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Beobachtung der Apoptose von Saccharomyces Cerevisiae durch FACS-Methode mit DHE- und

TUNEL-Frbung
Novak Elisabeth MatrNr:0831017 , Rei Heidemarie MatrNr:0830345 , und Hofer Ines
MatrNr:0830393
Im Rahmen der Lehrveranstaltung EDV - Basiswissen an der Technischen Universitt Graz
www.tugraz.at
In diesem Paper werden die Methoden der
TUNEL- und DHE - Methode im Bezug auf
den programmierten Zelltod vorgestellt.
Weiters werden experimentelle Daten
theoretisch und graphisch ausgewertet und
die Ergebnisse anschlieend interpretiert.
Es wird ein Grenzwert bestimmt und die
prozentuelle Aufteilung von toten und
lebenden Zellen aufgelistet. Im letzten
Abschnitt
des
Papers
werden die
Analyseergebnisse
in
Form
von
Diagrammen dargestellt und die Bilder der
Mikroskopierergebnisse mit den FACS Analysen verglichen.
Im Laufe dieses Experiments wurde
Bckerhefe
(Saccharomyces
Cerevisiae)
angezchtet und mittels verschiedener
mikroskopischer
Methoden
untersucht.
Dadurch wurde in einer Zeitspanne von 5
Tagen die Zellalterung und der programmierter
Zelltod (Apoptose) beobachtet.

durch
das
Enzym
TdT
(terminal
deoxynucleotidyl
transferase)
mit
fluoreszierenden
Nukleotiden
markiert.
TUNEL-positive Zellen erscheinen grn
fluoreszierend. Sie stellen den Anteil der
apoptotischen (sterbenden) Zellen dar, die
aktiv Selbstmord begehen.
Ergebnisse
Mit den von diesen Methoden erhaltenen
Daten wurden vier Histogramme im Excel
erstellt: Zwei fr DHE und zwei fr TUNEL,
jeweils von Tag 1 und Tag 5 der Versuche. In
den Histogrammen von DHE d1 und DHE d5,
(siehe Abbildung 1 (DHE d1) und Abbildung 2
(DHE d5)) wurde e7,1 als Grenzwert
ausgewhlt, daraus ergab sich, dass am ersten
Tag 916 und am fnften Tag 8691 Zellen
Zellstress aufweisen. In den Histogrammen
von TUNEL d1 und TUNEL d5 (siehe
Abbildung 3 (TUNEL d1) und Abbildung 4
(TUNEL d5)) wurde e5,9 als Grenzwert
gewhlt, somit wiesen am ersten Tag 2414 und
am fnften Tag 8482 Zellen DNAFragmentierung auf. Auerdem wurde im
Excel eine Signifikanzprfung (TTEST)
durchgefhrt, welche Aussage auf einen
mglichen Zusammenhang zwischen den
Messgren des DHE am Tag 1 und des
TUNEL am Tag 1 hinweist. Der
Signifikanztest von DHE d1 gegen TUNEL d1
ergab 0,0141. Zustzlich wurden fr Tag 1 und
Tag 5 beider Methoden der Mittelwert und der
Median ermittelt.

Methoden
Bei der Methode der Durchflusszytometrie
(FACS)-Analyse werden markierte Zellen in
eine Suspension eingebracht, durch ein dnnes
Rohr geleitet und dabei von mehreren Lasern
belichtet.
Die
Auftrennung
der
Fluoreszenzsignale erfolgt auf verschiedene
Detektoren, wodurch die Intensitt der
abgegebenen Fluoreszenz gemessen wird.
Diese Intensitt wird von einem Computer
aufgezeichnet. Die Einteilung, ab wann eine
Zelle tot ist kann frei entschieden werden.
Auerdem
werden
unterschiedliche
fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt. Ein
Beispiel fr diese Frbungen sind DHE und
TUNEL-Methoden. DHE (Dihydroethidium)
ist eine Frbung mit der man reaktive
Sauerstoffspezien (z.B.:H2O2) nachweisen
kann und somit bestimmen kann ob die Zelle
Zellstress hat. Im Fluoreszenzmikroskop
erscheinen
DHE-positive
Zellen
rot
fluoreszierend. Die TUNEL-Methode ist ein
Frbevorgang, den man verwendet um die
DNA-Fragmentierung
im
Zellkern
nachzuweisen. Dabei werden DNA-Fragmente

Diskussion
Aus den berechneten Median kann man
erkennen, dass bei TUNEL d1 mehr
Extremwerte auerhalb des Grenzwertes liegen
und bei DHE d1 weniger. Daher ist der Wert
der prozentuellen Verteilung der toten Zellen
bei TUNEL d1 grer als bei DHE d1. Aus der
Ermittlung der beiden Grenzwerte von DHE
und TUNEL kann man folgendes schlieen:
Bei DHE d1 und bei DHE d5 kann man ab
dem Grenzwert von e7,1
(~1200) das

Vorkommen von reaktiven Sauerstoffspezien,


und somit Zellstress annehmen. Am ersten Tag
sind 3,5% der Zellen tot, am fnften Tag liegt
der Prozentsatz von toten Zellen bei 33,4%.
Bei TUNEL d1 und TUNEL d5 kann man ab
dem Grenzwert von e5,9 (~400) annehmen,
dass
in
dieser
Population
DNAFragmentierung vorliegt. Das bedeutet, dass
am ersten Tag 9,2% und am fnften Tag 32,6%
der Zellen tot sind.
Das Ergebnis des TTests zwischen DHE d1
und TUNEL d1 ergab eine Signifikanz unter
0,05, was bedeutet, dass es zwischen den
beiden Stichproben keinen wesentlichen
Unterschied zu verzeichnen gibt.
Bei Vergleich der DHE-Mikroskopie (siehe
Abbildung 5 (DHE d1)) und TUNELMikroskopie (siehe Abbildung 7 (TUNEL d1))
kommt man zu dem Schluss, dass die Resultate
nur bedingt vergleichbar sind. Der Grund dafr
ist, dass bei der DHE-Methode eine
Unterscheidung zwischen nekrotischen und
apoptotischen Zelluntergngen nur teilweise
mglich ist. Im Gegensatz dazu, kann man bei
der TUNEL-Methode auf sichere Apoptose
schlieen, da DNA-Fragmentierung vorliegt.
Bei Vergleich der prozentuellen Ergebnisse der
toten Zellen bei DHE und TUNEL-Methode

kann man vermuten, dass bei DHE d5 auch


nekrotische Zellen einbezogen wurden. Bei
Vergleich der Mikroskopiebilder und der
FACS-Analyse, kann man erkennen, dass wie
bei den Mikroskopiebildern auch bei den
Histogrammen die Anzahl der Toten Zellen bis
Tag 5 stark zunimmt.
Zusammenfassung
Das Paper handelt von verschiedenen
Methoden zur Feststellung von Apoptose bei
Backhefe (Saccharomyces Cerevisiae) und den
Ergebnissen der Experimente. Es wurden
Histogramme erstellt und Mikroskopiebilder
bearbeitet
um
die
Ergebnisse
zu
veranschaulichen.
Danach wurden die
Ergebnisse miteinander verglichen um eine
mglichst
aussagekrftige
Theorie
zu
entwickeln. Schlielich kommt man zu dem
Ergebnis, dass am Tag 5 der Experimente bei
der DHE-Methode 33,4% der Zellen tot sind
und bei der TUNEL-Methode 32,6% und, dass
somit die DHE-Methode ungenauer ist, da bei
dieser Methode auch Zellen, welche nur
Zellstress aufweisen, aber noch leben, in die
Berechnung einbezogen werden.

Referenzen
1. www.wikipedia.at
2. www.google.at
3. Technische Universitt Graz

Abbildung 5 (DHE d1)

Abbildung 1 (DHE d1)

Abbildung 6 (DHE d5)

Abbildung 2 (DHE d5)

Abbildung 7 (TUNEL d1)

Abbildung 3 (TUNEL d1)

Abbildung 8 (TUNEL d5)

Abbildung 4 (TUNEL d5)