin