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ESQUEMA
Qu queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs
A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativos
Metodologas generales. Son todas iguales?
Requisitos de un laboratorio de analisis de PCDD/F y
PCB
PCBs
Esquema de una metodologa de confirmacin
Nuevas metodologas: Dnde podemos actuar?
Nuevos mtodos de preparacin de muestras
Nuevos mtodos de determinacin
Conclusiones
Cl
Cl
Cl
Cl
2,3,7,8 Tetraclorodibenzo-p-diossina
Cl
Cl
3
4
Cl
Cl
2,3,7,8 Tetraclorodibenzofurano
CB--77
CB
CB--81
CB
CB--126
CB
CB--169
CB
CB--123
CB
2,3,4,6,7,8--HxCDF
2,3,4,6,7,8
CB--118
CB
1,2,3,7,8,9--HxCDF
1,2,3,7,8,9
CB--114
CB
1,2,3,4,6,7,8, ,3, ,6, ,8-HpCDF
pC
1,2,3,4,6,7,8
1,2,3,4,7,8,9--HpCDF
1,2,3,4,7,8,9
OCDF
2,3,7,8--TCDD
2,3,7,8
1,2,3,7,8--PeCDD
1,2,3,7,8
1,2,3,4,7,8--HxCDD
1,2,3,4,7,8
1,2,3,6,7,8--HxCDD
1,2,3,6,7,8
1,2,3,7,8,9--HxCDD
1,2,3,7,8,9
1,2,3,4,6,7,8--HpCDD
1,2,3,4,6,7,8
OCDD
CB--105
CB
CB--167
CB
CB--156
CB
CB--157
CB
CB--189
CB
TEF
2,3,7,8--TCDF
2,3,7,8
0,1
1,2,3,7,8--PeCDF
1,2,3,7,8
0,05
2,3,4,7,82 3 4 7 82,3,4,7,8
8-PeCDF
05
0,5
1,2,3,4,7,8--HxCDF
1,2,3,4,7,8
0,1
1,2,3,6,7,8--HxCDF
1,2,3,6,7,8
0,1
2,3,4,6,7,8--HxCDF
2,3,4,6,7,8
0,1
1,2,3,7,8,9--HxCDF
1,2,3,7,8,9
0,1
TEQ
Q=
1,2,3,4,6,7,8--HpCDF
1,2,3,4,6,7,8
0,01
1,2,3,4,7,8,9--HpCDF
1,2,3,4,7,8,9
0,01
OCDF
0,0001
2,3,7,8--TCDD
2,3,7,8
1,2,3,7,8--PeCDD
1,2,3,7,8
1
1,2,3,4,7,8
1,2,3,4,7,82 3 4 7 8-HxCDD
H CDD
01
0,1
1,2,3,6,7,8--HxCDD
1,2,3,6,7,8
0,1
1,2,3,7,8,9--HxCDD
1,2,3,7,8,9
0,1
1,2,3,4,6,7,8--HpCDD
1,2,3,4,6,7,8
0,01
OCDD
TEF
0,0001
CB--77
CB
0,0001
CB--81
CB
0,0001
CB--126
CB
0,1
CB--169
CB
0,01
CB--123
CB
0,0001
CB--118
CB
0,0001
CB--114
CB
0,0005
CB--105
CB
0,0001
CB--167
CB
0 00001
0,00001
CB--156
CB
0,0005
CB--157
CB
0,0005
CB--189
CB
0 0001
0,0001
Ci x TEFi
Metodologas
Mtodos US EPA 1613 y
1668
European Standard Method
EN 1948
1948--1/2/3
bioensayo:
y :
Mtodos de bioensayo
DRDR-Calux assayy
Metodologas
Mtodos US EPA 1613 y
1668
European Standard Method
EN 1948
1948--1/2/3
Mtodo
odo de referencia
e e e c a GC
GC--HRMS
S
EI--SIM modo
EI
Resolucin 10.000 (10%valle)
GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GCxGC--ECD
GCxGC
GCxGC--TOF
GCxGC
y
Mtodos de bioensayo:
DRDR-Calux assayy
Mtodos de confirmacin
Ventajas
- Elevada sensibilidad compatible con la normativa
- Elevada selectividad y especificidad
- Minimizacin de falsos positivos y negativos
- Una vez implantada la metodologa. Elevada robusted
Inconvenientes
- Elevada inversin
- Alta cualificacin del personal
- Alto mantenimiento
- mayor tiempo de anlisis?
Mtodos de cribado
Ventajas
- Menor coste
- Menor cualificacin del personal
- Herramienta til para el cribado de negativos
Inconvenientes
Limitada sensibilidad no siempre compatible con la normativa
- baja selectividad y especificidad
- Elevado nmero de falsos positivos
- Buenos resultados dependientes del estado de instrumental
- No necesariamente mayor rapidez
PCDDs/Fs
/ y PCBs
Productos de la pesca
Muestra
PCDDF y PCB LCS
Extraccin soxhlet
Ataque cido
Clean-up
Clean
up automtico
Concentracin
PCDDF y PCB ISS
HRGC-HRMS
PCDDs/Fs
/ y PCBs
Preparacin de muestras y Extraccin
soxhlet
HOMOGEINIZACIN Y
PREPARACIN DE
MUESTRA
Patrones 13C12
Reposo 3 horas
EXTRACCIN TOLUENO
8 HORAS
BCHI 811
PCDDs/Fs
/ y PCBs
Muestras grasas: Ataque cido
Cambio de disolvente
tolueno-hexano
tolueno
hexano
Disolucin en hexano
PCDDs/Fs
/ y PCBs
CLEAN UP
Eluato en hexano
12 mL
FMS
POWER-PREP
Slice multicapa
p
Almina bsica
Carbn px-21
Hexano
DCM/Hexano 2%
DCM/Hexano 50%
A OEt/T l
AcOEt/Tolueno
50%
Tolueno
Frac. Tolueno
l
Non-ortho PCBs
PCDD/Fs
Frac. DCM/Hexano
Mono-ortho PCBs
PCDDs/Fs y PCBs
ANLISIS INSTRUMENTAL
Extracto a sequedad
F
Frac.
tolueno
l
THERMO FINNIGAN
MAT 95 XP
Extracto a sequedad
F
Frac.
tolueno
l
y
DCM/Hex
EPA1613 ISS
EPA1613-ISS
+
nonano
EPA1668 ISS
EPA1668-ISS
+
nonano
HRGC:DB5 MS
HRGC:DB5-MS
60 m x 0,25 mm
x 0,1 um
HRGC:RTX 2330
60 m x 0,25 mm x
0,1 um
HRGC: MID
R= 10000
HRGC: MID
R= 10000
COSTE
METODOS DE SCREENING
Mtodos qumicos: GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GC GC-ECD
GCxGCGCxGC
ECD
Preparacin de
muestra
GCxGC--TOF
GCxGC
Mtodos de bioensayo:
DR
DR--Calux assay
Mtodos ELISA
METODOS DE SCREENING
Requisitos de los mtodos de screening
- Debe ser lo suficientemente selectivos y sensibles en los niveles y
matrices legislados.
- Es necesario disponer y proporcionar informacin de los falsos
positivos y negativos en una amplia serie de datos.
- El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%
- El porcentaje de falsos positivos debe ser lo suficientemente bajo
para resultar til
- Debern confirmarse mediante HRGC/HRMS todos los positivos y al
menos entre un 2-10% de las muestras negativas
- Segn la estrategia de anlisis del Reglamento (CE) 1883/2006
deberan confirmarse muestras cuyo EQT > 25% del limite
1. Toma de muestra
2. Extraccin de la muestra
3. Clean-up: Silica, Almina, Florisil
4. Cultivo celular
5. Crecimiento celular
6. Exposicin de las clulas a extractos
de muestra.
7. Adicin de luciferina y cuantificacin de la
actividad luminiscente de la luciferasa
8. Comparacion de curva de calibrado y
expresin de resultados : CALUX-EQT
07/27/2011 04:04:52 PM
2011/23856
NL: 3 .13 E3
m/ z=
32 1.793 6 32 1.9 93 6 F: + c
EI SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07
2 3.2 3
2 2 .11
Relative Abundance
80
2 2.2 2 22 .24
60
22 .3 5
40
EQT CALUX=
CALUX 3.25
3 25 pg/g
/
EQT HRGC-HRMS= 0.64 pg/g
22 .9 7
22 .74
2 2 .4 7
20
2 3.3 0
2 3.4 0
23 .65
23 .06
0
22 .0
22 .1
22 .2
22 .3
2 2 .4
2 2 .5
2 2.6
2 2.7
2 2.8
2 2.9
2 3.0
Time (min)
2 3.1
2 3.2
Relative Ab
bundance
80
2 3.3
2 3.4
2 3.5
23 .6
23 .7
23 .8
23 .9
NL: 2 .29 E3
2 3.2 2
m/ z=
319.796 5319.9 96 5 F: + c EI
SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07
2 2.2 3
60
2 2.36
2 36
40
22 .47
22 .96
2 2.73
20
22 .84
2 2.6 3
0
22 .0
22 .1
22 .2
22 .3
2 2 .4
2 2 .5
2 2.6
2 2.7
2 2.8
2 3.0
Time (min)
2 3.65
2 3.4 2
2 3.0 5
2 2.9
2 3.4 9 2 3.51
2 3.1
2 3.2
2 3.3
2 3.4
2 3.5
23 .7
23 .8
2 3.9 4
23 .9
22 .96
100
m/ z=
33 1.8 30 033 2.0 30 0 F: + c
EI SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07
Relative Abun
ndance
80
60
2 3.4 0
40
20
0
22 .0
22 .07
22 .1
22 .3
22 .44
2 2 .4
22 .59
2 2 .5
22 .72 2 2.76
2 2.6
2 2.7
2 3.2 5
2 2.8
2 2.9
2 3.0
Time (min)
2 3.1
2 3.2
23 .56
2 3.3
2 3.4
2 3.5
2 3.65
23 .6
23 .73
23 .7
23 .80
23 .88 2 3.9 1
23 .8
23 .9
22 .96
100
m/ z=
3 3 3.83 3 93 3 4.03 3 9
MS
2 0 110 72 7C
07
Relative Abunda
ance
80
60
23 .40
40
20
0
22 .0
2 2.11 2 2.13
22 .1
2 2.3
2 2.4
2 2.54
22 .5
22 .63
22 .6
2 2.73
22 .7
22 .82
2 2 .8
23 .13
2 2.9
2 3.0
Time (min)
2 3.1
2 3.2 2
23 .2
23 .82 2 3.8 8
2 3.58 23 .61
23 .3
23 .4
2 3.5
2 3.6
2 3.7
23 .8
23 .9
2 3.9 6
E t
Extraccin
i
)
Clean-up
Obtencin de EQT
ELISA
Caractersticas
- Elevada rapidez
rapidez. Placas de 96 platos simultaneos
- Menor necesidad de purificacin. Aunque los resultados pueden ser
fuertemente dependientes del mismo
- Elevada sensibilidad. Uso de reducido tamao de muestra
- Estudio directo de la toxicidad de la muestra
- Coste reducido. Sobre un 50-60% del mtodo de confirmacin
- Selectividad comprometida. Depende del perfil de contaminacin.
Posibilidad de falsos positivos
- No siempre se utilizan con rigor
- No proporcionan perfil de congneres. Difcil saber el origen de al
contaminacin
METODOS DE SCREENING
Mtodos qumicos: GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GCxGC--ECD
GCxGC
Preparacin de
muestra
GCxGC--TOF
GCxGC
Extraccin
Purificacin
Automatizacin
con
a
elevadas
temperaturas y presiones
2. Uso de disolventes de
muy diferente polaridad y
en poco volumen
Extraccin soxhlet
4 muestras 8-12 h
Extraccin PLE
12 muestras 2 h
S INSTRUMENTAL
SIN
S U
FACIL PARA CUALUIER
LABORATORIO
MIPs
MEPS
- Preparacin
p
de un p
polmero altamente entrecruzado
en presencia del analito (plantilla) para el cual se desea
el reconocimiento selectivo.
- Se pone inicialmente en contacto el analito con un
monmero adecuado con el fin de formar un complejo
p j
de pre-polimerizacin.
- Posteriormente se le aade el entrecruzante, el
iniciador y el disolvente en el que se lleva a cabo la
polimerizacin (p
p
(porogen).
g )
- Una vez obtenido el polmero, se extrae el analito
plantilla, liberando los sitios de reconocimiento
especfico.
- La p
plantilla p
puede ser el p
propio
p analito (p
(posibles
problemas de fondo) o molculas de estructura similar.
- Se pueden preparar estructuras solo para TCDD
(como representante de EQT) o todos los congneres.
- Necesario calibrar p
para cada matriz.
GC--Triple cuadrupolo
GC
MS/MS:
C t moderado
d d
- Coste
- Sensibilidad aceptable
- Selectividad moderada
- Resolucin baja
- Robustez baja
j
- Coste medio
- Sensibilidad buena
- Selectividad moderada
- Resolucin 0.7 amu
- Robustez alta
- rapidez elevada
CONCLUSIONES
1 Los mtodos de screening resultan un herramienta til para la
1.
obtencin de manera rpida y asequible de un gran numero de
datos sobre los niveles de dioxinas y PCBs. Son muy tiles en las
crisis.
crisis
2. De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo
mejor son programas combinados con HRGCHRGC-HRMS.
3. Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el
perfil de congneres y evitar falsos negativos y positivos.
4 Muchos
4.
M h d
de llos elementos
l
t d
de llos mtodos
t d d
de screening
i sirven
i
para
hacer tambin mas rpidos los mtodos de confirmacin.
5. Adems de las metodologas,
g , es necesaria la inversin en p
personal
cualificado
AGRADECIMIENTOS
MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIN
PERSONAL DE LA UTC